Summary
여기서는 랩 온 어 칩 플랫폼 내에서 뼈 리모델링을 분석하기 위한 프로토콜을 제공합니다. 3D 프린팅 된 기계적 로딩 장치는 셀룰러 매트릭스를 변형시킴으로써 골혈구 기계화 변환을 유도하기 위해 플랫폼과 페어링 될 수 있습니다. 이 플랫폼은 또한 파골 세포와 파골 세포 (재흡수 / 형성)에서 뼈 리모델링 기능 결과를 정량화하는 데 사용할 수 있습니다.
Abstract
뼈 리모델링은 골격 성장 및 수리뿐만 아니라 기계 환경의 변화에 적응하는 데 필요한 엄격하게 규제되는 프로세스입니다. 이 과정에서 메카노에민성 골세포는 이화 파골세포와 단백 동화 골아세포 사이의 반대 반응을 조절합니다. 이 프로세스를 조절하는 매우 복잡한 신호 경로를 더 잘 이해하기 위해 당사의 실험실은 소규모 시스템 내에서 뼈 리모델링의 기능적 결과(형성 및 재흡수)를 분석하기 위한 기초 실험실 온 어 칩(LOC) 플랫폼을 개발했습니다. 뼈 리모델링은 몇 주에서 몇 달까지 진행되는 긴 과정이므로 시스템 내에서 장기 세포 배양 프로토콜을 개발했습니다. 골아세포 및 파골세포는 LOC 내의 기능활성 기판상에서 성장시키고 최대 7주 동안 유지하였다. 그 후, 칩을 분해하여 뼈 형성 및 재흡수의 정량화를 허용하였습니다. 또한 LOC 플랫폼과 페어링되는 3D 프린팅 기계 적재 장치를 설계했으며 셀룰러 매트릭스를 변형하여 골혈구 메카노 트랜스듀션을 유도하는 데 사용할 수 있습니다. 우리는 LOC 플랫폼 내에서 골세포, 골세포 및 파골세포에 대한 세포 배양 프로토콜을 최적화했으며 불임 및 세포 독성에 대한 우려를 해결했습니다. 여기서는 LOC의 제조 및 살균, 기능성 기판의 시딩 셀, 기계적 부하 유도 및 LOC 분해를 통해 엔드포인트 결과를 정량화하는 프로토콜을 제시합니다. 우리는 이러한 기술이 뼈 리모델링을위한 진정한 오르간 온 칩을 개발하기위한 토대를 마련한다고 믿습니다.
Introduction
뼈는 세 가지 주요 세포 유형 중 복잡한 조정을 필요로하는 매우 역동적 인 조직입니다: 골세포, 골세포, 파골 세포. 이 세포 사이 다세포 상호 작용은 마비 와 장기 부동성 도중 생기는 뼈 손실에 및 성장과 운동에 응하여 생기는 뼈 대형에 책임 있습니다. 가장 풍부한 뼈 세포 유형인 골세포는 뼈에 가해지는 기계적 자극에 매우 민감합니다. 기계적 자극은 골혈구 대사 활성을 변화시키고 주요 신호 분자1,,2의증가로 이어집니다. 이 과정을 통해, 메카노 트랜스 덕션으로 알려진, 골세포는 직접 골아세포 (뼈 형성 세포)와 파골 세포 (뼈 재소자 세포)의 활동을 조정할 수 있습니다. 뼈 항상성을 유지 하려면 뼈 형성 및 뼈 흡수 속도 사이 엄격한 규제 필요; 그러나, 이 프로세스에 있는 중단은 골다공증 골다공증 골다공증 골다공증골페트로증과 같은 질병 국가 귀착될 수 있습니다.
이 3개의 세포 모형 사이 상호 작용의 복잡성은 마이크로 유체 및 실험실 에 칩 (LOC) 기술을 이용한 조사에 잘 빌려준다. 이를 위해 우리 연구실은 최근 뼈 리모델링 과정에서 뼈 재흡수 및 형성(기능적 결과)을 분석하기 위한 LOC 플랫폼의 개념 증명을 확립했습니다. 이 플랫폼은 세포 상호 작용, 변경된 로딩 환경 및 조사용 약물 스크리닝 연구에 사용될 수 있습니다. 최근, 뼈 리모델링을 조절 하는 분자 신호 경로 조사 하기 위해 다양 한 미세 유체 장치 개발 되었습니다.; 그러나, 이러한 시스템의 대부분은 기능 적 활동3,,4,,5,,6,,7을나타내는 간접 마커를 통해 리모델링을 정량화한다. 우리 시스템의 장점은 기능적 결과의 직접 정량화에 사용할 수 있다는 것입니다. 뼈 리모델링은 장기적인 과정입니다. 이와 같이, 골 흡수 및 형성의 직접 정량화는,,8개월, 9,810,911까지최소 몇 주 동안 유지될 수 있는 배양 시스템을 필요로 한다. 따라서 LOC 플랫폼을 개발할 때 형성 및 재흡수에 필요한 장기 배양 프로토콜을 확립하고 최대 7주 동안 시스템 내에서 세포를유지관리했습니다 11. 추가적으로, 우리는 플랫폼에 두 세포 모형을 위한 적당한 배양 기판을 통합했습니다; 골골세포는 뼈에 직접 배양되었고, 플라스틱 부착으로 알려진 조골 세포는 폴리스티렌 디스크에서 배양되었습니다. 또한, 리모델링 분석을 위한 불임, 장기 세포독성 및 칩 분해에 관한 문제를해결하였으며 11,,12.
LOC 플랫폼은 또한 매트릭스 변형을 통해 골혈구 메카노 트랜스듀션을 유도하는 데 사용될 수 있습니다. 3D 프린팅 기계적 로딩 장치는 LOC와 페어링하고 평면 소멸에서 정적을 적용하여셀(13)을스트레칭하도록 개발되었다. 이러한 기계적 하중을 수용하기 위해 LOC 내의 웰 깊이가 증가했습니다. 이 작은 규모, 간단한 기계 적재 장치는 제한된 엔지니어링 경험이있는 실험실에서 쉽게 생산 할 수 있으며 이전에 3D 인쇄 구성 요소(13)의도면을 공유했습니다. 현재 작업에서, 우리는 LOC의 성공적인 사용에 필요한 새로운 기술의 일부를 보여줍니다. 구체적으로, 우리는 칩 제조, 기능 기판에 셀 시드, 기계적 로딩 및 리모델링 정량화를위한 칩 분해를 보여줍니다. 우리는 이러한 기술에 대한 설명이 시각적 형식의 이점을 얻을 수 있다고 믿습니다.
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Protocol
1. 칩 마스크 준비
참고: 1.1단계 - 1.3단계는 칩 마스크를 처음 받으면 한 번만 수행하면 됩니다. 사용 중에 마스크가 절하지 않도록 합니다. 미세 유체 마스크의 설계는 이전에11,,14를기술했다. 마스크는 사내에서 설계되었으며 고해상도 스테레오리소그래피(그림1A)를사용하여 상업적으로 제작되었습니다.
- 마스크의 상단 표면을 플라스틱 시트로 덮어 접착제로부터 이 표면을 보호합니다. 스프레이 접착제를 사용하여 칩 마스크를 동등한 크기의 아크릴 시트에 고정하십시오. 접착제가 완전히 치료될 수 있도록 조각을 밤새 함께 고정합니다. 접착제가 건조된 후 마스크 상단에서 플라스틱 시트를 제거합니다.
- 양면 테이프를 사용하여 아크릴 시트의 바닥을 3D 인쇄 된 수평 상자(보충 그림 1, 보충 파일 1-4)에부착하십시오. 단단한 결합을 보장하기 위해 단단히 누르고 있습니다.
- 방수 실란트로 레벨링 상자의 분리형 벽 근처의 작은 개구부를 밀봉합니다. 실란트가 24시간 동안 치료되도록 하십시오.
- 마스크 표면을 70% 에탄올(EtOH)으로 청소합니다. 오븐에 원하는 칩 마스크와 레벨링 상자를 놓습니다. 디지털 각도기를 사용하여 마스크의 상단이 수평인지 확인합니다. 필요한 경우 수평 나사를 조정합니다.
2. PDMS 제작
참고: 얕은 웰(1mm) 칩 설계는 기능적 활성(형성 및 재흡수) 어세이에 사용되며, 딥 웰(10mm) 칩 설계는 기계적 로딩 연구에 사용됩니다. 딥웰의 바닥은 별도의 얇은 PDMS 멤브레인을 부착하여 형성된다(도1B).
- 뚜껑 레이어(레이어 1)
- PDMS 프리폴리머 63 g과 경화제 6.3 g(10:1 비율)을 플라스틱 컵에 결합합니다. 일회용 셀 주걱과 완전히 섞고 진공 건조기에서 30 분 동안 탈가하십시오.
- 준비된 레벨링 상자에 혼합물을 천천히 붓습니다. PDMS를 30 분 동안 앉게한 다음 45 °C에서 18 시간 동안 굽습니다.
- 테이퍼 된 실험실 주걱으로 PDMS의 가장자리를 풀고 수평 상자에서 폴리머 시트를 제거하십시오.
- 메스와 3D 프린트 템플릿을 사용하여 개별 뚜껑을 크기(70mm x 34mm)로 자른다.
- 생검 펀치 (직경 1mm)로 각 뚜껑을 통해 구멍을 펀치.
- 포장 테이프로 뚜껑을 청소합니다.
참고: 뚜껑을 즉시 사용하지 않는 경우, 포장 테이프에 각각 포장하고 실온(RT)에 보관하십시오.
- 음 및 마이크로 채널 층 (레이어 2)
- PDMS 프리폴리머와 경화제(10:1 비율)를 플라스틱 컵에 결합합니다. 얕은 웰 디자인은 프리폴리머 43 g과 경화제 4.3 g이 필요하며 딥 웰 설계에는 프리폴리머 227 g과 경화제 22.7 g이 필요합니다. 중합체를 힘차게 혼합하고 30 분 동안 탈가스.
참고: 마스크 치수는 152.4mm x 152.4mm입니다. - 적절한 사전 평준화 마스크 위에 혼합물을 천천히 붓습니다. PDMS를 30 분 동안 앉게한 다음 45 °C에서 18 시간 동안 굽습니다.
- 테이퍼 된 실험실 주걱으로 PDMS의 가장자리를 풀고 조심스럽게 마스크에서 폴리머를 벗깁니다. 메스와 3D 인쇄 템플릿을 사용하여 개별 칩을 잘라냅니다.
참고: 로딩 스터디의 경우 칩 치수(70 x 34mm)가 정확하고 웰이 칩 중앙에 위치하는 것이 중요합니다. - 포장 테이프로 PDMS를 표면 청소합니다.
참고: 칩을 즉시 사용하지 않는 경우 각 칩을 포장 테이프에 싸서 RT에 보관하십시오.
- PDMS 프리폴리머와 경화제(10:1 비율)를 플라스틱 컵에 결합합니다. 얕은 웰 디자인은 프리폴리머 43 g과 경화제 4.3 g이 필요하며 딥 웰 설계에는 프리폴리머 227 g과 경화제 22.7 g이 필요합니다. 중합체를 힘차게 혼합하고 30 분 동안 탈가스.
- 얇은 PDMS 멤브레인 (층 3)
주: 이 레이어는 딥 웰 디자인에만 사용됩니다.- 플라스틱 컵에 PDMS 프리폴리머 12.7 g과 경화제 1.3 g(10:1 비율)을 추가합니다. 30분 동안 힘차게 섞고 드가스를 드하세요.
- 준비된 레벨링 박스에 폴리머를 천천히 붓고 플라스틱 컵을 철저히 긁어 가능한 한 많은 PDMS를 제거하십시오.
- 세포 주걱을 사용하여 전체 표면에 PDMS를 확산시면
참고: 중합체가 수동으로 퍼지지 않으면 표면 장력이 충분하여 폴리머가 균일한 시트를 형성하는 것을 방지할 수 있습니다. - PDMS를 30 분 동안 앉게한 다음 45 °C에서 18 시간 동안 굽습니다.
- 테이퍼 주걱으로 PDMS의 가장자리를 느슨하게하고 조심스럽게 수평 상자에서 PDMS 시트를 제거합니다. 레이어 2의 치수와 일치하는 개별 멤브레인을 잘라냅니다.
- 캘리퍼를 사용하여 멤브레인 중앙의 멤브레인 두께를 측정합니다. 원하는 두께(0.5mm ±0.1 mm)를 벗어난 멤브레인은 폐기합니다.
- 포장 테이프로 멤브레인을 조심스럽게 청소하고 파라핀 필름 위에 놓습니다.
참고: 멤브레인을 즉시 사용하지 않는 경우 멤브레인 상단을 포장 테이프로 덮고 RT에 보관하십시오.
3. 기능 활성 기판
참고: 폴리스티렌 디스크와 뼈 웨이퍼는 각각 조골 세포 및 타골 배양에 사용되는 우물바닥에 부착되어야 합니다.
- 폴리스티렌 디스크(그림 1C)
- 폴리스티렌 커버슬립을 처리한 조직 배양의 뒷면에 마스킹 테이프를 놓습니다. 날카로운 코르크 보어(직경 5.4mm)를 사용하여 커버슬립에서 원형 디스크를 자른다. 디스크를 70% EtOH로 잠그고 밤새 둡니다.
- 70% EtOH에 적신 면 팁 어플리케이터로 디스크 상단표면을 부드럽게 문질러 주세요. 디스크의 바깥쪽 가장자리를 완전히 청소해야 합니다.
- 두 쌍의 집게를 사용하여 디스크를 잡고 마스킹 테이프 백업을 제거합니다. 디스크 처리된 쪽을 아래로 놓고 면 팁 어플리케이터로 뒷면을 청소합니다.
- 면 팁 어플리케이터의 나무 끝을 경화되지 않은 PDMS의 탈기 혼합물에 담그고 원하는 우물바닥에 소량의 폴리머를 놓습니다.
참고: 경화되지 않은 PDMS는 -20°C에서 보관할 수 있습니다. - 폴리스티렌 디스크를 위로 올려 놓고 면봉으로 디스크를 부드럽게 누릅니다. 경화되지 않은 PDMS가 디스크의 처리된 면과 접촉하지 않도록 하십시오.
참고: PDMS가 디스크의 처리된 표면과 접촉하는 경우 웰에서 디스크를 제거하고 새 디스크로 3.1.4 및 3.1.5 단계를 반복합니다. - 칩을 평평한 표면에 30 분 동안 앉힌 다음 65 °C에서 4 시간 동안 굽습니다.
- 뼈 웨이퍼
- 포셉을 사용하여 100mm 접시 의 바닥에 뼈 웨이퍼 (직경 6mm, 두께 0.4mm)를 놓습니다. 집게로 웨이퍼를 안정적으로 잡고 메스로 웨이퍼 뒷면에 'X'를 부드럽게 에칭합니다.
참고: 이미징 과정에서 'X'는 웨이퍼의 뒷면과 세포가 시드된 표면을 구별하는 데 사용됩니다. - 면 팁 어플리케이터의 나무 끝을 사용하여 원하는 우물 바닥에 소량의 경화되지 않은 PDMS를 추가하십시오. 뼈 웨이퍼를 아래쪽으로 표시한 후 면 으로 기울인 어플리케이터를 사용하여 웨이퍼를 누릅니다.
- 칩을 평평한 표면에 30 분 동안 앉힌 다음 65 °C에서 4 시간 동안 굽습니다.
- 포셉을 사용하여 100mm 접시 의 바닥에 뼈 웨이퍼 (직경 6mm, 두께 0.4mm)를 놓습니다. 집게로 웨이퍼를 안정적으로 잡고 메스로 웨이퍼 뒷면에 'X'를 부드럽게 에칭합니다.
4. 칩 조립 및 살균
- 중간 무선 주파수(RF) 전력 설정(약 10.2W)을 사용하여 30s용 플라즈마 클리너로 레이어 1및 레이어 2의 표면을 활성화합니다.
- 레이어 1의 액세스 구멍을 레이어 2의 마이크로채널과 정렬하고 두 레이어를 함께 단단히 누릅니다.
- 딥 웰 디자인의 경우 레이어 2와 레이어 3을 통해 4.1 단계를 반복합니다. 플라즈마 처리 동안, 양면 테이프를 사용하여 3층의 파라핀 필름을 평평한 표면에 부착한다.
- 메스를 사용하여 PDMS 멤브레인에서 여분의 물질을 다듬습니다. 조심스럽게 칩의 바닥에서 파라핀 필름시트를 벗겨냅니다.
- PDMS 층 사이의 결합 강도를 높이기 위해 65 °C에서 10 분 동안 칩을 굽습니다.
- 각진 디스펜싱 팁(게이지 18개, 0.5in, 90°)을 뚜껑의 액세스 구멍에 삽입합니다. 두 부분의 에폭시로 디스펜싱 팁을 뚜껑에 고정합니다. 마이크로파이펫 팁을 사용하여 각 디스펜싱 팁 주위에 에폭시를 바치도록 하십시오.
- 에폭시가 완전히 경화된 후, 표면은 70% EtOH로 칩을 청소하고 생체 안전 성 캐비닛에 놓습니다. 생체 안전 성 캐비닛 내에서 모든 후속 단계를 수행합니다.
- 멸균 실리콘 튜브(1/32'ID, ~10cm 길이)로 디스펜싱 팁에 5mL 주사기를 연결하고 칩 전체를 70% EtOH로 30s 이상 채웁니다. 얕은 웰 설계의 경우, 4 mL/h의 유량으로 설정된 주사기 펌프로 모든 액체를 관리하십시오. 딥 웰 설계를 위해 주사기를 천천히 손으로 분배하여 모든 액체를 관리하십시오.
- 칩에서 EtOH를 제거하고 밤새 자외선으로 칩을 살균합니다.
- dH2O. dH2O로칩을 3회 세척하고 디스펜싱 팁에서 튜브를 제거하고 37 °C에서 적어도 48 시간 동안 배양하십시오.
5. 기계적 적재 장치 조립
참고: 3D 인쇄 기계 적재 장치(그림2A-C)의설계 및 제작 프로세스는 이전에 설명되었으며 인쇄된 구성 요소에 대한 모든 설계 파일은 이전에13을제공했습니다.
- 121 °C에서 30 분 동안 로딩 장치의 모든 구성 요소를 오토 클레이브하십시오.
참고: 인쇄된 부품의 뒤틀기를 방지하려면 각 조각을 호일에 개별적으로 감싸고 오토클레이브 공정 중에 단단한 평평한 표면에 놓습니다. 금속 하드웨어를 함께 래핑할 수 있습니다. 생체 안전 성 캐비닛 내에서 모든 후속 단계를 완료하십시오. - 압축 스프링을 플레이트의 샤프트 주위에 놓고 플레이트를 베이스 하단의 중앙 구멍에삽입합니다(그림 2D).
- 4개의 셀프 태핑 나사를 사용하여 다이얼 블록을 베이스 하단에 부착합니다.
- 중앙 나사 주위에 두 번째 압축 스프링을 놓습니다. 나사를 다이얼 하단의 육각형 구멍에 삽입하고 어셈블리를 다이얼 블록 중앙의 나사 구멍에 끼어 넣습니다.
- 4개의 남성-여성 스탠드오프를 베이스 의 바닥에 나사로 조입니다.
- 플래번의 상단이 베이스의 상단 아래에 놓일 때까지 다이얼을 시계 반대 방향으로 돌려 장치에서 느슨해지다. 그런 다음 플래턴의 상단이 베이스의 상단과 수평이 될 때까지 천천히 시계 방향으로 다이얼을 돌립니다.
6화 실험
참고: 기능 적 활성 실험을 위한 프로토콜은 이전에11,,12를제공하였다.
- 로딩스터디(그림 3)
- 4.9 단계 다음, 5 mL 주사기를 사용하여 딥 웰 칩에서 dH2O를 제거합니다. 0.15 mg/mL 타입 I 콜라겐(CTI)을 0.02 M 아세트산으로 1시간 동안 200 μL로 웰의 바닥을 코팅하였다.
- 칼슘과 마그네슘(DPBS++)으로 덜베코의 인산완충식염수로 칩을 세 번 헹구세요.
- 칩 홀더에 칩을 넣고 MLO-Y4 골세포가 있는 씨앗을 최소 필수 알파 배지(MEMα)에서 최소 2 x 104 세포/mL의 밀도로 5% 송아지 혈청, 5% 태아 소 혈청, 1% 페니실린/스트렙토마이신으로 보충합니다.
- 디스펜싱 팁에서 튜브를 제거하고 칩을 깊은 웰 배양 접시 (150mm x 25mm)에 넣습니다. 72시간 동안 37°C 및 5%CO2에서 세포를 배양한다.
- 디스펜싱 팁에 멸균 튜브를 부착하고 5mL 주사기를 사용하여 칩에서 소비된 배양 배지를 제거합니다. 칩을 리필하기 위해 신선한 배양 매체에서 천천히 분배하십시오.
- 칩 홀더를 로딩 장치 베이스 상단의 직사각형 인셋에 넣습니다. 로딩 장치 뚜껑에 있는 슬롯을 통해 튜브를 공급하고 4개의 팬 헤드 나사와 육각 너트로 뚜껑을 베이스에 고정시다.
참고: 뚜껑이 수평으로 유지되도록 하려면 먼저 나머지 두 개의 나사를 고정하기 전에 대각선으로 배치된 두 개의 나사를 서로 고정하십시오. - 원하는 플래칸 변위에 도달할 때까지 다이얼을 시계 방향으로 돌려 셀에 부하를 가합니다.
참고: 이 장치는 다이얼의 한 회전이 1mm의 플래톤 변위와 동일하도록 설계되었습니다. PDMS 멤브레인의 상부에 생성된 스트레인 필드는 이전에 유한 요소 분석(FEA)13을사용하여 플래튼 변위의 함수로서 모델링되었다. - 로딩 장치를 빈 P1000 마이크로파이펫 팁 박스에 넣습니다. 15 분 동안 적용 된 하중으로 세포를 인큐베이션합니다.
참고: 여기에 사용된 로드 기간은 예제로 사용됩니다. 대체 로딩 시간을 사용할 수 있습니다. - 인큐베이션 후, 플래틴이 원래 시작 위치로 돌아올 때까지 다이얼을 시계 반대 방향으로 돌려 셀에서 부하를 제거합니다. 장치에서 뚜껑을 제거하고 칩 홀더를 딥 웰 배양 플레이트에 넣습니다. 90 분 후 부하 복구 기간 동안 세포를 배양.
참고: 다시 말하지만 여기에 사용된 복구 기간은 예입니다. 대체 복구 시간을 사용할 수 있습니다. 장기 연구를 위해, 모든 72 시간 세포를 공급. - 5mL 주사기를 사용하여 칩에서 조절된 매체를 제거합니다.
참고 :이 매체는 -80 °C에서 저장하고 저장할 수 있습니다. - 칩 홀더에서 칩을 제거하고 테이퍼 주걱을 사용하여 PDMS 뚜껑과 잘 층 사이의 결합을 끊습니다.
참고: 세포 배양 판에 대해 확립된 임의의 프로토콜에 따라 세포 분석이 수행될 수 있습니다.
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Representative Results
얕은 웰 구성은 조골 세포 및 골골아의 기능 적 활성을 분석하는 데 사용할 수 있습니다. 파골 세포와 파골 세포에 의한 재흡수를 통한 뼈 형성은 몇 주에서 몇 달까지의 순서로 배양 시간을 필요로합니다. MC3T3-E1 프리골아세포로부터의 뼈 형성은 알리자린 레드 및 폰 코사 얼룩11,,15를사용하여 정량화되었다. 49일째에, 알리자린 적색으로 염색된 평균 표면적은 10.7% ±2.2%(평균 ±표준 오차)(평균±표준오차)였다. 폰 코사(von Kossa)로 염색된 평균 표면적은 6.4% ± 1.6%11이었다. 도 4A는 49일째에 골아세포 배양물로부터의 전형적인 형성 결과를 알리자린 레드 및 폰 코사로 염색한 것을 나타낸다. RAW264.7 시골 세포로부터의 뼈 흡수는 토루이딘 청색 염색11,,15를사용하여 정량화되었다. 30일째에 토루이딘 청색으로 염색된 평균 표면적은 30.4% ±4.5%11이었다. 도 4B는 30일째에 토루이딘 청색으로 염색된 파골배양으로부터의 전형적인 골 흡수 결과를 나타낸다. 주사 전자 현미경은 재흡수 구덩이의 존재를 확인하기 위해 수행되었다. 일반적인 결과는 그림4C에나와 있습니다. Figure 4 이러한 결과는 장치 내의 세포가 적어도 7주 동안 실행 가능하고 기능적으로 활성 상태로 남아 있음을 보여줍니다.
3D 프린팅 로딩 장치는 딥 웰 칩 구성을 수용하도록 설계 및 제작되었습니다. 함께, 이 시스템은 정적 아웃-평면 소멸을 통해 세포를 스트레칭시킴으로써 골혈구 메카노트랜스덕션을 유도할 수 있다. 4.9단계에서 설명된 칩의 48시간 배양은 세포 생존력 및 전형적인 형태를 유지하기 위한 중요한 과정인 것으로 입증되었습니다. 도 5A는 이러한 잠복기 유무에 관계없이 칩에 시드된 72h에서 MLO-Y4 골세포의 대표적인 이미지를 나타낸다. 로딩의 시합 동안, 골세포는 세포가 시드된 PDMS 막상에 유도된 변형 구이에 노출되었다(보충비디오 1). 이 공정 동안 생성된 동등한 균주를 FEA13으로 모델링하고 PDMS 멤브레인의 상부에서 생성된 평균 동등한 균주를 결정하였다. 그림 5B는 1~2mm 사이의 값에 대한 평균 등가 변형률과 플래펜 변위 간의 관계를 보여줍니다. 유도된 변형률 구배의 대표적인 히트 맵은 도5C에도시되어 있다. 이 예에서, 1.5 mm의 플래튼 변위는 멤브레인의 상부에 12.29%의 평균 등가 변형률을 생성하였다. 이 모델은 또한 웰의 중심 부근에서 유도된 균주가 상대적으로 낮고 점차 적으로 바깥쪽으로 증가하며, 최대 균주는 플래틴의 바깥쪽 가장자리 바로 위에 생성된다는 것을 보여줍니다. 로딩 후, 세포 생존가능성을 젖산 탈수소효소 염색 및 아넥신 V 및 죽은 세포 분석실험14,,16으로분석하였다. 전형적인 결과는 각각 도 5D,E에도시된다.
그림 1: 미세 유체 장치. (A)칩 마스크를 제작하고 수평화합니다. (왼쪽) CAD 소프트웨어를 사용하여 사내에서 설계된 딥 웰 칩 마스크의 회로도. (중간) 고해상도 스테레오리토그래피를 사용하여 상업적으로 인쇄된 딥 웰 칩 마스크의 이미지. (오른쪽) 마스크는 3D 인쇄 레벨링 박스 내에 배치되어 칩의 레이어 2를 캐스팅하는 동안 마스크가 수평을 유지하도록 합니다. (B)장치의 얕은 우물과 깊은 웰 디자인의 회로도 스케치. (맨 위) 얕은 웰 디자인은 조골 세포 및 파골 세포의 기능 적 활성 (형성 및 재흡수)을 분석하는 데 사용되었습니다. 이 구성은 두 개의 PDMS 계층으로 구성됩니다. 기능적 활성 기판은 층을 함께 밀봉하기 전에 배양물의 바닥에 잘 고정되었다. 폴리스티렌 디스크와 뼈 웨이퍼는 각각 조골 및 골세포 배양에 사용되었다. (하단) 깊은 우물 디자인은 골혈구에 기계적 하중을 적용하는 데 사용되었다. 이 구성은 세 개의 PDMS 계층으로 구성됩니다. 배양의 바닥은 변형 가능한 PDMS 멤브레인(층 3)에 의해 잘 형성된다. (C)조골 배양에 사용되는 폴리스티렌 디스크제조 단계. 치료된 조직 배양 커버슬립의 뒷면은 마스킹 테이프로 표시하였다. 개별 디스크는 코르크 보어로 잘라냈다. 디스크는 에탄올과 면봉으로 세척되었습니다. 테이프 백업을 제거하고 디스크를 PDMS 배양의 하단에 잘 부착했습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 기계 적재 장치의 설계 및 조립. (A)조립된 기계적 로딩 장치의 이미지. PDMS 칩의 딥 웰 설계와 결합하면 로딩 장치는 변형 가능한 멤브레인에 평면 분산을 적용하여 셀을 늘입니다. (B)장치의 분해 보기입니다. 파란색으로 표시된 모든 부품은 내열 폴리락트산 필라멘트로 3D 인쇄되었습니다. 모든 하드웨어는 스테인레스 스틸입니다. (C)로딩 장치의 나사 잭 메커니즘. 중앙 나사(주황색)의 회전은 판을 베이스를 통해 위쪽으로 밀어 넣습니다. 플래튼의 상향 이동은 세포가 시드된 딥 웰 칩의 PDMS 멤브레인을 변형시킵니다. (D)로딩 장치의 조립 프로세스. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 기계적 적재 실험. 모든 액체를 액세스 튜브에 연결된 5 mL 주사기를 사용하여 칩으로부터 투여 및 제거시켰다. 이 과정에서 중요한 단계는 세포 파종 전에 멸균 증류수를 사용하여 48 시간 배양하는 것입니다. 이 배양 세포없이 낮은 생존력과 비정형 형태를 보였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 일반적인 기능 적 활동 결과. (A)전형적인 형성 결과는 49일째에 유도된 MC3T3-E1 골골세포 배양물로부터 알리자린 레드(왼쪽)와 폰 코사(오른쪽)로 염색되었다. 전체 디스크 이미지는 직경 이 5.4mm입니다. (b)전형적인 파골세포 흡수작용은 핵인자 카파-B 리간드(RANKL)의 수용체 활성제로 유도된 RAW264.7 preosteoclasts에서 발생한다. 세포는 골 웨이퍼상에서 배양하고 30일째에 토루이딘 블루로 염색하였다. (C)전형적인 스캐닝 전자 현미경 이미지는 뼈 웨이퍼에 재흡수 구덩이의 존재를 확인합니다. 위쪽 이미지의 축척 막대는 200 μm를 나타내고 아래쪽 이미지의 축척 막대는 50 μm를 나타냅니다.
그림 5: 골세포에 기계적으로 유도된 변형의 영향. (A)MLO-Y4 골혈구의 이미지는 세포 파종 전에 증류수로 48시간 배양된(왼쪽)과 없이 제조된 딥웰 칩에서 72시간에서 의 정골세포를 시동한다. (b)유한 요소 분석은 로딩 장치 플래튼의 변위에 기초하여 변형 가능한 PDMS 멤브레인의 상부에서 생성된 평균 등가 균주를 모델링하는데 사용되었다. 1.0 mm에서 2.0 mm 사이의 변위 결과가 표시됩니다. (C)1.5 mm의 플래튼 변위를 위해 PDMS 멤브레인상에 유도된 모델링된 스트레인 그라데이션의 열맵(D)1.5 mm 플라톤 변위를 이용하여 연화된 약물 유도 골혈구의 젖산 탈수소효소 얼룩의 전형적인 결과. 더 가벼운 세포 염색은 세포 손상 및/또는 사망을 나타내는 더 높은 변형 값의 위치에 해당하는 우물의 바깥 쪽 가장자리 근처에서 관찰됩니다. (e)부속서 V 및 죽은 세포 분석으로 표시된 부하 유도 세포사멸의 대표적인 유동 세포 분석 결과. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
보조 그림 1: 탈착식 벽이 있는 3D 인쇄 레벨링 상자. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
보조 파일 1: 수평 상자 CAD 파일 1. 이 파일을 보려면 여기를 클릭하십시오 (다운로드 오른쪽 버튼을 클릭하십시오).
보조 파일 2: 수평 상자 CAD 파일 2. 이 파일을 보려면 여기를 클릭하십시오 (다운로드 오른쪽 버튼을 클릭하십시오).
보조 파일 3: 수평 상자 CAD 파일 3. 이 파일을 보려면 여기를 클릭하십시오 (다운로드 오른쪽 버튼을 클릭하십시오).
보충 파일 4: 평준화 상자 하드웨어 목록입니다. 이 파일을 보려면 여기를 클릭하십시오 (다운로드 오른쪽 버튼을 클릭하십시오).
보조 비디오 1: 기계적 로딩 장치. 이 파일을 보려면 여기를 클릭하십시오 (다운로드 오른쪽 버튼을 클릭하십시오).
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Discussion
이 기사에서는 골혈구, 파골세포 및 조골 세포배양용 뼈 리모델링 LOC 플랫폼을 제작하기 위한 기초를 설명합니다. 칩 내의 우물의 깊이와 크기를 변경함으로써, 기계적 하중으로 골혈구를 자극하고 뼈 리모델링의 기능적 결과를 정량화하기 위한 여러 구성이 개발되었습니다(그림1B).
칩 조립 중에 플라즈마 산화 프로토콜을 최적화하는 것은 누출 문제를 제거하는 데 매우 중요합니다. 우리는 PDMS 표면을 중간 RF 전력 설정(단계 4.1)을 사용하여 생성된 30초의 산소 플라즈마에 노출시키는 것이 약 10.2W에 해당하며, 층 들 사이의 강한 결합을 만들기에 충분하다는 것을 발견했습니다. 더 긴 노출 시간 또는 더 높은 RF 전력 설정을 사용할 때 본드의 무결성이 감소했습니다. 이는 산소 플라즈마에 대한 PDMS의 과다 노출이 표면 거칠기를 증가시키고 접착력 감소(17,,18)를지적한 이전 보고서와 일치한다.
추가적으로, 높은 세포 생존율 및 전형적인 세포 형태를 유지하는 것은 PDMS 경화 과정에 비판적으로 의존되었다. PDMS 폴리머는 가교 디메틸실록산 올리고머로 구성된다. 이 가교 과정은 시간과 온도에 따라 다릅니다. 그러나, 광범위한 경화에도 불구하고 중합체는완전히 중합되지 못한다 19. 나머지 올리고머는 벌크 중합체에서 주변 세포 배양 배지로 침출되는 것으로 나타났으며 심지어 중합체표면(20)에서성장한 세포의 막에서도 발견되었다. 몇몇 단은 비 가교 PDMS 올리고머21,,22,,23에서세포 독성 효력을 보고했습니다. 시스템에서 이러한 문제를 해결하기 위해 PDMS 경화 프로세스를 최적화했습니다. PDMS의 경화 속도는 온도에 따라 다르지만 칩 마스크의 재료 특성은 경화 온도를 45 °C로 제한했습니다. 따라서, 우리는 칩이 최소 18 시간 동안 구워야한다고 결정했습니다. 또한, 세포 시종(단계 4.9)에 앞서 dH2O를 함유한 칩을 세포 독성 효과를 감소시키기 위해 필요하다는 것을 발견하였다. 도 5A는 이러한 배양 기간 유무에 관계없이 칩에서 배양된 MLO-Y4 골혈구를 나타낸다.
기계적 부하 애플리케이션을 수용하도록 설계된 딥 웰 구성은 칩을 세 개의 개별 층으로 제작해야 합니다. 얕은 웰 구성과 는 달리, 깊은 웰 구성을 위한 단일 조각으로 웰 및 멤브레인 부분을 제조하는 것은 멤브레인을 뒤틀게 하였다. 이는 칩의 두껍고 얇은 부분 사이의 경화 속도의 차이 때문일 수 있다. 이러한 문제점을 극복하기 위해, 멤브레인 층을 별도로 시공하고 경화 공정에 따라 칩의 바닥에 접착하였다. 균일한 두께의 별도의 멤브레인 층을 생성하려면 PDMS를 추가하기 전에 레벨링 박스가 완전히 수평화되는 것이 중요합니다(단계 1.4). 따라서 높은 정확도를 보장하기 위해 디지털 각도기를 사용하는 것이 좋습니다. 또한 2.3.2단계에서는 플라스틱 컵에서 가능한 한 많은 PDMS를 제거하는 것이 중요합니다. 이 단계의 불일치는 막 두께의 높은 편차로 이어질 것이며, 궁극적으로 골혈구 메카노트랜스덕션을 유도하는 데 사용되는 평균 기질 변형에서 높은 편차가 발생할 것이다.
우리의 뼈 리모델링 플랫폼은 높은 수준의 다기능성을 제공합니다. 이 시스템은 부하 유도 된 메카노 트랜스 듀션, 다세포 신호, 염증 또는 약물 효과와 같은 뼈 리모델링을 조절하는 다양한 요인을 조사하는 데 사용할 수 있습니다. 예를 들어, 시스템은 약물 유도환경(14)에서뼈 리모델링에 대한 기계적 하중 및 염증의 결합된 효과를 분석하는데 사용되었다. 기계적 하중은 비스포스포네이트 처리골세포에 적용하였다. 조절된 배지의 단백질 분석은 렙틴 및 오스테오넥틴의 수치가 크게 증가하고 기계적으로 로드되지 않은 골세포와 비교했을 때 CCL21 및 CD36의 수준에서 현저한 감소를 나타났다14.
여기에 제시된 프로토콜은 LOC 내의 각 세포 유형을 배양하기 위한 토대뿐만 아니라 기계적 부하를 유도하고 기능적 활성을 정량화하는 방법을 제공합니다. 앞으로, 우리는 진정한 뼈 장기 -에 칩을 향해 노력하고 있습니다. 또한, 우리는 수학 모델링 시스템을 개발하기 위해 우리의 시스템을 사용하여 크게 뼈 리모델링 을 조절 하는 복잡 한 다세포 신호 프로세스에 대 한 우리의 이해를 향상 시킬 수 있다고 생각24,,25.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없다.
Acknowledgments
이 작품은 그랜트 Nos. (CBET 1060990 및 EBMS 1700299)에서 국립 과학 재단에 의해 지원되었다. 또한, 이 자료는 그랜트 번호 (2018250692)에 따라 국립 과학 재단 대학원 연구 펠로우십 프로그램에 의해 지원 되는 작업을 기반으로합니다. 이 자료에 표현 된 의견, 결과, 결론 또는 권장 사항은 저자의 의견이며 반드시 국립 과학 재단의 견해를 반영하지는 않습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acrylic sheet | Optix | -- | 3.175 mm thick |
| Angled dispensing tips | Jensen Global | JG18-0.5X-90 | Remove plastic connector prior to use |
| Biopsy punch | Robbins Instruments | RBP-10 | 1 mm diameter |
| Bone wafers | Boneslices.com | 0.4 mm thick | Bovine cortical bone |
| Bovine calf serum | Hyclone | SH30072 | |
| Calipers | Global Industrial | T9F534164 | |
| Cell spatula | TPP | 99010 | |
| Chip mask | ProtoLabs | Custom-designed | Print material: Accura SL 5530 |
| Cork borer | Fisher Scientific | 07-865-10B | |
| Cotton tipped applicator | Puritan | 806-WCL | |
| Culture dish (100 mm) | Corning | 430591 | Sterile, Non-tissue culture treated |
| Culture dish (150 mm) | Corning | 430597 | Sterile, Non-tissue culture treated |
| Double sided tape | 3M Company | Scotch 237 | |
| Fetal bovine serum | Hyclone | SH30910 | |
| Forceps | Fisher Scientific | 22-327379 | |
| Leveling box | Custom-made | -- | 3D printed |
| Masking tape | 3M Company | Scoth 2600 | |
| MC3T3-E1 preosteoblasts | ATCC | CRL-2593 | Subclone 4 |
| Mechanical loading device | Custom-made | -- | 3D printed |
| Minimum essential alpha medium | Gibco | 12571-063 | |
| MLO-Y4 osteocytes | -- | -- | Gift from Dr. Lynda Bonewald |
| Packaging tape | Duck Brand | -- | Standard packaging tape |
| Paraffin film | Bemis Parafilm | PM999 | |
| Penicillin/streptomycin | Invitrogen | p4333 | |
| Plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC-001 | Expanded plasma cleaner |
| Polydimethylsiloxane kit | Dow Corning | Sylgard 184 | |
| Polystyrene coverslips | Nunc Thermanox | 174942 | Sterile, tissue culture treated |
| Oven | Quincy Lab | 12-180 | |
| RAW264.7 preosteoclasts | ATCC | TIB-71 | |
| Scalpel | BD Medical | 372611 | |
| Silicone tubing | Saint-Gobain Tygon | ABW00001 | ID: 1/32" (0.79 mm), OD: 3/32" (2.38 mm) |
| SolidWorks software | Dassault Systèmes | -- | Used to generate 3D printed models and perform FEA |
| Spray adhesive | Loctite | 2323879 | Multi-purpose adhesive |
| Syringe (5 ml) | BD Medical | 309646 | Sterile |
| Syringe pump | Harvard Apparatus | 70-2213 | Pump 11 Pico Plus |
| Tapered laboratory spatula | Fisher Scientific | 21-401-10 | |
| Two-part expoxy | Loctite | 1395391 | 5 minute quick set |
| Type I collagen | Corning | 354236 | Rat tail collagen |
| Vacuum desiccator | Bel-Art | F42010-0000 | |
| Waterproof sealant | Gorilla | 8090001 | 100% silicone sealant |
References
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