Summary
Hier stellen wir Protokolle zur Analyse der Knochenumgestaltung innerhalb einer Lab-on-a-Chip-Plattform vor. Eine 3D-gedruckte mechanische Ladevorrichtung kann mit der Plattform gekoppelt werden, um osteozyte Mechanostransduktion durch Verformung der zellulären Matrix zu induzieren. Die Plattform kann auch verwendet werden, um Knochen-Remodeling funktionelle Ergebnisse von Osteoklasten und Osteoblasten (Resorption/Bildung) zu quantifizieren.
Abstract
Knochenumbau ist ein streng regulierter Prozess, der für das Skelettwachstum und die Reparatur sowie die Anpassung an Veränderungen in der mechanischen Umgebung erforderlich ist. Dabei regulieren mechanosensitive Osteozyten die gegensätzlichen Reaktionen zwischen den katabolen Osteoklasten und anabolen Osteoblasten. Um die hochkomplizierten Signalwege, die diesen Prozess regulieren, besser zu verstehen, hat unser Labor eine grundlegende Lab-on-a-Chip (LOC)-Plattform entwickelt, um funktionelle Ergebnisse (Bildung und Resorption) des Knochenumbaus innerhalb eines kleinen Systems zu analysieren. Da der Knochenumbau ein langwieriger Prozess ist, der in der Größenordnung von Wochen bis Monaten stattfindet, haben wir langfristige Zellkultivierungsprotokolle innerhalb des Systems entwickelt. Osteoblasten und Osteoklasten wurden auf funktionellen Aktivitätssubstraten innerhalb des LOC angebaut und bis zu sieben Wochen lang gewartet. Danach wurden Späne demontiert, um die Quantifizierung der Knochenbildung und Resorption zu ermöglichen. Darüber hinaus haben wir ein 3D-gedrucktes mechanisches Ladegerät entwickelt, das mit der LOC-Plattform koppelt und verwendet werden kann, um osteozyte Mechanotransduktion durch Verformung der Zellmatrix zu induzieren. Wir haben die Zellkultivierungsprotokolle für Osteozyten, Osteoblasten und Osteoklasten innerhalb der LOC-Plattform optimiert und Bedenken der Sterilität und Zytotoxizität angesprochen. Hier stellen wir die Protokolle zur Herstellung und Sterilisation des LOC, zum Säen von Zellen auf funktionalen Substraten, zur Induzieren mechanischer Belastung und zur Demontage des LOC zur Quantifizierung der Endpunktergebnisse vor. Wir glauben, dass diese Techniken den Grundstein für die Entwicklung eines echten Organ-on-a-Chip für den Knochenumbau legen.
Introduction
Knochen ist ein hochdynamisches Gewebe, das eine komplizierte Koordination zwischen den drei Hauptzelltypen erfordert: Osteozyten, Osteoblasten und Osteoklasten. Multizelluläre Wechselwirkungen zwischen diesen Zellen sind verantwortlich für den Knochenverlust, der während der Lähmung und der langfristigen Unbeweglichkeit auftritt, und für die Knochenbildung, die als Reaktion auf Wachstum und Bewegung auftritt. Osteozyten, der am häufigsten vorkommende Knochenzelltyp, sind hochempfindlich gegenüber mechanischen Reizen, die auf den Knochen aufgetragen werden. Mechanische Stimulation verändert Osteozyten metabolische Aktivität und führt zu einer Erhöhung der wichtigsten Signalmoleküle1,2. Durch diesen Prozess, der als Mechanotransduktion bekannt ist, können Osteozyten die Aktivitäten von Osteoblasten (Knochenbildenden Zellen) und Osteoklasten (Knochenresorbing-Zellen) direkt koordinieren. Die Aufrechterhaltung der Knochenhomöostase erfordert eine strenge Regulierung zwischen Knochenbildung und Knochenresorptionsraten; Störungen in diesem Prozess können jedoch zu Krankheitszuständen wie Osteoporose oder Osteoporose führen.
Die Komplexität der Wechselwirkungen zwischen diesen drei Zelltypen eignet sich gut für die Untersuchung unter Verwendung von mikrofluidischen und Lab-on-a-Chip (LOC)-Technologien. Zu diesem Zweck hat unser Labor vor kurzem den Proof of Concept einer LOC-Plattform zur Analyse der Knochenresorption und -bildung (funktionelle Ergebnisse) im Knochenumbauprozess etabliert. Die Plattform kann für die Untersuchung von zellulären Wechselwirkungen, veränderten Belastungsumgebungen und Prüfmedikamenten-Screening verwendet werden. In den letzten Jahren wurden verschiedene mikrofluidische Geräte entwickelt, um die molekularen Signalwege zu untersuchen, die den Knochenumbau regulieren; Viele dieser Systeme quantifizieren jedoch die Umgestaltung durch indirekte Marker, die auf eine funktionale Aktivität hinweisen3,4,5,6,7. Ein Vorteil unseres Systems ist, dass es für die direkte Quantifizierung von funktionellen Ergebnissen verwendet werden kann. Der Bone-Umbau ist ein langfristiger Prozess. Daher erfordert die direkte Quantifizierung der Knochenresorption und -bildung ein Kultivierungssystem, das für mindestens mehrere Wochen bis Monate8,,9,10,11aufrechterhalten werden kann. So haben wir bei der Entwicklung der LOC-Plattform langfristige Kultivierungsprotokolle erstellt, die für die Bildung und Resorption notwendig sind, und haben Zellen innerhalb des Systems für bis zu sieben Wochen11gepflegt. Zusätzlich haben wir geeignete Kultiumsubstrate für beide Zelltypen in die Plattform integriert; Osteoklasten wurden direkt am Knochen kultiviert, und Osteoblasten, die als plastische Anhänger bekannt sind, wurden auf Polystyrol-Scheiben kultiviert. Darüber hinaus haben wir Fragen in Bezug auf Sterilität, langfristige Zytotoxizität und Spandemontage für die Remodeling-Analyse11,12behandelt.
Die LOC-Plattform kann auch verwendet werden, um Osteozyten-Mechanotransduktion durch Matrixverformung zu induzieren. Eine 3D-gedruckte mechanische Ladevorrichtung wurde entwickelt, um mit dem LOC zu koppeln und eine statische aus der Ebene Distention anzuwenden, um die Zellen zu dehnen13. Um dieser mechanischen Belastung gerecht zu werden, wurde die Tiefe des Brunnens innerhalb des LOC erhöht. Diese kleine, einfache mechanische Ladevorrichtung kann leicht von Laboren mit begrenzter Engineering-Erfahrung hergestellt werden, und wir haben zuvor Zeichnungen der 3D-gedruckten Komponenten13geteilt. In der aktuellen Arbeit zeigen wir einige der neuartigen Techniken, die für den erfolgreichen Einsatz des LOC notwendig sind. Insbesondere zeigen wir Spanfertigung, Zellsaat auf funktionalen Substraten, mechanische Beladung und Spandemontage für die Remodellierung der Quantifizierung. Wir glauben, dass die Erklärung dieser Techniken von einem visuellen Format profitiert.
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Protocol
1. Chipmaskenvorbereitung
HINWEIS: Die Schritte 1.1 - 1.3 müssen nur einmal nach dem ersten Empfang der Chipmaske durchgeführt werden. Sie stellen sicher, dass sich die Maske während des Gebrauchs nicht verbeugt. Das Design der mikrofluidischen Masken wurde zuvor beschrieben11,14. Masken wurden im eigenen Haus entworfen und mit hochauflösender Stereolithographie kommerziell hergestellt (Abbildung 1A).
- Bedecken Sie die Oberseite der Maske mit Kunststofffolien, um diese Oberfläche vor Klebstoff zu schützen. Befestigen Sie die Spanmaske mit Sprühkleber auf einer gleich großen Acrylfolie. Klemmen Sie die Stücke über Nacht zusammen, damit der Klebstoff vollständig aushärten kann. Nachdem der Klebstoff trocken ist, entfernen Sie die Kunststofffolie von der Oberseite der Maske.
- Befestigen Sie die Unterseite des Acrylblatts mit doppelseitigem Klebeband an einem 3D-gedruckten Navellierungsfeld (Zusatzabbildung 1, Ergänzungsdateien 1-4). Drücken Sie fest, um eine enge Bindung zu gewährleisten.
- Versiegeln Sie alle kleinen Öffnungen in der Nähe der abnehmbaren Wand der Nättsbox mit einem wasserdichten Dichtmittel. Lassen Sie das Dichtmittel für 24 h aushärten.
- Reinigen Sie die Oberfläche der Maske mit 70% Ethanol (EtOH). Legen Sie die Naderbox mit der gewünschten Spanmaske in den Ofen. Verwenden Sie einen digitalen Winkelmesser, um sicherzustellen, dass die Oberseite der Maske eben ist. Stellen Sie bei Bedarf die Ntellschrauben ein.
2. PDMS-Fertigung
HINWEIS: Für funktionelle Aktivitätstests (Bildung und Resorption) wird ein Flachbrunnen(1mm) Chipdesign verwendet, und für mechanische Belastungsstudien wird ein Tiefbrunnen (10 mm) verwendet. Der Boden des Tiefbrunnens wird durch Anbringen einer separaten dünnen PDMS-Membran gebildet (Abbildung 1B).
- Deckelschicht (Schicht 1)
- Kombinieren Sie 63 g PDMS-Prepolymer und 6,3 g Aushärtungsmittel (10:1-Verhältnis) in einer Kunststofftasse. Mit einem Einweg-Zellspachtel und Degas in einem Vakuum-Austrocknungsor für 30 min gründlich mischen.
- Langsam Mischung in die vorbereitete Nättchenkiste gießen. Lassen Sie das PDMS 30 min sitzen und dann bei 45 °C für 18 h backen.
- Lösen Sie die Ränder des PDMS mit einem verjüngten Laborspachtel und entfernen Sie das Polymerblech aus dem Navellierungskasten.
- Schneiden Sie einzelne Deckel mit einem Skalpell und einer 3D-gedruckten Schablone auf die Größe (70 mm x 34 mm).
- Stanzlöcher durch jeden Deckel mit einem Biopsiesstempel (1 mm Durchmesser).
- Oberfläche reinigen Sie die Deckel mit Verpackungsband.
HINWEIS: Wenn die Deckel nicht sofort verwendet werden, wickeln Sie sie jeweils in Verpackungsband und lagern Sie sie bei Raumtemperatur (RT).
- Brunnen- und Mikrokanalschicht (Layer 2)
- Kombinieren Sie das PDMS-Prepolymer und das Härtungsmittel (10:1-Verhältnis) in einem Kunststoffbecher. Das Flachgut-Design erfordert 43 g Prepolymer und 4,3 g Härtungsmittel, und das Tiefbrunnen-Design erfordert 227 g Prepolymer und 22,7 g Härtungsmittel. Mischen Sie das Polymer kräftig und entgasen für 30 min.
HINWEIS: Hierbei wird eine Maskenabmessung von 152,4 mm x 152,4 mm angenommen. - Langsam Mischung über geeignete vorlevelierte Maske gießen. Lassen Sie das PDMS 30 min sitzen und dann bei 45 °C für 18 h backen.
- Lösen Sie die Ränder des PDMS mit einem verjüngten Laborspachtel und schälen Sie das Polymer vorsichtig von der Maske ab. Verwenden Sie ein Skalpell und eine 3D-gedruckte Vorlage, um einzelne Chips auszuschneiden.
HINWEIS: Für Ladestudien ist es wichtig, dass die Chipabmessungen (70 x 34 mm) präzise sind und dass sich der Brunnen in der Mitte des Chips befindet. - Oberfläche reinigen Sie das PDMS mit Verpackungsband.
HINWEIS: Wenn die Chips nicht sofort verwendet werden, wickeln Sie jeden Chip in Verpackungsband und lagern Sie ihn bei RT.
- Kombinieren Sie das PDMS-Prepolymer und das Härtungsmittel (10:1-Verhältnis) in einem Kunststoffbecher. Das Flachgut-Design erfordert 43 g Prepolymer und 4,3 g Härtungsmittel, und das Tiefbrunnen-Design erfordert 227 g Prepolymer und 22,7 g Härtungsmittel. Mischen Sie das Polymer kräftig und entgasen für 30 min.
- Dünne PDMS-Membran (Schicht 3)
HINWEIS: Diese Ebene wird nur für das Tiefbrunnendesign verwendet.- 12,7 g PDMS-Prepolymer und 1,3 g Aushärtungsmittel (10:1-Verhältnis) zu einer Kunststofftasse geben. Kräftig mischen und 30 min entgasen.
- Gießen Sie langsam Polymer in vorbereitete Nweiterbox und gründlich kratzen Kunststoff-Becher, um so viel PDMS wie möglich zu entfernen.
- Verwenden Sie Zellspachtel, um PDMS über die gesamte Oberfläche zu verteilen.
HINWEIS: Wenn das Polymer nicht manuell verteilt ist, reicht die Oberflächenspannung aus, um zu verhindern, dass das Polymer ein einheitliches Blatt bildet. - Lassen Sie das PDMS 30 min sitzen und dann bei 45 °C für 18 h backen.
- Lösen Sie die Ränder des PDMS mit einem verjüngten Spachtel und entfernen Sie das PDMS-Blatt vorsichtig aus dem Naderfeld. Schneiden Sie einzelne Membranen, die den Abmessungen von Schicht 2 entsprechen.
- Messen Sie die Membrandicke in der Mitte der Membran mit Bremssätteln. Entsorgen Sie alle Membranen, die außerhalb der gewünschten Dicke liegen (0,5 mm x 0,1 mm).
- Reinigen Sie die Membranen sorgfältig mit Verpackungsband und legen Sie sie auf ein Stück Paraffinfolie.
HINWEIS: Wenn die Membranen nicht sofort verwendet werden, bedecken Sie die Oberseite der Membran mit Verpackungsband und lagern Sie bei RT.
3. Funktionelle Aktivität Substrate
HINWEIS: Polystyrol-Scheiben und Knochenwafer müssen am Boden von Brunnen befestigt werden, die für Osteoblasten bzw. Osteoklastkulturen verwendet werden.
- Polystyrol-Scheiben (Abbildung 1C)
- Legen Sie Klebeband auf der Rückseite eines Gewebekultur behandelt Polystyrol-Abdeckung. Mit einem geschärften Korkbohrer (5,4 mm Durchmesser) die kreisförmigen Scheiben aus dem Deckelschlupf schneiden. Die Scheiben in 70% EtOH untertauchen und über Nacht verlassen.
- Schrubben Sie vorsichtig die Oberseite der Scheibe mit einem Baumwolle gekippt Applikator in 70% EtOH getränkt. Stellen Sie sicher, dass die äußere Kante der Scheibe gründlich gereinigt wird.
- Halten Sie die Disc mit zwei Zangenpaaren fest und entfernen Sie die Abspielbandunterlage. Legen Sie die behandelte Scheibe seitlich nach unten und reinigen Sie die Rückseite mit einem mit Baumwolle gekippten Applikator.
- Tauchen Sie das hölzerne Ende eines baumwollgekippten Applikators in eine entgaste Mischung aus ungehärtetem PDMS und legen Sie eine kleine Menge des Polymers auf den Boden des gewünschten Brunnens.
HINWEIS: Das ungehärtete PDMS kann bei -20 °C gelagert werden. - Legen Sie die Polystyrolscheibe, seitlich nach oben behandelt, in den Brunnen und drücken Sie vorsichtig auf die Scheibe mit einem Wattestäbchen. Stellen Sie sicher, dass kein ungehärtetes PDMS mit der behandelten Seite der Disc in Kontakt kommt.
HINWEIS: Wenn PDMS mit der behandelten Oberfläche der Disc in Kontakt kommt, entfernen Sie die Disc aus dem Brunnen und wiederholen Sie die Schritte 3.1.4 und 3.1.5 mit einer neuen Disc. - Lassen Sie den Chip 30 min auf einer ebenen Oberfläche sitzen und dann bei 65 °C 4 h backen.
- Knochenwafer
- Verwenden Sie Zangen, um einen Knochenwafer (6 mm Durchmesser, 0,4 mm dick) auf den Boden einer 100 mm Schale zu legen. Halten Sie den Wafer mit den Zangen stabil und ätzen Sie vorsichtig ein "X" auf der Rückseite des Wafers mit einem Skalpell.
HINWEIS: Während des Bildgebungsprozesses wird das "X" verwendet, um zwischen der Rückseite des Wafers und der Oberfläche zu unterscheiden, auf der Zellen gesät wurden. - Verwenden Sie das hölzerne Ende eines Baumwoll-Applikators, um eine kleine Menge ungehärteten PDMS an den Boden des gewünschten Brunnens hinzuzufügen. Legen Sie den seitlich markierten Knochenwafer in den Brunnen und drücken Sie den Wafer mit einem mit Baumwolle gekippten Applikator nach unten.
- Lassen Sie den Chip 30 min auf einer ebenen Oberfläche sitzen und dann bei 65 °C 4 h backen.
- Verwenden Sie Zangen, um einen Knochenwafer (6 mm Durchmesser, 0,4 mm dick) auf den Boden einer 100 mm Schale zu legen. Halten Sie den Wafer mit den Zangen stabil und ätzen Sie vorsichtig ein "X" auf der Rückseite des Wafers mit einem Skalpell.
4. Spanmontage und Sterilisation
- Aktivieren Sie die Oberflächen von Schicht 1 und Schicht 2 mit einem Plasmareiniger für 30 s mit einer mittleren Hochfrequenzeinstellung (RF) (entspricht ca. 10,2 W).
- Richten Sie die Zugangslöcher in Schicht 1 mit den Mikrokanälen in Schicht 2 aus und drücken Sie die beiden Schichten fest zusammen.
- Wiederholen Sie für das Tiefbrunnendesign Schritt 4.1 mit Schicht 2 und Schicht 3. Verwenden Sie während der Plasmabehandlung doppelseitiges Klebeband, um den Paraffinfilm der Schicht 3 an einer ebenen Oberfläche zu befestigen.
- Verwenden Sie ein Skalpell, um überschüssiges Material von der PDMS-Membran abzuschneiden. Das Blatt Paraffinfolie vorsichtig von der Unterseite des Chips abziehen
- Backen Sie den Chip bei 65 °C für 10 min, um die Bindungsfestigkeit zwischen den PDMS-Schichten zu erhöhen.
- Angled Dosierspitzen (18 Gauge, 0.5 in, 90°) in die Zugangslöcher im Deckel einlegen. Sichern Sie die Dosierspitzen mit einem zweiteiligen Epoxid am Deckel. Verwenden Sie eine Mikropipette-Spitze, um das Epoxid um jede Dosierspitze aufzutragen.
- Nachdem das Epoxid vollständig ausgehärtet ist, reinigen Sie den Chip mit 70% EtOH und legen Sie ihn in einen Biosicherheitsschrank. Führen Sie alle nachfolgenden Schritte innerhalb des Biosicherheitsschranks aus.
- Schließen Sie eine 5 ml Spritze mit sterilen Silikonschläuchen (1/32'' ID, 10 cm Länge) an die Dosierspitzen an und füllen Sie den gesamten Chip mit 70% EtOH für mindestens 30 s. Für die Flachgut-Konstruktion alle Flüssigkeiten mit einer Spritzenpumpe auf einen Durchfluss von 4 ml/h abstellen. Für das Tiefbrunnen-Design alle Flüssigkeiten verabreichen, indem Sie die Spritze langsam von Hand abgeben.
- Entfernen Sie den EtOH vom Chip und sterilisieren Sie den Chip über Nacht mit UV-Licht.
- Waschen Sie den Chip 3 mal mit dH2O. Füllen Sie den Chip mit dH2O, entfernen Sie Schläuche von den Dosierspitzen und brüten sie mindestens 48 h bei 37 °C.
5. Mechanische Ladevorrichtungsbaugruppe
HINWEIS: Die Konstruktions- und Fertigungsprozesse für die 3D-gedruckte mechanische Ladevorrichtung (Abbildung 2A-C) wurden zuvor beschrieben, und alle Konstruktionsdateien für gedruckte Komponenten wurden zuvor bereitgestellt13.
- Alle Komponenten der Ladevorrichtung für 30 min bei 121 °C autoklavieren.
HINWEIS: Um eine Verformung von bedruckten Bauteilen zu vermeiden, wickeln Sie jedes Stück einzeln in Folie und legen Sie es während des Autoklaviervorgangs auf eine harte, flache Oberfläche. Metallhardware kann zusammengewickelt werden. Führen Sie alle nachfolgenden Schritte in einem Biosicherheitsschrank aus. - Legen Sie eine Kompressionsfeder um die Welle der Platte und setzen Sie die Platte in das zentrale Loch auf der Unterseite der Basis(Abbildung 2D).
- Befestigen Sie den Zifferblattblock mit vier selbstschneidenden Schrauben an der Unterseite der Basis.
- Legen Sie eine zweite Kompressionsfeder um die Mittelschraube. Setzen Sie die Schraube in die sechseckige Bohrung in der Unterseite des Zifferblatts ein und schrauben Sie die Baugruppe in die Gewindebohrung in der Mitte des Zifferblattblocks.
- Schrauben Sie vier männlich-weibliche Aussen in den Boden der Basis.
- Entfernen Sie die Pufferzeit vom Gerät, indem Sie das Zifferblatt gegen den Uhrzeigersinn drehen, bis sich die Oberseite der Platte unter der Oberseite der Basis befindet. Drehen Sie dann langsam das Zifferblatt im Uhrzeigersinn, bis die Oberseite der Platte mit der Oberseite der Basis eben ist.
6. Experimentieren
HINWEIS: Protokolle für funktionelle Aktivitätsexperimente wurden zuvor bereitgestellt11,12.
- Ladestudien (Abbildung 3)
- Verwenden Sie nach Schritt 4.9 eine 5 ml Spritze, um dH2O aus dem Tiefbrunnenchip zu entfernen. Beschichten Sie den Boden des Brunnens mit 200 l 0,15 mg/ml Kollagen Typ I (CTI) in 0,02 M Essigsäure für 1 h.
- Spülen Sie den Chip dreimal mit Dulbeccos phosphatgepufferter Saline mit Kalzium und Magnesium (DPBS++).
- Legen Sie Den Chiphalter und den Samen mit MLO-Y4-Osteozyten mit einer Dichte von 2 x 104 Zellen/ml in einem minimal entiellen Alphamedium (MEM) ein, ergänzt mit 5% Kalbsserum, 5% fetalem Rinderserum und 1% Penicillin/Streptomycin.
- Entfernen Sie die Schläuche von den Dosierspitzen und legen Sie den Chip in eine Tiefbrunnen-Kulturschale (150 mm x 25 mm). Inkubieren Sie Zellen bei 37 °C und 5%CO2 für 72 h.
- Befestigen Sie sterile Schläuche an Dosierspitzen und verwenden Sie eine 5 ml Spritze, um verbrauchtes Kulturmedium vom Chip zu entfernen. Langsam in frischem Kulturmedium abgeben, um den Chip nachzufüllen.
- Platzieren Sie den Spanhalter in den rechteckigen Einset auf der Oberseite der Ladevorrichtungsbasis. Führen Sie die Schläuche durch die Schlitze auf dem Ladevorrichtungsdeckel und befestigen Sie den Deckel mit vier Schwenkkopfschrauben und Sechskantmuttern an der Basis.
HINWEIS: Um sicherzustellen, dass der Deckel eben bleibt, befestigen Sie zunächst zwei Schrauben, die diagonal voneinander entfernt sind, bevor Sie die verbleibenden beiden Schrauben sichern. - Tragen Sie die Last auf die Zellen auf, indem Sie das Zifferblatt im Uhrzeigersinn drehen, bis die gewünschte Plattenverschiebung erreicht ist.
HINWEIS: Das Gerät ist so ausgelegt, dass eine Drehung des Zifferblatts einer Plattenverschiebung von 1 mm entspricht. Das auf der Oberseite der PDMS-Membran erzeugte Dehnungsfeld wurde zuvor als Funktion der Plattenverschiebung mittels Finite-Elemente-Analyse (FEA)13modelliert. - Legen Sie das Ladegerät in eine leere P1000 Micropipette-Spitzenbox. Inkubieren Sie die Zellen mit der angewendeten Last für 15 min.
HINWEIS: Die hier verwendete Ladezeit dient als Beispiel. Es können alternative Ladezeiten verwendet werden. - Entfernen Sie nach der Inkubation die Last aus den Zellen, indem Sie das Zifferblatt gegen den Uhrzeigersinn drehen, bis die Platte in die ursprüngliche Startposition zurückkehrt. Entfernen Sie den Deckel vom Gerät und legen Sie den Spanhalter in die Tiefbrunnen-Kulturplatte. Inkubieren Sie die Zellen für eine 90-min-Nachladeerholungsphase.
HINWEIS: Auch hier dient der hier verwendete Erholungszeitraum als Beispiel. Alternative Wiederherstellungszeiten können verwendet werden. Für Langzeitstudien, Futterzellen alle 72 h. - Verwenden Sie eine 5 ml Spritze, um das konditionierte Medium vom Chip zu entfernen.
HINWEIS: Dieses Medium kann bei -80 °C gespeichert und gespeichert werden. - Entfernen Sie den Chip aus dem Chiphalter und verwenden Sie einen verjüngten Spachtel, um die Bindung zwischen dem PDMS-Deckel und der Well-Schicht zu brechen.
HINWEIS: Zelluläre Assays können nun nach jedem Protokoll durchgeführt werden, das für eine Zellkulturplatte eingerichtet wurde.
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Representative Results
Die Flachgutkonfiguration kann zur Analyse der funktionellen Aktivität von Osteoblasten und Osteoklasten verwendet werden. Die Knochenbildung über Osteoblasten und die Resorption über Osteoklasten erfordert Kultivierungszeiten in der Größenordnung von mehreren Wochen bis Monaten. Die Knochenbildung aus MC3T3-E1-Präosteoblasten wurde mit Alizarinrot und von Kossa-Färbungen11,15quantifiziert. An Tag 49 betrug die durchschnittliche, mit Alizarinrot gefärbte Oberfläche 10,7 % bis 2,2 % (mittlere Standardfehler des Mittelwerts)11. Die durchschnittliche Fläche, die mit von Kossa gefärbt wurde, betrug 6,4 % bis 1,6 %11. Abbildung 4A zeigt typische Formationsergebnisse aus Osteoblastenkulturen an Tag 49, gefärbt mit Alizarinrot und von Kossa. Die Knochenresorption von RAW264.7-Präosteoklasten wurde mit Toluidin blau erbeinen 11,15quantifiziert. An Tag 30 betrug die durchschnittliche, mit Toluidinblau gefärbte Oberfläche 30,4 % bis 4,5 %11. Abbildung 4B zeigt typische Knochenresorptionsergebnisse von Osteoklastkulturen, die an Tag 30 mit Toluidinblau gefärbt sind. Rasterelektronenmikroskopie wurde durchgeführt, um das Vorhandensein von Resorptionsgruben zu überprüfen. Typische Ergebnisse sind in Abbildung 4Cdargestellt. Diese Ergebnisse zeigen, dass Zellen innerhalb des Geräts mindestens sieben Wochen lang lebensfähig und funktionell aktiv bleiben.
Ein 3D-gedrucktes Ladegerät wurde entwickelt und hergestellt, um die Tiefbrunnen-Chipkonfiguration zu ermöglichen. Zusammen kann dieses System osteozytierte Mechanotransduktion induzieren, indem es die Zellen über eine statische Ausdehnung der Ebene distention dehnt. Die in Schritt 4.9 beschriebene 48-h-Inkubation des Chips hat sich als kritischer Prozess zur Aufrechterhaltung der Zelllebensfähigkeit und typischen Morphologie erwiesen. Abbildung 5A zeigt repräsentative Bilder von MLO-Y4-Osteozyten bei 72 h, die in Chips mit und ohne diese Inkubationszeit gesät sind. Während der Belastungsanfälle wurden Osteozyten einem Dehnungsgradienten ausgesetzt, der auf der PDMS-Membran induziert wurde, auf dem die Zellen gesät wurden (Ergänzendes Video 1). Die bei diesem Prozess erzeugten äquivalenten Stämme wurden mit FEA13 modelliert und die durchschnittliche Äquivalentdehnung, die auf der Oberseite der PDMS-Membran erzeugt wurde, wurde bestimmt. Abbildung 5B zeigt die Beziehung zwischen der durchschnittlichen äquivalenten Dehnung und der Plattenverschiebung für Werte zwischen 1 und 2 mm. Eine repräsentative Wärmekarte des induzierten Dehnungsgradienten ist in Abbildung 5Cdargestellt. In diesem Beispiel erzeugte eine Plattenverschiebung von 1,5 mm einen durchschnittlichen Äquivalentstamm von 12,29 % auf der Oberseite der Membran. Dieses Modell zeigt auch, dass die in der Nähe der Mitte des Brunnens induzierten Stämme relativ niedrig sind und allmählich radial nach außen zunehmen, wobei maximale Stämme direkt über dem äußeren Rand der Platte erzeugt werden. Nach der Belastung wurde die Zelllebensfähigkeit mit Laktatdehydrogenase-Färbung und dem Annexin V und dem Totzell-Assay14,16analysiert. Typische Ergebnisse sind in Abbildung 5D,Ebzw. dargestellt.
Abbildung 1: Mikrofluidisches Gerät. (A) Herstellung und Nivellierung der Chipmaske. (Links) Schemat der Tiefbrunnen-Chipmaske, die intern mit CAD-Software entwickelt wurde. (Mitte) Bild der Tiefbrunnen-Chipmaske, die mit hochauflösender Stereolithographie kommerziell gedruckt wurde. (Rechts) Die Maske wird in einer 3D-gedruckten Navellierungsbox platziert, um sicherzustellen, dass die Maske während des Gießens von Schicht 2 der Chips eben bleibt. (B) Schematische Skizzen der Flach- und Tiefbrunnenkonstruktionen des Gerätes. (Oben) Das Flachgut-Design wurde zur Analyse der funktionellen Aktivität (Bildung und Resorption) von Osteoblasten und Osteoklasten verwendet. Diese Konfiguration besteht aus zwei PDMS-Schichten. Ein funktionelles Aktivitätssubstrat wurde vor dem Zusammenschließen der Schichten gut am Grund der Kultur befestigt. Polystyrol-Scheiben und Knochenwafer wurden für Osteoblasten bzw. Osteoklastkulturen verwendet. (Unten) Das Tiefbrunnen-Design wurde zum Auftragen mechanischer Belastungen auf Osteozyten verwendet. Diese Konfiguration besteht aus drei PDMS-Schichten. Der Boden der Kultur gut wird durch die verformbare PDMS Membran (Schicht 3) gebildet. (C) Herstellungsschritte für die Polystyrolscheibe, die für Osteoblastkulturen verwendet wird. Die Rückseite eines behandelten Tissuekultur-Coverslips war mit Klebeband markiert. Einzelne Scheiben wurden mit einem Korkbohrer ausgeschnitten. Die Scheibe wurde mit Ethanol und einem Wattestäbchen gereinigt. Die Bandsicherung wurde entfernt und die Disc wurde an der Unterseite der PDMS-Kultur befestigt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Konstruktion und Montage der mechanischen Ladevorrichtung. (A) Bild der montierten mechanischen Ladevorrichtung. In Verbindung mit dem Tiefen-Well-Design des PDMS-Chips dehnt die Ladevorrichtung die Zellen, indem sie eine aus der Ebene distention auf eine verformbare Membran aufwendet. (B) Explosionsansicht des Geräts. Alle blau dargestellten Teile wurden 3D mit einem hitzebeständigen Polymilchsäure-Filament bedruckt. Die gesamte Hardware ist aus Edelstahl. (C) Schraubenhebemechanismus der Ladevorrichtung. Die Drehung der Mittelschraube (orange) schiebt die Platte (grün) durch die Basis nach oben. Die Aufwärtsbewegung der Platte verformt die PDMS-Membran des Tiefbrunnenchips, auf dem die Zellen gesät wurden. (D) Montageprozess der Ladevorrichtung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Mechanisches Belastungsexperiment. Alle Flüssigkeiten wurden mit einer 5 ml Spritze, die mit dem Zugangsschlauch verbunden war, verabreicht und vom Chip entfernt. Ein kritischer Schritt in diesem Prozess ist die 48 h Inkubation mit sterilem destilliertem Wasser vor der Zellaussaat. Ohne diese Inkubationszellen zeigten zellen wenig Lebensfähigkeit und atypische Morphologie. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Typische Ergebnisse der funktionellen Aktivität. (A) Typische Formationsergebnisse mit Alizarinrot (links) und von Kossa (rechts) aus induzierten MC3T3-E1-Osteoblastenkulturen an Tag 49. Ganze Scheibenbilder haben einen Durchmesser von 5,4 mm. (B) Typische Osteoklast-Resorption resultiert aus RAW264.7-Präosteoklasten, die mit Rezeptoraktivator des Kernfaktors Kappa-B Ligand (RANKL) induziert wurden. Die Zellen wurden auf Knochenwafern kultiviert und an Tag 30 mit Toluidinblau befleckt. (C) Typische Rasterelektronenmikroskopiebilder, die das Vorhandensein von Resorptionsgruben auf Knochenwafern überprüfen. Die Maßstabsleiste im oberen Bild stellt 200 m dar und die Maßstabsleiste im unteren Bild stellt 50 m dar. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 5: Auswirkungen einer mechanisch induzierten Belastung von Osteozyten. (A) Bilder von MLO-Y4-Osteozyten bei 72 h im Tiefbrunnenchip, hergestellt mit (links) und ohne (rechts) eine 48 h Inkubation mit destilliertem Wasser vor der Zellaussaat. (B) Die Finite-Elemente-Analyse wurde verwendet, um die durchschnittliche äquivalente Dehnung zu modellieren, die oben auf der verformbaren PDMS-Membran erzeugt wird, basierend auf der Verschiebung der Ladevorrichtung. Gezeigt werden Ergebnisse aus Verschiebungen zwischen 1,0 mm und 2,0 mm. (C) Wärmekarte des modellierten Dehnungsgradienten, der auf der PDMS-Membran für eine Plattenverschiebung von 1,5 mm induziert wurde. (D) Typische Ergebnisse eines Lactat-Dehydrogenase-Fleckens von medikamenteninduzierten Osteozyten, die mit einer 1,5 mm Plattenverschiebung gestreckt wurden. Eine leichtere Zellfärbung wird in der Nähe des äußeren Rands des Brunnens beobachtet, was der Position höherer Dehnungswerte entspricht, die auf Zellschäden und/oder Tod hinweisen. (E) Repräsentative Durchflusszytometrie Ergebnisse der lastinduzierten Apoptose, die durch einen Anhang V und einen Totzelltest angegeben sind. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Ergänzende Abbildung 1: 3D-gedruckte Navellierungsbox mit abnehmbarer Wand. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Ergänzende Datei 1: Abstellfeld CAD-Datei 1. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei anzuzeigen (Rechtsklick zum Herunterladen).
Ergänzende Datei 2: Abstellfeld CAD-Datei 2. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei anzuzeigen (Rechtsklick zum Herunterladen).
Ergänzende Datei 3: Abstellfeld CAD-Datei 3. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei anzuzeigen (Rechtsklick zum Herunterladen).
Ergänzende Datei 4: Leveling Box Hardware-Liste. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei anzuzeigen (Rechtsklick zum Herunterladen).
Ergänzendes Video 1: Mechanische Ladevorrichtung. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei anzuzeigen (Rechtsklick zum Herunterladen).
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Discussion
Dieser Artikel beschreibt die Grundlagen für die Herstellung einer BONE Remodeling LOC Plattform für die Kultivierung von Osteozyten, Osteoklasten und Osteoblasten. Durch die Änderung der Tiefe und Größe des Bohrbrunnens innerhalb des Chips wurden mehrere Konfigurationen entwickelt, um Osteozyten mit mechanischer Belastung zu stimulieren und die funktionellen Ergebnisse des Knochenumbaus zu quantifizieren (Abbildung 1B).
Während der Chipmontage war die Optimierung des Plasmaoxidationsprotokolls entscheidend für die Beseitigung von Leckagenbedenken. Wir fanden heraus, dass die Exposition von PDMS-Oberflächen auf 30 s Sauerstoffplasma, das mit einer mittleren HF-Leistungseinstellung (Schritt 4.1) erzeugt wurde, gleich etwa 10,2 W, ausreichte, um eine starke Bindung zwischen den Schichten herzustellen. Die Integrität der Bindung verringerte sich, wenn längere Belichtungszeiten oder eine höhere HF-Leistungseinstellung verwendet wurden. Dies steht im Einklang mit früheren Berichten, die eine Überbelichtung von PDMS gegenüber Sauerstoffplasma erhöhte Oberflächenrauheit und reduzierte Klebstoffität17,18festgestellt.
Darüber hinaus war die Aufrechterhaltung einer hohen Zelllebensfähigkeit und der typischen Zellmorphologie entscheidend vom PDMS-Härtungsprozess abhängig. Das PDMS-Polymer besteht aus vernetzten Dimethylsiloxan-Oligomeren. Dieser Vernetzungsprozess ist sowohl zeit- als auch temperaturabhängig; jedoch, auch bei extensiver Aushärtung das Polymer nicht vollständig polymerisieren19. Die übrigen Oligomere haben gezeigt, dass sie aus dem Bulk-Polymer in das umgebende Zellkulturmedium auslaugen und sogar in den Membranen von Zellen gefunden wurden, die auf der Polymeroberfläche20angebaut wurden. Mehrere Gruppen haben zytotoxische Wirkungen von nicht vernetzten PDMS-Oligomeren21,22,23berichtet. Um diesem Problem in unserem System zu begegnen, haben wir den PDMS-Härtungsprozess optimiert. Obwohl die Aushärtungsrate für PDMS temperaturabhängig ist, haben die Materialeigenschaften unserer Spanmasken unsere Aushärtungstemperatur auf 45 °C begrenzt. Als solche haben wir festgelegt, dass die Chips für ein Minimum von 18 h gebacken werden sollten. Darüber hinaus haben wir festgestellt, dass das Inkubieren von Chips mit dH2O für mindestens 48 h vor der Zellaussaat (Schritt 4.9) notwendig war, um zytotoxische Wirkungen zu reduzieren. Abbildung 5A zeigt MLO-Y4-Osteozyten, die in Chips mit und ohne diese Inkubationszeit kultiviert werden.
Die Tiefbrunnenkonfiguration, die für die mechanische Lastanwendung entwickelt wurde, erfordert, dass der Chip aus drei separaten Schichten gefertigt wird. Im Gegensatz zur Flachgutkonfiguration führte die Herstellung der Brunnen- und Membranteile als Einzelstück für die Tiefbrunnenkonfiguration dazu, dass sich die Membran verziehen ließ. Dies kann auf einen Unterschied in den Aushärtungsraten zwischen den dicken und dünnen Teilen des Chips zurückzuführen sein. Um dieses Problem zu lösen, wurde die Membranschicht separat konstruiert und nach dem Aushärtungsprozess an der Unterseite des Chips verklebt. Um eine separate Membranschicht mit gleichmäßiger Dicke zu erzeugen, ist es wichtig, dass die Navellierungsbox vor dem Hinzufügen des PDMS vollständig eben ist (Schritt 1.4). Daher wird die Verwendung eines digitalen Winkelmessers empfohlen, um ein hohes Maß an Genauigkeit zu gewährleisten. Darüber hinaus ist es in Schritt 2.3.2 wichtig, so viel PDMS wie möglich aus dem Kunststoffbecher zu entfernen. Inkonsistenzen in diesem Schritt führen zu hohen Abweichungen in den Membrandicken und letztlich zu hohen Abweichungen in der durchschnittlichen Substratdehnung, die zur Induzieren von Osteozyten-Mechanotransduktion verwendet wird.
Unsere Knochen-Remodeling-Plattform bietet ein hohes Maß an Vielseitigkeit. Dieses System kann verwendet werden, um eine Vielzahl von Faktoren zu untersuchen, die Knochenumbau regulieren, wie lastinduzierte Mechanotransduktion, mehrzellige Signalisierung, Entzündungen oder Arzneimitteleffekte. Zum Beispiel wurde das System verwendet, um die kombinierten Auswirkungen von mechanischer Belastung und Entzündung auf KnochenUmbau in einer medikamenteninduzierten Umgebung zu analysieren14. Mechanische Belastung wurde auf Bisphosphonat-behandelte Osteozyten angewendet. Die Proteinanalyse des konditionierten Mediums ergab einen signifikanten Anstieg der Leptin- und Osteonectin-Spiegel und eine signifikante Abnahme der CCL21- und CD36-Spiegel im Vergleich zu Osteozyten, die nicht mechanisch belastet waren14.
Die hier vorgestellten Protokolle bilden die Grundlage für die Kultivierung jedes Zelltyps innerhalb des LOC sowie Methoden zur Induktion mechanischer Belastung und zur Quantifizierung der funktionstüchchenen Aktivität. In Zukunft arbeiten wir auf ein echtes Knochenorgan auf einem Chip hin. Darüber hinaus glauben wir, dass die Verwendung unseres Systems zur Entwicklung mathematischer Modellierungssysteme unser Verständnis der komplexen mehrzelligen Signalprozesse, die die Knochenumbildung regulieren, erheblich verbessernkönnte.,25
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde von der National Science Foundation unter Grant Nos. (CBET 1060990 und EBMS 1700299) unterstützt. Dieses Material basiert auch auf Arbeiten, die vom National Science Foundation Graduate Research Fellowship Program unter Grant No. (2018250692) unterstützt werden. Alle Meinungen, Erkenntnisse, Schlussfolgerungen oder Empfehlungen, die in diesem Material zum Ausdruck kommen, sind die der Autoren und spiegeln nicht unbedingt die Ansichten der National Science Foundation wider.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acrylic sheet | Optix | -- | 3.175 mm thick |
| Angled dispensing tips | Jensen Global | JG18-0.5X-90 | Remove plastic connector prior to use |
| Biopsy punch | Robbins Instruments | RBP-10 | 1 mm diameter |
| Bone wafers | Boneslices.com | 0.4 mm thick | Bovine cortical bone |
| Bovine calf serum | Hyclone | SH30072 | |
| Calipers | Global Industrial | T9F534164 | |
| Cell spatula | TPP | 99010 | |
| Chip mask | ProtoLabs | Custom-designed | Print material: Accura SL 5530 |
| Cork borer | Fisher Scientific | 07-865-10B | |
| Cotton tipped applicator | Puritan | 806-WCL | |
| Culture dish (100 mm) | Corning | 430591 | Sterile, Non-tissue culture treated |
| Culture dish (150 mm) | Corning | 430597 | Sterile, Non-tissue culture treated |
| Double sided tape | 3M Company | Scotch 237 | |
| Fetal bovine serum | Hyclone | SH30910 | |
| Forceps | Fisher Scientific | 22-327379 | |
| Leveling box | Custom-made | -- | 3D printed |
| Masking tape | 3M Company | Scoth 2600 | |
| MC3T3-E1 preosteoblasts | ATCC | CRL-2593 | Subclone 4 |
| Mechanical loading device | Custom-made | -- | 3D printed |
| Minimum essential alpha medium | Gibco | 12571-063 | |
| MLO-Y4 osteocytes | -- | -- | Gift from Dr. Lynda Bonewald |
| Packaging tape | Duck Brand | -- | Standard packaging tape |
| Paraffin film | Bemis Parafilm | PM999 | |
| Penicillin/streptomycin | Invitrogen | p4333 | |
| Plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC-001 | Expanded plasma cleaner |
| Polydimethylsiloxane kit | Dow Corning | Sylgard 184 | |
| Polystyrene coverslips | Nunc Thermanox | 174942 | Sterile, tissue culture treated |
| Oven | Quincy Lab | 12-180 | |
| RAW264.7 preosteoclasts | ATCC | TIB-71 | |
| Scalpel | BD Medical | 372611 | |
| Silicone tubing | Saint-Gobain Tygon | ABW00001 | ID: 1/32" (0.79 mm), OD: 3/32" (2.38 mm) |
| SolidWorks software | Dassault Systèmes | -- | Used to generate 3D printed models and perform FEA |
| Spray adhesive | Loctite | 2323879 | Multi-purpose adhesive |
| Syringe (5 ml) | BD Medical | 309646 | Sterile |
| Syringe pump | Harvard Apparatus | 70-2213 | Pump 11 Pico Plus |
| Tapered laboratory spatula | Fisher Scientific | 21-401-10 | |
| Two-part expoxy | Loctite | 1395391 | 5 minute quick set |
| Type I collagen | Corning | 354236 | Rat tail collagen |
| Vacuum desiccator | Bel-Art | F42010-0000 | |
| Waterproof sealant | Gorilla | 8090001 | 100% silicone sealant |
References
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