Summary
Her presenterer vi protokoller for å analysere beinremodeling i en lab-on-a-chip-plattform. En 3D trykt mekanisk lasteenhet kan pares med plattformen for å indusere osteocytter mechanostransduction ved å deformere cellulær matrisen. Plattformen kan også brukes til å kvantifisere beinremodellering av funksjonelle resultater fra osteoklaster og osteoblaster (resorpsjon/dannelse).
Abstract
Beinombygging er en tett regulert prosess som kreves for skjelettvekst og reparasjon, samt tilpasning til endringer i det mekaniske miljøet. Under denne prosessen regulerer mechanosensitive osteocytter de motstridende svarene mellom de katabolske osteoklastene og anabole osteoblaster. For bedre å forstå de svært intrikate signalveiene som regulerer denne prosessen, har laboratoriet vårt utviklet en grunnleggende lab-on-a-chip (LOC) plattform for å analysere funksjonelle resultater (dannelse og resorpsjon) av beinremodellering i et lite skalasystem. Som bein remodeling er en lang prosess som oppstår i størrelsesorden uker til måneder, utviklet vi langsiktige celle kuling protokoller i systemet. Osteoblaster og osteoklaster ble dyrket på funksjonelle aktivitetssubstrater i LOC og opprettholdt i opptil syv uker. Etterpå ble chips demontert for å tillate kvantifisering av beindannelse og resorpsjon. I tillegg har vi designet en 3D trykt mekanisk lasteenhet som parer med LOC-plattformen og kan brukes til å indusere osteocytter mechanotransduction ved å deformere cellulær matrisen. Vi har optimalisert cellekulturingprotokoller for osteocytter, osteoblaster og osteoklaster i LOC-plattformen og har adressert bekymringer for sterilitet og cytotoksisitet. Her presenterer vi protokollene for fabrikasjon og sterilisering av LOC, seeding celler på funksjonelle substrater, indusere mekanisk belastning, og demontere LOC å kvantifisere endepunkt resultater. Vi tror at disse teknikkene legger grunnlaget for å utvikle en ekte organ-on-a-chip for beinremodeling.
Introduction
Bone er et svært dynamisk vev som krever intrikat koordinering blant de tre store celletypene: osteocytter, osteoblaster og osteoklaster. Flercellulære interaksjoner mellom disse cellene er ansvarlige for beintapet som oppstår under lammelse og langsiktig immobilitet og for beinformasjonen som oppstår som svar på vekst og trening. Osteocytter, den rikeste bencelletypen, er svært følsomme for mekaniske stimuli påført beinet. Mekanisk stimulering endrer osteocytter metabolsk aktivitet og fører til en økning i viktige signalmolekyler1,2. Gjennom denne prosessen, kjent som mechanotransduction, kan osteocytter direkte koordinere aktivitetene til osteoblaster (beindannende celler) og osteoklaster (bein resorbing celler). Opprettholde bein homeostase krever en stram regulering mellom beindannelse og bein resorpsjon priser; Imidlertid kan forstyrrelser i denne prosessen føre til sykdomstilstander som osteoporose eller osteopetrose.
Kompleksiteten i interaksjoner mellom disse tre celletypene gir seg godt til undersøkelse ved hjelp av mikrofluidiske og lab-on-a-chip (LOC) teknologier. For dette formål har laboratoriet vårt nylig etablert bevis på konsept av en LOC-plattform for å analysere beinresorpsjon og dannelse (funksjonelle resultater) i beinombyggingsprosessen. Plattformen kan brukes til studiet av cellulære interaksjoner, endrede lastemiljøer og undersøkelsesmedisinscreening. I de senere årene har ulike mikrofluidiske enheter blitt utviklet for å undersøke molekylære signalveier som regulerer beinremodellering; Men mange av disse systemene kvantifiserer remodeling gjennom indirekte markører som er et tegn på funksjonell aktivitet3,4,5,6,7. En fordel med systemet vårt er at det kan brukes til direkte kvantifisering av funksjonelle resultater. Beinremodeling er en langsiktig prosess. Som sådan krever direkte kvantifisering av beinresorpsjon og dannelse et kulingssystem som kan opprettholdes i minst flere uker til måneder8,9,10,11. Dermed, når vi utviklet LOC-plattformen, etablerte vi langsiktige kulingsprotokoller som er nødvendige for dannelse og resorpsjon og har opprettholdt celler i systemet i opptil syv uker11. I tillegg innlemmet vi passende kulingsubstrater for begge celletyper i plattformen; osteoklaster ble dyrket direkte på bein, og osteoblaster, som er kjent for å være plasttilhenger, ble dyrket på polystyrenskiver. Videre tok vi opp spørsmål om sterilitet, langsiktig cytotoksisitet og spondemontering for ombyggingsanalyse11,12.
LOC-plattformen kan også brukes til å indusere osteocytter mechanotransduction gjennom matrisedeformasjon. En 3D trykt mekanisk lasteenhet ble utviklet for å pare med LOC og bruke en statisk ut av flyet distention å strekke cellene13. For å imøtekomme denne mekaniske belastningen ble dybden av brønnen innenfor LOC økt. Denne lille, enkle mekaniske lasteanordningen kan enkelt produseres av laboratorier med begrenset teknisk erfaring, og vi har tidligere delte tegninger av 3D-trykte komponenter13. I dagens arbeid demonstrerer vi noen av de nye teknikkene som er nødvendige for vellykket bruk av LOC. Spesielt demonstrerer vi chip fabrikasjon, celleseeding på funksjonelle underlag, mekanisk lasting og chip demontering for ombygging kvantifisering. Vi tror at forklaringen på disse teknikkene drar nytte av et visuelt format.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Forberedelse av chipmaske
MERK: Trinn 1.1 - 1.3 trenger bare å utføres én gang ved første mottak av chipmasken. De sørger for at masken ikke bøyer seg under bruk. Utformingen av mikrofluidiske masker ble tidligere beskrevet11,14. Masker ble designet internt og kommersielt fabrikkert ved hjelp av høy oppløsning stereolittografi (Figur 1A).
- Dekk den øverste overflaten av masken med plastfolie for å beskytte denne overflaten mot lim. Fest chipmasken til et like stort akrylark ved hjelp av spraylim. Klem brikkene sammen over natten for å la limet fullt ut kurere. Etter at limet er tørt, fjern plastfolie fra toppen av masken.
- Fest bunnen av akrylarket til en 3D-utjevningsboks (Tilleggsfigur 1, Supplerende filer 1-4) ved hjelp av dobbeltsidig tape. Trykk godt på for å sikre et stramt bånd.
- Forsegle eventuelle små åpninger nær den avtakbare veggen i utjevningsboksen med et vanntett tetningsmiddel. La tetningsmasse å kurere i 24 timer.
- Rengjør overflaten av masken med 70% etanol (EtOH). Plasser utjevningsboksen med ønsket chipmaske i ovnen. Bruk en digital vinkelmåler for å sikre at toppen av masken er jevn. Juster nivelleringsskruene om nødvendig.
2. PDMS fabrikasjon
MERK: En grunnbrønn (1 mm) chip design brukes til funksjonell aktivitet (dannelse og resorpsjon) analyser, og en dyp brønn (10 mm) chip design brukes til mekaniske lasting studier. Bunnen av dypbrønnen dannes ved å feste en egen tynn PDMS-membran (figur 1B).
- Lokk lag (Lag 1)
- Kombiner 63 g PDMS prepolymer og 6,3 g herdingsmiddel (10:1-forhold) i en plastkopp. Bland godt med en engangscelleslikkepott og degas i en vakuumtørkemaskin i 30 min.
- Hell langsomt blandingen i den tilberedte utjevningsboksen. La PDMS sitte i 30 min og stek deretter ved 45 °C i 18 timer.
- Løsne kantene på PDMS med en konisk laboratorieslikkepott og fjern polymerarket fra utjevningsboksen.
- Skjær enkeltlokkene til størrelse (70 mm x 34 mm) med en skalpell og en 3D-trykt mal.
- Punch tilgang hull gjennom hvert lokk med en biopsi punch (1 mm diameter).
- Overflate rengjør lokkene med emballasjetape.
MERK: Hvis lokkene ikke brukes umiddelbart, må du pakke hver i emballasjetap og oppbevare ved romtemperatur (RT).
- Brønn- og mikrokanallag (lag 2)
- Kombiner PDMS prepolymer og herding agent (10: 1 ratio) i en plastkopp. Den grunne-brønn design krever 43 g prepolymer og 4,3 g herding middel, og den dype-godt design krever 227 g prepolymer og 22,7 g herding agent. Bland polymeren kraftig og degas i 30 min.
MERK: Dette forutsetter en maskedimensjon på 152,4 mm x 152,4 mm. - Hell langsomt blandingen over passende forhåndsutjevnet maske. La PDMS sitte i 30 min og stek deretter ved 45 °C i 18 timer.
- Løsne kantene på PDMS med en konisk laboratorieslikkepott og fjern forsiktig polymeren bort fra masken. Bruk en skalpell og 3D-trykt mal for å kutte ut individuelle sjetonger.
MERK: For lastingsstudier er det viktig at chipdimensjonene (70 x 34 mm) er presise og at brønnen ligger i midten av brikken. - Overflate rengjør PDMS med emballasjetape.
MERK: Hvis sjetongene ikke brukes umiddelbart, pakker du hver brikke i emballasjetape og oppbevares på RT.
- Kombiner PDMS prepolymer og herding agent (10: 1 ratio) i en plastkopp. Den grunne-brønn design krever 43 g prepolymer og 4,3 g herding middel, og den dype-godt design krever 227 g prepolymer og 22,7 g herding agent. Bland polymeren kraftig og degas i 30 min.
- Tynn PDMS membran (Lag 3)
MERK: Dette laget brukes bare til dypbrønndesign.- Tilsett 12,7 g PDMS prepolymer og 1,3 g herdingsmiddel (10:1-forhold) til en plastkopp. Bland kraftig og degas i 30 min.
- Hell polymer langsomt i klargjøringsboks og skrap plastkoppen grundig for å fjerne så mye PDMS som mulig.
- Bruk celleslikkepott til å spre PDMS over hele overflaten.
MERK: Hvis polymeren ikke spres manuelt ut, vil overflatespenningen være tilstrekkelig for å hindre at polymeren danner et jevnt ark. - La PDMS sitte i 30 min og stek deretter ved 45 °C i 18 timer.
- Løsne kantene på PDMS med en konisk slikkepott og fjern PDMS-arket forsiktig fra utjevningsboksen. Klipp individuelle membraner som samsvarer med dimensjonene til lag 2.
- Mål membrantykkelsen i midten av membranen ved hjelp av kalipere. Kast alle membraner som er utenfor ønsket tykkelse (0,5 mm ± 0,1 mm).
- Rengjør forsiktig membraner med emballasjetape og plasser på et stykke parafinfilm.
MERK: Hvis membranene ikke brukes umiddelbart, dekk toppen av membranen med emballasjetape og oppbevares på RT.
3. Underlag av funksjonell aktivitet
MERK: Polystyrenplater og benwafers må festes til bunnen av brønner som skal brukes til henholdsvis osteoblast og osteoklastkulturer.
- Polystyrenplater (Figur 1C)
- Plasser maskeringstape på baksiden av en vevskultur behandlet polystyrencoverslip. Klipp sirkulære plater fra trekkslipen med en skjerpet korkborer (5,4 mm diameter). Senk skivene ned i 70% EtOH og la over natten.
- Skrubb forsiktig platens øverste overflate med en bomullsspissapplikator gjennomvåt i 70% EtOH. Pass på at den ytre kanten av platen er grundig rengjort.
- Bruk to tangpar til å holde platen og fjerne maskeringstapestøtten. Plasser platen behandlet side ned og rengjør baksiden med en bomull tippet applikator.
- Dypp treenden av en bomulltippet applikator i en avgasset blanding av uherdet PDMS og plasser en liten mengde polymer på bunnen av ønsket brønn.
MERK: Gjenværende ikke-anskaffet PDMS kan oppbevares ved -20 °C. - Plasser polystyrenskiven, behandlet side opp, i brønnen og trykk forsiktig ned på platen med en bomullspinne. Kontroller at ingen uherdet PDMS kommer i kontakt med den behandlede siden av platen.
MERK: Hvis PDMS kommer i kontakt med den behandlede overflaten på platen, fjerner du platen fra brønnen og gjentar trinn 3.1.4 og 3.1.5 med en ny plate. - La brikken sitte på en jevn overflate i 30 min og stek deretter ved 65 °C i 4 timer.
- Ben wafers
- Bruk tang til å plassere en beinwafer (6 mm diameter, 0,4 mm tykk) på bunnen av en 100 mm tallerken. Hold wafer stødig med tang og etse forsiktig en "X" på baksiden av wafer med en skalpell.
MERK: Under bildeprosessen brukes 'X' til å skille mellom baksiden av wafer og overflaten som cellene ble sådd på. - Bruk treenden av en bomulltippet applikator for å legge til en liten mengde uherdet PDMS til bunnen av ønsket brønn. Plasser beinwaferen, merket side ned, inn i brønnen og bruk en bomullsspissapplikator til å trykke waferen ned.
- La brikken sitte på en jevn overflate i 30 min og stek deretter ved 65 °C i 4 timer.
- Bruk tang til å plassere en beinwafer (6 mm diameter, 0,4 mm tykk) på bunnen av en 100 mm tallerken. Hold wafer stødig med tang og etse forsiktig en "X" på baksiden av wafer med en skalpell.
4. Sponmontering og sterilisering
- Aktiver overflatene på lag 1 og lag 2 med en plasmarengjøringsmiddel i 30 s ved hjelp av en middels radiofrekvens (RF) effektinnstilling (tilsvarende ca. 10,2 W).
- Juster tilgangshullene i lag 1 med mikrokanalene i lag 2 og trykk godt på de to lagene sammen.
- For den dype designen gjentar du trinn 4.1 med lag 2 og lag 3. Under plasmabehandlingen, bruk dobbeltsidig tape for å feste parafinfilmen av lag 3 til en flat overflate.
- Bruk en skalpell til å trimme overflødig materiale fra PDMS-membranen. Fjern forsiktig arket med parafinfilm fra bunnen av brikken
- Stek brikken ved 65 °C i 10 minutter for å øke bindingsstyrken mellom PDMS-lagene.
- Sett de vinklede uttaksspissene (18 Måler, 0,5 tommer, 90 °) inn i tilgangshullene i lokket. Fest dispenseringsspissene til lokket med en todelt epoksy. Bruk en mikropipettespiss til å påføre epoxyen rundt hver dispenseringsspiss.
- Etter at epoxy har fullstendig herdet, overflate rengjør brikken med 70% EtOH og plasser i et biosikkerhetsskap. Utfør alle påfølgende trinn i biosikkerhetsskapet.
- Koble en 5 ml sprøyte til dispenseringsspissene med sterilsilikonrør (1/32'' ID, ~ 10 cm i lengde) og fyll hele brikken med 70% EtOH i minst 30 s. For grunnbrønndesign, administrer alle væsker med en sprøytepumpe satt til en strømningshastighet på 4 ml/t. For dyp-brønn design, administrere alle væsker ved sakte dispensering sprøyten for hånd.
- Fjern EtOH fra brikken og steriliser brikken med UV-lys over natten.
- Vask spon3 ganger med dH2O. Fyll brikken med dH2O, fjern slangen fra dispenseringsspissene og inkuber i minst 48 timer ved 37 °C.
5. Montering av mekanisk lasteinnordning
MERK: Design- og fabrikasjonsprosessene for 3D-trykt mekanisk lasteinnretning (Figur 2A-C) ble tidligere beskrevet, og alle designfiler for trykte komponenter har tidligere blitt gitt13.
- Autoklav alle komponenter av lasteinnretningen i 30 min ved 121 °C.
MERK: For å unngå fordreining av trykte komponenter, pakk hvert stykke individuelt i folie og legg på en hard flat overflate under autoklavingsprosessen. Metallmaskinvare kan pakkes sammen. Fullfør alle påfølgende trinn i et biosikkerhetsskap. - Plasser en kompresjonsfjær rundt akselen på platen og sett platen inn i det sentrale hullet på bunnen av sokkelen (figur 2D).
- Fest ringeblokken til bunnen av sokkelen ved hjelp av fire selvgjengende skruer.
- Plasser en andre kompresjonsfjær rundt den sentrale skruen. Sett skruen inn i det sekskantede hullet i bunnen av skiven og skru enheten inn i det gjengede hullet midt på ringeblokken.
- Skru fire mannlige-kvinnelige standoffs inn i bunnen av basen.
- Fjern slakk fra enheten ved å dreie hjulet mot klokken til toppen av platen er under toppen av sokkelen. Vri deretter hjulet langsomt med klokken til toppen av platen er på nivå med toppen av sokkelen.
6. Eksperimentering
MERK: Protokoller for funksjonelle aktivitetseksperimenter ble tidligere gitt11,12.
- Lasting studier (Figur 3)
- Etter trinn 4.9, bruk en 5 ml sprøyte for å fjerne dH2O fra den dype brønnen chip. Coat bunnen av brønnen med 200 μL på 0,15 mg/ml type I kollagen (CTI) i 0,02 M eddiksyre i 1 timer.
- Skyll brikken tre ganger med Dulbeccos fosfatbufret saltvann med kalsium og magnesium (DPBS++).
- Plasser chip i chip holderen og frø med MLO-Y4 osteocytter med en tetthet på 2 x 104 celler / ml i minimum viktig alfa medium (MEMα) supplert med 5% kalv serum, 5% føtal storfe serum, og 1% penicillin / streptomycin.
- Fjern slangen fra dispenseringsspissene og plasser brikken i en dypkulturrett (150 mm x 25 mm). Inkuberceller ved 37 °C og 5 % CO2 i 72 timer.
- Fest sterile rør til dispenseringstips og bruk en 5 ml sprøyte for å fjerne brukt kulturmedium fra brikken. Dispenser langsomt i frisk kulturmedium for å fylle på brikken.
- Plasser chipholderen i det rektangulære innsettet øverst på innlastingsenhetens base. Før slangen gjennom sporene som er plassert på lokket på lasteinnretningen, og fest lokket til basen med fire pannehodeskruer og sekskantmuttere.
MERK: For å sikre at lokket forblir jevnt, må du først feste to skruer som er plassert diagonalt fra hverandre før du fester de resterende to skruene. - Påfør last på cellene ved å dreie skiven med klokken til ønsket plateforskyvning er nådd.
MERK: Enheten er utformet slik at én rotasjon av skiven tilsvarer en plateforskyvning på 1 mm. Stammefeltet som ble generert på toppen av PDMS-membranen, ble tidligere modellert som en funksjon av platenforskyvning ved hjelp av begrenset elementanalyse (FEA)13. - Plasser lasteinnretningen i en tom P1000 mikropipette-tipbox. Inkuber cellene med den påførte lasten i 15 min.
MERK: Lastetiden som brukes her fungerer som et eksempel. Alternative lastetider kan brukes. - Etter inkubasjon fjerner du belastningen fra cellene ved å dreie hjulet mot klokken til platen går tilbake til den opprinnelige startposisjonen. Fjern lokket fra enheten og plasser chipholderen i den dype kulturplaten. Inkuber cellene for en 90-min post load recovery periode.
MERK: Igjen fungerer gjenopprettingstidsperioden som brukes her som et eksempel. Alternative gjenopprettingstider kan brukes. For langsiktige studier, mate celler hver 72 h. - Bruk en 5 ml sprøyte til å fjerne det betingede mediet fra brikken.
MERK: Dette mediet kan lagres og lagres ved -80 °C. - Fjern brikken fra chipholderen og bruk en konisk slikkepott til å bryte bindingen mellom PDMS-lokket og brønnlaget.
MERK: Cellulære analyser kan nå utføres etter en protokoll som er etablert for en cellekulturplate.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den grunne brønnkonfigurasjonen kan brukes til å analysere funksjonell aktivitet av osteoblaster og osteoklaster. Beindannelse via osteoblaster og resorpsjon via osteoklaster krever kulingstider i størrelsesorden flere uker til måneder. Bendannelse fra MC3T3-E1 pre-osteoblaster ble kvantifisert ved hjelp av alizarin røde og von Kossa flekker11,15. På dag 49 var gjennomsnittlig overflateareal farget med alizarin rød 10,7% ± 2,2% (gjennomsnitt ± standardfeil i gjennomsnittet)11. Gjennomsnittlig overflateareal farget med von Kossa var 6,4% ± 1,6%11. Figur 4A viser typiske formasjonsresultater fra osteoblastkulturer på dag 49 farget med alizarin rød og von Kossa. Benresorpsjon fra RAW264.7 pre-osteoklaster ble kvantifisert ved hjelp av toluidin blå farging 11,,15. På dag 30 var gjennomsnittlig overflateareal farget med toluidinblå 30,4% ± 4,5%11. Figur 4B viser typiske beinresorpsjonsresultater fra osteoklastkulturer farget med toluidinblå på dag 30. Skanning av elektronmikroskopi ble utført for å verifisere tilstedeværelsen av resorpsjonsgroper. Typiske resultater vises i figur 4C. Disse resultatene viser at cellene i enheten forblir levedyktige og funksjonelt aktive i minst syv uker.
En 3D-trykt lasteenhet ble designet og fabrikkert for å imøtekomme den dype chip-konfigurasjonen. Sammen kan dette systemet indusere osteoocytter mechanotransduction ved å strekke cellene via en statisk ut-av-plan distention. Den 48 h inkubasjon av brikken beskrevet i trinn 4.9 har vist seg å være en kritisk prosess for å opprettholde celle levedyktighet og typisk morfologi. Figur 5A viser representative bilder av MLO-Y4 osteocytter ved 72 timer seeded i chips med og uten denne inkubasjonsperioden. Under anfall av lasting ble osteocytter utsatt for en belastninggradient indusert på PDMS-membranen der cellene ble sådd (Supplerende Video 1). Tilsvarende stammer som genereres under denne prosessen ble modellert med FEA13 og den gjennomsnittlige tilsvarende belastningen som produseres på toppen av PDMS membranen ble bestemt. Figur 5B viser sammenhengen mellom gjennomsnittlig tilsvarende belastning og plateforskyvning for verdier mellom 1 og 2 mm. Et representativt varmekart over den induserte stammegradienten vises i figur 5C. I dette eksemplet genererte en plateforskyvning på 1,5 mm en gjennomsnittlig tilsvarende stamme på 12,29 % på toppen av membranen. Denne modellen viser også at stammene indusert nær midten av brønnen er relativt lav og gradvis øke radialt utover, med maksimale stammer generert rett over den ytre kanten av platen. Etter lasting ble cellelevedyktighet analysert med laktatdehydrogenasefarging og vedlegget V og død celleanalyse14,16. Typiske resultater vises i henholdsvis figur 5D,E.
Figur 1: Mikrofluidisk enhet. (A) Fabrikat og utjevning av chipmasken. (Venstre) Skjematisk av den dype chip masken som ble designet internt ved hjelp av CAD-programvare. -Jeg har ikke noe å si. Bilde av den dype chip masken som ble kommersielt trykt ved hjelp av høyoppløselig stereolittografi. (Høyre) Masken er plassert i en 3D-utjevningsboks for å sikre at masken forblir jevn under støping av lag 2 av sjetongene. (B) Skjematiske skisser av grunne-vel og dyp-brønn design av enheten. (Øverst) Den grunne-brønn design ble brukt for å analysere funksjonell aktivitet (dannelse og resorpsjon) av osteoblaster og osteoklaster. Denne konfigurasjonen er dannet fra to PDMS-lag. Et funksjonelt aktivitetssubstrat ble sikret til bunnen av kulturen godt før de forsegler lagene sammen. Polystyrenplater og benwafers ble brukt til henholdsvis osteoblast og osteoklastkulturer. (Nederst) Den dype brønndesignen ble brukt til å bruke mekanisk belastning på osteocytter. Denne konfigurasjonen består av tre PDMS-lag. Bunnen av kulturbrønnen er dannet av den deformbare PDMS membranen (lag 3). (C) Fabrikasjonstrinn for polystyrenplaten som brukes til osteoblastkulturer. Baksiden av en vevkultur behandlet coverslip ble merket med maskeringstape. Individuelle plater ble kuttet ut med en kork-borer. Platen ble rengjort med etanol og en bomullspinne. Båndstøtten ble fjernet og platen ble festet til bunnen av PDMS-kulturen godt. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Design og montering av den mekaniske lasteanordningen. (A) Bilde av den monterte mekaniske lasteinnretningen. Når den er kombinert med den dype brønnutformingen av PDMS-brikken, strekker lasteenheten celler ved å bruke en utav flyfordeling på en deformbar membran. (B) Eksplodert visning av enheten. Alle deler vist i blått ble 3D trykt med en varmebestandig polymelkesyrefilament. All maskinvare er rustfritt stål. (C) Skruekontaktmekanismen til lasteenheten. Rotasjon av den sentrale skruen (oransje) skyver platen (grønn) oppover gjennom sokkelen. Den oppadgående bevegelsen av platen deformerer PDMS-membranen til den dype brønnen som cellene har blitt sådd på. (D) Monteringsprosessen for lasteenheten. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Mekanisk lasting eksperiment. Alle væsker ble administrert og fjernet fra sponet ved hjelp av en 5 ml sprøyte koblet til tilgangsslangen. Et kritisk skritt i denne prosessen er 48 h inkubasjon med sterilt destillert vann før celleseeding. Uten denne inkubasjonscellene viste lav levedyktighet og atypisk morfologi. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Typiske funksjonsaktivitetsresultater. (A) Typiske formasjonsresultater farget med alizarin rød (venstre) og von Kossa (høyre) fra indusert MC3T3-E1 osteoblastkulturer på dag 49. Hele platebilder måler 5,4 mm i diameter. (B) Typiske osteoklastresorpsjonsresultater fra RAW264.7 preosteoklaster indusert med reseptoraktivator av kjernefaktor kappa-B ligand (RANKL). Cellene ble dyrket på beinwafers og farget med toluidin blå på dag 30. (C) Typiske skanneelektronmikroskopibilder som bekrefter tilstedeværelsen av resorpsjonsgroper på beinwafers. Skalalinjen i det øverste bildet representerer 200 μm og skalalinjen i det nederste bildet representerer 50 μm. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Effekter av mekanisk indusert belastning på osteocytter. (A) Bilder av MLO-Y4 osteocytter ved 72 timer i dypbrønnsponfabrikkert med (venstre) og uten (høyre) en 48 h inkubasjon med destillert vann før cellesåing. (B) Begrenset elementanalyse ble brukt til å modellere den gjennomsnittlige tilsvarende belastningen som genereres på toppen av den deformbare PDMS-membranen basert på forskyvningen av lasteplaten. Resultater fra forskyvninger mellom 1,0 mm og 2,0 mm vises. (C) Varmekart over den modellerte stammegradienten som ble indusert på PDMS-membranen for en plateforskyvning på 1,5 mm. (D) Typiske resultater av en laktatdehydrogenaseflekk av legemiddelinduserte osteocytter som ble strukket ved hjelp av en 1,5 mm plateforskyvning. En lettere cellefarging observeres nær den ytre kanten av brønnen, noe som tilsvarer plasseringen av høyere belastningsverdier som indikerer celleskade og/ eller død. (E) Representative flyt cytometri resultater av last-indusert apoptose indikert av en annexin V og død celle analyse. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Tilleggsfigur 1: 3D-utjevningsboks med avtakbar vegg. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Tilleggsfil 1: Utjevningsboks CAD-fil 1. Vennligst klikk her for å se denne filen (Høyreklikk for å laste ned).
Tilleggsfil 2: Utjevningsboks CAD-fil 2. Vennligst klikk her for å se denne filen (Høyreklikk for å laste ned).
Tilleggsfil 3: Utjevningsboks CAD-fil 3. Vennligst klikk her for å se denne filen (Høyreklikk for å laste ned).
Tilleggsfil 4: Utjevningboksmaskinvareliste. Vennligst klikk her for å se denne filen (Høyreklikk for å laste ned).
Supplerende video 1: Mekanisk lasteenhet. Vennligst klikk her for å se denne filen (Høyreklikk for å laste ned).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne artikkelen beskriver grunnlaget for å fremstille en bein remodeling LOC plattform for kuling osteocytter, osteoklaster, og osteoblaster. Ved å endre dybden og størrelsen på brønnen i sponet, ble flere konfigurasjoner utviklet for å stimulere osteocytter med mekanisk belastning og kvantifisere funksjonelle resultater av beinremodeling (figur 1B).
Under chip montering, optimalisere plasma oksidasjon protokollen var avgjørende for å eliminere lekkasje bekymringer. Vi fant at å utsette PDMS overflater til 30 s oksygen plasma generert ved hjelp av en middels RF strøminnstilling (trinn 4.1), lik ca 10.2 W, var tilstrekkelig for å skape en sterk binding mellom lagene. Integriteten til obligasjonen gikk ned når lengre eksponeringstider eller en høyere RF-effektinnstilling ble brukt. Dette er i samsvar med tidligere rapporter som bemerket en overeksponering av PDMS til oksygenplasma økt overflate ruhet og redusert limidhet17,18.
I tillegg var opprettholdelse av høy cellelevedyktighet og typisk cellemorfologi kritisk avhengig av PDMS-herdingsprosessen. PDMS-polymeren består av krysskoblede dimetylsiloxanoligomere. Denne krysskoblingsprosessen er både tid og temperaturavhengig; Men selv med omfattende herding polymer en ikke klarer å fullt polymerisere19. De resterende oligomerne har vist seg å leach ut av bulk polymer i omkringliggende cellekultur medium og har til og med blitt funnet i membranene av celler dyrket på polymeroverflaten20. Flere grupper har rapportert cytotoksiske effekter fra ikke-krysskoblede PDMS oligomers21,22,23. For å løse denne bekymringen i systemet vårt, optimaliserte vi PDMS-herdingsprosessen. Selv om herdingshastigheten for PDMS er temperaturavhengig, begrenset de materielle egenskapene til våre chipmasker vår herdetemperatur til 45 °C. Som sådan bestemte vi oss for at sjetongene skulle bakes i minst 18 timer. Videre har vi funnet ut at inkubering av chips med dH2O i minst 48 timer før celleseeding (trinn 4.9) var nødvendig for å redusere cytotoksiske effekter. Figur 5A viser MLO-Y4 osteocytter dyrket i chips med og uten denne inkubasjonsperioden.
Den dype brønnkonfigurasjonen, som ble designet for å imøtekomme mekanisk lastapplikasjon, krever at brikken skal fabrikkeres fra tre separate lag. I motsetning til den grunne-brønn konfigurasjon, fabrikasjon brønnen og membran deler som et enkelt stykke for dyp-brønn konfigurasjon forårsaket membranen å deformere. Dette kan skyldes en forskjell i herding priser mellom tykke og tynne deler av brikken. For å overvinne dette problemet ble membranlaget konstruert separat og bundet til bunnen av brikken etter herdingsprosessen. For å generere et eget membranlag med ensartet tykkelse, er det avgjørende at utjevningsboksen er helt på nivå før pdms (trinn 1.4). Som sådan anbefales bruk av en digital vinkelmåler for å sikre høy grad av nøyaktighet. I tillegg, i trinn 2.3.2, er det avgjørende å fjerne så mye PDMS fra plastkoppen som mulig. Inkonsekvenser på dette trinnet vil føre til høye avvik i membrantykkelser, og til slutt høye avvik i gjennomsnittlig substratstamme som brukes til å indusere osteocytter mechanotransduction.
Vår beinremodelingplattform gir en høy grad av allsidighet. Dette systemet kan brukes til å undersøke en rekke faktorer som regulerer bein remodeling, for eksempel load-indusert mechanotransduction, multicellulær signalering, betennelse, eller narkotikaeffekter. For eksempel ble systemet brukt til å analysere de kombinerte effektene av mekanisk belastning og betennelse på beinremodeling i et legemiddelindusert miljø14. Mekanisk belastning ble påført bisfosfonatbehandlede osteocytter. Proteinanalyse av det betingede mediet viste en betydelig økning i nivåene av leptin og osteonectin og en betydelig reduksjon i nivåene av CCL21 og CD36 sammenlignet med osteocytter som ikke var mekanisk lastet14.
Protokollene som presenteres her gir et grunnlag for å kule hver celletype innenfor LOC, samt metoder for å indusere mekanisk belastning og kvantifisere funksjonell aktivitet. Fremover jobber vi mot en ekte beinorgan-on-a-chip. I tillegg tror vi at bruk av vårt system for å utvikle matematiske modelleringssystemer i stor grad kan forbedre vår forståelse av de komplekse flercellulære signalprosessene som regulerer beinremodeling24,25.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av National Science Foundation under Grant Nos. (CBET 1060990 og EBMS 1700299). Også dette materialet er basert på arbeid støttet av National Science Foundation Graduate Research Fellowship Program under Grant No. (2018250692). Eventuelle meninger, funn, konklusjoner eller anbefalinger uttrykt i dette materialet er forfatternes og reflekterer ikke nødvendigvis synspunktene til National Science Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acrylic sheet | Optix | -- | 3.175 mm thick |
| Angled dispensing tips | Jensen Global | JG18-0.5X-90 | Remove plastic connector prior to use |
| Biopsy punch | Robbins Instruments | RBP-10 | 1 mm diameter |
| Bone wafers | Boneslices.com | 0.4 mm thick | Bovine cortical bone |
| Bovine calf serum | Hyclone | SH30072 | |
| Calipers | Global Industrial | T9F534164 | |
| Cell spatula | TPP | 99010 | |
| Chip mask | ProtoLabs | Custom-designed | Print material: Accura SL 5530 |
| Cork borer | Fisher Scientific | 07-865-10B | |
| Cotton tipped applicator | Puritan | 806-WCL | |
| Culture dish (100 mm) | Corning | 430591 | Sterile, Non-tissue culture treated |
| Culture dish (150 mm) | Corning | 430597 | Sterile, Non-tissue culture treated |
| Double sided tape | 3M Company | Scotch 237 | |
| Fetal bovine serum | Hyclone | SH30910 | |
| Forceps | Fisher Scientific | 22-327379 | |
| Leveling box | Custom-made | -- | 3D printed |
| Masking tape | 3M Company | Scoth 2600 | |
| MC3T3-E1 preosteoblasts | ATCC | CRL-2593 | Subclone 4 |
| Mechanical loading device | Custom-made | -- | 3D printed |
| Minimum essential alpha medium | Gibco | 12571-063 | |
| MLO-Y4 osteocytes | -- | -- | Gift from Dr. Lynda Bonewald |
| Packaging tape | Duck Brand | -- | Standard packaging tape |
| Paraffin film | Bemis Parafilm | PM999 | |
| Penicillin/streptomycin | Invitrogen | p4333 | |
| Plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC-001 | Expanded plasma cleaner |
| Polydimethylsiloxane kit | Dow Corning | Sylgard 184 | |
| Polystyrene coverslips | Nunc Thermanox | 174942 | Sterile, tissue culture treated |
| Oven | Quincy Lab | 12-180 | |
| RAW264.7 preosteoclasts | ATCC | TIB-71 | |
| Scalpel | BD Medical | 372611 | |
| Silicone tubing | Saint-Gobain Tygon | ABW00001 | ID: 1/32" (0.79 mm), OD: 3/32" (2.38 mm) |
| SolidWorks software | Dassault Systèmes | -- | Used to generate 3D printed models and perform FEA |
| Spray adhesive | Loctite | 2323879 | Multi-purpose adhesive |
| Syringe (5 ml) | BD Medical | 309646 | Sterile |
| Syringe pump | Harvard Apparatus | 70-2213 | Pump 11 Pico Plus |
| Tapered laboratory spatula | Fisher Scientific | 21-401-10 | |
| Two-part expoxy | Loctite | 1395391 | 5 minute quick set |
| Type I collagen | Corning | 354236 | Rat tail collagen |
| Vacuum desiccator | Bel-Art | F42010-0000 | |
| Waterproof sealant | Gorilla | 8090001 | 100% silicone sealant |
References
- Hemmatian, H., Bakker, A. D., Klein-Nulend, J., van Lenthe, G. H. Aging, Osteocytes, and Mechanotransduction. Current Osteoporosis Reports. 15 (5), 401-411 (2017).
- Bonewald, L. F. The amazing osteocyte. Journal of Bone and Mineral Research. 26 (2), 229-238 (2011).
- Middleton, K., Al-Dujaili, S., Mei, X., Gunther, A., You, L. Microfluidic co-culture platform for investigating osteocyte-osteoclast signalling during fluid shear stress mechanostimulation. Journal of Biomechanics. 59, 35-42 (2017).
- Kou, S., et al. A multishear microfluidic device for quantitative analysis of calcium dynamics in osteoblasts. Biochemical and Biophysical Research Communications. 408 (2), 350-355 (2011).
- Ma, H. P., et al. A microfluidic chip-based co-culture of fibroblast-like synoviocytes with osteoblasts and osteoclasts to test bone erosion and drug evaluation. Royal Society Open Science. 5 (9), 180528 (2018).
- Jang, K., et al. Development of an osteoblast-based 3D continuous-perfusion microfluidic system for drug screening. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 390 (3), 825-832 (2008).
- Yu, W., et al. A microfluidic-based multi-shear device for investigating the effects of low fluid-induced stresses on osteoblasts. PLOS ONE. 9 (2), e89966 (2014).
- Hwang, P. W., Horton, J. A. Variable osteogenic performance of MC3T3-E1 subclones impacts their utility as models of osteoblast biology. Scientific Reports. 9 (1), 8299 (2019).
- Beier, E. E., Holz, J. D., Sheu, T. J., Puzas, J. E. Elevated lifetime lead exposure impedes osteoclast activity and produces an increase in bone mass in adolescent mice. Toxicological Sciences. 149 (2), 277-288 (2016).
- Chaudhary, L. R., Hofmeister, A. M., Hruska, K. A. Differential growth factor control of bone formation through osteoprogenitor differentiation. Bone. 34 (3), 402-411 (2004).
- George, E. L., Truesdell, S. L., York, S. L., Saunders, M. M. Lab-on-a-chip platforms for quantification of multicellular interactions in bone remodeling. Experimental Cell Research. 365 (1), 106-118 (2018).
- Truesdell, S. L., George, E. L., Saunders, M. M. Cellular considerations for optimizing bone cell culture and remodeling in a lab-on-a-chip platform. Biotechniques. , In review (2019).
- Truesdell, S. L., George, E. L., Seno, C. E., Saunders, M. M. 3D printed loading device for inducing cellular mechanotransduction via matrix deformation. Experimental Mechanics. 59 (8), 1223-1232 (2019).
- George, E. L., Truesdell, S. L., Magyar, A. L., Saunders, M. M. The effects of mechanically loaded osteocytes and inflammation on bone remodeling in a bisphosphonate-induced environment. Bone. 127, 460-473 (2019).
- George, E. L. Quantifying the roles of stimulated osteocytes and inflammation in bone remodeling Doctor of Philosophy. , University of Akron. (2019).
- York, S. L., Sethu, P., Saunders, M. M. In vitro osteocytic microdamage and viability quantification using a microloading platform. Medical Engineering & Physics. 38 (10), 1115-1122 (2016).
- Hui, A. Y., Wang, G., Lin, B., Chan, W. T. Microwave plasma treatment of polymer surface for irreversible sealing of microfluidic devices. Lab Chip. 5 (10), 1173-1177 (2005).
- Millare, B., et al. Dependence of the quality of adhesion between poly(dimethylsiloxane) and glass surfaces on the conditions of treatment with oxygen plasma. Langmuir. 24 (22), 13218-13224 (2008).
- Lee, J. N., Park, C., Whitesides, G. M. Solvent compatibility of poly(dimethylsiloxane)-based microfluidic devices. Analytical Chemistry. 75 (23), 6544-6554 (2003).
- Regehr, K. J., et al. Biological implications of polydimethylsiloxane-based microfluidic cell culture. Lab Chip. 9 (15), 2132-2139 (2009).
- Wang, Y., Burghardt, T. P. Uncured PDMS inhibits myosin in vitro motility in a microfluidic flow cell. Analytical Biochemistry. 563, 56-60 (2018).
- Millet, L. J., Stewart, M. E., Sweedler, J. V., Nuzzo, R. G., Gillette, M. U. Microfluidic devices for culturing primary mammalian neurons at low densities. Lab Chip. 7 (8), 987-994 (2007).
- Kilic, O., et al. Brain-on-a-chip model enables analysis of human neuronal differentiation and chemotaxis. Lab Chip. 16 (21), 4152-4162 (2016).
- Van Scoy, G. K., et al. A cellular automata model of bone formation. Mathematical Biosciences. 286, 58-64 (2017).
- Truesdell, S. L., Saunders, M. M. Bone remodeling platforms: Understanding the need for multicellular lab-on-a-chip systems and predictive agent-based models. Mathematical Biosciences and Engineering. 17 (2), 1233-1252 (2020).
