Summary
Aquí, presentamos protocolos para analizar la remodelación ósea dentro de una plataforma de laboratorio en un chip. Un dispositivo de carga mecánica impreso en 3D se puede emparejar con la plataforma para inducir la transducción de mechanostratos de osteocitos deformando la matriz celular. La plataforma también se puede utilizar para cuantificar los resultados funcionales de remodelación ósea de osteoclastos y osteoblastos (resorción/formación).
Abstract
La remodelación ósea es un proceso estrictamente regulado que se requiere para el crecimiento y la reparación esquelética, así como para adaptarse a los cambios en el entorno mecánico. Durante este proceso, los osteocitos mecanosensibles regulan las respuestas opuestas entre los osteoclastos catabólicos y los osteoblastos anabólicos. Para comprender mejor las vías de señalización altamente intrincadas que regulan este proceso, nuestro laboratorio ha desarrollado una plataforma fundamental de laboratorio en chip (LOC) para analizar los resultados funcionales (formación y resorción) de la remodelación ósea dentro de un sistema a pequeña escala. Como la remodelación ósea es un proceso largo que se produce en el orden de semanas o meses, desarrollamos protocolos de cultivo celular a largo plazo dentro del sistema. Los osteoblastos y osteoclastos se cultivaron en sustratos de actividad funcional dentro del LOC y se mantuvieron hasta siete semanas. Posteriormente, las virutas se desmontaron para permitir la cuantificación de la formación y resorción ósea. Además, hemos diseñado un dispositivo de carga mecánica impreso en 3D que se empareja con la plataforma LOC y se puede utilizar para inducir la transducción de mecanocitos de osteocitos deformando la matriz celular. Hemos optimizado los protocolos de cultivo celular para osteocitos, osteoblastos y osteoclastos dentro de la plataforma LOC y hemos abordado las preocupaciones de esterilidad y citotoxicidad. Aquí, presentamos los protocolos para fabricar y esterilizar el LOC, sembrar células en sustratos funcionales, inducir la carga mecánica y desmontar el LOC para cuantificar los resultados de los endpoints. Creemos que estas técnicas sentan las bases para desarrollar un verdadero órgano en un chip para la remodelación ósea.
Introduction
El hueso es un tejido altamente dinámico que requiere una coordinación intrincada entre los tres tipos principales de células: osteocitos, osteoblastos y osteoclastos. Las interacciones multicelulares entre estas células son responsables de la pérdida ósea que se produce durante la parálisis y la inmovilidad a largo plazo y de la formación ósea que se produce en respuesta al crecimiento y al ejercicio. Los osteocitos, el tipo de célula ósea más abundante, son altamente sensibles a los estímulos mecánicos aplicados al hueso. La estimulación mecánica altera la actividad metabólica de los osteocitos y conduce a un aumento de las moléculas clave de señalización1,2. A través de este proceso, conocido como mecanotransducción, los osteocitos pueden coordinar directamente las actividades de osteoblastos (células formadoras de huesos) y osteoclastos (células resorteantes óseas). Mantener la homeostasis ósea requiere una regulación estricta entre la formación ósea y las tasas de resorción ósea; sin embargo, las alteraciones en este proceso pueden resultar en estados de la enfermedad como osteoporosis u osteopetrosis.
La complejidad de las interacciones entre estos tres tipos de células se presta bien a la investigación utilizando tecnologías microfluídicas y de laboratorio en chip (LOC). Para ello, nuestro laboratorio ha establecido recientemente una prueba de concepto de una plataforma LOC para analizar la resorción ósea y la formación (resultados funcionales) en el proceso de remodelación ósea. La plataforma se puede utilizar para el estudio de interacciones celulares, entornos de carga alterados y pruebas de detección de drogas en investigación. En los últimos años, se han desarrollado varios dispositivos microfluídicos para investigar las vías de señalización molecular que regulan la remodelación ósea; sin embargo, muchos de estos sistemas cuantifican la remodelación a través de marcadores indirectos que son indicativos de la actividad funcional3,4,5,6,7. Una ventaja de nuestro sistema es que se puede utilizar para la cuantificación directa de los resultados funcionales. La remodelación ósea es un proceso a largo plazo. Como tal, la cuantificación directa de la resorción y formación ósea requiere un sistema de cultivo que se pueda mantener durante un mínimo de varias semanas a meses8,9,10,11. Por lo tanto, al desarrollar la plataforma LOC, establecimos protocolos de cultivo a largo plazo necesarios para la formación y resorción y hemos mantenido células dentro del sistema hasta siete semanas11. Además, incorporamos sustratos de cultivo apropiados para ambos tipos de células en la plataforma; los osteoclastos se cultivaban directamente en los huesos, y los osteoblastos, que se sabe que eran adherentes plásticos, se cultivaban en discos de poliestireno. Además, abordamos cuestiones relativas a la esterilidad, la citotoxicidad a largo plazo y el desmontaje de virutas para el análisis de remodelación11,12.
La plataforma LOC también se puede utilizar para inducir la mecanotransducción de mecanocitos osteocitos a través de la deformación de la matriz. Se desarrolló un dispositivo de carga mecánica impreso en 3D para emparejarse con el LOC y aplicar una distancia estática fuera del plano para estirar las celdas13. Para acomodar esta carga mecánica, se incrementó la profundidad del pozo dentro del LOC. Este dispositivo de carga mecánica simple a pequeña escala puede ser fácilmente producido por laboratorios con experiencia de ingeniería limitada, y hemos compartido previamente dibujos de los componentes impresos en 3D13. En el trabajo actual, demostramos algunas de las técnicas novedosas necesarias para el uso exitoso del LOC. Específicamente, demostramos la fabricación de virutas, la sembrado celular en sustratos funcionales, la carga mecánica y el desmontaje de virutas para la cuantificación de remodelación. Creemos que la explicación de estas técnicas se beneficia de un formato visual.
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Protocol
1. Preparación de la máscara de chip
NOTA: Los pasos 1.1 - 1.3 solo deben realizarse una vez al recibir la máscara de chip inicial. Aseguran que la máscara no se incline durante el uso. El diseño de las máscaras microfluídicas fue descrito previamente11,14. Las máscaras fueron diseñadas internamente y fabricadas comercialmente utilizando estereolitografía de alta resolución(Figura 1A).
- Cubra la superficie superior de la máscara con láminas de plástico para proteger esta superficie del adhesivo. Fije la máscara de viruta a una hoja de acrílico de igual tamaño utilizando adhesivo en aerosol. Sujete las piezas durante la noche para permitir que el adhesivo se cure por completo. Después de que el adhesivo esté seco, retire las láminas de plástico de la parte superior de la máscara.
- Fije la parte inferior de la hoja de acrílico a una caja de nivelación impresa en 3D(Figura Suplementaria 1, Archivos Suplementarios 1-4) utilizando cinta adhesiva de doble cara. Presione firmemente para asegurar un enlace apretado.
- Selle las aberturas pequeñas cerca de la pared desmontable de la caja nivelada con un sellador impermeable. Deje que el sellador se cure durante 24 horas.
- Limpie la superficie de la máscara con un 70% de etanol (EtOH). Coloque la caja de nivelación con la máscara de viruta deseada en el horno. Utilice un transportador digital para asegurarse de que la parte superior de la máscara está nivelada. Ajuste los tornillos de nivelación si es necesario.
2. Fabricación de PDMS
NOTA: Un diseño de viruta de pozo poco profundo (1 mm) se utiliza para ensayos de actividad funcional (formación y remordición), y un diseño de viruta de pozo profundo (10 mm) se utiliza para estudios de carga mecánica. La parte inferior del pozo profundo se forma mediante la fijación de una membrana DELGADA independiente PDMS(Figura 1B).
- Capa de tapa (Capa 1)
- Combine 63 g de prepolímero PDMS y 6,3 g de agente de curado (10:1 de proporción) en una taza de plástico. Mezclar bien con una espátula de celda desechable y desgasen se despide en un desecador al vacío durante 30 min.
- Vierta lentamente la mezcla en la caja de nivelación preparada. Deje que el PDMS se quede durante 30 minutos y luego hornee a 45 oC durante 18 h.
- Afloje los bordes del PDMS con una espátula de laboratorio cónica y retire la hoja de polímero de la caja de nivelación.
- Corte las tapas individuales a medida (70 mm x 34 mm) utilizando un bisturí y una plantilla impresa en 3D.
- Perforar los orificios de acceso a través de cada tapa con un punzón de biopsia (1 mm de diámetro).
- Limpie las tapas de la superficie con cinta adhesiva.
NOTA: Si las tapas no se utilizan inmediatamente, envuelva cada una en cinta de embalaje y guárdelas a temperatura ambiente (RT).
- Capa de pozo y microcanal (Capa 2)
- Combine el prepolímero PDMS y el agente de curado (10:1 de proporción) en una taza de plástico. El diseño de pozos poco profundos requiere 43 g de prepolímero y 4,3 g de agente de curado, y el diseño de pozo profundo requiere 227 g de prepolímero y 22,7 g de agente de curado. Mezclar el polímero vigorosamente y desgasificación durante 30 min.
NOTA: Esto supone una dimensión de máscara de 152,4 mm x 152,4 mm. - Vierta lentamente la mezcla sobre la mascarilla prenivelada apropiada. Deje que el PDMS se quede durante 30 minutos y luego hornee a 45 oC durante 18 h.
- Afloje los bordes del PDMS con una espátula de laboratorio cónica y pele cuidadosamente el polímero lejos de la máscara. Utilice un bisturí y una plantilla impresa en 3D para cortar virutas individuales.
NOTA: Para los estudios de carga es importante que las dimensiones de la viruta (70 x 34 mm) sean precisas y que el pozo se encuentre en el centro del chip. - Limpie el PDMS con cinta adhesiva.
NOTA: Si los chips no se utilizan inmediatamente, envuelva cada chip en cinta de embalaje y guárdelos en RT.
- Combine el prepolímero PDMS y el agente de curado (10:1 de proporción) en una taza de plástico. El diseño de pozos poco profundos requiere 43 g de prepolímero y 4,3 g de agente de curado, y el diseño de pozo profundo requiere 227 g de prepolímero y 22,7 g de agente de curado. Mezclar el polímero vigorosamente y desgasificación durante 30 min.
- Membrana Thin PDMS (Capa 3)
NOTA: Esta capa solo se utiliza para el diseño de pozos profundos.- Añadir 12,7 g de prepolímero PDMS y 1,3 g de agente de curado (10:1 de proporción) a una taza de plástico. Mezclar vigorosamente y desgasifigas durante 30 min.
- Vierta lentamente el polímero en la caja de nivelación preparada y raspe completamente la taza de plástico para eliminar tanto PDMS como sea posible.
- Utilice la espátula celular para distribuir PDMS en toda la superficie.
NOTA: Si el polímero no se extiende manualmente, la tensión superficial será suficiente para evitar que el polímero forme una lámina uniforme. - Deje que el PDMS se quede durante 30 minutos y luego hornee a 45 oC durante 18 h.
- Afloje los bordes del PDMS con una espátula cónica y retire cuidadosamente la hoja PDMS de la caja de nivelación. Corte membranas individuales que coincidan con las dimensiones de la capa 2.
- Mida el espesor de la membrana en el centro de la membrana utilizando pinzas. Deseche las membranas que estén fuera del espesor deseado (0,5 mm a 0,1 mm).
- Limpie cuidadosamente las membranas con cinta adhesiva de embalaje y colóquelas en una pieza de película de parafina.
NOTA: Si las membranas no se utilizan inmediatamente, cubra la parte superior de la membrana con cinta adhesiva de embalaje y guárdelas en RT.
3. Sustratos de actividad funcional
NOTA: Los discos de poliestireno y las obleas óseas deben estar unidos a la parte inferior de los pozos que se utilizarán para los cultivos de osteoblastos y osteoclastos, respectivamente.
- Discos de poliestireno (Figura 1C)
- Coloque la cinta de enmascaramiento en la parte posterior de un cubreobjetos de poliestireno tratado con cultivo de tejido. Corte los discos circulares de la cubierta con un perfil de corcho afilado (5,4 mm de diámetro). Sumerja los discos en 70% EtOH y déjelos pasar la noche.
- Frota suavemente la superficie superior del disco con un aplicador con punta de algodón empapado en 70% EtOH. Asegúrese de que el borde exterior del disco esté bien limpiado.
- Con dos pares de fórceps, sostenga el disco y retire el respaldo de cinta adhesiva. Coloque el disco tratado hacia abajo y limpie la parte posterior con un aplicador con punta de algodón.
- Sumerja el extremo de madera de un aplicador con punta de algodón en una mezcla desgasifada de PDMS sin curar y coloque una pequeña cantidad del polímero en la parte inferior del pozo deseado.
NOTA: Los PDMS no curados restantes se pueden almacenar a -20 oC. - Coloque el disco de poliestireno, tratado hacia arriba, en el pozo y presione suavemente hacia abajo sobre el disco con un hisopo de algodón. Asegúrese de que ningún PDMS no curado entre en contacto con el lado tratado del disco.
NOTA: Si PDMS entra en contacto con la superficie tratada del disco, extraiga el disco del pozo y repita los pasos 3.1.4 y 3.1.5 con un disco nuevo. - Deje que la viruta se sitúe en una superficie nivelada durante 30 minutos y luego hornee a 65 oC durante 4 h.
- Obleas óseas
- Utilice fórceps para colocar una oblea ósea (6 mm de diámetro, 0,4 mm de espesor) en la parte inferior de un plato de 100 mm. Mantenga la oblea firme con los fórceps y encienda suavemente una 'X' en la parte posterior de la oblea con un bisturí.
NOTA: Durante el proceso de toma de imágenes, la 'X' se utiliza para distinguir entre la parte posterior de la oblea y la superficie en la que se sembraron las células. - Utilice el extremo de madera de un aplicador con punta de algodón para añadir una pequeña cantidad de PDMS sin curar a la parte inferior del pozo deseado. Coloque la oblea ósea, marcada hacia abajo, en el pozo y use un aplicador de punta de algodón para presionar la oblea hacia abajo.
- Deje que la viruta se sitúe en una superficie nivelada durante 30 minutos y luego hornee a 65 oC durante 4 h.
- Utilice fórceps para colocar una oblea ósea (6 mm de diámetro, 0,4 mm de espesor) en la parte inferior de un plato de 100 mm. Mantenga la oblea firme con los fórceps y encienda suavemente una 'X' en la parte posterior de la oblea con un bisturí.
4. Montaje y esterilización de virutas
- Active las superficies de la capa 1 y la capa 2 con un limpiador de plasma durante 30 s utilizando un ajuste de potencia de radiofrecuencia media (RF) (equivalente a aproximadamente 10,2 W).
- Alinee los orificios de acceso en la capa 1 con los microcanales de la capa 2 y presione firmemente las dos capas juntas.
- Para el diseño de pozo profundo, repita el paso 4.1 con la capa 2 y la capa 3. Durante el tratamiento de plasma, utilice cinta adhesiva de doble cara para unir la película de parafina de la capa 3 a una superficie plana.
- Utilice un bisturí para recortar el exceso de material de la membrana PDMS. Retire cuidadosamente la hoja de película de parafina de la parte inferior del chip
- Hornee el chip a 65 oC durante 10 minutos para aumentar la resistencia de la unión entre las capas de PDMS.
- Inserte las puntas dosificadoras en ángulo (18 Gauge, 0.5 in, 90o) en los orificios de acceso de la tapa. Fije las puntas dosificadoras a la tapa con un epoxi de dos partes. Utilice una punta de micropipette para aplicar el epoxi alrededor de cada punta dispensadora.
- Después de que el epoxi se haya curado completamente, limpie la superficie con un 70% de EtOH y colóquelo en un gabinete de bioseguridad. Realice todos los pasos posteriores dentro del gabinete de bioseguridad.
- Conecte una jeringa de 5 ml a las puntas dosificadoras con tubos de silicona estériles (1/32'' ID, 10 cm de longitud) y llene todo el chip con 70% EtOH durante al menos 30 s. Para el diseño de pozos poco profundos, administre todos los líquidos con una bomba de jeringa establecida a un caudal de 4 ml/h. Para el diseño de pozo profundo, administre todos los líquidos dispensando lentamente la jeringa a mano.
- Retire el EtOH del chip y esterilice el chip con luz UV durante la noche.
- Lavar el chip 3 veces con dH2O. Llenar el chip con dH2O, retirar el tubo de las puntas dosificadoras e incubar durante al menos 48 h a 37 oC.
5. Montaje del dispositivo de carga mecánica
NOTA: Los procesos de diseño y fabricación para el dispositivo de carga mecánica impreso en 3D(Figura 2A-C)se describieron previamente y se han proporcionado previamente13.
- Autoclave todos los componentes del dispositivo de carga durante 30 min a 121 oC.
NOTA: Para evitar la deformación de los componentes impresos, envuelva cada pieza individualmente en papel de aluminio y colóquela sobre una superficie plana dura durante el proceso de autoclave. El hardware metálico se puede envolver juntos. Complete todos los pasos posteriores dentro de un gabinete de bioseguridad. - Coloque un muelle de compresión alrededor del eje de la platina e inserte la platina en el orificio central en la parte inferior de la base (Figura 2D).
- Fije el bloque de esfera a la parte inferior de la base utilizando cuatro tornillos autorroscantes.
- Coloque un segundo resorte de compresión alrededor del tornillo central. Inserte el tornillo en el orificio en forma hexagonal en la parte inferior de la esfera y atornille el ensamblaje en el orificio roscado en el centro del bloque de marcado.
- Atornille cuatro separaciones hombre-mujer en la parte inferior de la base.
- Retire la holgura del dispositivo girando el dial en sentido antihorario hasta que la parte superior de la platina esté por debajo de la parte superior de la base. A continuación, gire lentamente el dial en el sentido de las agujas del reloj hasta que la parte superior de la platina esté nivelada con la parte superior de la base.
6. Experimentación
NOTA: Los protocolos para experimentos de actividad funcional se proporcionaron anteriormente11,12.
- Estudios de carga (Figura 3)
- Siguiendo el paso 4.9, utilice una jeringa de 5 ml para extraer dH2O del chip de pozo profundo. Recubrir la parte inferior del pozo con 200 ml de colágeno tipo I de 0,15 mg/ml (CTI) en 0,02 M de ácido acético durante 1 h.
- Enjuague el chip tres veces con la solución salina con fosfato de Dulbecco con calcio y magnesio (DPBS++).
- Coloque el chip en el soporte de virutas y la semilla con osteocitos MLO-Y4 a una densidad de 2 x 104 células/ml en un medio alfa esencial mínimo (MEM) complementado con un 5% de suero de ternera, un 5% de suero bovino fetal y un 1% de penicilina/estreptomicina.
- Retire el tubo de las puntas dosificadoras y coloque el chip en un plato de cultivo de pozo profundo (150 mm x 25 mm). Incubar células a 37oC y 5%co2 durante 72 h.
- Coloque el tubo estéril en las puntas de dosificación y utilice una jeringa de 5 ml para eliminar el medio de cultivo gastado de la viruta. Dispensar lentamente en un medio de cultivo fresco para rellenar la viruta.
- Coloque el soporte de la viruta en el retén rectangular en la parte superior de la base del dispositivo de carga. Alimente el tubo a través de las ranuras situadas en la tapa del dispositivo de carga y fije la tapa a la base con cuatro tornillos de cabeza de sartén y tuercas hexagonales.
NOTA: Para asegurarse de que la tapa permanece nivelada, primero fije dos tornillos que se encuentran diagonalmente entre sí antes de fijar los dos tornillos restantes. - Aplique la carga a las células girando el dial en el sentido de las agujas del reloj hasta que se alcance el desplazamiento deseado de la platina.
NOTA: El dispositivo está diseñado para que una rotación de la esfera equide a un desplazamiento de platina de 1 mm. El campo de deformación unitaria generado en la parte superior de la membrana PDMS se modeló previamente como una función de desplazamiento de platina utilizando el análisis de elementos finitos (FEA)13. - Coloque el dispositivo de carga en una caja de punta de micropipeta P1000 vacía. Incubar las células con la carga aplicada durante 15 min.
NOTA: El período de tiempo de carga utilizado aquí sirve de ejemplo. Se pueden utilizar tiempos de carga alternativos. - Después de la incubación, retire la carga de las celdas girando el dial en sentido antihorario hasta que la platina vuelva a la posición inicial original. Retire la tapa del dispositivo y coloque el soporte de la viruta en la placa de cultivo de pozo profundo. Incubar las celdas durante un período de recuperación posterior a la carga de 90 minutos.
NOTA: Una vez más, el período de tiempo de recuperación utilizado aquí sirve como ejemplo. Se pueden utilizar tiempos de recuperación alternativos. Para estudios a largo plazo, alimentar las células cada 72 h. - Utilice una jeringa de 5 ml para extraer el medio acondicionado del chip.
NOTA: Este medio se puede guardar y almacenar a -80 oC. - Retire el chip del soporte de la viruta y utilice una espátula cónica para romper el vínculo entre la tapa PDMS y la capa de pozo.
NOTA: Los ensayos celulares ahora se pueden realizar siguiendo cualquier protocolo establecido para una placa de cultivo celular.
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Representative Results
La configuración de pozos poco profundos se puede utilizar para analizar la actividad funcional de osteoblastos y osteoclastos. La formación ósea a través de osteoblastos y resorción a través de osteoclastos requiere tiempos de cultivo en el orden de varias semanas a meses. La formación ósea a partir de preosteoblastos MC3T3-E1 se cuantificó utilizando rojo alizarin y manchas de von Kossa11,15. En el día 49, la superficie media teñida de rojo alizarina fue del 10,7% a 2,2% (media de los errores estándar de la media)11. La superficie media teñida con von Kossa fue del 6,4% a 1,6%11. La Figura 4A muestra los resultados típicos de la formación de cultivos de osteoblastos en el día 49 teñido con rojo alizarin y von Kossa. La resorción ósea de los preosteoclastos RAW264.7 se cuantificó utilizando la tinción azul de toluidina 11,15. En el día 30 la superficie media teñida de azul toluidina era del 30,4% a 4,5%11. La Figura 4B muestra los resultados típicos de resorción ósea de cultivos osteoclastos manchados de azul toluidina en el día 30. Se realizó una microscopía electrónica de barrido para verificar la presencia de pozos de resorción. Los resultados típicos se muestran en la Figura 4C. Estos resultados demuestran que las células dentro del dispositivo permanecen viables y funcionalmente activas durante al menos siete semanas.
Se diseñó y fabricó un dispositivo de carga impreso en 3D para adaptarse a la configuración de chip de pozo profundo. Juntos, este sistema puede inducir la mecanotransducción de los osteocitos estirando las células a través de una distensión estática fuera del plano. La incubación de 48 h del chip descrito en el paso 4.9 ha demostrado ser un proceso crítico para mantener la viabilidad celular y la morfología típica. La Figura 5A muestra imágenes representativas de los osteocitos MLO-Y4 a 72 h sembradas en virutas con y sin este período de incubación. Durante los bouts de carga, los osteocitos fueron expuestos a un gradiente de tensión inducido en la membrana PDMS en la que se sembraron las células(Vídeo Suplementario 1). Las cepas equivalentes generadas durante este proceso se modelaron con FEA13 y se determinó la cepa equivalente media producida en la parte superior de la membrana PDMS. La Figura 5B muestra la relación entre la deformación unitaria equivalente media y el desplazamiento de la platina para valores entre 1 y 2 mm. En la Figura 5Cse muestra un mapa de calor representativo del gradiente de tensión inducido. En este ejemplo, un desplazamiento de platina de 1,5 mm generó una cepa equivalente media de 12,29% en la parte superior de la membrana. Este modelo también demuestra que las destensiones inducidas cerca del centro del pozo son relativamente bajas y aumentan gradualmente radialmente hacia afuera, con deformaciones máximas generadas directamente sobre el borde exterior de la platina. Tras la carga, se analizó la viabilidad celular con la tinción de lactato deshidrogenasa y el ensayo anexo V y células muertas14,16. Los resultados típicos se muestran en la Figura 5D,E, respectivamente.
Figura 1: Dispositivo microfluídico. (A) Fabricación y nivelación de la máscara de viruta. (Izquierda) Esquema de la máscara de chip de pozo profundo que fue diseñado internamente utilizando el software CAD. (Medio) Imagen de la máscara de chip de pozo profundo que se imprimió comercialmente utilizando estereolitografía de alta resolución. (Derecha) La máscara se coloca dentro de una caja de nivelación impresa en 3D para asegurarse de que la máscara permanece nivelada durante la fundición de la capa 2 de las fichas. (B) Esbozos de los diseños de pozos profundos y pozos profundos del dispositivo. (Arriba) El diseño de pozos poco profundos se utilizó para analizar la actividad funcional (formación y resorción) de osteoblastos y osteoclastos. Esta configuración se forma a partir de dos capas PDMS. Un sustrato de actividad funcional se aseguró a la parte inferior del cultivo bien antes de sellar las capas juntas. Los discos de poliestireno y las obleas óseas se utilizaron para cultivos de osteoblastos y osteoclastos, respectivamente. (Abajo) El diseño de pozo profundo se utilizó para aplicar carga mecánica a los osteocitos. Esta configuración consta de tres capas PDMS. La parte inferior del pozo de cultivo está formada por la membrana PDMS deformable (capa 3). (C) Pasos de fabricación para el disco de poliestireno utilizado para cultivos de osteoblastos. La parte posterior de un cubreobjetos tratado con cultivo de tejido estaba marcada con cinta adhesiva. Los discos individuales fueron cortados con un cornoque. El disco fue limpiado con etanol y un hisopo de algodón. El respaldo de cinta se eliminó y el disco se adjuntó a la parte inferior del pozo de la cultura PDMS. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Diseño y montaje del dispositivo de carga mecánica. (A) Imagen del dispositivo de carga mecánica montado. Cuando se combina con el diseño de pozo profundo del chip PDMS, el dispositivo de carga estira las células aplicando una distensión fuera del plano a una membrana deformable. (B) Vista explosionada del dispositivo. Todas las piezas mostradas en azul fueron impresas en 3D con un filamento de ácido poliláctico resistente al calor. Todo el hardware es de acero inoxidable. (C) Mecanismo de toma de tornillo del dispositivo de carga. La rotación del tornillo central (naranja) empuja la platina (verde) hacia arriba a través de la base. El movimiento ascendente de la platina deforma la membrana PDMS del chip de pozo profundo en el que se han sembrado las células. (D) Proceso de montaje del dispositivo de carga. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Experimento de carga mecánica. Todos los líquidos se administraron y retiraron del chip utilizando una jeringa de 5 ml conectada al tubo de acceso. Un paso crítico en este proceso es la incubación de 48 h con agua destilada estéril antes de la sembración celular. Sin esta incubación las células mostraron baja viabilidad y morfología atípica. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Resultados típicos de la actividad funcional. (A) Resultados típicos de la formación manchados de rojo alizarina (izquierda) y von Kossa (derecha) de cultivos de osteoblastos INducidos MC3T3-E1 en el día 49. Las imágenes de disco completo miden 5,4 mm de diámetro. (B) Resultados típicos de resorción de osteoclastos de preosteoclastos RAW264.7 inducidos con activador del receptor del ligando del factor nuclear kappa-B (RANKL). Las células se cultivaban en obleas óseas y se tiñían con azul toluidina en el día 30. (C) Imágenes típicas de microscopía electrónica de barrido que verifican la presencia de fosas de resorción en obleas óseas. La barra de escala en la imagen superior representa 200 m y la barra de escala en la imagen inferior representa 50 m. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Efectos de la tensión inducida mecánicamente en los osteocitos. (A) Imágenes de osteocitos MLO-Y4 a 72 h en el chip de pozo profundo fabricado con (izquierda) y sin (derecha) una incubación de 48 h con agua destilada antes de la sembración celular. (B) El análisis de elementos finitos se utilizó para modelar la cepa equivalente media generada en la parte superior de la membrana PDMS deformable en función del desplazamiento de la platina del dispositivo de carga. Se muestran los resultados de desplazamientos entre 1,0 mm y 2,0 mm. (C) Mapa de calor del gradiente de tensión modelado inducido en la membrana PDMS para un desplazamiento de platina de 1,5 mm. (D) Resultados típicos de una mancha de lactato deshidrogenasa de los osteocitos inducidos por fármacos que se estiraron utilizando un desplazamiento de platina de 1,5 mm. Se observa una tinción celular más clara cerca del borde exterior del pozo, que corresponde a la ubicación de valores de tensión más altos indicativos de daño celular y/o muerte. (E) Resultados representativos de la citometría de flujo de apoptosis inducida por la carga indicados por un anexo V y un ensayo de células muertas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura suplementaria 1: Caja de nivelación impresa en 3D con pared desmontable. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Archivo suplementario 1: Archivo CAD de cuadro de nivelación 1. Haga clic aquí para ver este archivo (haga clic con el botón derecho para descargar).
Archivo suplementario 2: Archivo CAD de cuadro de nivelación 2. Haga clic aquí para ver este archivo (haga clic con el botón derecho para descargar).
Archivo suplementario 3: Archivo CAD de cuadro de nivelación 3. Haga clic aquí para ver este archivo (haga clic con el botón derecho para descargar).
Archivo suplementario 4: Lista de hardware del cuadro de nivelación. Haga clic aquí para ver este archivo (haga clic con el botón derecho para descargar).
Vídeo suplementario 1: Dispositivo de carga mecánico. Haga clic aquí para ver este archivo (haga clic con el botón derecho para descargar).
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Discussion
Este artículo describe los fundamentos para fabricar una plataforma LOC de remodelación ósea para el cultivo de osteocitos, osteoclastos y osteoblastos. Al alterar la profundidad y el tamaño del pozo dentro del chip, se desarrollaron múltiples configuraciones para estimular los osteocitos con carga mecánica y cuantificar los resultados funcionales de la remodelación ósea(Figura 1B).
Durante el montaje de la viruta, la optimización del protocolo de oxidación plasmática fue fundamental para eliminar los problemas de fugas. Encontramos que exponer las superficies pdmS a 30 s de plasma de oxígeno generado usando un ajuste de potencia de RF medio (paso 4.1), igual a aproximadamente 10,2 W, era suficiente para crear un vínculo fuerte entre las capas. La integridad de la unión disminuyó cuando se utilizaron tiempos de exposición más largos o un ajuste de potencia de RF más alto. Esto es consistente con informes anteriores que observaron una sobreexposición de PDMS al plasma de oxígeno que aumentó la rugosidad de la superficie y redujo la adherencia17,18.
Además, el mantenimiento de la alta viabilidad celular y la morfología celular típica dependían críticamente del proceso de curado de PDMS. El polímero PDMS consiste en oligómeros de dimetilsiloxano reticulados. Este proceso de reticulación depende tanto del tiempo como de la temperatura; sin embargo, incluso con un curado extenso, el polímero no polimeriza completamente19. Se ha demostrado que los oligómeros restantes se lixivian del polímero a granel en el medio de cultivo celular circundante e incluso se han encontrado en las membranas de las células cultivadas en la superficie del polímero20. Varios grupos han notificado efectos citotóxicos de los oligomeros PDMS no reticulados21,22,23. Para abordar esta preocupación en nuestro sistema, optimizamos el proceso de curado de PDMS. Aunque la velocidad de curado de PDMS depende de la temperatura, las propiedades del material de nuestras máscaras de viruta restringen nuestra temperatura de curado a 45 oC. Como tal, determinamos que las fichas deben ser horneadas por un mínimo de 18 h. Además, hemos encontrado que la incubación de chips con dH2O durante al menos 48 horas antes de la sembración celular (paso 4.9) era necesaria para reducir los efectos citotóxicos. La Figura 5A muestra los osteocitos MLO-Y4 cultivados en chips con y sin este período de incubación.
La configuración de pozo profundo, que fue diseñada para adaptarse a la aplicación de carga mecánica, requiere que el chip se fabrica a partir de tres capas separadas. A diferencia de la configuración de pozo sano, la fabricación de las porciones de pozo y membrana como una sola pieza para la configuración de pozo profundo hizo que la membrana se deforme. Esto puede deberse a una diferencia en las tasas de curado entre las partes gruesas y delgadas del chip. Para superar este problema, la capa de membrana se construyó por separado y se unió a la parte inferior del chip después del proceso de curado. Para generar una capa de membrana separada con espesor uniforme, es fundamental que la caja de nivelación esté completamente nivelada antes de agregar el PDMS (paso 1.4). Como tal, se recomienda el uso de un transportador digital para garantizar un alto grado de precisión. Además, durante el paso 2.3.2, es fundamental eliminar tanto PDMS de la taza de plástico como sea posible. Las incoherencias en este paso conducirán a altas desviaciones en los espesores de las membranas, y en última instancia a altas desviaciones en la cepa de sustrato promedio utilizada para inducir la mecanotransducción de los osteocitos.
Nuestra plataforma de remodelación ósea proporciona un alto grado de versatilidad. Este sistema se puede utilizar para investigar una variedad de factores que regulan la remodelación ósea, como la mecanotransducción inducida por la carga, la señalización multicelular, la inflamación o los efectos de los medicamentos. Por ejemplo, el sistema se utilizó para analizar los efectos combinados de la carga mecánica y la inflamación en la remodelación ósea en un entorno inducido por fármacos14. Se aplicó carga mecánica a los osteocitos tratados con bisfosfonato. El análisis proteico del medio acondicionado reveló un aumento significativo en los niveles de leptina y osteonectina y una disminución significativa en los niveles de CCL21 y CD36 en comparación con los osteocitos que no estaban cargados mecánicamente14.
Los protocolos presentados aquí proporcionan una base para el cultivo de cada tipo de célula dentro del LOC, así como métodos para inducir la carga mecánica y cuantificar la actividad funcional. En el futuro, estamos trabajando hacia un verdadero órgano óseo en un chip. Además, creemos que el uso de nuestro sistema para desarrollar sistemas de modelado matemático podría mejorar en gran medida nuestra comprensión de los complejos procesos de señalización multicelular que regulan la remodelación ósea24,25.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por la National Science Foundation bajo Grant No. (CBET 1060990 y EBMS 1700299). Además, este material se basa en el trabajo apoyado por el Programa de Becas de Investigación de Posgrado de la Fundación Nacional de Ciencias bajo la Beca No. (2018250692). Todas las opiniones, hallazgos, conclusiones o recomendaciones expresadas en este material son las de los autores y no reflejan necesariamente las opiniones de la Fundación Nacional de Ciencias.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acrylic sheet | Optix | -- | 3.175 mm thick |
| Angled dispensing tips | Jensen Global | JG18-0.5X-90 | Remove plastic connector prior to use |
| Biopsy punch | Robbins Instruments | RBP-10 | 1 mm diameter |
| Bone wafers | Boneslices.com | 0.4 mm thick | Bovine cortical bone |
| Bovine calf serum | Hyclone | SH30072 | |
| Calipers | Global Industrial | T9F534164 | |
| Cell spatula | TPP | 99010 | |
| Chip mask | ProtoLabs | Custom-designed | Print material: Accura SL 5530 |
| Cork borer | Fisher Scientific | 07-865-10B | |
| Cotton tipped applicator | Puritan | 806-WCL | |
| Culture dish (100 mm) | Corning | 430591 | Sterile, Non-tissue culture treated |
| Culture dish (150 mm) | Corning | 430597 | Sterile, Non-tissue culture treated |
| Double sided tape | 3M Company | Scotch 237 | |
| Fetal bovine serum | Hyclone | SH30910 | |
| Forceps | Fisher Scientific | 22-327379 | |
| Leveling box | Custom-made | -- | 3D printed |
| Masking tape | 3M Company | Scoth 2600 | |
| MC3T3-E1 preosteoblasts | ATCC | CRL-2593 | Subclone 4 |
| Mechanical loading device | Custom-made | -- | 3D printed |
| Minimum essential alpha medium | Gibco | 12571-063 | |
| MLO-Y4 osteocytes | -- | -- | Gift from Dr. Lynda Bonewald |
| Packaging tape | Duck Brand | -- | Standard packaging tape |
| Paraffin film | Bemis Parafilm | PM999 | |
| Penicillin/streptomycin | Invitrogen | p4333 | |
| Plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC-001 | Expanded plasma cleaner |
| Polydimethylsiloxane kit | Dow Corning | Sylgard 184 | |
| Polystyrene coverslips | Nunc Thermanox | 174942 | Sterile, tissue culture treated |
| Oven | Quincy Lab | 12-180 | |
| RAW264.7 preosteoclasts | ATCC | TIB-71 | |
| Scalpel | BD Medical | 372611 | |
| Silicone tubing | Saint-Gobain Tygon | ABW00001 | ID: 1/32" (0.79 mm), OD: 3/32" (2.38 mm) |
| SolidWorks software | Dassault Systèmes | -- | Used to generate 3D printed models and perform FEA |
| Spray adhesive | Loctite | 2323879 | Multi-purpose adhesive |
| Syringe (5 ml) | BD Medical | 309646 | Sterile |
| Syringe pump | Harvard Apparatus | 70-2213 | Pump 11 Pico Plus |
| Tapered laboratory spatula | Fisher Scientific | 21-401-10 | |
| Two-part expoxy | Loctite | 1395391 | 5 minute quick set |
| Type I collagen | Corning | 354236 | Rat tail collagen |
| Vacuum desiccator | Bel-Art | F42010-0000 | |
| Waterproof sealant | Gorilla | 8090001 | 100% silicone sealant |
References
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