Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Beredning av akut mänskliga Hippocampus skivor för elektrofysiologiska Recordings

Published: May 7, 2020 doi: 10.3791/61085
Automatic Translation
1, 1,2, 3, 3, 3, 1, 1,2
1Department of Neurology with Experimental Neurology, Charité-Universitätsmedizin Berlin, Freie Universität Berlin, Humboldt-Universität zu Berlin, and Berlin Institute of Health, 2NeuroCure Cluster of Excellence, Charité-Universitätsmedizin Berlin, Freie Universität Berlin, Humboldt-Universität zu Berlin, and Berlin Institute of Health, 3Department of Neurosurgery, Charité-Universitätsmedizin Berlin, Freie Universität Berlin, Humboldt-Universität zu Berlin, and Berlin Institute of Health

ERRATUM NOTICE

Summary

Det presenterade protokollet beskriver transport och beredning av resected mänskliga hippocampus vävnad med det slutliga målet att använda vitala hjärnan skivor som en preklinisk utvärdering verktyg för potentiella antiepileptiska ämnen.

Abstract

Epilepsi drabbar ca 1% av världens befolkning och leder till en allvarlig minskning av livskvaliteten på grund av pågående anfall samt hög risk för plötslig död. Trots ett överflöd av tillgängliga behandlingsalternativ är cirka 30% av patienterna läkemedelsresistenta. Flera nya terapier har utvecklats med hjälp av djurmodeller, även om andelen läkemedelsresistenta patienter fortfarande är oföränderlig. En av troliga orsaker är bristen på översättning mellan gnagare modeller och människor, såsom en svag representation av mänskliga pharmacoresistance i djurmodeller. Resected mänskliga hjärnvävnaden som en preklinisk utvärdering verktyg har fördelen att överbrygga denna translationella gap. Beskrivs här är en metod för hög kvalitet beredning av mänskliga hippocampus hjärnan skivor och efterföljande stabil induktion av epileptiform aktivitet. Protokollet beskriver induktion av burst aktivitet under tillämpning av 8 mM KCl och 4-aminopyridin. Denna verksamhet är känslig för etablerade AED-lacosamid eller nya antiepileptiska kandidater, såsom dimetyletanolamin (DMEA). Dessutom beskriver metoden induktion av beslag-liknande händelser i CA1 av mänskliga hippocampus hjärnan skivor genom minskning av extracellulära Mg2 + och tillämpning av bicuculline, en GABAA receptor blockerare. Den experimentella set-up kan användas för att skärmen potentiella antiepileptiska ämnen för deras effekter på epileptiform aktivitet. Vidare kan verkningsmekanismer som postuleras för specifika föreningar valideras med hjälp av detta tillvägagångssätt i mänsklig vävnad (t.ex. med hjälp av patch-clamp-inspelningar). Som avslutning kommer undersökningen av vitala mänskliga hjärnvävnad ex vivo (här, resected hippocampus från patienter som lider av temporala lob epilepsi) förbättra den nuvarande kunskapen om fysiologiska och patologiska mekanismer i den mänskliga hjärnan.

Introduction

Epilepsi är en av de vanligaste neurologiska sjukdomar, som påverkar 1% av världens befolkning, och är associerad med ökad sjuklighet ochdödlighet 1,2. Tyvärr är en tredjedel av patienterna som lider av epilepsi läkemedelsresistenta, trots ett överflöd av tillgängliga behandlingsalternativ inklusive mer än 20 godkända antiepileptiska läkemedel (AED)3. Underlåtenhet att översätta resultat från preklinisk djurforskning till kliniska prövningar är en anledning till att lovande behandlingsstrategier inte är effektiva hos många patienter4. Nyligen, neuropeptid Y (NPY) och galanin har visat sig ha antiepileptiska effekter i djurmodeller; dock, när de testas i resected mänskliga hjärnvävnaden, endast NPY var effektiv5.

De flesta av de befintliga kunskaper som rör grundläggande neurologiska mekanismer och metoder sjukdom terapi härrör från djurmodeller och cellodling experiment. Även om informativa, dessa modeller endast representerar enstaka aspekter av komplexa mänskliga sjukdomar och den vuxna mänskliga hjärnan nätverk. Alternativt har mänsklig hjärnvävnad potential att överbrygga den translationella klyftan men är sällan tillgänglig för funktionella studier. Till exempel, post mortem hjärnvävnad har varit ett värdefullt verktyg för att undersöka proteinuttryck, hjärnans morfologi, eller anatomiska anslutningar, även om neuronal aktivitet ofta äventyras är denna vävnad6,7,8,9,10,11.

Däremot har levande resected mänskliga hjärnvävnaden undersökts om preklinisk läkemedelsutvärdering, grundläggande neuronala funktioner och genuttryck mönster12,13,14,15,16,17. En stor fördel med mänskliga hjärnan skivor jämfört med gnagare skivor är den långa livskraften hos neuronal vävnad efter samband och beredning. Jämfört med gnagare hjärnan skivor, som vanligtvis kan registreras i upp till 8 h efter beredning, mänskliga hjärnan skivor visar stabil neuronal aktivitet i upp till 72 h, möjliggör grundlig undersökning av dessa sällsynta och värdefulla prover12,18.

Flera studier har undersökt egenskaper av epileptiform aktivitet i olika områden av resected när och hippocampus mänsklig vävnad och använt olika metoder för induktion av epileptiform aktivitet. I gnagare skivor, epileptiform aktivitet kan induceras genom flera metoder: elektrisk stimulering av GD hilar celler, ökning av extracellulära K+ (8–12 mM KCl), blockering av GABA A-receptorer genom bicuculline (BIC), blockering av kaliumkanaler med 4-aminopyridine (4-AP), och ta bort eller minska Mg2 + i extracellulär lösning19.A Induktion av epileptiform aktivitet i mänsklig vävnad kräver dock kombinationen av minst två av de ovan nämnda metoderna20,21,22.

Presenteras här är en metod för beredning av mänskliga hippocampus hjärnan skivor, som är livskraftiga för upp till 20 h och visa induktion av epileptiform aktivitet vid tillämpning av hög K+ (8 mM) och 4-AP eller låg Mg2 + och BIC.

Protocol

Patienterna måste ge skriftligt samtycke före operationen, och nödvändiga etiska avtal måste finnas före försöket. Angående de representativa resultaten granskades och godkändes alla studier som omfattade deltagare på människa av Charité-Universitätsmedizin, Berlin (EA2/111/14).

1. Beredning av 10x-lösningar

OBS: På grund av svårigheter att planera tillgång till mänskliga hjärnvävnad, rekommenderas att förbereda 10x lösningar som beskrivs här. Alternativt kan man bereda slutliga 1x-lösningar nyligen genom att tillföra enskilda ämnen i slutkoncentration till dubbeldestillerat vatten (ddH2O).

  1. För enskilda 10x-lösningar, tillsätt ämnen till ddH2O enligt tabell 1 och rör om tills de är upplösta.
  2. Använd 10x lösningar upp till 1 månad efter beredning (upp till 1 år för frysta 10x kolin aCSF).
  3. För 10x kolin aCSF, förbereda 50 mL alikvoter av 10x 1.1 kolin aCSF (Tabell 1) och frysa vid -20 °C eller -80 °C tills vidare används.
    OBS: Tillsätt inte glukos och CaCl2 till 10x 1.1 kolin aCSF att förhindra kontaminering med bakterier och utfällning av kalciumkarbonat.
  4. 10x lösning 2 kan användas för alla 1x slutliga lösningar, medan 10x lösningar 1.1–1.4 är anpassade och namnges i enlighet med detta (Tabell 1).

2. Beredning av 1x slutliga lösningar

OBS: Final 1x lösningar bör förberedas färska eller tidigaste som möjligt på dagen före användning. Alla slutliga lösningar bör carbogeneras med 5% CO2 och 95% O2 med hjälp av en glasgasdisperser för att berika lösningar med syre, och justera pH-värdet till 7,4 (max = 7,4 ± 0,2).

  1. Kolin aCSF för transport och beredning
    1. För den slutliga 500 mL-lösningen tina en 50 mL alikvot av 10x-lösningen 1.1 alikvot för kolin aCSF i 37 °C vattenbad.
    2. Tillsätt den tinade 50 mL alikvoten av 10x-lösningen 1.1 och 50 mL av 10x lösning 2 till ca 300 mL ddH2O.
    3. Tillsätt slutliga koncentrationer av glukos och CaCl2, rör sedan tills upplöst (Tabell 1, lösning 1.1).
    4. Lägg ddH2O till en slutlig volym på 500 mL och mäta osmolaritet (300 mOsm ± 10 mOsm).
    5. Använd valfritt filter för att sterilisera lösningen (se diskussionen om långvarig segmentsenlig viabilitet under sterila förhållanden).
    6. Fyll en separat flaska med cirka 100 mL 1x kolin aCSF för transport från operationsrummet till laboratoriet.
    7. Valfritt: beroende på transporttiden från operationsrummet till laboratoriet, överväg att använda gastäta flasklock för att säkerställa stabilt pH av aCSF under längre transportperioder.
    8. Förvara den slutliga lösningen på 4–8°C tills vidare används.
    9. På driftsdagen, kyla 1x kolin aCSF på is och karbida i minst 10–15 min med hjälp av en glasgas disperser ansluten till carbogen gas (5% CO2, 95% O2).
      OBS: Överväg att hålla en gasflaska åtkomlig för operationsrummet vid längre väntetider, vilket kommer att kräva åter carbogenation av transportlösningen. Vi har dock transporteras hippocampus vävnad utan re-carbogenation innan långa och korta transporttider (15 min vs 60 min) och observerade inte skillnader i induktion av epileptiform aktivitet.
  2. aCSF för lagring och inspelning
    1. För en slutlig 2 L-lösning, tillsätt 200 mL av 10x lösning 1.2 (aCSF) och 200 mL av 10x lösning 2 och glukos (Tabell 1) till ~1500 mL av ddH2O.
      OBS: Volymerna av de slutliga lösningarna beror på tillämpade experiment och vilken typ av kammare som används för förvaring och inspelning.
    2. Lägg ddH2O till en slutlig volym på 2 L och mät osmolaritet (300 mOsm ±10 mOsm).
    3. Förvärm lösningen till 35 °C och karbiogent i minst 10–15 min före användning.
  3. HighK + +4-AP aCSF för induktion av burst aktivitet+
    1. För en slutlig 1 L-lösning, tillsätt 100 mL 10x lösning 1.3 (highK++4-AP aCSF) och 100 mL av 10x lösning 2 till ~ 700 mL av ddH2O.
    2. Tillsätt glukos och 4-AP (slutkoncentration = 100 μM) enligt tabell 1.
    3. Lägg till ddH2O till slutlig volym på 1 L och mät osmolaritet (300 mOsm ±10 mOsm).
    4. Förvärm lösningen till 35 °C och karbiogent i minst 10–15 min före användning.
  4. LowMg2++BIC aCSF för induktion av anfallsliknande händelser (SLEs)
    1. För en slutlig 1 L-lösning, tillsätt 100 mL 10x lösning 1.4 (lowMg2++BIC aCSF) och 100 mL av 10x lösning 2 till ~700 mL ddH2O.
    2. Tillsätt glukos och BIC (slutkoncentration = 10 μM) enligt tabell 1.
    3. Lägg ddH2O till slutlig volym på 1 L och mät osmolaritet (300 mOsm ± 10 mOsm).
    4. Förvärm lösningen till 35 °C och karbiogent i minst 10–15 min före användning.

3. Beredning av gränssnittskammare

  1. I en gränssnittskammare vilar skivor på tre lager filterpapper för att säkerställa tillräcklig mängd lösning under segmentet. För att göra detta, skär två ~ 4 cm x ~ 2 cm bitar av filterpapper för varje skiva-hålla fack (den beskrivna gränssnitt kammaren består av två fack) och placera dem ovanpå varandra.
  2. Placera tunna bomullssträngar runt filterpapperna på 4 cm x 2 cm inuti facken för att bryta lösningens spänning. Se till att jämnt flöde (här, svarta nylonstrumpbyxor skurna till tunna strängar ~10 cm i längd används; för placering, se figur 1).
  3. Placera små bitar av filterpapper ovanpå de större filterpapperen inuti de segmenthållande facken. Små filtervävnad bitar bör vara ungefär lika stor som en hjärna skiva (~ 1,5 cm x ~ 1,0 cm) och kommer att möjliggöra ytterligare hantering av enskilda skivor. Placera tre till fyra små filterpappersbitar i varje fack.
  4. Säkerställa en aCSF-flöde på 1,8 mL/min med en peristaltisk pump.
  5. Karbiogener och förkrigsförmörka gränssnittskammaren till ~35 °C (skivans sluttemperatur bör vara ~32 °C).

4. Uppställande av beredningsområde

OBS: Beredning kan utföras under sterila förhållanden för att undvika kontaminering och förlänga skiva överlevnad. Men inte alla vibratomer passar under en steril huva, och andra åtgärder krävs för att minska kontaminering under beredningen. I detta avsnitt beskrivs några av dessa åtgärder.

  1. Torka av beredningsområdet med 70% EtOH och placera antingen aluminiumfolie eller sterila omslag ovanpå området.
  2. Förbered superlim, två vassa pincett, en spatel, en skalpell med blad, och ett blad för grov skärning av hjärnvävnaden. Verktyg kan steriliseras före ingreppet för att minska kontaminering.
  3. Torka av buffertbrickan och provplattan på vibratomen med 70% EtOH. När buffertbrickan är helt torr, täck den med aluminiumfolie och placera brickan i isbadet. Fyll isbadet med krossad is och håll vid -20 °C tills tillredningen.
  4. Torka av vibratomen och rakbladet med 70% EtOH och kalibrera vibratomen för att minimera vertikala vibrationer och vävnadsskador under skivningsproceduren.

5. Vävnadsslicering och lagring

  1. Direkt efter samband, placera vävnaden omedelbart i kall, karbiogen kolin aCSF och transportera snabbt till laboratoriet.
    FÖRSIKTIGHET: Använd handskar och en ansiktsmask hela tiden under beredningen, eftersom mänsklig hjärnvävnad kan innehålla potentiella patogener. Dessutom, bär en ansiktsmask när inte arbetar under en steril huva kommer att kraftigt minska kontaminering av lösningar och hjärnvävnad.
  2. Ta bort vävnad från kolin aCSF och skära bort eventuella brända delar av vävnad.
  3. Skär en jämn yta för att limma vävnad bit på preparatplattan, samtidigt som man överväger skärvinkel och vävnadslager. Helst innehåller en hippocampus skiva GD, CA1-4, och (om möjligt) subiculum.
  4. Skiva hjärnvävnaden i 400 μm tjocka skivor och justera amplituden och hastigheten under skärning. På grund av eventuella återstående pia mater, mänskliga hjärnvävnaden visar mer motstånd och kan kräva långsammare skärning.
    OBS: Skiva tjocklek påverkar kraftigt antingen det tillgängliga nätverket (fler nervceller i tjockare skivor) eller viabiliteten av skivan (penetration av lösning i skivan). Vi har använt 500 μm skivor för att öka potentiellt tillgängliga mikro-nätverk, och kunde inte observera skillnader i induktion av epileptiform aktivitet. 300 μm skivor används ofta för patch-clamp experiment, även om induktion av epileptiform aktivitet i dessa skivor har ännu inte testats här. Vi använder 400 μm som en standardskiva tjocklek, fast 300–500 μm skivor kan vara tillräckligt.
  5. Innan du samlar, använd en skalpell för att minska storleken på hjärnan skivor för att passa in i inspelningskammaren. För användning av membrankammaren (se avsnitt 6) bör skivor vara maximalt 1,5 cm x 1 cm. Medan du minskar, överväga de specifika lager och anslutningar som behövs för att vara intakt för inspelning (t.ex. för inspelning i CA1 och GD, skära bort subiculum och omgivande vit vävnad).
  6. Med hjälp av en spatel och små tcupp, försiktigt placera skivor i gränssnittet kammaren på små filter papper och låt dem vila för ~ 1 h i aCSF tills inspelningen.
  7. Skivor kan spelas in i upp till 20 h (ännu längre vid sterila förhållanden).

6. Registrering av epileptiform aktivitet

  1. I membrankammaren (nedsänkt typ inspelning kammare), placera hjärnan skiva på en transparent semipermeable membran, som är limmade till en plastring24. För detta, använd superlim för att fästa plastringen till membranet i en cellodlingsinsats.
  2. Använd en skalpell för att ta bort något membran på utsidan av plastringen. Säkerställ att membranet är jämnt och helt fastsatt i ringen innan membranet placeras i kammaren.
    OBS: Membranet kan förvaras i ddH2O vid 4–8 °C och återanvändas i upp till 1 månad. Håll membranet vått hela tiden.
  3. Både inflödet och utflödet av membrankammaren är anslutna till rör för lösningsförsörjning. Placera rören i en peristaltisk pump så att inflödet och utflödet rör sig i motsatta riktningar.
  4. Placera inflödes- och utflödesröret i karbiogent, förvärmt aCSF tills alla rör och kammaren är fyllda med lösning. Justera hastigheten på peristalticpumpen för att uppnå ett jämnt flöde på 10–13 mL/min.
    OBS: Den membrankammare som används här är en hög flödeshastighet, nedsänkt typ inspelningskammare möjliggör en lösning flöde på upp till 14 mL/min24. Vid användning av en annan nedsänkt typinspelningskammare behöver flödeshastigheterna justeras. För induktion av epileptiform aktivitet rekommenderas det dock starkt att använda membrankammaren.
  5. Använd ett värmeelement som är anslutet till inflödet i nära anslutning till membrankammaren för att säkerställa en stabil temperatur på 32 °C.
  6. Förbered 1–2 MΩ glaspipetter med hjälp av en vertikal puller. Fyll pipetter med 154 mM NaCl-lösning och placera dem i en elektrodhållare.
  7. Med hjälp av pincett och en spatel, ta bort en hippocampus skiva från gränssnittet kammaren genom att ta skiva med det lilla filtrerpapper och placera både i en Petri skålen fylld med karbiogen aCSF. Ta bort det lilla filtrerpapperet från hippocampusskivan och (vid behov) applicera lite kraft med hjälp av en pipett för att separera skivan från filterpapperet. Var försiktig så att du inte vänder på segmentet.
  8. Placera skivan i inspelningskammaren och håll den på plats med hjälp av skivans nät.
    OBS: På grund av Bernoullis princip, i den använda nedsänkta typmembrankammaren, är skivor vanligtvis stabila utan användning av ett extra skiva mesh.
  9. Placera elektroder i regionen och lagret av intresse (här, CA1) och börja inspelningen.
  10. Registrera fältpotentialaktivitet i nuvarande klämläge med en samplingsfrekvens på 10–20 kHz och lågpassfilterad vid 2 kHz.
  11. Registrera basal aktivitet i aCSF i upp till 5 min.
  12. Växla inflödesrören från aCSF till highK++4AP eller lowMg2++BIC aCSF och utflödesröret till en avfallsbehållare för att förhindra blandning av lösningar. Efter 2 min, placera utflödesröret i samma lösning som inflödet för att bevara lösning.
  13. Burst aktivitet framkallas av highK++4-AP ska vara synlig 2–5 min efter tvätten i. Men induktion av SLOEs av lowMg2 ++BIC kan ta upp till 30 min. Om det behövs, ändra elektrodernas positioner noggrant för att få optimala resultat.
  14. En gång i den slutliga positionen, registrera baslinjeaktivitet för minst 20 min. Om du spelar in SES, överväga längre baslinjeinspelningar på grund av låg frekvens av SLEs.
  15. I det fall som baslinjen aktivitet är stabil (platå av händelsefrekvens), tvätta i det önskade läkemedlet. Observera att på grund av den höga flödeshastigheten tvätta i av droger tar bara 2–5 min, vilket möjliggör snabb lösning utbyte.
  16. Registrera aktivitet under läkemedelsansökning på minst 20 min, efter att tvättas ur. Aktiviteten ska vara stabil i minst 60–90 min, vilket möjliggör längre inspelningar.

7. Analys

  1. Analys av frekvens och amplitud kan utföras med valfri tillgänglig programvara. Hittills har vi inte kunnat fastställa en tillförlitlig automatisk analys av slEs eller burst aktivitet, och istället använt en halvautomatisk analys med visuell bekräftelse av identifierad aktivitet.
  2. Burst-aktivitet kännetecknas av bifasisk, positiv och negativ avböjning och en varaktighet på ≥100 ms. Alla händelser som visuellt identifierats som burst-aktivitet (t.ex. halvautomatiskt genom tröskelanalys) ska anges manuellt för vidare analys av händelsefrekvens (inter-händelseintervall, IEI), amplitud och totalt antal händelser under den analyserade tidsramen.
    OBS: På grund av den höga frekvensen av burst aktivitet, är den sista 5 min av varje ansökan fas analyseras typiskt20.
  3. SLEs kan analyseras enligt beskrivningen i Heuzeroth et al. Identifierade SLEs kan analyseras ytterligare för varaktighet, amplitud, spike frekvens, och varaktighet tonic (högfrekventa spiking) vs. kloniska (lågfrekventa spiking) fas varaktighet. SlEs som är <10 s i varaktighet bör uteslutas från analys.
    OBS: För preklinisk utvärdering av möjliga antiepileptiska ämnen undersöks effekter på burst-aktivitet (framkallad av highK++4AP), på grund av etablerad induktion i återförsted hippocampusvävnad. Preliminära resultat på induktion av SCE:er med användning av lowMg2++BIC har rapporterats (Figur 2), även om analys av dessa data inte ingår här.

Representative Results

Epileptiform verksamhet har framgångsrikt registrerats i resected mänskliga hippocampus vävnad som härrör från upp till 15 patienter. Upprättande av stabila transport- och beredningsförfaranden är avgörande för framgångsrik induktion av epileptiform aktivitet i mänsklig hjärnvävnad. Nyligen publicerade resultat har visat 1) stabil induktion av epileptiform aktivitet i resected vävnad av olika patienter samt 2) användning av resected mänskliga hjärnvävnaden som ett prekliniskt verktyg för utvärdering av nya antiepileptiskamekanismer 14,20.

Tillämpning av highK++4-AP inducerad epileptiform aktivitet i form av burst aktivitet inom några minuter (Figur 2A,B,C,D). På grund av låg neuronal fördelning i mänskliga hippocampus vävnad eller hög neuronal cell förlust på grund av temporala LOB epilepsi (TLE), placering av elektroder kan justeras i början av inspelningen. I de fall där burst aktivitet av skivor inte syns i CA1-området efter 10 min (oberoende av elektrod placering), slice livskraft kan äventyras, och slice kommer att behöva bytas ut.

SlEs, med en varaktighet på >10 s, kan induceras med tillämpning av lowMg2++BIC (Bild 2E,F). Bild 2E visar stabil induktion av sles efter några minuter och stabil frekvens under hela inspelningen. Här var SLE verksamhet framgångsrikt induceras i två av fyra skivor från den undersökta patienten. En skiva visade bara brista aktivitet efter 15 min SLE aktivitet, medan den andra skivan inte visa SLEs även efter 40 min.

För preklinisk utvärdering av substanseffekter undersöktes en potentiell antiepileptikaeffekt på burst-aktivitet som inducerats av highK++4- AP. Kända och potentiella antiepileptiska substanser (lasamid, DMEA, dynorfin14) testades, och exempel visas här för den konventionella AED-lakasamiden (en natriumkanalblockerare) samt DMEA (ett nytt potentiellt antiepileptiskt ämne)20. Antalet händelser och inter-event-intervall (IEI) av burst-händelser minskade både under applicering av lasamid och DMEA (figur 3C), även om amplituderna till största delen inte påverkades (figur 3D). I en delmängd av skivor, trots att induktion av burst händelser uppnåddes under de första minuterna, frekvensen av verksamheten inte återhämta sig under tvätt ur tillämpad AED (data som inte visas här, se Kraus et al.20). Här, de tillämpade drogerna ansågs framkalla effekter; dock kan minskningar av burst-aktivitet ha påverkats av det gradvisa förfallet i aktivitet under långa inspelningar. Således måste resultaten tolkas noggrant.

Figure 1
Bild 1: Gränssnittskammare. För lagring av mänskliga hippocampus hjärnan skivor, ett gränssnitt kammare med två hjärnan skiva hålla fack används (A); specifikt, en Haas-typ gränssnittskammare23. Här, hippocampus hjärnan skivor vila på (d) tre lager av filterpapper, (e) mindre bitar för att möjliggöra hantering av enskilda hjärnan skivor, och (f) större filterpapper bitar för att säkerställa ett tillräckligt lager av lösning under skiva. (c) En bomullssträng som omger hjärnskivorna, ovanpå filterpapperen, säkerställer jämnt lösningsflöde från inloppen vid den (en) toppen av kupén. (b)Ett täcklock riktar syre underifrån kupén på skivan. (B) Toppvy av ett segmenthållningsfack. (C) Sidovy för att illustrera lager av filterpapper. g)Kammarens botten. (h) Rör för lösningsinflöde, som är ansluten till en peristaltisk pump (blå pilar markerar riktningen på lösningsflödet). Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.

Figure 2
Figur 2: Epileptiform aktivitet i mänskliga hippocampus skivor framkallas av highK++4-AP och lowMg2 ++BIC. CA1 exempelinspelningar och utdrag av applikation av highK+ (8 mM)+4-AP (100 μM) (A,B,C,D) och lowMg2++BIC (10 μM) (E,F). (A) BadansökningavhighK + +4- AP inducerar epileptiform aktivitet inom några minuter, och aktiviteten är stabil i minst 60 min. Detaljer om (A) kan ses i (B). Två olika typer av aktivitet induceras i CA1 området av mänskliga hippocampus skivor: interictal-liknande spikar (C, uppgifter om [B]) och burst aktivitet (D, uppgifter om [B]). Burst aktivitet visade sig vara känslig för antiepileptiska läkemedel och därför analyseras för effekten av potentiella antiepileptiska ämnen (Figur 3). (E,F) Tillämpning av lowMg2++BIC inducerar slEs med en varaktighet av >10 s (F) i CA1 inom några minuter. Induktion av SLOEs kan dock ta upp till 30 min i andra skivor. Skalstreck = 0,2 mV, 2 min (A,E), 5 s (B), 500 ms (C,D), 5 min (E), och 2 s (F). Denna siffra har anpassats från Kraus et al.20. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.

Figure 3
Figur 3: Minskning av epileptisk sprängaktivitet hos mänskliga skivor vid applicering av lasamid eller DMEA. Burst aktivitet minskade under tillämpning av (A) lasamid och (B) DMEA, en potentiell ny antiepileptisk molekyl. (A) och (B) visar exemplariska inspelningar av CA1-området med utdrag av regioner som används för analys i (C) och (D). Burst aktivitet minskade under lasamid (100 μM) och DMEA (10 mM) ansökan, som ses av mellersta utdrag och ökar igen under wash out. (C,D) Antal och amplitud av burst aktivitet analyserades för de sista 5 min av varje ansökan fas (baslinjen, laosamid/DMEA, tvätta ut) och visas som sammanfattade resultat för alla patienter (antal händelser, C; amplitud, D) som medelvärde ± SD. Varje punkt indikerar en patient. Asterisker markerar betydande skillnader enligt bedömning av antingen Friedman test och post-hoc med Dunnetts flerfaldiga jämförelse av grupper för analys av lasamidapplikation (*p < 0,05, n = 4) eller genom upprepad mätning ANOVA och post-hoc med Tukeys jämförelse för analys av DMEA-applikation (**p < 0.01, n = 10). Skala barer = 0,2 mV, 2 min (full inspelning, A), 5 s (utdrag, A), 3 min (full inspelning, B), och 1 s (utdrag, B). Denna siffra har anpassats från Kraus et al.20. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.

Lösning 1.1 kolin aCSF
Ämne 10x koncentration (mM) 1x koncentration (mM) Observera
kolin Cl 1100 110
(+)-Na L-askorbat 116 11.6
MgCl2x6H2O 70 7
Na pyruvat 31 3.1
KCl 25 2.5
NaH2PO4 12.5 1.25
NaHCO3 260 26
CaCl2 - 0.5 lägg till i slutlig lösning
Glukos - 10 lägg till i slutlig lösning
Lösning 1.2 aCSF
Ämne 10x koncentration (mM) 1x koncentration (mM) Observera
Nacl 1290 129
NaH2PO4 12.5 1.25
CaCl2 16 1.6
KCl 30 3
MgSO4 18 1.8
Glukos - 10 lägg till i slutlig lösning
Lösning 1.3 highK++4-AP aCSF
Ämne 10x koncentration (mM) 1x koncentration (mM) Observera
Nacl 1240 124
NaH2PO4 12.5 1.25
CaCl2 16 1.6
KCl 80 8
MgSO4 18 1.8
Glukos - 10 lägg till i slutlig lösning
4-AP - 0.1 lägg till i slutlig lösning
Lösning 1.4 lowMg2++BIC aCSF
Ämne 10x koncentration (mM) 1x koncentration (mM) Observera
Nacl 1300 130
NaH2PO4 12.5 1.25
CaCl2 16 1.6
KCl 30 3
Glukos - 10 lägg till i slutlig lösning
Bic - 0.01 lägg till i slutlig lösning
Lösning 2
Ämne 10x koncentration (mM) 1x koncentration (mM) Observera
NaHCO3 210 21

Tabell 1: Beredning av 10x- och 1x-lösningar för transport, beredning och registrering.

Discussion

Living resected mänskliga hjärnvävnaden är ett mycket värdefullt verktyg i preklinisk utvärdering av AED, eftersom det korrekt representerar en intakt mänskliga hjärnan mikro-nätverk. Det presenterade protokollet beskriver en metod för vävnad transport och beredning, som säkerställer hög kvalitet hippocampus skivor samt en stabil induktionsmetod för epileptiform verksamhet kritisk för AED utvärdering.

Utredning av epileptiform aktivitet samt metoder för kemisk eller elektrisk induktion i mänskliga hjärnskivor har tidigare visats av andra grupper17,20,21,22. Detta protokoll beskriver induktion av stabil burst aktivitet i skivor från olika patienter via tillämpning av hög K++4-AP samt induktion av SLEs i CA1 område via tillämpning av låga Mg2 +BIC. Det konstaterades att induktion av burst aktivitet är mer konsekvent (80% av testade skivor i 15 patienter) än induktion av SES (50% av testade skivor i en patient). Hittills har dock induktion av SES endast testats hos en patient. Trots detta rekommenderas induktion av slEs av låga Mg2++BIC, eftersom slEs ännu inte har kunnat induceras med hjälp av hög K++4-AP.

Flera studier har infört metoder för transport och beredning av mänskliga hjärnvävnad och ofta belysa tre faktorer som är avgörande för neuronal överlevnad: transport tid, används transportlösningar, och lagra villkor.

För optimal skiva livskraft, vissa grupper tyder på att transporten av resected hjärnvävnad vara så kort som möjligt. Driftrum och laboratorier ligger dock sällan i närheten, vilket innebär att segmentkvaliteten kan äventyras på grund av långa transporter. Vissa grupper har övervunnit detta hinder genom att tillämpa konstant O2 på lösningen under transport12. Vi har transporterat hjärnvävnad för kort (max = 15 min) och långa (upp till 1 h) tidsperioder utan konstant ytterligare O2 försörjning under transport, liknande andra grupper18,25. I dessa fall observerades inte skillnader i vävnadskvalitet under epileptiform-inspelningar. I kommunikation med andra grupper på vårt institut, skiva kvalitet inte förändras för patch-clamp experiment heller. Däremot beror varians i vävnadskvalitet möjligen från skador under operationer, långvarig resektion och skivningsprocedur.

Angående transport- och skärlösning utelämnar alla publicerade metoder NaCl från lösningar för att minska cellsvullnad på grund av osmotisk tryck, liknande standardproceduren för gnagare patch-clamp experiment. Emellertid, flera substitut har införts hittills (dvs., sackaros baserade aCSF13,22, NMDG-baserade aCSF12,26, och kolin-baserade aCSF27). Ting och kollegor introducerade NMDG-baserade aCSF för skiva beredning i 201426 och senare lagt till ett återhämtningsprotokoll, som långsamt återinför NaCl tillskivorna 28. Men som beskrivs av Ting et al., nervceller av hjärnvävnad som utarbetats i NMDG-baserade aCSF visa högre membran motstånd, vilket påverkar hela-cellen tätning under patch-clamp experiment26. Därför har vi övergått från NMDG-baserade aCSF till användning av kolin-baserade aCSF20, som ger hög kvalitet skivor för både fält potential och patch-clamp inspelningar.

När det gäller lagring av skivor är det allmänt accepterat att gränssnittsförhållanden ger optimal syresättning kritisk för lång skiva överlevnad18. Andra grupper visar dock skiva överlevnad för upp till 72 h under nedsänkta förhållanden12. I motsats till tidigare hypotes, mänskliga hjärnan skivor verkar vara mer resistenta mot låg syresättning eller oxidativ stress jämfört med gnagare skivor. I första hand har gränssnittskammare tidigare använts för lagring av mänskliga hippocampusskivor, men under vattenvillkor rekommenderas för underhåll av mänskliga hjärnskivor i patch-clamp-experiment.

Som diskuteras av andra grupper, ett ytterligare kritiskt steg för lång skiva överlevnad (gränssnitt för <48 h18, nedsänkt för <72 h12) är förebyggande av bakteriell kontaminering. Gnagare hjärnskivor används vanligtvis i elektrofysiologiska inspelningar i upp till 8 h, och bakteriell kontaminering anses inte påverka segmentens livskraft under denna period. Stort antal skivor som utarbetats från en resektion och den ovanliga tillgången på mänsklig hjärnvävnad belyser behovet av att förlänga livskraften hos mänskliga hjärnskivor. Denna metod beskriver framgångsrikt beredningen av levande mänskliga hippocampus hjärnan skivor, som lätt kan anpassas till sterila förhållanden. Men för inspelningarna som utförs här, skiva överlevnad sträcker 20 h var inte en prioritet.

Registrering i gränssnittskammare har också visat sig vara väsentlig för induktion av epileptiform aktivitet såsom sles22. Nedsänkta förhållanden, på grund av låg syresättning, används sällan för registrering av SLEs; dock, de är nödvändiga för optisk hög upplösning som behövs för patch-clamp experiment. Användningen av en optimerad nedsänkt typ inspelning kammare möjliggör inspelning av epileptiform aktivitet (extracellulärt fält eller enda neuron) i mänskliga hjärnan skivor, på grund av hög syresättning och snabb läkemedelsapplikation29. Här beskrivs metoder och resultat för fältpotentialinspelningar, men det bör betonas att patch-clamp-inspelningar framgångsrikt har utförts i mus- och människohjärnskivor med hjälp av denna modifierade inspelningskammare (data som inte visas).

Resected mänskliga hjärnvävnaden har ett högre translationellt värde jämfört med gnagare modeller. Det representerar en vuxen, sjuka neuronal nätverk som inte kan reproduceras av iPSCs. Men som i alla in vitro-system, mänskliga hjärnan skivor representerar inte en intakt mänsklig hjärna. Dessutom kan de registrerade neuronala nätverken av resected hjärnvävnad genomgå betydande molekylära och funktionella förändringar på grund av skador under drift eller beredning. Skivningsprocedurer har visat sig påverka GABAerga funktion och kan påverka induktionen av epileptiform aktivitet30. Dessa begränsningar bör övervägas samtidigt som man formulerar en hypotes. Vid testning av potentiella antiepileptiska läkemedel bör användningen av olika hjärnområden övervägas, eftersom läkemedelsmålen kanske inte uttrycks i alla mänskliga hjärnregioner eller alla patienter. I synnerhet visar hippocampi av TLE patienter ofta tecken på hippocampus skleros åtföljs av allvarliga neuronala cellförlust. Det rekommenderas att få patientinformation om patologiska förändringar och sjukdomshistoria, såsom potentiella eldfasta mot mediciner, och överväga detta under data tolkning.

Sammanfattningsvis beskriver denna metod framgångsrikt utarbetandet av levande mänskliga hippocampus hjärnan skivor och induktionstekniker för inspelning av två olika typer av epileptiform aktivitet. Eftersom tillgången på levande mänsklig hjärnvävnad är sällsynt, bör optimerade transport- och inspelningsförhållanden användas för att säkerställa maximal utmatning från experiment med hjälp av mänskliga hjärnskivor. det föreslås att resected mänskliga hjärnvävnaden kan användas som en preklinisk validering verktyg utöver gnagare modeller och cellodling experiment.

Disclosures

Författarna förklarar ingen intressekonflikt.

Acknowledgments

Vi tackar Mandy Marbler-Pötter (Charite-Unversitätsmedizin, Berlin) för utmärkt tekniskt bistånd. P.F. finansierades av den tyska forskningsstiftelsen (DFG, Deutsche Forschungsgemeinschaft) enligt Tysklands excellence strategy-EXC-2049-390688087. Detta arbete har fått stöd av QUEST Center for Transforming Biomedical Research vid Institutet för hälsa i Berlin.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
(+)-Na L-ascorbate Sigma Aldrich A4034
4-AP Sigma Aldrich 275875-5G
Blades eliteSERVE GmbH HW3 used for the vibratome
CaCl2 Merck 102382
Choline Cl Sigma Aldrich C1879
Filter paper Tiffen EK1546027T
Gas-tight bottle caps Carl Roth GmbH+Co.KG E694.1
Glass filaments Science Products GB150F-8P for recording electrodes
Glass gas disperser DWK Life Sciences GmbH 258573309
Glucose Sigma Aldrich G7528
Interface Chamber inhouse made - see Haas et al., 1979
KCl AppliChem 131494.1210
Membrane (Cell culture inserts) Merck PICM030050
Membrane chamber inhouse made - see Hill and Greenfield, 2011
MgCl2?6H2O Carl Roth HNO3.2
MgSO4 Sigma Aldrich M7506
Na pyruvate Sigma Aldrich P8574
NaCl Carl Roth 3957.1
NaH2PO4 Merck 106346
NaHCO3 Carl Roth HNO1.2
Peristaltic pump Gilson Minipuls 3
Slice holder Warner instruments SHD-41/15
Vertical puller Narishige PC-10
Vibratome Leica VT1200S

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hirtz, D., et al. How common are the "common" neurologic disorders. Neurology. 68 (5), 326-337 (2007).
  2. Ngugi, A. K., Bottomley, C., Kleinschmidt, I., Sander, J. W., Newton, C. R. Estimation of the burden of active and life-time epilepsy: a meta-analytic approach. Epilepsia. 51 (5), 883-890 (2010).
  3. Kwan, P., Brodie, M. J. Early Identification of Refractory Epilepsy. New England Journal of Medicine. 342 (5), 314-319 (2000).
  4. Löscher, W. Critical review of current animal models of seizures and epilepsy used in the discovery and development of new antiepileptic drugs. Seizure. 20 (5), 359-368 (2011).
  5. Ledri, M., et al. Differential Effect of Neuropeptides on Excitatory Synaptic Transmission in Human Epileptic Hippocampus. The Journal of Neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience. 35 (26), 9622-9631 (2015).
  6. Qi, X. R., et al. Alterations in the steroid biosynthetic pathways in the human prefrontal cortex in mood disorders: A post-mortem study. Brain Pathology. 28 (4), 536-547 (2018).
  7. Verwer, R. W. H., et al. Post-mortem brain tissue cultures from elderly control subjects and patients with a neurodegenerative disease. Experimental Gerontology. 38 (1-2), 167-172 (2003).
  8. Verwer, R. W. H., et al. Cells in human postmortem brain tissue slices remain alive for several weeks in culture. FASEB journal official publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 16 (1), 54-60 (2002).
  9. Le Maître, T. W., Dhanabalan, G., Bogdanovic, N., Alkass, K., Druid, H. Effects of Alcohol Abuse on Proliferating Cells, Stem/Progenitor Cells, and Immature Neurons in the Adult Human Hippocampus. Neuropsychopharmacology. 43 (4), 690-699 (2018).
  10. Dennis, C. V., Suh, L. S., Rodriguez, M. L., Kril, J. J., Sutherland, G. T. Human adult neurogenesis across the ages: An immunohistochemical study. Neuropathology and Applied Neurobiology. 42 (7), 621-638 (2016).
  11. Verwer, R. W. H., et al. Mature astrocytes in the adult human neocortex express the early neuronal marker doublecortin. Brain. 130 (12), 3321-3335 (2007).
  12. Ting, J. T., et al. A robust ex vivo experimental platform for molecular-genetic dissection of adult human neocortical cell types and circuits. Scientific Reports. 8 (1), 8407 (2018).
  13. Le Duigou, C., et al. Imaging pathological activities of human brain tissue in organotypic culture. Journal of Neuroscience Methods. 298, 33-44 (2018).
  14. Agostinho, A. S., et al. Dynorphin-based "release on demand" gene therapy for drug-resistant temporal lobe epilepsy. EMBO molecular medicine. 11 (10), 9963 (2019).
  15. Hodge, R. D., et al. Conserved cell types with divergent features in human versus mouse cortex. Nature. 573 (7772), 61-68 (2019).
  16. Beaulieu-Laroche, L., et al. Enhanced Dendritic Compartmentalization in Human Cortical Neurons. Cell. 175 (3), 643-651 (2018).
  17. Sandow, N., et al. Drug resistance in cortical and hippocampal slices from resected tissue of epilepsy patients: no significant impact of p-glycoprotein and multidrug resistance-associated proteins. Frontiers in Neurology. 6, 30 (2015).
  18. Wickham, J., et al. Prolonged life of human acute hippocampal slices from temporal lobe epilepsy surgery. Scientific Reports. 8 (1), (2018).
  19. Avoli, M., Jefferys, J. G. R. Models of drug-induced epileptiform synchronization in vitro. Journal of Neuroscience Methods. , (2015).
  20. Kraus, L., et al. Dimethylethanolamine Decreases Epileptiform Activity in Acute Human Hippocampal Slices in vitro. Frontiers in Molecular Neuroscience. 12, 209 (2019).
  21. Antonio, L. L., et al. In vitro seizure like events and changes in ionic concentration. Journal of Neuroscience Methods. , (2016).
  22. Gabriel, S., et al. Stimulus and Potassium-Induced Epileptiform Activity in the Human Dentate Gyrus from Patients with and without Hippocampal Sclerosis. Journal of Neuroscience. 24 (46), 10416-10430 (2004).
  23. Haas, H. L., Schaerer, B., Vosmansky, M. A simple perfusion chamber for the study of nervous tissue slices in vitro. Journal of Neuroscience Methods. 1 (4), 323-325 (1979).
  24. Hill, M. R. H., Greenfield, S. A. The membrane chamber: a new type of in vitro recording chamber. Journal of neuroscience methods. 195 (1), 15-23 (2011).
  25. Andersson, M., et al. Optogenetic control of human neurons in organotypic brain cultures. Scientific Reports. 6, 24818 (2016).
  26. Ting, J. T., Daigle, T. L., Chen, Q., Feng, G. Acute brain slice methods for adult and aging animals: application of targeted patch clamp analysis and optogenetics. Methods in molecular biology. 1183, Clifton, N.J. 221-242 (2014).
  27. Testa-Silva, G., et al. Human synapses show a wide temporal window for spike-timing-dependent plasticity. Frontiers in Synaptic Neuroscience. 2, 12 (2010).
  28. Ting, J. T., et al. Preparation of Acute Brain Slices Using an Optimized N-Methyl-D-glucamine Protective Recovery Method. Journal of Visualized Experiments. (132), (2018).
  29. Morris, G., Jiruska, P., Jefferys, J. G. R., Powell, A. D. A New Approach of Modified Submerged Patch Clamp Recording Reveals Interneuronal Dynamics during Epileptiform Oscillations. Frontiers in Neuroscience. 10, 519 (2016).
  30. Valeeva, G., Valiullina, F., Khazipov, R. Excitatory actions of GABA in the intact neonatal rodent hippocampus in vitro. Frontiers in Cellular Neuroscience. , (2013).

Tags

Neurovetenskap elektrofysiologi epilepsi läkemedelsutveckling människa hippocampus ex vivo

Erratum

Formal Correction: Erratum: Preparation of Acute Human Hippocampal Slices for Electrophysiological Recordings
Posted by JoVE Editors on 07/13/2020. Citeable Link.

An erratum was issued for: Preparation of Acute Human Hippocampal Slices for Electrophysiological Recordings. Step 2.1.3 in the Protocol was corrected.

Step 2.1.3 in the Protocol was updated from:

Add final concentrations of glucose and MgCl, then stir until dissolved (Table 1, solution 1.1).

to:

Add final concentrations of glucose and CaCl2, then stir until dissolved (Table 1, solution 1.1).

Beredning av akut mänskliga Hippocampus skivor för elektrofysiologiska Recordings
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kraus, L., Monni, L., Schneider, U.… More

Kraus, L., Monni, L., Schneider, U. C., Onken, J., Spindler, P., Holtkamp, M., Fidzinski, P. Preparation of Acute Human Hippocampal Slices for Electrophysiological Recordings. J. Vis. Exp. (159), e61085, doi:10.3791/61085 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter