Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Multicellulær human alveolær model sammensat af epitelceller og primære immunceller til farevurdering

Published: May 6, 2020 doi: 10.3791/61090
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1
1Adolphe Merkle Institute, University of Fribourg
* These authors contributed equally

Summary

Præsenteret her er en protokol for primær human blod monocyt isolation samt deres differentiering i makrofager og dendritiske celler og samling med epitelceller i en multicellulær menneskelige lunge model. Biologiske reaktioner af cocultures bestående af immunceller differentieret fra enten frisk isolerede eller optøede monocytter, ved udsættelse for proinflammatoriske stimuli, sammenlignes.

Abstract

En human alveolær celle coculture model er beskrevet her for simulering af alveolær epitelvæv barriere bestående af alveolær epitel type II celler og to typer af immunceller (dvs. humant monocyt-afledte makrofager [MDMs] og dendritiske celler [MDDCs]). Der findes en protokol til samling af den flercellede model. Alveolær epitelceller (A549 celle linje) dyrkes og differentieres under neddykkede forhold på gennemtrængelige skær i to-kammer brønde, derefter kombineret med differentierede MDMs og MDDCs. Endelig er cellerne udsat for en luft-væske interface i flere dage. Da humane primære immunceller skal isoleres fra menneskelige buffycoats, sammenlignes immunceller, der adskiller sig fra enten friske eller optøede monocytter, for at skræddersy metoden baseret på eksperimentelle behov. De tredimensionale modeller, der består af alveolær celler med enten nyisolerede eller optøede monocyt-afledte immunceller, viser en statistisk signifikant stigning i cytokin (interleukins 6 og 8) frigivelse ved eksponering for proinflammatoriske stimuli (lipopolysaccharid og tumornekrose faktor α) sammenlignet med ubehandlede celler. På den anden side er der ingen statistisk signifikant forskel mellem cytokin frigivelse observeret i cocultures. Dette viser, at den præsenterede model er lydhør over for proinflammatoriske stimuli i overværelse af MDMs og MDDCs differentieret fra friske eller optøede perifere blod monocytter (PbMs). Det er således et effektivt redskab til undersøgelser af akut biologisk reaktion på forskellige stoffer, herunder aerosoliserede lægemidler eller nanomaterialer.

Introduction

In vitro lungecellekulturer tilbyder omkostningseffektive, robuste og velkontrollerede platforme til at vurdere farerne ved aerosoler1. Som en model celle system for humane alveolær pneumocytter, epitel A549 celle linje isoleret fra en pulmonal adenocarcinom bruges ofte2. Disse celler repræsenterer planocellulær type II-epitelceller fra alveolær region3 og er en meget anvendt lungecellelinje til vurdering af farer ogtoksicitet 1,4,5,6,7,8,9,10. A549-cellelinjen har relevante træk ved alveolær epiteltype II-celler, såsom tilstedeværelsen af karakteristiske lamellarstoffer, der indeholder tætpakkede fosfolipider3.

Det er blevet påvist, at når cellerne dyrkes ved en luft-væske interface (ALI), overfladeaktivt stof frigives på den apikale side af luft-eksponerede epitelceller, reducere overfladespænding11,,12,13. Denne funktion er særlig vigtig i nanomateriale luftvejsrisiko og toksicitet undersøgelser. Når inhaleret nanomaterialer / toksikanter er deponeret i alveolær regionen, de først interagerer med lunge overfladeaktive og er fordrevet ved befugtning kræfter i den vandige hypofase, hvor samspillet med lungeceller finder sted14,15. Selv om A549 celler danner et monolag (som kan overgrow i flerlags på senere tidspunktpunkter, når de dyrkes på ALI) og producere overfladeaktive, en ulempe er deres utilstrækkelige stramme samling dannelse, hvilket resulterer i lav transepithelial elektrisk modstand værdier, men stadig udgør en funktionel barriere mod intercellulære (nano)partikler omplantning16,17,18.

I lungerne er der en række immuncellepopulationer, herunder fagocytiske og professionelle antigen-præsenterende celler (dvs. makrofager og dendritiske celler), der kommunikerer direkte gennem cellecellekontakt eller intercellulær signalering for at kontrollere og vedligeholde homøostase. Makrofager og dendritiske celler er kritiske medfødte immuneffektorer og initiativtagere til det adaptive immunrespons19. Dendritiske celler, der bor i eller under epitel, kan danne fremspring på tværs af epitel til lumen for at fange antigener. Alveolær makrofager er placeret på den apikale overflade af epitel og fungere som sentinel celler, der repræsenterer den første cellulære forsvar mod fremmed materiale samt bakterielle, virale og svampeinfektioner. Deres fænotopypiske plasticitet giver mulighed for hurtigt induktion af proinflammatoriske reaktioner som reaktion på sådanne stimuli samt at flytte til udløsende anti-inflammatoriske (dvs. hæmmende) reaktioner20.

For at simulere den humane alveolær epitelvævsbarriere etablerede vi en tredobbelt cokulturmodel med A549-celler suppleret med humane blodmoncytafledte makrofager (MDMs) og dendritiske celler (MDDCs) på de apiske basale og basale sider,henholdsvis 17. Dyrkning af denne model hos ALI er tidligere blevetrapporteret 16, endda op til 72 timer efter eksponering21. Akut immunrespons på kulstofnanorør eksponeringer blev væsentligt forbedret i cellekultur udsat for ALI i forhold til neddykkede betingelser22. Coculture model, dyrket og udsat for forskellige materialer på ALI, har tidligere været brugt til at undersøge cytotoksicitet, oxidativstress og inflammatoriske reaktioner på eksponering for zinkoxid,23 grafen-relateredematerialer 24, guldpartikler25,26, kulstof nanorør21, og vulkansk aske og diesel udstødning partikler27.

Endvidere er den vigtige rolle, som makrofager og dendritiske celler spiller som immuneffektorceller i en in vitro-lungemodel, blevet bekræftet. Især blev der kun observeret en øget proinflammatorisk respons i modellen ved tilstedeværelse af immunceller sammenlignet med monokultursystemer7. Potentielle ulemper ved at anvende primære monocytafledte immunceller er den begrænsede adgang til PbM'er samt donor-til-donor-variation. Som en løsning på disse potentielle ulemper, præsenteret her er en protokol, der indfører kryopræservering af frisk isolerede PBMs28 for cellekultur model forsamling. Formålet med denne undersøgelse er at demonstrere 3D human alveolær epitelvæv model samling, herunder isolering af PbMs fra menneskelige buffy frakker. Reaktionsevnen over for proinflammatoriske stimuli sammenlignes med modellen, der består af MDM'er og MDDC'er, der er differentieret fra friske PBM'er eller differentieret fra frosne/optøede PbM'er.

Arbejde med uprøvede humane blodprøver indebærer særlig pleje for at forhindre potentiel overførsel af smitsomme sygdomme, såsom HIV (human immundefekt virus), hepatitis B, og hepatitis C. Derfor er brugen af personlige beskyttelsesforanstaltninger såsom handsker, kjoler, masker og øjenbeskyttelse afgørende og skal være i overensstemmelse med principperne for god laboratoriepraksis. Disse beskyttelser reducerer risikoen for at udsætte huden eller slimhinderne for potentielt infektiøse væsker. For dem, der er involveret i håndtering af buffy coats og PbMs, vaccination mod hepatitis B-virus er obligatorisk, og blod titer niveauer af antistoffer anti-hepatitis B skal være over 100 IE / L (landespecifikke lovgivningsmæssige krav skal behandles). Desuden skal alt arbejde udføres i laboratorier på biosikkerhedsniveau 2 (landespecifikke lovkrav skal behandles). Der bør vedtages standardforanstaltninger for sundhed og sikkerhed i forbindelse med arbejde i et laboratoriemiljø og håndtering af cellekulturen for pattedyr, herunder håndtering af affald, når hele protokollen gennemføres.

Protocol

Arbejdet med primære monocytter isoleret fra menneskeblod blev godkendt af udvalget under Federal Office for Public Health Schweiz (referencenummer: 611-1, Meldung A110635/2) for Adolphe Merkle Institute.

1. Isolering af perifere blodmoncytter (PbMs) fra menneskelige buffy frakker

BEMÆRK: Følgende afsnit beskriver isolering af immunceller fra en 50 ml pose med en buffy frakke, købt fra den schweiziske Transfusion Center i Bern, Schweiz.

  1. Fremstilling af reagenser
    1. Der klargøres 100 ml magnetisk separationsbuffer pr. buffycoat: 0,5 % [w/v] kvægserumalbumin (BSA; i fosfat-bufferet saltvand [PBS]) med 2 mM ethylenediamintetraacetasyre (EDTA), og juster dig til pH = 7,2, sterilt filter med 0,22 μm porestørrelse). Opbevares ved 4 °C under hele proceduren.
    2. Forbered cellekulturmediet (CCM): RPMI 1640 med 10% [v/v] føtal kvægserum (FBS), 1% [v/v] L-glutamin (her, 2 mM L-glutamin) og 1% [v/v] penicillin-streptomycin (her 100 enheder/ml penicillin og 100 μg/ml streptomycin).
      BEMÆRK: Den nødvendige mængde af hvert reagens afhænger af antallet af celler, der skal sås i følgende trin.
  2. Isolering af PbM'er
    BEMÆRK: Alt glas og plastmateriale skal steriliseres før brug. Af sikkerhedsmæssige årsager anbefales det at anvende plasticware ved håndtering af blodprøver fra mennesker for at reducere risikoen for personskade med glas.
    1. Brug en saks til at skære åbne slangen ende af posen indeholder buffy pels.
    2. Fordel den buffy frakke ved at hælde posens indhold gennem posens kanal direkte i to koniske centrifuge 50 ml rør (~ 25 ml hver).
    3. Hæld forsigtigt pbs eller pipettere PBS i rørene for at nå 50 ml volumener. Bland indholdet ved at dreje røret forsigtigt på hovedet 3x.
    4. Opdel buffy coat-PBS blandingen i fire nye 50 ml koniske centrifugerør ved at pipettere 25 ml af blandingen i hvert frisk rør.
    5. Læg langsomt 13 ml tæthedsgradient under den buffy coat-PBS-blanding ved hjælp af en 10 ml serologisk pipette. Fjern den fyldte pipette fra pipetteholderen, og sæt straks den øverste åbning af pipetten med en tommelfinger for at forhindre yderligere lækage af tæthedens gradientmedium i buffy coat-PBS-blandingen.
      BEMÆRK: Hold den øverste åbning med tommelfingeren, placer den fyldte pipette i bunden af det koniske centrifugerør, så tætheden gradient medium langsomt flyder under buffy coat-PBS blandingen, forlader ca 1 ml af densitet gradient medium inde i pipetten.
    6. Trin 1.2.5 gentages med de tre andre rør, der indeholder den buffy coat-PBS-blanding.
    7. Alle fire rør, der indeholder blandingerne, centeres i 20 minutter ved 1.000 x g og 25 °C ved langsom bremsetilstand. Brug holdere med beskyttende låg til centrifugering.
    8. Åbn låget på hvert rør, fjern det øverste lag, der indeholder plasma og blodplader, med en serologisk pipette, og bortskaf det i en beholder til flydende affald i biologisk fare.
    9. Brug en serologisk pipette til opsamling af det perifere mononukleære cellelag i blodet, der fremstår som en hvidlig uklar lille fraktion (~2-3 mm i tykkelse) mellem plasmaet og desitetsgradientens mediumlag. Pellet indeholder røde blodlegemer i bunden. Undgå at overføre erythrocytter, der danner det nederste lag. Gentag dette for alle fire rør.
      BEMÆRK: Perifere blodmonnukleare celler består af PbMs og lymfocytter. PBM'er vil blive adskilt fra lymfocytter senere under magnetisk CD14+ adskillelse.
    10. Pool perifere blod mononuclear celler fra fire rør i to 50 ml rør.
    11. Fyld de to rør med PBS til 50 ml og dæk dem med låg.
    12. Kassér de tilbagedene erythrocytter og plasma fra de oprindelige fire rør i en beholder til flydende affald på biologisk belastning.
    13. Centrifuge de to rør i 8 min ved 500 x g og 18-20 °C ved en regelmæssig centrifugehastighed.
    14. Efter centrifugering fjernes supernatanten med en serologisk pipette, og den kasseres i en beholder til flydende affald på biologisk fare.
    15. Resuspend cellerne med 5 ml PBS ved hjælp af en serologisk pipette.
    16. Cellesuspensionerne samles i et 50 ml konisk centrifugerør, og 50 ml fyldes med PBS.
    17. Brug 5 μL af cellesuspensionen til at tælle cellerne med en celletæller ved hjælp af prøvepanblå (45 μL) ekskluderingsmetode.
    18. Pipette 10 μL af trypan blue-PbMs-opløsningen i et celletællerkammer og tælle antallet af celler pr. standardtællingsprotokollen. Brug Ligning 1 til at beregne det samlede cellenummer, CT.
      Equation 1
    19. Efter optælling af cellerne centrifuger 50 ml-røret som udført i trin 1.2.13.
  3. POSITIV markering af CD14
    1. Åbn forsigtigt låget på hvert rør, fjern og kassér derefter supernatanten ved hjælp af en serologisk pipette uden at forstyrre pellet.
    2. Den beregnede mængde (ligning 2) af magnetisk separationsbuffer (her 80 μL buffer pr. 1 x 107 celler i alt) og resuspenderede cellepilpellet ved at pipettere opløsningen op og ned.
      Equation 2
    3. Beregn ved hjælp af ligning 3 (her, 10 μL pr. 1 x 107 totalceller) det tilsvarende volumen af CD14+ magnetiske perler og pipette det relevante volumen.
      Equation 3
    4. Bland godt ved pipettering op og ned, luk låget, og inkuber opløsningen ved 4 °C i 15 min.
    5. Ved inkubation fyldes røret op til 50 ml med magnetisk separationsbuffer.
    6. Centrifuge som udført i trin 1.2.13.
    7. Inspirer og kassér supernatanten ved hjælp af en serologisk pipette uden at forstyrre cellepellet.
    8. Pipette den tilsvarende mængde magnetisk adskillelse buffer (Ligning 4; her, 500 μL buffer pr 1 x 108 celler) og forsigtigt blandes ved pipettering op og ned 3x.
      Equation 4
    9. Desinficere den magnetiske separation station ved sprøjtning og aftørring det med en sterilisering agent. Placer i laminar flow hætte sammen med kolonnen for magnetisk adskillelse.
    10. Den magnetiske adskillelsessøjle anbringes i magnetfeltet, og et tomt 50 ml konisk centrifugerør anbringes direkte under kolonnen til opsamling af vaske- og ikke-mærkede celler (dvs. affald).
    11. Skyl den magnetiske adskillelsessøjle ved at pipettere 3 ml magnetisk separationsbuffer ind i kolonnen. Lad ikke kolonnen tørre ud under hele proceduren.
    12. Forbered et 15 ml konisk centrifugerør og pipette 1 ml magnetisk separationsbuffer.
    13. Påfør cellesuspensionen (fremstillet i trin 1.3.8) på den magnetiske skillesøjle. I det koniske centrifugerør på 50 ml under filteret indsamles ikke-mærkede celler, der er passeret igennem.
      BEMÆRK: Må ikke overstige 2 x 109 celler pr. kolonne for at undgå blokering af kolonnen.
    14. Så snart kolonnebeholderen er tom (dvs. når cellerne er passeret gennem kolonnen), skal der anvendes 3 ml magnetisk separationsbuffer ved hjælp af en serologisk pipette, og lad den passere gennem kolonnen. Gentag denne 3x.
    15. Den magnetiske adskillelsessøjle fjernes fra den magnetiske separator ved forsigtigt at trække med hænderne, og den anbringes derefter i et 15 ml rør, der indeholder forrøret 1 ml magnetisk separationsbuffer (fremstillet i trin 1.3.12).
    16. Der tilsættes 5 ml magnetisk separationsbuffer til kolonnen, og de magnetisk mærkede celler skylles ud ved at skubbe stemplet fast i kolonnen.
  4. Reagenspræparat til MDM- og MDDC-differentiering
    1. Tæl cellerne med en celletæller ved hjælp af metoden trypan blue exclusion som udført i trin 1.2.17.
    2. De krævede mængder CCM eller FBS beregnes for yderligere trin som følger: enten det volumen CCM, der svarer til en celletæthed på 1 x 106 celler/ml (trin 1.5.1), eller mængden af FBS svarende til en celletæthed på 6 x 106 celler pr. 0,9 ml FBS (trin 1.6.3).
      Equation 5
    3. Luk låget, sæt røret i centrifugen, og centrifuge som udført i trin 1.2.13. Fjern og kassér supernatanten uden at forstyrre cellepellet. Fortsæt til trin 1.5 for cellesåning eller trin 1.6 for cellefrysning.
  5. PBM-såning og -differentiering i MDM'er og MDDC'er
    1. Opslæmning af cellepilpellet i det beregnede volumen af CCM som beregnet i trin 1.4.2 (her en endelig koncentration på 1 x 106 celler/ml) ved at pipettere op og ned 3x.
    2. Pipette antallet af celler, der skal differentieres i MDM'er og MDDC'er i separate koniske centrifugerør ved hjælp af en serologisk pipette.
    3. Pipette differentiere faktorer til CCM med PBMs og bland godt ved pipettering op og ned. Der anvendes følgende differentierende faktorer:
      1. For MDDC'er: endelig koncentration på 10 ng/ml interleukin-4 (IL-4) og 10 ng/mL granulocyt-makrofagkolonistimulerende faktor (GM-CSF).
      2. For MDMs: endelig koncentration af 10 ng/mL makrofagkolonistimulerende faktor (M-CSF).
    4. Pipette cellesuspensionerne i CCM med de ekstra differentierende faktorer i 6 brøndplader ved at fordele 3 ml af suspensionen pr. brønd (svarer til 3 x 106 celler/brønd, dvs. 1 x 106 celler/ml).
    5. De 6 brøndplader i en cellekulturinkubator (37 °C, 5% CO2)og lad dem differentiere i 6 dage uden at opdatere CCM' en.
      BEMÆRK: Differentiering varierer fra 5-8 dage afhængigt af den lokale tilgængelighed af buffy coats og eksperimentel opsætning, forudsat at differentieringseffektiviteten bestemmes ved hjælp af de relevante teknikker (se diskussionsafsnittet).
  6. PBM frysning
    1. Opslæm cellepillerne i et kryobeskyttende medium (her FBS og dimethylsulfoxid [DMSO; cytotoksisk]) i et forhold på 9:1 (v/v) ved at pipettere et volumen af forvarmet FBS. Dette svarer til en endelig cellekoncentration på 6 x 106 celler/ml, i betragtning af en yderligere tilsætning af 10% DMSO (v/v).
    2. Marker det ønskede antal kryovialer i laminarflowhætten (dvs. registrere dato, isolationskode og antal celler).
    3. Pipette 0,9 ml celleaffjedring i ren FBS (her, 6 x 106 celler i 0,9 ml FBS) til hver kryovial. Efterfølgende langsomt pipette 0,1 ml DMSO og bland suspensionen godt ved at dreje kryovials op og ned 3x.
    4. Kryovials til en celle-frysning beholder og straks indstille den til -80 °C i 24 timer.
    5. Efter 24 timer fjernes kryoterne fra -80 °C-fryseren og beholderen, og de sættes i den flydende nitrogentank, der er egnet til celleopbevaring.
  7. PBM optøning og differentiering i MDMs og MDDCs
    1. Varm alle de nødvendige reagenser til 37 °C i et vandbad (~20-30 min).
    2. Der klargøres et passende antal 6 brøndplader svarende til antallet af optøede celler (her en plade pr. 1,8 x10 7 celler, dvs. 3 kryovialer). Pipette 2 ml CCM til hver brønd under aseptiske forhold. Pladerne i inkubatoren (5 % CO2, 37 °C) i 15 minutter, så pH-besværet kan blive jævnbyrdet.
    3. Tag den nødvendige mængde kryovials med frosne celler fra en flydende nitrogentank og hvirvle dem forsigtigt i et 37 °C vandbad (1-2 min) for at sikre ensartet optøning af cellesuspensionen.
    4. Fjern kryovial fra vandbadet og dekontaminere med et steriliseringsmiddel, der sikrer, at agenten ikke interagerer med låget og O-ringen.

      BEMÆRK: Herpå skal alle trin udføres under aseptiske forhold.
    5. Der klargøres et passende antal koniske centrifugerør på 15 ml svarende til det antal kryoovialer, der skal optøes (her 6 x 106 celler/rør). Pipette 9 ml forvarmet CCM i hvert rør.
    6. Pipette langsomt (drop-by-drop) indholdet af kryovial i et rør, der indeholder CCM. Luk låget, gentag for hvert rør, og centrifuge ved 200 x g i 5 min ved en regelmæssig centrifuge hastighed.
    7. Kassér supernatanten uden at forstyrre pellet.
    8. Opsalt pellet fra hvert rør (som indeholder celler fra en kryovial) i 2 ml forvarmet CCM ved pipettering op og ned ved hjælp af en serologisk pipette (celletæthed svarende til 3 x 106 celler /ml).
    9. Fra hvert rør pipettes de resuspenderede celler i to brønde (1 ml pr. brønd) af en 6 brøndplade indeholdende 2 ml tidligere forberedt CCM for at nå en celletæthed på 3 x 106 celler/brønd (svarende til en endelig koncentration på 1 x 106 celler/ml). Gentag dette for alle andre rør.
    10. Fortsætter med differentiering som beskrevet i punkt 1.5.3.
    11. De 6 brøndplader i en cellekulturinkubator (37 °C, 5% CO2)og lad dem differentiere i 6 dage uden at opdatere CCM' en.

2. Triple celle coculture model af humant alveolær epitelvæv

BEMÆRK: Dette afsnit indeholder instruktioner om volumener og cellenumre svarende til 12 brøndpladeindsatser. Figur 1 opsummerer en foreslået tidslinje for modelsamling.

  1. Epitelcelle (A549 cellelinje) såning
    1. Epitelcellerne kulturresenatoriske celler i overensstemmelse med leverandørens (ATTC) anbefalinger. Kort, subkultur cellerne i CCM ved 80% celle sammenløb (ca. 2x-3x om ugen).
      BEMÆRK: Subkultur A549 for mindst fire passager før coculture model sammensætning, ved hjælp af A549 celler i en passage område på 5-25.
    2. Pipette 1,5 ml forvarmet CCM i 12 brøndplader (antallet af brønde svarer til det ønskede antal modeller).
    3. Placer individuelle 12 godt cellekultur indsætter i brønde af en 12 godt plade ved hjælp af steriliseret pincet.
    4. Cellerne fjernes fra en kolbe i henhold til subdyrkningsprotokollen (dvs. ved hjælp af et afmonterermiddel, og agenten fjernes ved centrifugering som udført i trin 1.2.13). Opsprænning i det passende volumen af CCM svarende til den endelige cellekoncentration af A549 (her 50 x 104 celler/ml; 0,5 ml cellesuspension pr. skær, dvs. 25 x 104 celler/skær, hvilket svarer til såningstætheden på 27,8 x 104 celler/cm2).
    5. Pipette 0,5 ml af celleophænget (dvs. 25 x 104 celler/indføring) i den apikale side af indsatsen ved hjælp af en 1 ml pipette.
    6. Pladerne dækkes med låg, og de sættes i en cellekulturinkubator (37 °C, 5 % CO2) i 4 dage.
      BEMÆRK: Kontroller regelmæssigt sammenløbet af A549-celler under et fasekontrastmikroskop.
  2. MDDC såning
    1. Aspirere CCM med ikke-tilknyttede celler i de 6 brøndplader, der indeholder MDDCs.
    2. Tilføj 1 ml frisk prewarmed CCM til hver brønd.
    3. Brug en celleskraber, løsrive (skrabe) klæbende MDDCs fra hver brønd, forsigtigt vaske brøndene med den eksisterende 1 ml CCM 3x, og kombinere dem i en konisk centrifuge rør.
    4. Tæl cellerne med en celletæller ved hjælp af trypanblå ekskluderingsmetoden ved hjælp af 10 μL cellesuspension og 10 μL torpblå opløsning.
    5. Centrifuge celle suspension som gjort i trin 1.2.13.
    6. Den CCM-diskenhed, der kræves til resuspension (ligning 5):
      Påkrævet MDDC-tæthed = 42 x 104 celler/ml; hver indsats kræver 6,3 x 104 celler, hvilket svarer til en seedet celletæthed på 7 x 104 celle/cm2 (her, 150 μL tilføjet på 0,9 cm2 i trin 2.2.10.).
      CCM-diskenhed til gensuspension (VM; Ligning 5):
      Equation 8
    7. Sug forsigtigt CCM fra det øverste kammer af 12 brøndplader med voksende A549 på skærene.
    8. Anslaf indsatsen med A549-celler i en på hovedet position i en steril petriskål ved hjælp af steriliseret pincet. Der klargør et konisk centrifugerør (50 ml) med PBS, og en celleskraber fugtes på forhånd.
    9. Skrab A549-cellerne af fra indsatsens basale overflade (dvs. den øverste del på hovedet), som skal vokse gennem skærnes porer.
      BEMÆRK: Skyl skraberen med PBS (tilberedt i et rør) mellem skrabning af enkelte prøver, og hold den våd under hele proceduren.
    10. Ved centrifugering (trin 2.2.5) aspireres og kassér supernatanten, og omdisperse derefter MDDC-pellet i den beregnede mængde CCM (trin 2.2.6) og pipette op og ned 3x.
    11. Pipette 150 μL af cellesuspensionen oven på hver indsats, således at hele indsatsens basale overflade er lige dækket af væsken og ikke indeholder bobler.
    12. Dæk skålen med et låg og sted i en cellekultur inkubator i 70 min. Inspirer CCM'en fra cellekulturpladerne (hvor skærne oprindeligt er blevet placeret), kassér den i et flydende affald med biologisk fare og pipetter 1,5 ml frisk CCM i hver brønd. Pladen dækkes med låg og i cellenkubatoren (37 °C, 5% CO2).
      BEMÆRK: Ud over ovennævnte tidsperiode må ikke udtørres for at undgå udtørring af cellerne.
    13. Efter inkubationen skal hver indsats med steriliseret pincet holdes, og de placeres på pladerne, der indeholder CCM, i en almindelig position. Pladen dækkes med et låg, og vend den tilbage til celleinkubatoren (37°C, 5% CO2).
  3. Makrofag (MDM) seeding
    1. Tag 6 brøndplader, der indeholder foruddifferentierede MDMs. Placer dem fra celleinkubatoren til en laminar flowhætte.
    2. Inspirer og kassér CCM med uopsluttede MDM'er dyrket i 6 brøndplader, og pipette 1 ml frisk forvarmet CCM i hver brønd.
    3. Ved hjælp af en celleskraber skal du forsigtigt fjerne klæbende MDM'er fra individuelle brønde (som udført i trin 2.2.3 for MDDCs).
    4. Pipette 10 μL prøvepandeblå i en brønd eller et rør og tilsættes 10 μL AF MDM-suspensionen for at opnå den endelige fortynding af 1:1 (v/v). Tæl antallet af MDM'er ved hjælp af den relevante optællingsprotokol.
    5. Centrifuge celle suspension som gjort i trin 1.2.13.
    6. Beregn den ønskede diskenhed (ligning 6):
      Påkrævet MDM-tæthed = 2,5 x 104 celler/ml i CCM (her kræver hvert skær 1,25 x 104 celler i 0,5 ml CCM, hvilket svarer til en seedet celletæthed på 1,4 x 104 celle/cm2).
      Equation 10(6)
    7. Ved centrifugering, aspirere og kassere supernatant, redisperse MDM pellet i den beregnede mængde CCM (trin 2.3.6), og pipette op og ned 3x.
    8. Pipette forsigtigt 0,5 ml AF MDM-suspensionen (forberedt i trin 2.3.7) på væggen i cellekulturindsatserne med A549 og MDDCs (ikke direkte på epitelceller) ved hjælp af en 1 ml pipette. Dækplader med låg og i en cellekulturinkubator (37 °C, 5 % CO2) i 24 timer.
  4. Overførsel af cokultur model til luft-væske interface (ALI)
    1. Ved afslutningen af den samlede models inkubationstid på 24 timer (±2 timer) i en cellekulturinkubator aspirere og kasseres CCM fra både apikale og basale dele af cellekulturindsatser og fra brøndene.
    2. Brug steriliseret pincet, løft individuelle skær fra brøndene og pipette 0,6 ml frisk prewarmed CCM til hver brønd ved hjælp af en 1 ml pipette. Der må ikke tilsættes CCM til den apikale side af indsatsen.
    3. Dækplader med låg og i en cellekulturinkubator (37 °C, 5 % CO2) til 24 timer før videre brug.

3. Eksponering for udvalgte positive kontroller (kendt stimuli til inducerende proinflammatorisk respons)

BEMÆRK: Eksponering af coculture modeller til en kendt proinflammatorisk stimulus endotoksin lipopolysaccharid (LPS)7 og proinflammatoriske cytokin tumor nekrose faktor α (TNF-α)7 bruges til at illustrere lydhørhed af modellen. Desuden anvendes eksponering for et vaskemiddel (Triton X-100) til at bekræfte følsomheden af en laktatdehydrogenase (LDH)-analyse.

  1. Forbered de positive kontrolopløsninger: LPS-materiel (1 mg/ml i destilleret vand), TNF-α-lager (100 μg/ml i destilleret vand) og Triton-X 100 (2% [v/v] i PBS).
  2. Ved 24 timers inkubation af cokulturmodellen ved ALI-forhold aspirere og kassér supernatanten fra det basale rum. Brug steriliseret pincet, løft individuelle skær fra brøndene og pipette 0,6 ml frisk prewarmed CCM i hver brønd.
  3. Der forbered individuelle positive kontrolopløsninger ved at fortynde lagrene i CCM i koniske centrifugerør på følgende måde: 1 μg/ml LPS, 1 μg/mL TNF-α og 0,2% Triton-X 100. Mængderne svarer til antallet af testede skær (her 100 μL/skær). Bland løsningerne godt ved pipettering op og ned 3x.
  4. Påfør 100 μL af hver positiv kontrolopløsning ved langsomt at pipettere på væggen i cellekulturindsatsen. Dæk brøndpladen med låg og læg den i cellekulturinkubatoren (37 °C, 5% CO2) i 24 timer. Ved inkubation aspirere og kassér væsken på den apikale side af indsatsen ved at holde individuelle skær med en pincet.
  5. CCM opsamles i de basale rum og opbevares ved 1) 4 °C til yderligere LDH-analyse, der angiver cellemembranens brudmedieret cytotoksicitet og/eller 2) opbevares ved -80 °C til yderligere analyse af proteinfrigivelse via enzym-forbundet immunosorbentassay (ELISA). Kør analyserne i henhold til kitleverandøranbefadingerne.
  6. Ved fjernelse af CCM vaskes skær med PBS 3x og cellerne på cellekulturindsatserne i 4% [w/v] paraformaldehyd (i PBS, 15 min ved stuetemperatur) ved at sikre, at begge skærsider er godt dækket med PFA-opløsning. Vask derefter 3x med PBS for at fjerne PFA. Prøverne opbevares nedsænket i PBS ved 4 °C for yderligere immunstaining (et eksempel på denne metode er tidligere beskrevet17).

Representative Results

Human lunge coculture modeller, der består af alveolær epitelceller og immunceller, blev samlet enten fra friske eller frosne MDDCs og MDMs progenitorer (her, menneskelige perifere blod-afledte monocytter). Som præsenteret i figur 1blev A549-celleret sået 3 dage efter det første afsnit med monocytisolering/optøning. Efter 6 dages differentiering, syntes de differentierede MDMs rundformet, mens MDDCs dannede en mere aflang form med observerbare fremspring. De optrådte også som agglomerater, især når de adskiller sig fra friske monocytter (Figur 2, Figur 3). Epitelceller dannede et tæt cellelag af celler efter 3 dages vækst på membranindsatser (Figur 4), da cokulturerne blev samlet. Efter 24 timers samling og yderligere 24 timer for at være udsat for ALI-betingelser blev cocultures forberedt til eksponeringer.

Reaktionsevne af 3D-celle kultur modeller blev undersøgt ved eksponering for kendte proinflammatoriske stimuli ved hjælp af en pseudo-ALI tilgang, som beskrevet tidligere29. De proinflammatoriske stimuli, LPS og TNF-α, blev tilsat i små mængder (100 μL) på den apikale overflade af den luftudsatte cellemodel. Sideløbende hermed blev fraværet af membranbrud som et mål for cytotoksicitet vurderet via LDH-analysen. En betydelig stigning i LDH frigivelse i CCM af de basale rum blev observeret ved udsættelse for den positive kontrol for membran brud, et vaskemiddel Triton-X 100 (Figur 5). Disse resultater viste, at modellen var lydhør over for et cytotoksisk stof, mens der ikke blev observeret nogen stigning i LDH-frigivelsen ved apikerstimulering med TNF-α eller LPS.

En mulig årsag til de forskellige målte værdier af LDH i de prøver, der er samlet med enten friske eller tidligere frosne PBM'er, kan tilskrives prøvelageret. Prøver fra friske PBM'er blev opbevaret i længere tid ved -80 °C; derfor kan aktiviteten af LDH-enzym falde. Især er LDH stabil i kun op til 4 dage i CCM; Således anbefales det at udføre analysen de seneste 2 dage efter indsamling af supernatanter. Alternativt er det muligt at fryse supernatanterne ned direkte efter afhentning. Det er dog vigtigt at overveje, at frysning kan nedsætte LDH's enzymatiske aktivitet.

Udskillelsen af proinflammatoriske mæglere (her, TNF-α og interleukins 6 [IL-6] og 8 [IL-8]) i den basale CCM blev kvantificeret via ELISA. Statistisk signifikante (p < 0,05, envejs ANOVA) blev der observeret stigninger i frigivelsen af IL-6 og IL-8 i både LPS- og TNF-α- behandlede prøver sammenlignet med respektive ubehandlede celler samt i de cellekulturmodeller, der er samlet fra enten PBM-kilde (Figur 6). Selv om koncentrationerne (pg/ml) af alle de testede cytokiner i det basale CCM var højere i kokulturerne bestående af friske PBM'er, var forskellene mellem de to kokulturer og monokulturer ikke statistisk signifikante (p > 0,05) (figur 6). For at bekræfte cokulturmodellernes merværdi med hensyn til en 2D-epitelcellekultur blev A549-monokulturer også udsat for LPS eller TNF-α. Som forventet var frigivelsen af alle undersøgte mæglere fra A549 monokulturer lavere sammenlignet med begge cokulturmodeller; selv om forskellen mellem dem ikke var statistisk signifikant (p > 0,05, envejs ANOVA).

Cellulær morfologi af 3D human alveolær epitelvævsbarriere blev vurderet via konfokal laserscanningmikroskopi (LSM). For at visualisere sammensætningen af hver model blev makrofager i cokulturmodellerne (MDMs) plettet med moden makrofagmærke 25F9. MDDCs blev plettet med CD83, som er en vigtig markør for aktiverede dendritiske celler30. Med hensyn til cellulær morfologi blev der ikke observeret nogen forskel mellem cokulturmodellerne ved hjælp af MDMs og MDDCs fra friske PBM'er sammenlignet med dem, der brugte optøede PbMs. I LPS- og TNF-α-eksponerede cokulturer, der begge består af friske og frosne immunceller, blev der observeret et forstyrret epitellag i LSM-billeder, hvilket ikke var tilfældet i ubehandlede celler (Figur 7, Figur 8).

Figure 1
Figur 1: Protokollens skematiske tidslinje. Præsentation af 3D-cokulturmodellens præparat, samling og anvendelse (eksponering for et testet stof). ALI = luft-væske interface, MDDCs = monocyt-afledte dendritiske celler, MDMs = monocyt-afledte makrofager, PBM = perifere blod monocytter. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: MdMs og MDDCs differentieret fra friske PBM'er. Fasekontrastmikroskopibillede af differentierede (A)MDD'er og(B)MDD'er fra friske PB'er (6 dage efter celleisolation). MDM'er er rundformede, mens MDDCs ofte observeres som agglomerater. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: MDM'er og MDDCs adskiller sig fra frosne PB'er. Fasekontrastmikroskopibillede af differentierede (A)MDD'er og(B)MDDC'er fra optøede PB'er (6 dage efter optøning). MDM'er er rundformede, men nogle aflange celler kan observeres. MDDCs vises også rundformet med fremspring. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: Epitelceller vækst på membran skær. Fase-kontrast mikroskopi billede af sammenløbet A549 vokser på en membran indsætte 4 dage efter såning, danner et tæt lag af celler. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5: Cytotoksicitetsresultater undersøgt via membranbrudsbaseret (LDH)-analyse. Dataene præsenteres som en fold stigning i forhold til ubehandlede celler (gennemsnitlig ± SD, n = 3, stjerne betegner statistisk signifikant stigning i forhold til ubehandlede celler, ** p < 0,01, ****p < 0,0001). I grønne modeller er MDM'er og MDDCs fra friske PBM'er repræsenteret, og i lilla modeller, der er samlet fra optøede PbM'er, er de repræsenteret. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 6
Figur 6: Proinflammatoriske reaktioner i cocultures og monokulturer. De proinflammatoriske mæglere (TNF-α, IL-6 og IL-8) frigiver i cocultures efter 24 timers udfordring med LPS eller TNF-α. Dataene præsenteres som relative til ubehandlede celler (gennemsnitlig ± SD, n = 3, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001). I grønne modeller er MDM'er og MDDCs fra friske PBM'er repræsenteret, og i lilla modeller, der er samlet fra optøede PbM'er, er de repræsenteret. Grå repræsenterer A549 monokulturer. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 7
Figur 7: Kosmorologi bestående af friske immunceller. LSM-billeder af apikale og basale sider af coculture-modellen med xz-projektioner af apikale sider af modellen ved hjælp af MDMs og MDDCs fra friske PBMs. Cyan repræsenterer nuclei (DAPI), magenta repræsenterer cytoskeleton (rhodamin-phalloidin), hvid repræsenterer MDMs (25F9), og grøn repræsenterer MDDCs (CD 83). Den hvide pil betegner MDM, mens den grønne pil betegner MDDC. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 8
Figur 8: Kosmorologi bestående af frosne immunceller. LSM-billeder af den apikale side af coculture model med tilsvarende xz fremskrivninger, og basal side af modellen ved hjælp af MDMs og MDDCs fra optøede PBMs. Cyan repræsenterer nuclei (DAPI), magenta repræsenterer cytoskeleton (rhodamine-phalloidin), hvid repræsenterer MDMs (25F9), og grøn repræsenterer MDDCs (CD 83). Den hvide pil betegner MDM, mens den grønne pil betegner MDDC. Klik her for at se en større version af dette tal.

Discussion

Ny produktion af nye materialer, herunder kemikalier og narkotika, øger gradvist behovet for prædiktive in vitro-modeller. For at overholde de tre principper for udskiftning, reduktion og raffinering afdyreforsøg 32er in vitro-cellemodeller blevet effektive værktøjer til udskiftning og reduktion af mekanismer til belysning af mekanismerne i et lægemiddels eller materialesindsats 8,9,10,11. Præsenteret her er en detaljeret protokol for at samle den flercellede model ved hjælp af immunceller, der enten er frisk isoleret eller optøet fra tidligere frosne monocytter. Også beskrevet er dyrkning af modellen på ALI. Endelig illustrerer protokollen et eksempel på eksponering for proinflammatoriske stimuli og sammenligner reaktionen fra de to modeller, der indeholder enten friske eller frosne monocytter.

Der er udført forskellige undersøgelser for at bekræfte og begrunde merværdien af den øgede kompleksitet af de modeller , der dyrkes og eksponeres under ALI-forhold , sammenlignet med konventionel neddykketeksponering 7,22,31. Observation af den højere proinflammatoriske respons i cocultures sammenlignet med monokulturer af epitelceller bekræfter en tidligere undersøgelse. Undersøgelsen anvendte den præsenterede cokulturmodel (stimuleret med LPS) og viste en højere respons ved genekspressionsniveauerne for TNF og IL1B sammenlignet med A549 monokulturækvivalent model7. På den anden side viste begge modeller større variationer inden for målte proinflammatoriske mediator frigivelsesværdier sammenlignet med A549 monokulturer. Dette kan forklares ved brug af immunceller fra forskellige donorer (buffy coats) i biologiske gentagelser (dvs. en gentagelse, en donor), som tidligere vist7. Hvis det ønskes, kan variationerne mellem replikaterne overvindes ved 1) ved hjælp af optøede PbMs fra samme donor eller 2) pooling PbMs fra forskellige donorer før indefrysning af cellerne, derefter efterfølgende brug af den samme pulje i hver gentagelse. Det anbefales også at inkludere flere biologiske gentagelser.

Cellefrysningsteknikken kan betragtes som et kritisk skridt; Det er dog en fælles laboratorieprocedure til konservering af celler til fænotopypisk og funktionel analyse. Forskellige undersøgelser har vist, at kvaliteten af frosne PbMs er afgørende for deres overlevelse, og en passende frysning teknik er nøglen til succes for efterfølgende analyser med de samme celler28,32. Ændring af protokollen kan udføres ved at fryse PbMs, hvilket giver fleksibilitet i den eksperimentelle opsætning, da tilgængeligheden af buffy frakker er normalt begrænset. En anden fordel ved at bruge frosne PbMs (i flere hætteglas) over frisk isolerede dem er, at de kan bruges i efterfølgende eksperimenter, selv efter 1 år. Dette mindsker det potentielle problem med afvigelser fra donor til donor, hvis dette er en ønsket eller påkrævet parameter i et forsøg.

Resultaterne af en sammenligning mellem laboratoriet, der er foretaget efter op til 13 måneder, viser, at PbM'er, når de opbevares korrekt i en flydende nitrogentank, kan anvendes over en lang periode uden nogen indvirkning på cellernes levedygtighed eller cellegenvinding33. Længere opbevaringstider (over 1 år) kan være mulige ved omhyggelig validering af cellernes levedygtighed og cellerespons, før du udfører et eksperiment. Desuden skal temperaturen i den flydende nitrogentank altid være stabil. Den vigtigste faktor, der påvirkede levedygtigheden af kryobevarede PbM'er, blev anset for at være DMSO-koncentration med en optimal koncentration på 10-20 % (v/v)28. For at minimere de potentielt skadelige virkninger af frysning tilsættes forskellige kilder til proteiner, FBS eller BSA (med en bred vifte af koncentration fra 40% op til 100 %34)ofte til frysemediet som naturlige beskyttende komponenter, der kan øge celleres overlevelsen.

På grund af DMSO's høje cytotoksiske potentiale anbefales det først at dispergere PBM'er i FBS og derefter tilføje DMSO til PbM'er, der allerede er spredt i FBS. Især selv om højere FBS-koncentrationer (>40%) viste ingen forbedring af cellernes levedygtighed, men de forvolde ikke skade på cellerne28. Ikke desto mindre, frysning monocytter er en mulig tilgang til at overvinde spørgsmål af begrænset buffy pels tilgængelighed. Men hvis brugen af MDDCs og MDM'er fra friske PBM'er ønskes, kan immuncellerne differentieres og anvendes 5-8 dage efter isolation7,,16,,17,,35,36,37. Hvis eksperimentel planlægning tillader det, anbefales det at skelne mindst 6 dage i både MDDC'er og MDM'er. Men konsistens mellem forskellige gentagelser i det samme eksperiment, sammen med rutinemæssige inspektioner af deres specifikke overflade markør udtryk, er afgørende. Reaktionsevnen over for en proinflammatorisk stimulus, såsom LPS, efter differentieringstiden bør også kontrolleres regelmæssigt.

Mange undersøgelser ved hjælp af A549 celle linje er blevet udført på ALI, enten som en monokultur eller kombineret med andre celletyper (makrofager, dendritiske celler, eller fibroblaster) i 3D coculture model22,24,29,38. Ved hjælp af denne 3D-samkulturmodel er cytotoksicitet, oxidativ stress eller proinflammatoriske virkninger af (nano)materialer blevet undersøgt i op til 72 h1,17,21,24,29. Modellens lighed med in vivo væv er tidligere blevet undersøgt baseret på konfokale laserscanning imaging af model16. Ved samling af modellen, er det vigtigt at overveje både celleprolifeion (som kan påvirke A549 i den model, der præsenteres her) samt udførelsen af de primære (ikke prolifererende) immunceller (her, MDDCs og MDM'er). Det er også vigtigt at overveje, at ikke alle CD14 positive monocytter differentierer sig i MDDC'er og MDM'er, og at cellerne kan være til stede i både vedlagte og suspenderede former. Baseret på karakteren af coculture forsamling (her, begge celletyper nødt til at knytte til den eksisterende epitellag), anbefales det kun at bruge den klæbende sub-populationer af begge immuncelletyper. Derudover har rutinemæssige analyser af monocytter, MDDC og MDM monokultur lydhørhed over for LPS, og udtryk for specifikke overflade markører (CD14, CD163, CD86, CD93, eller CD206, data ikke vist) tyder på, at 6 og 7 dages differentiering er de optimale tidspunkter.

Selv om et realistisk antal alveolær epitelceller i humane lunger svarer til ~ 160.000 celler / cm2, er antallet af A549celler,der tælles i modellen ~ 1.000.000 celler /cm2 efter 9 dage dyrket på indsatsen16,18. Således skal denne in vitro-model begrænsninger overvejes. For det første blev tætheden af epitelceller etableret baseret på deres evne til at danne et sammenløbslag på den voksende membran. Det er også vigtigt at nævne, at A549 repræsenterer en epiteltype II-celle med en kuboid form, i modsætning til epiteltype I-celler, som er flade og udspread. På den anden side blev det krævede antal immunceller etableret på grundlag af litteraturen og præsenteret i denne protokol som cellenummer/overfladeområde39,,40,41. Celletætheden af MDDC'er i området 400 celler/mm2 (4 celler/cm2)16 kan sammenlignes med den stabile celletæthed på 500-750 celler/mm2 (5- 7 celler/cm2) rapporteret fra in vivo-studie39. Tætheden af MDM'er i denne model ligger inden for samme område af in vivo-situationen i den menneskelige alveolær region40.

Ældre makrofag markør farvning (25F9) blev observeret både i den apikale side (hvor MDMs er til stede) samt basal side (dvs. på det sted, hvor dendritiske celler). Translokation af immunceller gennem membranen skær porer er muligt og er også blevet observeret ved hjælp af denne model16, som kan forklare de observerede forskelle i farvning intensiteter. En anden mulig forklaring er dog, at den modne makrofagmarkør også kan udtrykkes på dendritiske celler, men udtrykket er meget donorspecifik42. Desuden er intensiteten af 25F9-udtrykket meget højere i MDMs (Figur 7, Figur 8). Begge proinflammatoriske stimuli (LPS og TNF-α) påvirkede integriteten af lungeepitelbarrieren i begge kokulturer (figur 7, figur 8). Dette var forventet baseret på tidligerepublikationer 43,44 viser,at proinflammatoriske cytokiner og bakterielle produkter forstyrre integriteten af epitelbarrierer.

Den 3D multicellulære model af den menneskelige alveolær epitel, etableret og karakteriserettidligere 17, har fungeret som et kraftfuldt og nyttigt redskab til vurdering af biologiske reaktioner (dvs. akutte proinflammatoriske reaktioner, oxidativstressrespons, partikelfordeling og cellulær kommunikation) in vitro21,24,25,45. Resultaterne bekræfter coculture modellers ansvar for at proinflammatoriske stimuli (her, LPS og TNF-α). Responsen blev lidt øget ved brug af immunceller fra friske PbMs; Der var imidlertid ingen statistisk signifikant forskel mellem cocultures ved hjælp af friske kontra optøede PbMs. Desuden var de proinflammatoriske reaktioner fra begge cokulturmodeller højere end dem, der blev dyrket i epitelcellemonokulturer under de samme (ALI) forhold. Kort sagt beskriver protokollen samlingen af en 3D human alveolær epitelvævskokulturmodel ved hjælp af enten friske eller optøede PbM'er til differentiering i MDMs og MDDCs. Det er vist, at begge modeller er meget lydhøre over for proinflammatoriske stimuli; De kan derfor fungere som effektive redskaber til potentielle risikovurderinger og toksicitetsvurderinger.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Forfatterne vil gerne takke Dr. Miguel Spuch-Golgata for coculture ordningen i figur 3 og til Dr. Bedia Begum Karakocak for kritisk læsning. Denne undersøgelse blev støttet af PATROLS-projektet, DEN Europæiske Unions Horisont 2020-forsknings- og innovationsprogram i henhold til tilskudsaftale nr. B.D. takker Peter und Traudl Engelhorn-fonden for økonomisk støtte.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Benchmark microplate reader does not have to be specific, for example BioRad, Cressier, Switzerland
Cell culture Incubator does not have to be specific
Cell freezing container (for example Mr. Frosty) does not have to be specific
Centrifuge does not have to be specific
Confocal laser scanning microscope does not have to be specific, for example Zeiss LSM 710 meta
Heamatocytometer, or automatic cell counter does not have to be specific
Laminar bio-safety hood class II does not have to be specific
MultiStand Macs (Macs Cell Separator) Miltenyi, Germany 130-042-303
pH meter does not have to be specific
Phase contrast inverted light microscope does not have to be specific
Pipette boy, pipettors (different volumes) do not have to be specific
Scissors do not have to be specific
Vacuum pump does not have to be specific
Water bath does not have to be specific
Disposable small equipment/glassware Catalogue Number
15 mL and 50 mL conical centrifuge tubes does not have to be specific
6- and 12-well cell culture plates, flat bottom, low evaporation lid, sterile Falcon, Switzerland 353046 and 353043
Cell culture inserts, transparent PET membrane, 12-well, 3 μm pore size Falcon, Switzerland 353181
Cell scrapper does not have to be specific, for example VWR, Switzerland 353085
Cryovials do not have to be specific
Glass autoclaved Petri Dishes do not have to be specific
LS Columns Miltenyi, Germany 130-042-401
Sterile filtration cup for vacuum filtration, 0.2 μm pore size does not have to be specific, for example VWR, Switzerland 10040-446
Sterile Lab Bottle compatible with Filtration cup (min. 100 mL) does not have to be specific
Sterile pipettes do not have to be specific
Chemicals
Bovine serum albumine (BSA) Sigma-Aldrich, Switzerland A7030-100g
CD14+ MicroBeads human - magnetic beads Miltenyi, Germany 130-097-052
Deattachnig agent Trypsin-EDTA, 0.05%, phenol red Gibco, Switzerland 25300054
Density gradient medium Lymphoprep Alere Technologies AS, Norway 1114547
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) Sigma Aldrich, Switzerland D2438
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Sigma-Aldrich, Switzerland E6758-100g
Fetal bovine serum (heat inactivated) Gibco, Switzerland 10270-106
Human granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF), premium grade Miltenyi, Germany 130-093-864
Human Interleukin 4 (IL-4), premium grade Miltenyi, Germany 130-095-373
Human macrophage colony-stimulating factor (M-CSF), premium grade Miltenyi, Germany 130-096-485
L-glutamine Gibco, Switzerland 25030-024
Lipopolysaccharid (LPS) from Escherichia coli Sigma-Aldrich, Switzerland 4524-5mg
Paraformaldehyde (PFA) Sigma-Aldrich, Switzerland 158127
Penicilin-Streptomycin Gibco, Switzerland 15140-122
Phosphate Buffer Saline (PBS) Gibco, Switzerland 10010-015
Roswell Park Memorial Institute-1640 Medium (RPMI) Gibco, Switzerland 42401-018
Triton X-100 Sigma-Aldrich, Switzerland T8787
Trypan blue solution (0.4%) Sigma Aldrich, Switzerland
Tumor necrosis factor alpha (TNF-α) Immunotools 11343015
Assays used for cytotoxicity, (pro-)inflammatory response
Cytotoxicity Detection Kit (LDH) Roche, Switzerland 11644793001
Human IL-6 DuoSet ELISA R&D, Biotechne, Switzerland DY206
Human IL-8/CXCL8 DuoSet ELISA R&D, Biotechne, Switzerland DY208
Immunostaining
4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI), concentration 2 μg/mL Sigma-Aldrich, Switzerland 10236276001
Goat anti-mouse IgG (H+L) Alexa Fluor 647 conjugated, concentration 20 μg/mL Abcam, UK ab150115
Goat anti-rabbit IgG antibody (H+L) Dylight 488 conjugated, concentration 10 μg/mL Agrisera, Sweden AS09 633
Mature Macrophage Marker Monoclonal Antibody, concentration 50 μg/mL eBioScience, Thermo Fischer, Switzerland 14-0115-82
Phalloidin rhodamine, concentration 0.264 µM Molecular Probes, Life Technologies, Switzerland R415
Recombinant Anti-CD83 antibody, 1:50 dillution Abcam, UK ab244204

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rothen-Rutishauser, B., Blank, F., Mühlfeld, C., Gehr, P. In vitro models of the human epithelial airway barrier to study the toxic potential of particulate matter. Expert Opinion on Drug Metabolism and Toxicology. 4 (8), 1075-1089 (2008).
  2. Giard, D., et al. In vitro cultivation of human tumors: establishment of cell lines derived from a series of solid tumors. Journal of National Cancer Institute. 51 (5), 1417-1423 (1973).
  3. Ochs, M., Weibel, E. R., et al. Ch. 2: Functional Design of the Human Lung for Gas Exchange . Fishman's Pulmonary Diseases and Disorders, 5e. Grippi, M. A., et al. , McGraw-Hill Education. (2008).
  4. Foster, K. A., Oster, C. G., Mayer, M. M., Avery, M. L., Audus, K. L. Characterization of the A549 Cell Line as a Type II Pulmonary Epithelial Cell Model for Drug Metabolism. Experimental Cell Research. 243 (2), 359-366 (1998).
  5. Guo, X. Y., Lu, M., Chen, X. Q., He, F. D., Li, A. Correlation study of biological characteristics of non-small cell lung cancer A549 cells after transfecting plasmid by microbubble ultrasound contrast agent. Asian Pacific Journal of Tropical Medicine. 9 (6), 582-586 (2016).
  6. Cooper, J. R., et al. Long Term Culture of the A549 Cancer Cell Line Promotes Multilamellar Body Formation and Differentiation towards an Alveolar Type II Pneumocyte Phenotype. PLoS ONE. 11 (10), 0164438 (2016).
  7. Bisig, C., Voss, C., Petri-Fink, A., Rothen-Rutishauser, B. The crux of positive controls - Proinflammatory responses in lung cell models. Toxicology In Vitro. 54, 189-193 (2019).
  8. Rothen-Rutishauser, B., et al. A newly developed in vitro model of the human epithelial airway barrier to study the toxic potential of nanoparticles. ALTEX. 25, (2008).
  9. Braakhuis, H. M., et al. Progress and future of in vitro models to study translocation of nanoparticles. Archives of Toxicology. 89 (9), 1469-1495 (2015).
  10. Thai, P., Chen, Y., Dolganov, G., Wu, R. Differential regulation of MUC5AC/Muc5ac and hCLCA-1/mGob-5 expression in airway epithelium. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 33 (6), 523-530 (2005).
  11. Wu, J., et al. Characterization of air-liquid interface culture of A549 alveolar epithelial cells. Brazilian Journal of Medical and Biological Research. 51 (2), 6950 (2017).
  12. Shapiro, D. I., Nardone, L. L., Rooney, S. A., Motoyama, E. K., Munoz, J. L. Phospholipid biosynthesis and secretion by a cell line (A549) which resembles type II aleveolar epithelial cells. Biochimica and Biophysica Acta. 530 (2), 197-207 (1978).
  13. Balis, J., Bumgarner, S. D., Paciga, J. E., Paterson, J. F., Shelley, S. A. Synthesis of lung surfactant-associated glycoproteins by A549 cells: description of an in vitro model for human type II cell dysfunction. Experimental Lung Research. 6 (3-4), 197-213 (1984).
  14. Schurch, S., Gehr, P., Im Hof, V., Geiser, M., Green, F. Surfactant displaces particles toward the epithelium in airways and alveoli. Respiration Physiology. 80 (1), 17-32 (1990).
  15. Gehr, P., Schurch, S., Berthiaume, Y., Hof, V. I., Geiser, M. Particle Retention in Airways by Surfactant. Journal of Aerosol Medicine. 3 (1), 27-43 (2009).
  16. Blank, F., Rothen-Rutishauser, B., Gehr, P. Dendritic Cells and Macrophages Form a Transepithelial Network against Foreign Particulate Antigens. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 36 (6), (2007).
  17. Rothen-Rutishauser, B. M., Kiama, S. G., Gehr, P. A three-dimensional cellular model of the human respiratory tract to study the interaction with particles. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 32, (2005).
  18. Blank, F., Rothen-Rutishauser, B. M., Schurch, S., Gehr, P. An optimized in vitro model of the respiratory tract wall to study particle cell interactions. Journal of Aerosol Medicine. 19, (2006).
  19. Jardine, L., et al. Lipopolysaccharide inhalation recruits monocytes and dendritic cell subsets to the alveolar airspace. Nature Communications. 10 (1), 1999 (2019).
  20. Kopf, M., Schneider, C., Nobs, S. P. The development and function of lung-resident macrophages and dendritic cells. Nature Immunology. 16 (1), 36-44 (2015).
  21. Chortarea, S., et al. Repeated exposure to carbon nanotube-based aerosols does not affect the functional properties of a 3D human epithelial airway model. Nanotoxicology. 9 (8), 983-993 (2015).
  22. Hilton, G., Barosova, H., Petri-Fink, A., Rothen-Rutishauser, B., Bereman, M. Leveraging proteomics to compare submerged versus air-liquid interface carbon nanotube exposure to a 3D lung cell model. Toxicology In Vitro. 54, 58-66 (2019).
  23. Brandenberger, C., et al. Effects and uptake of gold nanoparticles deposited at the air-liquid interface of a human epithelial airway model. Toxicology and Applied Pharmacology. 242, (2010).
  24. Drasler, B., et al. Single exposure to aerosolized graphene oxide and graphene nanoplatelets did not initiate an acute biological response in a 3D human lung model. Carbon. 137, 125-135 (2018).
  25. Durantie, E., et al. Carbon nanodots: Opportunities and limitations to study their biodistribution at the human lung epithelial tissue barrier. Biointerphases. 13, (2018).
  26. Brandenberger, C., et al. Quantitative evaluation of cellular uptake and trafficking of plain and polyethylene glycol-coated gold nanoparticles. Small. 6 (15), 1669-1678 (2010).
  27. Tomašek, I., et al. Combined exposure of diesel exhaust particles and respirable Soufrière Hills volcanic ash causes a (pro-)inflammatory response in an in vitro multicellular epithelial tissue barrier model. Particle and Fibre Toxicology. 13 (1), 67 (2016).
  28. Nazarpour, R., et al. Optimization of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells (PBMCs) Cryopreservation. International Journal of Molecular and Cellular Medicine. 1 (2), 88-93 (2012).
  29. Endes, C., et al. An in vitro testing strategy towards mimicking the inhalation of high aspect ratio nanoparticles. Particle and Fibre Toxicology. 11 (1), (2014).
  30. Ju, X., et al. The Analysis of CD83 Expression on Human Immune Cells Identifies a Unique CD83+-Activated T Cell Population. Journal of Immunology. 197 (12), 4613-4625 (2016).
  31. Lenz, A. G., et al. Inflammatory and Oxidative Stress Responses of an Alveolar Epithelial Cell Line to Airborne Zinc Oxide Nanoparticles at the Air-Liquid Interface: A Comparison with Conventional, Submerged Cell-Culture Conditions. BioMed Research International. , 12 (2013).
  32. Germann, A., Schulz, J. C., Kemp-Kamke, B., Zimmermann, H., von Briesen, H. Standardized serum-free cryomedia maintain peripheral blood mononuclear cell viability, recovery, and antigen-specific T-cell response compared to fetal calf serum-based medium. Biopreservation and Biobanking. 9 (3), 229-236 (2011).
  33. Weinberg, A., et al. Optimization and Limitations of Use of Cryopreserved Peripheral Blood Mononuclear Cells for Functional and Phenotypic T-Cell Characterization. Clinical and Vaccine Immunology. 16 (8), 1176 (2009).
  34. Freshney, R. I. Culture of animal cells: a manual of basic technique. Freshney, R. I. , Wiley-Liss Inc. 321-334 (2005).
  35. Lehmann, A. B. C., Blank, F., Gehr, P., Rothen-Rutishauser, B. Alternatives to animal testing. Yarmush, M. L., Langer, R. S. , Artech House. 239-260 (2010).
  36. Steiner, S., et al. Reduction in (pro-)inflammatory responses of lung cells exposed in to diesel exhaust treated with a non-catalyzed diesel particle filter. Atmospheric Environment. 81, 117-124 (2013).
  37. Martinez, F. O., Gordon, S., Locati, M., Mantovani, A. Transcriptional Profiling of the Human Monocyte-to-Macrophage Differentiation and Polarization: New Molecules and Patterns of Gene Expression. The Journal of Immunology. 177 (10), 7303 (2006).
  38. Chortarea, S., et al. Profibrotic activity of multi-walled carbon nanotubes upon prolonged exposures in different human lung cell types. Applied In Vitro Toxicology. 5 (1), (2019).
  39. Holt, P. G. Pulmonary Dendritic Cells in Local Immunity to Inert and Pathogenic Antigens in the Respiratory Tract. Proceedings of the American Thoracic Society. 2 (2), 116-120 (2005).
  40. Pinkerton, K. E., Gehr, P., Castañeda, A., Crapo, J. D. Comparative Biology of the Normal Lung (Second Edition). Parent, R. A. , Academic Press. 105-117 (2015).
  41. Crapo, J., Barry, B., Gehr, P., Bachofen, M., Weibel, E. R. Cell number and cell characteristics of the normal human lung. American Review of Respiratory Disease. 126 (2), 332-337 (1982).
  42. Maniecki, M. B., Møller, H. J., Moestrup, S. K., Møller, B. K. CD163 positive subsets of blood dendritic cells: The scavenging macrophage receptors CD163 and CD91 are coexpressed on human dendritic cells and monocytes. Immunobiology. 211 (6), 407-417 (2006).
  43. Chignard, M., Balloy, V. Neutrophil recruitment and increased permeability during acute lung injury induced by lipopolysaccharide. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 279 (6), 1083-1090 (2000).
  44. Coyne, C. B., et al. Regulation of Airway Tight Junctions by Proinflammatory Cytokines. Molecular Biology of the Cell. 13 (9), 3218-3234 (2002).
  45. Durantie, E., et al. Biodistribution of single and aggregated gold nanoparticles exposed to the human lung epithelial tissue barrier at the air-liquid interface. Particle and Fibre Toxicology. 14 (49), (2017).

Tags

Biologi human lunge cocultures 3D menneskelige cokulturer luft-flydende interface isolering af menneskelige perifere blod monocytter primære makrofager og dendritiske celler kryoreserveret primære immunceller
Multicellulær human alveolær model sammensat af epitelceller og primære immunceller til farevurdering
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Barosova, H., Drasler, B.,… More

Barosova, H., Drasler, B., Petri-Fink, A., Rothen-Rutishauser, B. Multicellular Human Alveolar Model Composed of Epithelial Cells and Primary Immune Cells for Hazard Assessment. J. Vis. Exp. (159), e61090, doi:10.3791/61090 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter