Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Flercellet human alveolærmodell bestående av epitelceller og primære immunceller for farevurdering

Published: May 6, 2020 doi: 10.3791/61090
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1
1Adolphe Merkle Institute, University of Fribourg
* These authors contributed equally

Summary

Presentert her er en protokoll for primær humant blod monocytt isolasjon samt deres differensiering i makrofager og dendrittiske celler og montering med epitelceller i en flercellet menneskelig lungemodell. Biologiske responser av kokulturer bestående av immunceller differensiert fra enten nyisolerte eller tinte monocytter, ved eksponering for proinflammatoriske stimuli, sammenlignes.

Abstract

En menneskelig alveolær cellekokulturmodell er beskrevet her for simulering av alveolær epitelvevbarrieren som består av alveolr epitelceller av type II og to typer immunceller (det vil si menneskelige monocyttavledede makrofager [MDM] og dendrittiske celler [MDDCer]). En protokoll for montering av den flercellede modellen er gitt. Alveolar epitelceller (A549 cellelinje) dyrkes og differensieres under nedsenkede forhold på gjennomtrengelige innsatser i to-kammerbrønner, deretter kombinert med differensierte MDM-er og MDDCer. Til slutt blir cellene utsatt for et luftvæskegrensesnitt i flere dager. Som menneskelige primære immunceller må isoleres fra menneskelige buffy strøk, immunceller differensiert fra enten friske eller tint monocytter sammenlignes for å skreddersy metoden basert på eksperimentelle behov. De tredimensjonale modellene, bestående av alveolære celler med enten nyisolert eller tint monocyttavledede immunceller, viser en statistisk signifikant økning i cytokin (interlekin 6 og 8) frigjøring ved eksponering for proinflammatoriske stimuli (lipopolysakkarid og tumornekrosefaktor α) sammenlignet med ubehandlede celler. På den annen side er det ingen statistisk signifikant forskjell mellom cytokinfrigjøring observert i kokulturene. Dette viser at den presenterte modellen er lydhør overfor proinflammatoriske stimuli i nærvær av MDM-er og MDDCer differensiert fra friske eller tinte perifere blodmonocytter (PBMs). Dermed er det et kraftig verktøy for undersøkelser av akutt biologisk respons på forskjellige stoffer, inkludert aerosoliserte stoffer eller nanomaterialer.

Introduction

In vitro lungecellekulturer tilbyr kostnadseffektive, robuste og velkontrollerte plattformer for å vurdere farene ved aerosoler1. Som et modellcellesystem for humane alveolære pneumocytter brukes den epiteliske A549-cellelinjen isolert fra et lungeadenokarsinomofte 2. Disse cellene representerer plateepitelceller type II fra alveolrområdet3 og er en mye brukt lungecellelinje for fare- og toksisitetsvurdering1,,4,,5,,6,,7,,8,,9,,10. A549-cellelinjen har relevante trekk ved alveoler epiteltype II-celler, for eksempel tilstedeværelsen av karakteristiske lamellerlegemer som inneholder tettpakkede fosfolippider3.

Det har vist seg at når cellene er dyrket på et luftvæskegrensesnitt (ALI), frigjøres overflateaktivt middel på den a apiske siden av luftutsatte epitelceller, noe som redusereroverflatespenningen 11,12,,13. Denne funksjonen er spesielt viktig i nanomateriale respiratoriske respirasjonsfare- og toksisitetsundersøkelser. Når inhalerte nanomaterialer/toksikosmidler deponeres i alveolrområdet, samhandler de først med lungeovervveningsmiddel og forskyves ved å fukte krefter inn i vandig hypofase, hvor samspillet med lungecellerfinner sted 14,15. Selv om A549-celler danner en monolayer (som kan overvekst i flerlags ved senere tidspunkter når de dyrkes ved ALI) og produserer overflateaktivt middel, er en ulempe deres utilstrekkelige tette koblingsdannelse, noe som resulterer i lave transepitheliale elektriske motstandsverdier, men fortsatt presenterer en funksjonell barriere mot intercellulære (nano)partikler translokasjon16,17,18.

I lungene er det en rekke immuncellepopulasjoner, inkludert fagocytiske og profesjonelle antigen-presenterende celler (det vil si makrofager og dendrittiske celler) som direkte kommuniserer gjennom cellecellekontakt eller intercellulær signalisering for å kontrollere og opprettholde homeostase. Makrofager og dendrittiske celler er kritiske medfødte immuneffektorer og initiativtakere til adaptiv immunrespons19. Dendrittiske celler som bor i eller under epitelet kan danne fremspring over epitelet til lumen for å fange antigener. Alveolr makrofager ligger på den akaliske overflaten av epitelet og fungerer som sentinel celler, som representerer det første cellulære forsvaret mot fremmedlegemer samt bakterielle, virale og soppinfeksjoner. Deres fenotypisk plastisitet tillater raskt induksjon av proinflammatoriske reaksjoner som svar på slike stimuli, samt skifte til å utløse antiinflammatoriske (det vil si hemmende) reaksjoner20.

For å simulere den menneskelige alveolær epitelvevbarrieren etablerte vi en trippel kokulturmodell med A549-celler supplert med humant blodmon monocyttavledede makrofager (MDM) og dendrittiske celler (MDDCer) på de apiske og basale sidene,henholdsvis 17. Dyrking av denne modellen ved ALI har tidligere blitt rapportert16, selv opp til 72 h etter eksponering21. Akutte immunresponser mot eksponeringer av karbonnanorør ble betydelig forbedret i cellekulturen utsatt for ALI sammenlignet med nedsenkede forhold22. Kokulturmodellen, kultivert og utsatt for ulike materialer ved ALI, har tidligere blitt brukt til å undersøke cytotoksisitet, oksidativt stress og inflammatoriske responser på eksponeringer for sinkoksid,23 grafenrelatertematerialer 24, gullnanopartikler25,,26, karbonnanorør21, og vulkansk aske og diesel eksospartikler27.

Videre er makrofagenes og dendrittiske cellers viktige rolle som immuneffektorceller i en in vitro human lungemodell bekreftet. Spesielt ble en økt proinflammatoriske respons i modellen kun observert i nærvær av immunceller sammenlignet med monokultursystemer7. Potensielle ulemper ved å bruke primære monocytt-avledede immunceller er begrenset tilgjengelighet av PBMs samt donor-til-donor variasjon. Som en løsning på disse potensielle ulempene, presentert her er en protokoll som introduserer kryopreservation av nyisolerte PBMs28 for cellekulturmodellenheten. Målet med denne studien er å demonstrere 3D human alveolar epitelvev modell montering, inkludert isolering av PBMs fra menneskelige buffy strøk. Responsen til proinflammatoriske stimuli sammenlignes med modellen bestående av MDM-er og MDDCer differensiert fra ferske PBMs eller differensiert fra frosne/tinte PBMs.

Arbeid med utestede blodprøver innebærer spesifikk forsiktighet for å forhindre potensiell overføring av smittsomme sykdommer, som HIV (humant immunsviktvirus), hepatitt B og hepatitt C. Derfor er bruk av personlige beskyttelsestiltak som hansker, kjoler, masker og øyebeskyttelse avgjørende og må være i samsvar med gode laboratoriepraksisprinsipper. Disse beskyttelsene reduserer risikoen for å utsette huden eller slimhinnene for potensielt smittsomme væsker. I tillegg, for de som er involvert i håndtering av buffy strøk og PBMs, vaksinasjon mot hepatitt B-viruset er obligatorisk, og blod titer nivåer av antistoffer anti-hepatitt B må være over 100 IE / L (landspesifikke lovkrav må løses). I tillegg må alt arbeid utføres i biosikkerhetsnivå 2 laboratorier (landsspesifikke lovkrav må tas opp). Standard helse- og sikkerhetsforanstaltninger knyttet til arbeid i et laboratoriemiljø og håndtering av pattedyrcellekultur, herunder håndtering av avfall, bør vedtas ved gjennomføring av hele protokollen.

Protocol

Arbeidet med primære monocytter isolert fra menneskelig blod ble godkjent av komiteen for Federal Office for Public Health Switzerland (referansenummer: 611-1, Meldung A110635/2) for Adolphe Merkle Institute.

1. Isolering av monocytter i perifert blod (PBMs) fra menneskelige buffy strøk

MERK: Følgende avsnitt beskriver isolering av immunceller fra en 50 ml pose med en buffy pels, kjøpt fra swiss transfusjonssenter i Bern, Sveits.

  1. Tilberedning av reagenser
    1. Forbered 100 ml magnetisk separasjonsbuffer per buffy coat: 0,5% [w / v] storfe serum albumin (BSA; i fosfatbufret saltvann [PBS]) med 2 mM etylendiaminetetraketisk syre (EDTA), og juster til pH = 7,2, sterilt filter med 0,22 μm porestørrelse). Oppbevars ved 4 °C gjennom hele prosedyren.
    2. Forbered cellekulturmediet (CCM): RPMI 1640 med 10 % [v/v] fosterbovinserum (FBS), 1 % [v/v] L-glutamin (her, 2 mM L-glutamin), og 1% [v / v] penicillin-streptomycin (her, 100 enheter / ml penicillin og 100 μg / ml streptomycin).
      MERK: Den nødvendige mengden av hver reagens avhenger av antall celler som skal seedes i følgende trinn.
  2. Isolering av PBMs
    MERK: Alt glass og plastikk må steriliseres før bruk. Av sikkerhetsmessige årsaker anbefales bruk av plastikk ved håndtering av blodprøver for å redusere risikoen for skade med glass.
    1. Bruk saks til å åpne slangeenden av posen som inneholder buffy pelsen.
    2. Fordel den buffy pelsen ved å helle posens innhold gjennom posens kanal direkte i to koniske sentrifuge 50 ml rør (~ 25 ml hver).
    3. Hell eller pipette PBS forsiktig inn i rørene for å nå 50 ml volumer. Bland innholdet ved å snu røret forsiktig opp ned 3x.
    4. Del buffy coat-PBS-blandingen i fire nye koniske sentrifugerør på 50 ml ved å pipettere 25 ml av blandingen i hvert friske rør.
    5. Legg langsomt 13 ml tetthetsgradientmedium under buffy coat-PBS-blandingen ved hjelp av en 10 ml serologisk pipette. Ta den fylte pipetten fra pipetteholderen og koble umiddelbart den øvre åpningen av pipetten med en tommel for å forhindre ytterligere lekkasje av tetthetsgradientmediet inn i buffy coat-PBS-blandingen.
      MERK: Hold den øvre åpningen med tommelen, plasser den fylte pipetten nederst på det koniske sentrifugerøret slik at tetthetsgradientmediet sakte flyter under buffy coat-PBS-blandingen, slik at ca. 1 ml av tetthetsgradientmediet inne i pipetten.
    6. Gjenta trinn 1.2.5 med de tre andre rørene som inneholder buffy coat-PBS-blandingen.
    7. Sentrifuge alle fire rørene som inneholder blandingene i 20 min ved 1000 x g og 25 °C i langsom bremsemodus. Bruk holdere med beskyttende lokk for sentrifugering.
    8. Åpne lokket på hvert rør, fjern det øvre laget som inneholder plasma og blodplater ved hjelp av en serologisk pipette, og kast i en biologisk farlig væskeavfallsbeholder.
    9. Bruk en serologisk pipette for å samle det perifere blodmononukleære cellelaget, som vises som en hvitaktig uklar liten brøkdel (~ 2-3 mm i tykkelse) mellom plasmaet og tetthetsgradientmediumlagene. Pellet inneholder røde blodlegemer nederst. Unngå å overføre erytrocytter som danner det nederste laget. Gjenta dette for alle fire rørene.
      MERK: Perifere mononukleære blodceller består av PBMs og lymfocytter. PbMs vil bli skilt fra lymfocytter senere under magnetisk CD14 + separasjon.
    10. Pool perifere blod mononukleære celler fra fire rør i to 50 ml rør.
    11. Fyll opp de to rørene med PBS til 50 ml og dekk med lokk.
    12. Kast restene av erytrocytter og plasma fra de opprinnelige fire rørene i en beholder med biohazard flytende avfall.
    13. Sentrifuger de to rørene i 8 min ved 500 x g og 18–20 °C med vanlig sentrifugehastighet.
    14. Etter sentrifugering fjerner du supernatanten med en serologisk pipette og kaster den i en biologisk farlig væskeavfallsbeholder.
    15. Resuspend cellene med 5 ml PBS ved hjelp av en serologisk pipette.
    16. Pool cellen suspensjoner i en 50 ml konisk sentrifuge rør og fylle til 50 ml med PBS.
    17. Bruk 5 μL av cellesuspensjonen til å telle cellene med en celleteller ved hjelp av trypanblå (45 μL) ekskluderingsmetode.
    18. Pipette 10 μL av trypan blå-PBMs løsning i et celletellerkammer og telle antall celler i henhold til standard telleprotokoll. Bruk Formel 1 til å beregne det totale cellenummeret, CT.
      Equation 1
    19. Etter å ha talt cellene, sentrifugere 50 ml røret som gjort i trinn 1.2.13.
  3. CD14 positivt utvalg
    1. Åpne forsiktig lokket på hvert rør, fjern og kast overnatanten ved hjelp av en serologisk pipette uten å forstyrre pelleten.
    2. Tilsett beregnet mengde (Formel 2) av magnetisk separasjonsbuffer (her, 80 μL buffer per 1 x 107 totalt celler) og gjenoppusser cellepelleten ved å pipettere løsningen opp og ned.
      Equation 2
    3. Beregn ved hjelp av Formel 3 (her, 10 μL per 1 x 107 totalt celler) tilsvarende volum av CD14 + magnetiske perler og pipette riktig volum.
      Equation 3
    4. Bland godt ved å pipetter opp og ned, lukk lokket og inkuber oppløsningen ved 4 °C i 15 min.
    5. Ved inkubasjon fyller du røret opp til 50 ml med magnetisk separasjonsbuffer.
    6. Sentrifuge som gjort i trinn 1.2.13.
    7. Aspirer og kast overnatanten ved hjelp av en serologisk pipette uten å forstyrre cellepelleten.
    8. Pipette tilsvarende mengde magnetisk separasjonsbuffer (Formel 4; her, 500 μL buffer per 1 x 108 celler) og bland forsiktig ved å pipettere opp og ned 3x.
      Equation 4
    9. Desinfiser den magnetiske separasjonsstasjonen ved å sprøyte og tørke den med et steriliseringsmiddel. Plasser i laminær strømningshette sammen med kolonnen for magnetisk separasjon.
    10. Plasser den magnetiske separasjonskolonnen i magnetfeltet og plasser et tomt konisk sentrifugrør på 50 ml rett under kolonnen for å samle opp vaske- og umerkede celler (det vil vilørke).
    11. Skyll den magnetiske separasjonskolonnen ved å pipettere 3 ml magnetisk separasjonsbuffer inn i kolonnen. Ikke la kolonnen tørke ut gjennom hele prosedyren.
    12. Forbered et konisk sentrifugrør på 15 ml og pipette 1 ml magnetisk separasjonsbuffer.
    13. Påfør cellefjæringen (klargjort i trinn 1.3.8) på den magnetiske separasjonskolonnen. I 50 ml konisk sentrifugerør under filteret samler du umerkede celler som passerte gjennom.
      MERK: Ikke overskrid 2 x 109 celler per kolonne for å unngå blokkering av kolonnen.
    14. Så snart kolonnereservoaret er tomt (det vil si når cellene har passert gjennom kolonnen), bruk 3 ml magnetisk separasjonsbuffer ved hjelp av en serologisk pipette og la den passere gjennom kolonnen. Gjenta denne 3x.
    15. Fjern den magnetiske separasjonskolonnen fra magnetskilletegnet ved å forsiktig trekke med hendene, og plasser den deretter i et 15 ml rør som inneholder forhåndsrørt 1 ml magnetisk separasjonsbuffer (tilberedt i trinn 1.3.12).
    16. Tilsett 5 ml magnetisk separasjonsbuffer i kolonnen og skyll ut de magnetisk merkede cellene ved å skyve stempelet godt inn i kolonnen.
  4. Reagens klargjøring for MDM og MDDC differensiering
    1. Telle cellene med en celleteller ved hjelp av trypan blå ekskludering metoden som gjort i trinn 1.2.17.
    2. Beregn de nødvendige volumene av CCM eller FBS for ytterligere trinn som følger: enten volumet av CCM som tilsvarer en celletetthet på 1 x 106 celler / ml (trinn 1.5.1), eller volumet av FBS som tilsvarer en celletetthet på 6 x 106 celler per 0,9 ml FBS (trinn 1.6.3).
      Equation 5
    3. Lukk lokket, plasser røret i sentrifugen, og sentrifuge som gjort i trinn 1.2.13. Fjern og kast supernatanten uten å forstyrre cellepellet. Fortsett til trinn 1,5 for cellesåing eller trinn 1.6 for cellefrysing.
  5. PBM-såing og differensiering i MDM-er og MDDCer
    1. Gjenoppussette cellepellet i beregnet volum av CCM som beregnet i trinn 1.4.2 (her, en endelig konsentrasjon på 1 x 106 celler / ml) ved å pipettering opp og ned 3x.
    2. Pipette antall celler som er ment å differensiere i MDM-er og MDDCer i separate koniske sentrifugerør ved hjelp av en serologisk pipette.
    3. Pipetterdimineringsfaktorer til CCM med PBMs og bland godt ved å pipettere opp og ned. Differensieringsfaktorer brukes som følger:
      1. For MDDCer: endelig konsentrasjon på 10 ng / ml interleukin-4 (IL-4) og 10 ng / ml granulocytt-makrofag kolonistimulerende faktor (GM-CSF).
      2. For MDMs: endelig konsentrasjon av 10 ng / ml makrofag kolonistimulerende faktor (M-CSF).
    4. Pipette cellesuspensjonene i CCM med de ekstra differensieringsfaktorene i 6 brønnplater ved å distribuere 3 ml suspensjon per brønn (tilsvarer 3 x 106 celler/ brønn, det vil si 1 x 106 celler / ml).
    5. Plasser de 6 brønnplatene i en cellekultur inkubator (37 °C, 5 % CO2) og la dem differensiere i 6 dager uten å oppdatere CCM.
      MERK: Differensiering varierer fra 5–8 dager, avhengig av den lokale tilgjengeligheten av buffy coats og eksperimentell oppsett, forutsatt at differensieringseffektiviteten bestemmes ved hjelp av de riktige teknikkene (se diskusjonsdelen).
  6. PBM frysing
    1. Resuspend cellepellet i et kryobeskyttende medium (her, FBS og dimetylsulfoksid [DMSO; cytotoksisk]) i forholdet 9:1 (v / v) ved å pipetter et volum av prewarmed FBS. Dette tilsvarer en endelig cellekonsentrasjon på 6 x 106 celler / ml, med tanke på et ytterligere tillegg på 10% DMSO (v / v).
    2. Merk ønsket antall kryovialer i laminærstrømningshetten (det vil vil at du registrerer dato, isolasjonskode og antall celler).
    3. Pipette 0,9 ml cellesuspensjon i ren FBS (her, 6 x 106 celler i 0,9 ml FBS) til hver kryovial. Deretter sakte pipette 0,1 ml DMSO og bland suspensjonen godt ved å snu kryovialene opp og ned 3x.
    4. Overfør kryovialene til en cellefrysende beholder og sett den umiddelbart til -80 °C i 24 timer.
    5. Etter 24 timer, fjern kryovialene fra -80 °C fryseren og beholderen og plasser dem i den flytende nitrogentanken egnet for cellelagring.
  7. PBM tining og differensiering i MDMs og MDDCs
    1. Varm alle nødvendige reagenser til 37 °C i et vannbad (~20–30 min).
    2. Forbered riktig antall 6 brønnplater som tilsvarer antall tinte celler (her, en plate per 1,8 x 107 celler, det vil si 3 kryovialer). Pipette 2 ml CCM til hver brønn under aseptiske forhold. Plasser platene i inkubatoren (5 % CO2,37 °C) i 15 min for å la pH-en likevekte.
    3. Ta den nødvendige mengden kryovialer med frosne celler fra en flytende nitrogentank og virvle dem forsiktig i et 37 °C vannbad (1–2 min) for å sikre jevn tining av cellefjæringen.
    4. Fjern kryovialen fra vannbadet og dekontaminer med et steriliseringsmiddel, slik at agenten ikke samhandler med lokket og O-ringen.

      MERK: Herpå, alle trinnene må fullføres under aseptiske forhold.
    5. Forbered riktig antall koniske sentrifugerør på riktig antall 15 ml koniske sentrifugerør som tilsvarer antall kryovialer som skal tines (her, 6 x 106 celler/rør). Pipette 9 ml forhåndswarmed CCM inn i hvert rør.
    6. Pipetten sakte (drop-by-drop) innholdet i kryovialen i et rør som inneholder CCM. Lukk lokket, gjenta for hvert rør, og sentrifuge ved 200 x g i 5 min med en vanlig sentrifugehastighet.
    7. Kast det overnaturlige uten å forstyrre pelleten.
    8. Resuspend pellet fra hvert rør (som inneholder celler fra en kryovial) i 2 ml prewarmed CCM ved å pipetter opp og ned ved hjelp av en serologisk pipette (celletetthet tilsvarende 3 x 106 celler / ml).
    9. Fra hvert rør pipette de resuspended cellene i to brønner (1 ml per brønn) av en 6 brønnplate som inneholder 2 ml av tidligere forberedt CCM for å nå en celletetthet på 3 x 106 celler / brønn (tilsvarende en endelig konsentrasjon på 1 x 106 celler / ml). Gjenta dette for alle andre rør.
    10. Fortsett med differensiering som beskrevet i pkt. 1.5.3.
    11. Plasser de 6 brønnplatene i en cellekultur inkubator (37 °C, 5 % CO2) og la dem differensiere i 6 dager uten å oppdatere CCM.

2. Trippel celle kokultur modell av menneskelig alveolær epitelvev

MERK: Denne delen inneholder instruksjoner om volumer og cellenumre som tilsvarer 12 brønnplateinnsatser. Figur 1 oppsummerer en foreslått tidslinje for modellsamling.

  1. Epitelcelle (A549 cellelinje) såing
    1. Kultur epitelcellene i henhold til anbefalingene fra leverandøren (ATTC). Kort sagt, subkultur cellene i CCM ved 80% celle samløpet (ca, 2x-3x per uke).
      MERK: Subkultur A549 for minst fire passasjer før kokulturmodellsammensetningen, ved hjelp av A549-celler i et passasjeområde på 5–25.
    2. Pipette 1,5 ml forhåndswarmed CCM i 12 brønnplater (antall brønner tilsvarer ønsket antall modeller).
    3. Plasser individuelle 12 brønncellekulturinnlegg i brønner av en 12 brønnplate ved hjelp av steriliserte pinsett.
    4. Koble cellene fra en kolbe i henhold til subcultivation protokollen (det vil si ved hjelp av et løsnemiddel, fjerne agenten ved sentrifugering som gjort i trinn 1.2.13). Resuspend i riktig volum av CCM tilsvarende den endelige cellekonsentrasjonen av A549 (her, 50 x 104 celler / ml; 0,5 ml cellesuspensjon per innsats, det vil si 25 x 104 celler / innsats, noe som tilsvarer såetetthet på 27,8 x 104 celler / cm2).
    5. Pipette 0,5 ml av cellefjæringen (f.eks. 25 x 104 celler/innsats) inn i den a apiske siden av innsatsen ved hjelp av en 1 ml pipette.
    6. Dekk platene med lokk og legg dem i en cellekultur inkubator (37 °C, 5 % CO2) i 4 dager.
      MERK: Kontroller regelmessig samløpet til A549-celler under et mikroskop med fasekontrast.
  2. MDDC såing
    1. Aspirer CCM med celler uten tilknytning i de 6 brønnplatene som inneholder MDDCer.
    2. Tilsett 1 ml fersk forhåndswarmed CCM til hver brønn.
    3. Bruk en celleskraper, koble fra (skrap) mddcer fra hver brønn, vask brønnene forsiktig med eksisterende 1 ml CCM 3x, og kombiner dem i ett konisk sentrifugerør.
    4. Telle cellene med en celleteller ved hjelp av trypan blå eksklusjonsmetode ved hjelp av 10 μL celle suspensjon og 10 μL trypan blå løsning.
    5. Sentrifuger cellefjæringen som gjort i trinn 1.2.13.
    6. Beregn CCM-volumet som kreves for gjenoppliving (ligning 5):
      Nødvendig MDDC tetthet = 42 x 104 celler / ml; hvert innlegg krever 6,3 x 104 celler, noe som tilsvarer en seeded celletetthet på 7 x 104 celle / cm2 (her, 150 μL lagt til 0,9 cm2 i trinn 2.2.10.).
      CCM-volum for celleruspensjon (VM; Ligning 5):
      Equation 8
    7. Aspirer og kast CCM forsiktig fra det øvre kammeret på 12 brønnplater med voksende A549 på innsatsene.
    8. Plasser innsatsene med A549-celler i opp-ned-posisjon i en steril petriskål ved hjelp av steriliserte pinsett. Forbered et konisk sentrifugerør (50 ml) med PBS og pre-fukte en celleskraper.
    9. Skrap av A549-celler fra basaloverflaten på innsatsen (det vil vil at den øvre delen på opp-ned-stilling), som skal vokse gjennom porene på innsatsene.
      MERK: Skyll skrapen med PBS (tilberedt i et rør) mellom å skrape individuelle prøver og holde den våt gjennom hele prosedyren.
    10. Ved sentrifugering (trinn 2.2.5), aspirer og kast supernatanten, og sett deretter MDDC pellet på nytt i den beregnede mengden CCM (trinn 2.2.6) og pipetten opp og ned 3x.
    11. Pipette 150 μL av cellefjæringen på toppen av hvert innlegg, slik at hele basaloverflaten på innsatsen er like dekket med væsken og ikke inneholder bobler.
    12. Dekk parabolen med et lokk og legg i en cellekultur inkubator i 70 min. Aspirer CCM fra cellekulturplatene (der innsatsene i utgangspunktet er plassert), kast den i et biohazard flytende avfall og pipette 1,5 ml fersk CCM i hver brønn. Dekk platen med et lokk og legg i celleinkubatoren (37 °C, 5 % CO2).
      MERK: Ikke overskrid tidsperioden nevnt ovenfor for å unngå å tørke ut cellene.
    13. Etter inkubasjonen holder du forsiktig hver innsats med steriliserte pinsett og plasserer dem til platene som inneholder CCM i en vanlig stilling. Dekk platen med et lokk og sett den tilbake til celleinkubatoren (37 °C, 5 % CO2).
  3. Makrofag (MDM) såing
    1. Ta 6 brønnplater som inneholder predifferentiated MDMs. Plasser dem fra celleinkubatoren til en laminær strømningshette.
    2. Aspirer og kast CCM med ufestede MDM-er dyrket i 6 brønnplater, og pipette 1 ml fersk prewarmed CCM i hver brønn.
    3. Bruk en celleskraper til å forsiktig fjerne overholdte MDM-er fra individuelle brønner (som gjort i trinn 2.2.3 for MDDCene).
    4. Pipette 10 μL trypan blå i en brønn eller rør og tilsett 10 μL av MDM suspensjon for å oppnå den endelige fortynningen av 1:1 (v / v). Telle antall MDM-er ved hjelp av riktig opptellingsprotokoll.
    5. Sentrifuger cellefjæringen som gjort i trinn 1.2.13.
    6. Beregn det nødvendige volumet (Formel 6):
      Nødvendig MDM tetthet = 2,5 x 104 celler / ml i CCM (her krever hvert innlegg 1,25 x 104 celler i 0,5 ml CCM, noe som tilsvarer en seeded celletetthet på 1,4 x 104 celle / cm2).
      Equation 10(6)
    7. Ved sentrifugering, aspirer og kast det overnaturlige, redisperse MDM pellet i beregnet mengde CCM (trinn 2.3.6), og pipette opp og ned 3x.
    8. Pipette 0,5 ml ml MDM-fjæring (klargjort i trinn 2.3.7) på veggen av cellekulturen setter inn med A549 og MDDCer (ikke direkte på epitelceller) ved hjelp av en 1 ml pipette. Dekkplater med lokk og plasser i en cellekultur inkubator (37 °C, 5 % CO2) i 24 timer.
  4. Overføring av kokulturmodell til luftvæskegrensesnitt (ALI)
    1. Ved slutten av inkubasjonsperioden på 24 timer (±2 h) av den monterte modellen i en cellekulturinkubator, aspirerer og forkaster CCM fra både apale og basale deler av cellekulturen og fra brønnene.
    2. Bruk steriliserte pinsett, løft individuelle innsatser fra brønnene og pipetten 0,6 ml fersk forhåndsvarm CCM til hver brønn ved hjelp av en 1 ml pipette. Ikke legg CCM til den agiske siden av innsatsen.
    3. Dekkplater med lokk og plasser i en cellekultur inkubator (37 °C, 5 % CO2) for 24 timer før videre bruk.

3. Eksponering for utvalgte positive kontroller (kjent stimuli for å indusere proinflammatoriske respons)

MERK: Eksponering av kokulturmodeller til en kjent proinflammatoriske stimulus endotoxin lipopolysakkarid (LPS)7 og proinflammatory cytokin tumor nekrose faktor α (TNF-α)7 brukes til å illustrere responsen til modellen. Videre brukes eksponering for et vaskemiddel (Triton X-100) til å bekrefte følsomheten til en laktatdehydrogenase (LDH)-analyse.

  1. Klargjør de positive kontrollløsningene: LPS-lager (1 mg/ml i destillert vann), TNF-α-lager (100 μg/ml i destillert vann) og Triton-X 100 (2 % [v/v] i PBS).
  2. Ved 24 h inkubasjon av kokulturmodellen ved ALI-forhold, aspirerer og kast supernatanten fra basalrommet. Bruk steriliserte pinsett, løft individuelle innsatser fra brønnene og pipetten 0,6 ml frisk prewarmed CCM inn i hver brønn.
  3. Forbered individuelle positive kontroller arbeidsløsninger ved å fortynne bestandene i CCM i koniske sentrifugerør som følger: 1 μg/ml LPS, 1 μg/ml TNF-α og 0,2 % Triton-X 100. Volumene tilsvarer antall testede innsatser (her, 100 μL/innsats). Bland løsningene godt ved å pipetter opp og ned 3x.
  4. Påfør 100 μL av hver positiv kontrollløsning ved å sakte pipettering på veggen av cellekulturinnsatsen. Dekk brønnplaten med et lokk og plasser i cellekulturinkubatoren (37 °C, 5 % CO2) i 24 timer. Ved inkubasjon aspirerer og kast væsken på den a apiske siden av innsatsen ved å holde individuelle innsatser ved hjelp av pinsett.
  5. Samle CCM i basalrommene og oppbevar ved 1) 4 °C for videre LDH-analyse, som betegner cellemembranbruddmediert cytotoksisitet og/eller 2) oppbevares ved -80 °C for videre analyse av proteinfrigjøring via enzymbundet immunosorbentanalyse (ELISA). Kjør analysene i henhold til kit leverandør anbefalinger.
  6. Ved fjerning av CCM, vask innsatsene med PBS 3x og fest cellene på cellekulturinnlegg i 4% [w / v] paraformaldehyd (i PBS, 15 min ved romtemperatur) ved å sikre at begge innsatssidene er godt dekket med PFA-løsning. Vask deretter 3x med PBS for å fjerne PFA. Oppbevar prøvene nedsenket i PBS ved 4 °C for ytterligere immunsoppnåelse (et eksempel på denne metoden er beskrevet tidligere17).

Representative Results

Modeller for human lungekokultur, bestående av alveolærepitelceller og immunceller, ble satt sammen enten fra friske eller frosne MDDCer og MDMs forfedre (her humane perifere blodavledede monocytter). Som presentert i figur 1ble A549-cellene seeded 3 dager etter den første delen som involverte monocyttisolering/tining. Etter 6 dager med differensiering dukket de differensierte MDM-ene opp rundt, mens MDDCer dannet en mer langstrakt form med observerbare fremspring. De dukket også opp som agglomerater, spesielt når differensiert fra friske monocytter (Figur 2, Figur 3). Epitelceller dannet et tett cellelag av celler etter 3 dager med vekst på membraninnlegg (figur 4), da kokulturene ble montert. Etter 24 timer montering og ytterligere 24 timer med å bli utsatt for ALI-forhold, ble kokulturene forberedt på eksponeringer.

Responsen til 3D-cellekulturmodellene ble undersøkt ved eksponering for kjente proinflammatoriske stimuli ved hjelp av en pseudo-ALI-tilnærming, som beskrevet tidligere29. Proinflammatoriske stimuli, LPS og TNF-α, ble tilsatt i lave volumer (100 μL) på den aketiske overflaten av den luftutsatte cellemodellen. Parallelt ble fraværet av membranbrudd som et mål på cytotoksisitet vurdert via LDH-analyse. En signifikant økning i LDH-frigjøring i CCM i basalrommet ble observert ved eksponering for positiv kontroll for membranbrudd, et vaskemiddel Triton-X 100 (figur 5). Disse resultatene viste seg å være en reaksjonsevne for et cytotoksisk stoff, mens det ikke ble observert noen økning i LDH-frigjøring ved aksisk stimulering med TNF-α eller LPS.

En mulig årsak til de ulike målte verdiene for LDH i prøvene som er montert med enten ferske eller tidligere frosne PBMer, kan tilskrives prøvelagringen. Prøver fra ferske PBMs ble lagret i lengre tid ved -80 °C; Aktiviteten til LDH-enzymet kan derfor synke. Spesielt er LDH stabil i bare opptil 4 dager i CCM; dermed anbefales det å utføre analysen de siste 2 dagene etter innsamling av supernatantene. Alternativt er det mulig å fryse ned supernativa direkte etter innsamling. Det er imidlertid viktig å vurdere at frysing kan redusere den enzymatiske aktiviteten til LDH.

Sekresjon av proinflammatoriske meklere (her ble TNF-α og interleukins 6 [IL-6] og 8 [IL-8]) i basal CCM kvantifisert via ELISA. Statistisk signifikante (p < 0,05, enveis ANOVA) økninger i utgivelsen av IL-6 og IL-8 ble observert i både LPS- og TNF-α-behandlede prøver sammenlignet med respektive ubehandlede celler, samt i cellekulturmodellene som er satt sammen fra enten PBMs kilde (figur 6). Selv om konsentrasjonene (pg/ml) av alle de testede cytokinene i basal CCM var høyere i kokulturene bestående av ferske PBMer, var forskjellene mellom de to kokulturene og monokulturene ikke statistisk signifikante (p > 0,05) (figur 6). For å bekrefte merverdien av kokulturmodeller med hensyn til en 2D epitelcellekultur, ble A549 monokulturer også utsatt for LPS eller TNF-α. Som forventet var utgivelsen av alle undersøkte meklere fra A549 monokulturer lavere sammenlignet med begge kokulturmodellene; selv om forskjellen mellom dem ikke var statistisk signifikant (p > 0,05, enveis ANOVA).

Cellulær morfologi av 3D human alveolr epitelvev barriere ble vurdert via konfokal laser skanning mikroskopi (LSM). For å visualisere sammensetningen av hver modell, ble makrofager i kokulturmodellene (MDM-er) farget med moden makrofagmarkør 25F9. MDDCs ble farget med CD83, som er en viktig markør for aktiverte dendrittiske celler30. Når det gjelder cellulær morfologi, ble det ikke observert noen forskjell mellom kokulturmodellene ved hjelp av MDM-er og MDDCer fra ferske PBMer sammenlignet med de som bruker tinte PBMs. I LPS- og TNF-α-eksponerte kokulturer, både sammensatt av friske og frosne immunceller, ble det observert et forstyrret epitellag i LSM-bilder, som ikke var tilfelle i ubehandlede celler (figur 7, figur 8).

Figure 1
Figur 1: Skjematisk tidslinje for protokollen. Presentasjon av 3D kokultur modell forberedelse, montering og anvendelse (eksponering for et testet stoff). ALI = luft-flytende grensesnitt, MDDCs = monocytt-avledede dendrittiske celler, MDMs = monocytt-avledede makrofager, PBMs = perifere blod monocytter. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: MDM-er og MDDCer differensiert fra ferske PBMer. Fasekontrast mikroskopibilde av differensierte (A) MDM-er og (B) MDDCer fra ferske PBMs (6 dager etter celleisolering). MDM-er er rundeformede, mens MDDCer ofte observeres som agglomerater. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: MDM-er og MDDCer differensiert fra frosne PBMer. Mikroskopi av fasekontrast av differensierte (A) MDM-er og(B) MDDCer fra tinte PBMer (6 dager etter tining). MDMs er rundformede, men noen langstrakte celler kan observeres. MDDCer vises også rundformed med fremspring. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: Epitelceller vekst på membraninnsatser. Fasekontrast mikroskopi bilde av samløpet A549 vokser på en membran innsats 4 dager etter seeding, danner et tett lag av celler. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 5
Figur 5: Cytotoksisitetsresultater undersøkt via membranbruddsbasert (LDH)-analyse. Dataene presenteres som en fold økning over ubehandlede celler (gjennomsnitt ± SD, n = 3, stjerne betegner statistisk signifikant økning sammenlignet med ubehandlede celler, ** p < 0,01, **** p < 0,0001). I grønne modeller er MDM-er og MDDCer fra ferske PBMer representert, og i lilla modeller som er montert fra tinte PBMer er representert. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 6
Figur 6: Proinflammatoriske reaksjoner i kokulturer og monokulturer. Proinflammatoriske meklere (TNF-α, IL-6 og IL-8) slippes ut i kokulturene på 24 h utfordring med LPS eller TNF-α. Dataene presenteres i forhold til ubehandlede celler (gjennomsnitt ± SD, n = 3, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001). I grønne modeller er MDM-er og MDDCer fra ferske PBMer representert, og i lilla modeller som er montert fra tinte PBMer er representert. Grå representerer A549 monokulturer. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 7
Figur 7: Morfologi av kokulturer bestående av friske immunceller. LSM-bilder av apiske og basale sider av kokulturmodellen med xz-projeksjoner av apiske sider av modellen ved hjelp av MDM-er og MDDCer fra ferske PBMs. Cyan representerer kjerner (DAPI), magenta representerer cytoskeleton (rhodamine-phalloidin), hvitt representerer MDMs (25F9), og grønn representerer MDDCs (CD 83). Den hvite pilen angir MDM, mens den grønne pilen angir MDDC. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 8
Figur 8: Morfologi av kokulturer bestående av frosne immunceller. LSM-bilder av den apiske siden av kokulturmodellen med tilsvarende xz-projeksjoner, og basal side av modellen ved hjelp av MDM-er og MDDCer fra tinte PBMs. Cyan representerer kjerner (DAPI), magenta representerer cytoskeleton (rhodamine-phalloidin), hvitt representerer MDMs (25F9), og grønn representerer MDDCs (CD 83). Den hvite pilen angir MDM, mens den grønne pilen angir MDDC. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Discussion

Fremvoksende produksjon av nye materialer, inkludert kjemikalier og narkotika, øker gradvis behovet for prediktive in vitro-modeller. For å overholde de tre prinsippene for utskifting, reduksjon og raffinement avdyretesting 32,in vitro celle modeller har blitt kraftige verktøy om erstatning og reduksjon aspektet for å belyse mekanismer av et stoff eller materialets handling8,9,10,11. Presentert her er en detaljert protokoll for montering av flercellet modell ved hjelp av immunceller som enten er nyisolerte eller tint fra tidligere frosne monocytter. Også beskrevet er dyrking av modellen på ALI. Til slutt illustrerer protokollen et eksempel på eksponering for proinflammatoriske stimuli og sammenligner responsen fra de to modellene som inneholder enten friske eller frosne monocytter.

Ulike studier har blitt utført for å bekrefte og rettferdiggjøre merverdien av den forbedrede kompleksiteten til modellene dyrket og utsatt under ALI forhold sammenlignet med konvensjonell nedsenketeksponering 7,,22,,31. Observasjon av høyere proinflammatoriske respons hos kokulturer sammenlignet med monokulturer av epitelceller bekrefter en tidligere studie. Studien brukte den presenterte kokulturmodellen (stimulert med LPS) og viste en høyere respons på genuttrykksnivåer av TNF og IL1B sammenlignet med A549 monokulturekvivalent modell7. På den annen side viste begge modellene høyere variasjoner innenfor målte proinflammatoriske meklerutgivelsesverdier sammenlignet med A549 monokulturer. Dette kan forklares ved bruk av immunceller fra forskjellige donorer (buffy coats) i biologiske repetisjoner (det vil si en repetisjon, en donor), som tidligere vist7. Hvis ønskelig, kan variasjonene blant replikere overvinnes med 1) ved hjelp av tinte PBMs fra samme donor eller 2) pooling PBMs fra forskjellige givere før frysing av cellene, deretter etterfølgende bruk av samme basseng i hver repetisjon. Inkludert mer biologiske repetisjoner anbefales også.

Cellefrysingsteknikken kan betraktes som et kritisk skritt; Det er imidlertid en vanlig laboratorieprosedyre for å bevare celler for fenotypisk og funksjonell analyse. Ulike studier har vist at kvaliteten på frosne PBMs er avgjørende for deres overlevelse, og en passende fryseteknikk er nøkkelen til suksessen til påfølgende analyser med de samme cellene28,32. Endring av protokollen kan utføres ved frysing pbms, som gir fleksibilitet i eksperimentell oppsett, som tilgjengeligheten av buffy strøk er vanligvis begrenset. En annen fordel med å bruke frosne PBMs (i flere hetteglass) over nyisolerte er at de kan brukes i etterfølgende eksperimenter selv etter 1 år. Dette reduserer det potensielle spørsmålet om donor-til-donor-variasjon hvis dette er en ønsket eller nødvendig parameter i en eksperimentell.

Resultatene av en interlaboratorisk sammenligning utført etter opptil 13 måneder viser at PBMs, når de er riktig lagret i en flytende nitrogentank, kan brukes over en lang periode uten noen effekt på celle levedyktighet eller cellegjenoppretting33. Lengre lagringstider (over 1 år) kan være mulig ved nøye validering av cellelevebilitet og cellerespons før du utfører et eksperiment. Temperaturen i den flytende nitrogentanken må også holde seg stabil til enhver tid. Hovedfaktoren som påvirker levedyktigheten til kryoreserverte PBMer ble funnet å være DMSO konsentrasjon, med en optimal konsentrasjon på 10%–20 % (v/v)28. For å minimere potensielt skadelige effekter av frysing, blir ulike kilder til proteiner, FBS eller BSA (med et bredt spekter av konsentrasjon fra 40% opp til 100 %34) ofte lagt til frysemediet som naturlige beskyttende komponenter som kan øke celleoverlevelse.

På grunn av det høye cytotoksiske potensialet til DMSO, anbefales det først å spre PBMs i FBS, og deretter legge DMSO til PBMs allerede spredt i FBS. Spesielt, selv om høyere FBS konsentrasjoner (> 40%) viste ingen forbedring i celle levedyktighet, samtidig forårsaket de ikke skade på cellene28. Likevel er frysing monocytter en mulig tilnærming til å overvinne problemer med begrenset buffy pels tilgjengelighet. Hvis bruk av MDDCer og MDM-er fra ferske PBM-er er ønsket, kan imidlertid immuncellene differensieres og brukes 5–8 dager etter isolasjon7,,16,,17,,35,,36,,37. Hvis eksperimentell planlegging tillater det, anbefales minst 6 dagers differensiering i både MDDCer og MDM-er. Konsistensen mellom ulike repetisjoner i samme eksperiment, sammen med rutinemessige inspeksjoner av deres spesifikke overflatemarkøruttrykk, er imidlertid avgjørende. Responsen på en proinflammatoriske stimulans, som LPS, etter differensieringstiden, bør også kontrolleres regelmessig.

Mange undersøkelser ved hjelp av A549 cellelinjen har blitt utført på ALI, enten som en monokultur eller kombinert med andre celletyper (makrofager, dendrittiske celler, eller fibroblaster) i 3D kokultur modell22,24,29,38. Ved hjelp av denne 3D kokulturmodellen har cytotoksisitet, oksidativt stress eller proinflammatoriske effekter av (nano-)materialer blitt undersøkt i opptil 72 t1,,17,,21,,24,,29. Modellens likhet med in vivo vev har tidligere blitt undersøkt basert på confocal laser skanning avbildning av modellen16. Når du monterer modellen, er det viktig å vurdere både cellespredning (som kan påvirke A549 i modellen som presenteres her) samt ytelsen til de primære (ikke spre) immuncellene (her MDDCer og MDM). Det er også viktig å vurdere at ikke alle CD14 positive monocytter skiller seg inn i MDDCer og MDM-er, og at cellene kan være til stede i både vedlagte og suspenderte former. Basert på arten av kokulturenheten (her må begge celletypene festes til det eksisterende epitellaget), anbefales det å bruke bare de tilslutnende underpopulasjonene av begge immuncelletyper. I tillegg har rutinemessige analyser av monocytter, MDDC og MDM monokulturrespons til LPS, og uttrykk for spesifikke overflatemarkører (CD14, CD163, CD86, CD93 eller CD206, data som ikke vises) antydet at 6 og 7 dager med differensiering er de optimale tidspunktene.

Selv om et realistisk antall alveolr epitelceller i menneskelige lunger tilsvarer ~ 160.000 celler / cm2, er antall A549-celler talt i modellen ~ 1.000.000 celler / cm2 etter 9 dager kultivert på innsatsen16,18. Dermed må denne in vitro-modellens begrensninger vurderes. For det første ble tettheten av epitelceller etablert basert på deres evne til å danne et samløpet lag på den voksende membranen. Det er også viktig å nevne at A549 representerer en epiteltype II-celle med en cuboidal form, i motsetning til epiteltype I-celler, som er flate og outspread. På den annen side ble det nødvendige antallet immunceller etablert basert på litteraturen og presentert i denne protokollen som cellenummer / overflateareal39,40,41. Celletettheten til MDDCer i området 400 celler/mm2 (4 celler/cm2)16 kan sammenlignes med steady-state celletettheten på 500–750 celler/mm2 (5- 7 celler/cm2) rapportert fra in vivo-studier39. Tettheten av MDMs i denne modellen er innenfor samme spekter av in vivo situasjon i den menneskelige alveolr regionen40.

Eldre makrofagmarkørfarging (25F9) ble observert både på den a apiske siden (der MDM-er er til stede) samt basalsiden (det vil vil vil at det er på stedet av dendrittiske celler). Translokasjon av immunceller gjennom membranen setter porene er mulig og har også blitt observert ved hjelp av denne modellen16, noe som kan forklare de observerte forskjellene i fargingsintensiteter. En annen mulig forklaring er imidlertid at den modne makrofagmarkøren også kan uttrykkes på dendrittiske celler, men uttrykket er svært giverspesifikt42. Intensiteten av 25F9-uttrykket er også mye høyere i MDMs (figur 7, figur 8). Både proinflammatoriske stimuli (LPS og TNF-α) påvirket integriteten til lungeepitelbarrieren i begge kokulturer (figur 7, figur 8). Dette var forventet basert påtidligere publikasjoner 43,44 viser at proinflammatoriske cytokiner og bakterielle produkter forstyrre integriteten til epitelbarrierer.

3D multicellulær modell av det humane alveolære epitelet, etablert og karakteriserttidligere 17,har fungert som et kraftig og nyttig verktøy for å vurdere biologiske responser (det vil vil vil at akutte proinflammatoriske reaksjoner, oksidativ stressrespons, partikkeldistribusjon og cellulær kommunikasjon) in vitro21,24,25,45. Resultatene bekrefter ansvaret for kokulturmodeller til proinflammatoriske stimuli (her LPS og TNF-α). Responsen ble litt økt ved bruk av immunceller fra ferske PBMs; Det var imidlertid ingen statistisk signifikant forskjell mellom kokulturer ved bruk av ferske vs. tinte PBMer. Videre var de proinflammatoriske reaksjonene til begge kokulturmodellene høyere enn de av epitelcellemonokulturer dyrket under samme (ALI) forhold. Oppsummert beskriver protokollen monteringen av en 3D human alveolr epitelvevkokulturmodell ved hjelp av enten friske eller tinte PBMer for differensiering i MDMs og MDDCer. Det er vist at begge modellene er svært lydhøre for proinflammatoriske stimuli; Derfor kan de tjene som kraftige verktøy for potensielle fare- og toksisitetsvurderinger.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Forfatterne vil gjerne takke Dr. Miguel Spuch-Calvar for coculture ordningen i figur 3 og til Dr. Bedia Begum Karakocak for kritisk lesing. Denne studien ble støttet av PATROLS-prosjektet, EUs Horizon 2020 Research and Innovation Programme i henhold til tilskuddsavtale nr. B.D. takker Peter und Traudl Engelhorn foundation for økonomisk støtte.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Benchmark microplate reader does not have to be specific, for example BioRad, Cressier, Switzerland
Cell culture Incubator does not have to be specific
Cell freezing container (for example Mr. Frosty) does not have to be specific
Centrifuge does not have to be specific
Confocal laser scanning microscope does not have to be specific, for example Zeiss LSM 710 meta
Heamatocytometer, or automatic cell counter does not have to be specific
Laminar bio-safety hood class II does not have to be specific
MultiStand Macs (Macs Cell Separator) Miltenyi, Germany 130-042-303
pH meter does not have to be specific
Phase contrast inverted light microscope does not have to be specific
Pipette boy, pipettors (different volumes) do not have to be specific
Scissors do not have to be specific
Vacuum pump does not have to be specific
Water bath does not have to be specific
Disposable small equipment/glassware Catalogue Number
15 mL and 50 mL conical centrifuge tubes does not have to be specific
6- and 12-well cell culture plates, flat bottom, low evaporation lid, sterile Falcon, Switzerland 353046 and 353043
Cell culture inserts, transparent PET membrane, 12-well, 3 μm pore size Falcon, Switzerland 353181
Cell scrapper does not have to be specific, for example VWR, Switzerland 353085
Cryovials do not have to be specific
Glass autoclaved Petri Dishes do not have to be specific
LS Columns Miltenyi, Germany 130-042-401
Sterile filtration cup for vacuum filtration, 0.2 μm pore size does not have to be specific, for example VWR, Switzerland 10040-446
Sterile Lab Bottle compatible with Filtration cup (min. 100 mL) does not have to be specific
Sterile pipettes do not have to be specific
Chemicals
Bovine serum albumine (BSA) Sigma-Aldrich, Switzerland A7030-100g
CD14+ MicroBeads human - magnetic beads Miltenyi, Germany 130-097-052
Deattachnig agent Trypsin-EDTA, 0.05%, phenol red Gibco, Switzerland 25300054
Density gradient medium Lymphoprep Alere Technologies AS, Norway 1114547
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) Sigma Aldrich, Switzerland D2438
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Sigma-Aldrich, Switzerland E6758-100g
Fetal bovine serum (heat inactivated) Gibco, Switzerland 10270-106
Human granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF), premium grade Miltenyi, Germany 130-093-864
Human Interleukin 4 (IL-4), premium grade Miltenyi, Germany 130-095-373
Human macrophage colony-stimulating factor (M-CSF), premium grade Miltenyi, Germany 130-096-485
L-glutamine Gibco, Switzerland 25030-024
Lipopolysaccharid (LPS) from Escherichia coli Sigma-Aldrich, Switzerland 4524-5mg
Paraformaldehyde (PFA) Sigma-Aldrich, Switzerland 158127
Penicilin-Streptomycin Gibco, Switzerland 15140-122
Phosphate Buffer Saline (PBS) Gibco, Switzerland 10010-015
Roswell Park Memorial Institute-1640 Medium (RPMI) Gibco, Switzerland 42401-018
Triton X-100 Sigma-Aldrich, Switzerland T8787
Trypan blue solution (0.4%) Sigma Aldrich, Switzerland
Tumor necrosis factor alpha (TNF-α) Immunotools 11343015
Assays used for cytotoxicity, (pro-)inflammatory response
Cytotoxicity Detection Kit (LDH) Roche, Switzerland 11644793001
Human IL-6 DuoSet ELISA R&D, Biotechne, Switzerland DY206
Human IL-8/CXCL8 DuoSet ELISA R&D, Biotechne, Switzerland DY208
Immunostaining
4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI), concentration 2 μg/mL Sigma-Aldrich, Switzerland 10236276001
Goat anti-mouse IgG (H+L) Alexa Fluor 647 conjugated, concentration 20 μg/mL Abcam, UK ab150115
Goat anti-rabbit IgG antibody (H+L) Dylight 488 conjugated, concentration 10 μg/mL Agrisera, Sweden AS09 633
Mature Macrophage Marker Monoclonal Antibody, concentration 50 μg/mL eBioScience, Thermo Fischer, Switzerland 14-0115-82
Phalloidin rhodamine, concentration 0.264 µM Molecular Probes, Life Technologies, Switzerland R415
Recombinant Anti-CD83 antibody, 1:50 dillution Abcam, UK ab244204

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rothen-Rutishauser, B., Blank, F., Mühlfeld, C., Gehr, P. In vitro models of the human epithelial airway barrier to study the toxic potential of particulate matter. Expert Opinion on Drug Metabolism and Toxicology. 4 (8), 1075-1089 (2008).
  2. Giard, D., et al. In vitro cultivation of human tumors: establishment of cell lines derived from a series of solid tumors. Journal of National Cancer Institute. 51 (5), 1417-1423 (1973).
  3. Ochs, M., Weibel, E. R., et al. Ch. 2: Functional Design of the Human Lung for Gas Exchange . Fishman's Pulmonary Diseases and Disorders, 5e. Grippi, M. A., et al. , McGraw-Hill Education. (2008).
  4. Foster, K. A., Oster, C. G., Mayer, M. M., Avery, M. L., Audus, K. L. Characterization of the A549 Cell Line as a Type II Pulmonary Epithelial Cell Model for Drug Metabolism. Experimental Cell Research. 243 (2), 359-366 (1998).
  5. Guo, X. Y., Lu, M., Chen, X. Q., He, F. D., Li, A. Correlation study of biological characteristics of non-small cell lung cancer A549 cells after transfecting plasmid by microbubble ultrasound contrast agent. Asian Pacific Journal of Tropical Medicine. 9 (6), 582-586 (2016).
  6. Cooper, J. R., et al. Long Term Culture of the A549 Cancer Cell Line Promotes Multilamellar Body Formation and Differentiation towards an Alveolar Type II Pneumocyte Phenotype. PLoS ONE. 11 (10), 0164438 (2016).
  7. Bisig, C., Voss, C., Petri-Fink, A., Rothen-Rutishauser, B. The crux of positive controls - Proinflammatory responses in lung cell models. Toxicology In Vitro. 54, 189-193 (2019).
  8. Rothen-Rutishauser, B., et al. A newly developed in vitro model of the human epithelial airway barrier to study the toxic potential of nanoparticles. ALTEX. 25, (2008).
  9. Braakhuis, H. M., et al. Progress and future of in vitro models to study translocation of nanoparticles. Archives of Toxicology. 89 (9), 1469-1495 (2015).
  10. Thai, P., Chen, Y., Dolganov, G., Wu, R. Differential regulation of MUC5AC/Muc5ac and hCLCA-1/mGob-5 expression in airway epithelium. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 33 (6), 523-530 (2005).
  11. Wu, J., et al. Characterization of air-liquid interface culture of A549 alveolar epithelial cells. Brazilian Journal of Medical and Biological Research. 51 (2), 6950 (2017).
  12. Shapiro, D. I., Nardone, L. L., Rooney, S. A., Motoyama, E. K., Munoz, J. L. Phospholipid biosynthesis and secretion by a cell line (A549) which resembles type II aleveolar epithelial cells. Biochimica and Biophysica Acta. 530 (2), 197-207 (1978).
  13. Balis, J., Bumgarner, S. D., Paciga, J. E., Paterson, J. F., Shelley, S. A. Synthesis of lung surfactant-associated glycoproteins by A549 cells: description of an in vitro model for human type II cell dysfunction. Experimental Lung Research. 6 (3-4), 197-213 (1984).
  14. Schurch, S., Gehr, P., Im Hof, V., Geiser, M., Green, F. Surfactant displaces particles toward the epithelium in airways and alveoli. Respiration Physiology. 80 (1), 17-32 (1990).
  15. Gehr, P., Schurch, S., Berthiaume, Y., Hof, V. I., Geiser, M. Particle Retention in Airways by Surfactant. Journal of Aerosol Medicine. 3 (1), 27-43 (2009).
  16. Blank, F., Rothen-Rutishauser, B., Gehr, P. Dendritic Cells and Macrophages Form a Transepithelial Network against Foreign Particulate Antigens. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 36 (6), (2007).
  17. Rothen-Rutishauser, B. M., Kiama, S. G., Gehr, P. A three-dimensional cellular model of the human respiratory tract to study the interaction with particles. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 32, (2005).
  18. Blank, F., Rothen-Rutishauser, B. M., Schurch, S., Gehr, P. An optimized in vitro model of the respiratory tract wall to study particle cell interactions. Journal of Aerosol Medicine. 19, (2006).
  19. Jardine, L., et al. Lipopolysaccharide inhalation recruits monocytes and dendritic cell subsets to the alveolar airspace. Nature Communications. 10 (1), 1999 (2019).
  20. Kopf, M., Schneider, C., Nobs, S. P. The development and function of lung-resident macrophages and dendritic cells. Nature Immunology. 16 (1), 36-44 (2015).
  21. Chortarea, S., et al. Repeated exposure to carbon nanotube-based aerosols does not affect the functional properties of a 3D human epithelial airway model. Nanotoxicology. 9 (8), 983-993 (2015).
  22. Hilton, G., Barosova, H., Petri-Fink, A., Rothen-Rutishauser, B., Bereman, M. Leveraging proteomics to compare submerged versus air-liquid interface carbon nanotube exposure to a 3D lung cell model. Toxicology In Vitro. 54, 58-66 (2019).
  23. Brandenberger, C., et al. Effects and uptake of gold nanoparticles deposited at the air-liquid interface of a human epithelial airway model. Toxicology and Applied Pharmacology. 242, (2010).
  24. Drasler, B., et al. Single exposure to aerosolized graphene oxide and graphene nanoplatelets did not initiate an acute biological response in a 3D human lung model. Carbon. 137, 125-135 (2018).
  25. Durantie, E., et al. Carbon nanodots: Opportunities and limitations to study their biodistribution at the human lung epithelial tissue barrier. Biointerphases. 13, (2018).
  26. Brandenberger, C., et al. Quantitative evaluation of cellular uptake and trafficking of plain and polyethylene glycol-coated gold nanoparticles. Small. 6 (15), 1669-1678 (2010).
  27. Tomašek, I., et al. Combined exposure of diesel exhaust particles and respirable Soufrière Hills volcanic ash causes a (pro-)inflammatory response in an in vitro multicellular epithelial tissue barrier model. Particle and Fibre Toxicology. 13 (1), 67 (2016).
  28. Nazarpour, R., et al. Optimization of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells (PBMCs) Cryopreservation. International Journal of Molecular and Cellular Medicine. 1 (2), 88-93 (2012).
  29. Endes, C., et al. An in vitro testing strategy towards mimicking the inhalation of high aspect ratio nanoparticles. Particle and Fibre Toxicology. 11 (1), (2014).
  30. Ju, X., et al. The Analysis of CD83 Expression on Human Immune Cells Identifies a Unique CD83+-Activated T Cell Population. Journal of Immunology. 197 (12), 4613-4625 (2016).
  31. Lenz, A. G., et al. Inflammatory and Oxidative Stress Responses of an Alveolar Epithelial Cell Line to Airborne Zinc Oxide Nanoparticles at the Air-Liquid Interface: A Comparison with Conventional, Submerged Cell-Culture Conditions. BioMed Research International. , 12 (2013).
  32. Germann, A., Schulz, J. C., Kemp-Kamke, B., Zimmermann, H., von Briesen, H. Standardized serum-free cryomedia maintain peripheral blood mononuclear cell viability, recovery, and antigen-specific T-cell response compared to fetal calf serum-based medium. Biopreservation and Biobanking. 9 (3), 229-236 (2011).
  33. Weinberg, A., et al. Optimization and Limitations of Use of Cryopreserved Peripheral Blood Mononuclear Cells for Functional and Phenotypic T-Cell Characterization. Clinical and Vaccine Immunology. 16 (8), 1176 (2009).
  34. Freshney, R. I. Culture of animal cells: a manual of basic technique. Freshney, R. I. , Wiley-Liss Inc. 321-334 (2005).
  35. Lehmann, A. B. C., Blank, F., Gehr, P., Rothen-Rutishauser, B. Alternatives to animal testing. Yarmush, M. L., Langer, R. S. , Artech House. 239-260 (2010).
  36. Steiner, S., et al. Reduction in (pro-)inflammatory responses of lung cells exposed in to diesel exhaust treated with a non-catalyzed diesel particle filter. Atmospheric Environment. 81, 117-124 (2013).
  37. Martinez, F. O., Gordon, S., Locati, M., Mantovani, A. Transcriptional Profiling of the Human Monocyte-to-Macrophage Differentiation and Polarization: New Molecules and Patterns of Gene Expression. The Journal of Immunology. 177 (10), 7303 (2006).
  38. Chortarea, S., et al. Profibrotic activity of multi-walled carbon nanotubes upon prolonged exposures in different human lung cell types. Applied In Vitro Toxicology. 5 (1), (2019).
  39. Holt, P. G. Pulmonary Dendritic Cells in Local Immunity to Inert and Pathogenic Antigens in the Respiratory Tract. Proceedings of the American Thoracic Society. 2 (2), 116-120 (2005).
  40. Pinkerton, K. E., Gehr, P., Castañeda, A., Crapo, J. D. Comparative Biology of the Normal Lung (Second Edition). Parent, R. A. , Academic Press. 105-117 (2015).
  41. Crapo, J., Barry, B., Gehr, P., Bachofen, M., Weibel, E. R. Cell number and cell characteristics of the normal human lung. American Review of Respiratory Disease. 126 (2), 332-337 (1982).
  42. Maniecki, M. B., Møller, H. J., Moestrup, S. K., Møller, B. K. CD163 positive subsets of blood dendritic cells: The scavenging macrophage receptors CD163 and CD91 are coexpressed on human dendritic cells and monocytes. Immunobiology. 211 (6), 407-417 (2006).
  43. Chignard, M., Balloy, V. Neutrophil recruitment and increased permeability during acute lung injury induced by lipopolysaccharide. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 279 (6), 1083-1090 (2000).
  44. Coyne, C. B., et al. Regulation of Airway Tight Junctions by Proinflammatory Cytokines. Molecular Biology of the Cell. 13 (9), 3218-3234 (2002).
  45. Durantie, E., et al. Biodistribution of single and aggregated gold nanoparticles exposed to the human lung epithelial tissue barrier at the air-liquid interface. Particle and Fibre Toxicology. 14 (49), (2017).

Tags

Biologi utgave 159 humane lungekokulturer 3D humane kokulturer luftvæskegrensesnitt isolering av humane perifere blodmonocytter primære makrofager og dendrittiske celler kryoserverte primære immunceller
Flercellet human alveolærmodell bestående av epitelceller og primære immunceller for farevurdering
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Barosova, H., Drasler, B.,… More

Barosova, H., Drasler, B., Petri-Fink, A., Rothen-Rutishauser, B. Multicellular Human Alveolar Model Composed of Epithelial Cells and Primary Immune Cells for Hazard Assessment. J. Vis. Exp. (159), e61090, doi:10.3791/61090 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter