Summary
我们引入一种内管方法的袖口技术，小鼠宫颈异位心脏移植，以帮助永远在袖口的容器。我们发现，两位经验丰富的外科医生的合作大大缩短了手术时间。
Abstract
穆林心脏移植已经进行了40多年。随着显微外科的进步，某些新技术被用于提高手术效率。在我们的实验室中，我们通过两个主要步骤优化了袖口技术。首先，我们使用内管技术将一个临时内管插入外侧血管和胡萝卜动脉血管，以方便血管在袖口上旋转。其次，我们通过两位经验丰富的外科医生的合作，进行了完整的异位心脏移植。这些修改有效地将操作时间缩短到 25 分钟，成功率达 95%。在此报告中，我们将详细描述这些过程，并提供补充视频。我们相信，这份关于改进的袖口技术的报告将为小鼠异位心移植提供实用的指导，并将增强这种小鼠模型在基础研究上的实用性。
Introduction
1973年，通过腹部的端到端肿瘤进行小鼠异位心脏移植的建立，是基础移植免疫学研究的一个重要里程碑。该模型为分析缺血再灌注损伤2、免疫排斥,和耐受性3、4的机制提供了重要有效的工具。然而，手术的复杂和耗时的性质，以及潜在的感染可能导致严重的腹腔和炎症反应，导致异位心移植模型的效率低。
1991年5月，陈首先描述了宫颈异位心移植技术。在此模型中，接受者的外血管被移植到移植物的肺动脉上，胡萝卜动脉被移植到上升主动脉上。这种方法的主要优点是便于监测和减少对接受者的创伤。同年，松浦晃一郎描述了一种改进的技术，其中外部血管和胡萝卜动脉的端部被戴在特氟隆袖口上，并用圆周丝结字6固定。一些研究人员还固定袖口在捐赠者心脏的右肺动脉之前插入袖口到接受者的外壶静脉7。迄今为止，袖口技术已广泛应用于各种血管皮囊移植模型，包括肺8、肝9、肾10移植等。
迄今为止，袖口技术存在一些困难。例如，由于额外的弹性，胡萝卜动脉很难在袖口上穿戴，导致组织向后翻转。因此，可能需要额外的练习和显微手术扩张器来完成此步骤。此外，子宫颈血管的准备可能需要长达25分钟。
为了解决这些问题，我们引入了内管技术，该技术基于袖口技术，包括使用内管固定外壶静脉和胡萝卜动脉上的袖口，帮助血管壁的反射。此外，通过简单的培训，接收者的准备时间缩短到15.5分钟。这种技术降低了手术的复杂性，不需要额外的练习或使用血管扩张器。它可以应用于所有移植免疫研究，特别是用于验证第三方免疫耐受性，在此期间，接受者接受两个心脏等值，一个在腹部，另一个在颈部11。我们还建议两位熟练的外科医生合作建立这种模式，一位外科医生准备接受动物，另一名外科医生准备收获和植入供体心脏。这种协作可将操作时间缩短至 25 分钟。利用这个优化的程序，我们建立了合成，异基因12，13，14，15，16，17，18，19，和异种小鼠心脏移植模型20。12,13,14,15,16,17,18,19
内管技术发展的基本原理是缩短建立小鼠心脏移植模型的操作时间，成功率高。与传统缝合和袖口技术相比，宫颈心脏移植模型的优化有助于在短时间内获得高成功率。此外，与使用单一操作者进行的手术相比，合作模式可以进一步缩短供体心脏的暖缺血时间。
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Protocol
动物（BALB/c，C57BL/6，雄性，8-12周）被安置在厦门大学实验动物中心特定的无病原体设施中。C57BL/6 用作接收方，BALB/c 用作捐赠者。所有程序都按照机构动物护理和使用委员会 （IACUC） 的准则执行。
注：操作需要一组显微外科仪器，包括微型剪刀、微型直钳、微弯曲钳和微针架（表和材料，图 1B、C、D、E）。需要一对一次一次斗牛犬夹 （图 1F） .在显微镜下用10号手术刀切割定制的聚酰胺管，为外壶静脉和胡萝卜状动脉准备了两个袖口。静脉和动脉袖口的直径分别是0.9毫米和0.55毫米。此外，相应静脉袖口的内管直径为0.6毫米，相应动脉袖口的内管直径为0.28毫米（图1G）。
1. 收件人准备
- 用五巴比妥（60毫克/千克，即p）麻醉接受小鼠。使用创伤机械剪子去除右侧宫颈区域的头发。
- 使用无菌棉尖施用器用碘防腐剂擦拭手术区域，然后用70%乙醇擦拭手术区域。
- 将鼠标放在操作平台上的上位位置。用无菌纱布盖住鼠标。
- 使用眼科剪刀做一个横向切口从下三分之一的领口到右肩锁关节。
- 用微弯曲钳分离出右外侧血管，以露出足够的长度，通过电凝切断分支，并使用 6-0 丝缝合线将容器在远端的壁接。
- 使用斗牛犬夹紧紧外部血管，然后用微型剪刀将静脉近向连结。
- 用 100 U/mL 0-4 °C 肝素盐水清洗容器流明，以去除任何残留血液。
- 使用微直钳将外血管通过静脉袖口拉;将静脉内管作为支架插入流明中，用微直钳将血管壁戴在袖口上（图2A）。
- 使用圆周 8-0 修复袖口近端的透水容器内皮丝绸缝合线（图2B）。
- 使用微直钳将静脉内管从静脉血管中取走。
- 使用微弯曲钳进行钝解剖，以隔离与胸骨内边缘相邻的右胡萝卜状动脉。
- 使用斗牛犬夹紧右胡萝卜动脉，使用 6-0 丝缝合线将胡萝卜动脉紧住，并使用微型剪刀将胡萝卜动脉直向连结。
- 用 100 U/mL 0-4 °C 肝素盐水清洗胡萝卜动脉，以去除任何残留的血液。
- 通过动脉袖口通过胡萝卜动脉，并使用微直钳将动脉内管插入动脉血管（图2C）。
- 使用微型直钳将容器戴在袖口上;使用圆周 8 - 0 修复 evered 的容器内皮丝绸缝合线（图2D）。
- 用微直钳将动脉内管从动脉容器中取走。
注：保留接受者的亚甲状腺腺。
2. 捐助者的准备
- 用五巴比妥（60毫克/千克，即p）麻醉供体小鼠。使用创伤机械剪子去除腹部区域的头发。
- 将鼠标放在操作平台上的上位位置。用无菌纱布盖住鼠标。
- 使用无菌棉尖施用器用碘防腐剂擦拭手术区域，然后用70%乙醇擦拭手术区域。
- 用眼科剪刀做腹部中线切口，露出腹腔。
- 使用微弯曲钳暴露劣质的静脉注射，然后静脉注射200μL的100 U/mL 0-4 °C肝素盐每20克体重通过劣质的静脉注射。
- 用眼科剪刀进行胸腔切除术，通过双边中轴线切口切断肋骨，向外翻转前胸壁以暴露胸腔。
- 用微弯曲钳切除胸腺。
- 暴露主动脉，然后通过主动脉拱门将200μL的100 U/mL 0-4 °C肝素盐系注入冠状动脉。
注：避免将任何气泡扩散到供体心脏。 - 使用微型剪刀在大音的开头横贯上升的母道。
- 用微型剪刀在两个主分支的开头横贯肺动脉。
- 使用 6 - 0 丝线缝合， 使用微型剪刀将高级维纳卡瓦和劣质的维纳卡瓦纳与连结线横切。
- 用一根6-0的丝线缝合将肺静脉连接在一起，用微型剪刀将静脉分支切到连结体上。
- 从周围软组织中去除心脏移植物;在0-4 °C肝素盐水中保存。
3. 心脏植入
- 将供体心脏倒置到接受者的右颈区域。
- 将供体心脏的肺动脉输入一个带微直钳的 6-0 丝环。
- 将容器流明缠绕在静脉袖口上，然后将 6-0 丝线线缠绕在袖口周围，以将容器接头缠绕在一起。
- 按照步骤3.2中所述的步骤，对移植物的主动脉和动脉袖口进行损伤。
- 松开夹紧的壶静脉，然后松开夹紧的壶动脉。保持血管接头未缠绕，确保血流畅通无阻。
注：鼻窦节律在1分钟内回到200多次被认为是正常的。 - 使用温暖 （37 °C） 盐水滋润供体心脏，并检查移植物是否出血。将脉动心脏移植到皮下空间，然后缝合切口。
4. 术后护理和移植评估
- 记录时间到正常的鼻窦节律和保持正常的鼻窦节律至少5分钟后夹释放，以监测术后移植功能。
- 单独将接受者放在温暖的毯子上，直到接受者从麻醉中醒来。在手术结束时和手术后72小时每12小时管理一次丁丙诺啡镇痛，0.05毫克/千克，s.c。
- 每天记录接收者的体重和术后恢复状态。在 >15% 的体重减轻的情况下，相对于手术日期， 血吸麻痹， 或感染， 安乐死接受者通过终端异氟烷吸入21.
- 每天通过苍白监测移植物的生存。如果穆林类人存活了 72 小时，手术被认为是成功的。分级的移植功能，如先前报告22：规模3 - 大力脉动和频率;刻度 2 - 少脉动;规模1-颤动和迫在眉睫的排斥;或规模 - 0，心跳损失和完全排斥。
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Representative Results
手术时间
培训后，熟练的外科医生可以使用内管技术在35分钟内成功完成手术，其中接受者准备需要大约15.5分钟，供体准备需要10.9分钟，供体心脏麻醉需要4.4分钟。与使用袖口技术进行内管技术和缝合技术（表1）21的手术相比，冷热缺血时间（从供体准备到心脏植入）缩短到15.3分钟。Table 1
我们设计了一个合作模式，以进一步提高运营效率。如示意图（图3所示），一名外科医生首先开始进行接受者准备，然后由第二位外科医生在4-5分钟后开始进行供体准备。15-16分钟后，第一位外科医生应该已经完成了接受者的准备，此时第二个外科医生在采集完供体心脏后，应该开始在接受者内对供体心脏进行手术。这种合作模式要求每位外科医生只需接受袖口技术的单一部分培训，并将进一步将总手术时间缩短到约 25 分钟。厦门大学器官移植研究所近两年来通过两位外科医生的合作，对>600异位骨髓移植进行了分析表明，采用这种技术心脏移植的成功率高达95%。
主要组织相容性复杂心脏不匹配和匹配的心脏移植物的生存
主要的相容性复合物（MHC），指定为"H-2"，已被用来确定遗传差异和相似性。捐赠者不匹配的MHC抗原可以通过直接与接受者T细胞相互作用或间接作为供体MHC衍生肽在接受者MHC分子23上表达来触发移植排斥。完全MHC不匹配的BALB/c（H-2d）同位心脏可以被拒绝，移植到C57BL/6（H-2b）接受小鼠后，平均存活时间为7.5天（图4A）。在我们的研究中，合成心脏移植存活超过100天，但一个罕见情况下，由于与手术前的正常体重相比，体重减轻了15%。
心脏同位体可以在排斥时收获用于组织病理学检查。图 4B显示了明显的细胞中位排斥特征的外观，如炎症细胞渗透、组织水肿和微血管闭塞。合成移植接近正常，没有菌细胞坏死或炎症细胞渗透的证据。
内管对血管内膜的影响
为了评估将内管插入流明后对血管内膜的损伤，在合成心脏移植100天后，可以通过免疫荧光收集和染色动脉瘤位点血管内膜。在这项分析中，没有观察到血管壁的明显缩小、血栓形成或内膜增厚（图4C）。电子显微成像显示，一个光滑的内皮和一个规律的纵向波峰形成，内皮细胞排列整齐，密切，没有明显的沉积物在表面上（图4D）。
图1：一套无菌手术器械：
（A） 精细钳子和眼科剪刀;（B） 微弯曲钳子;（C） 微型直钳;（D） 微型针架;（E） 微型剪刀;（F） 斗牛犬夹;（G） 动脉内管（红色虚线箭头）和袖口（红色实心箭头），以及静脉内管（黑色虚线箭头）和袖口（黑色实心箭头）。请单击此处查看此图的较大版本。
图2：收件人准备。
（A） 将静脉内管插入外侧血管;（B） 将静脉容器戴在袖口上，并使用圆周 8-0 固定丝绸缝合;（C） 将动脉内管插入动脉容器的流明;（D） Evert 静脉容器在袖口上， 并使用圆周 8 - 0 修复它丝绸缝合线。请单击此处查看此图的较大版本。
图3：异位移植中每个步骤的操作时间。请单击此处查看此图的较大版本。
图4： （ A） 心脏移植生存时间.卡普兰-迈尔图显示心脏异位体（BALB/c）和合成移植（C57BL/6）从移植到C57BL/6受援小鼠（n=12小鼠/组）中存活;（B） 移植后第7天C57BL/6（左）异种体和野生型BALB/c Allograft（右）的显微检查（比例杆，50 um;放大率+400）;（C） 免疫荧光 （比例杆，50 μm;放大倍率 +400） （D） 移植血管内皮电（左）和天真（右）接受者的电子显微镜扫描。请单击此处查看此图的较大版本。
| 解剖学技术 | 收件人准备时间 | 捐助者准备时间 | 心脏植入时间 | 寒冷和温暖的缺血时间 | 总操作时间 | |
| 5宫颈异质 | 缝合 | N | N | N | < 45 分钟 | N |
| 6宫颈异质 | 袖口 | 45分钟 | 15 分钟 | 10 分钟 | N | N |
| 24宫颈异质 | 袖口 | 15 分钟 | 20 分钟 | 15 分钟 | 25-40 分钟 | < 60 分钟 |
| 25腹部异质 | 缝合 | N | N | N | N | 35分钟 |
| 7宫颈异质 | 袖口 | N | 20 分钟 | N | 30分钟 | 35分钟 |
| 26宫颈异质 | 袖口 | N | 20 分钟 | 20 分钟 | < 35 分钟 | N |
| 4腹部异质 | 缝合 | 60~70分 | 6~7分钟 | N | N | 75 分钟 |
| 21宫颈异质 | 袖口 | N | N | 7 分钟 | 20 分钟 | 45分钟 |
| 27腹部异质 | 缝合 | N | 10-15 分钟 | N | N | 45-60 分钟 |
| 28宫颈异质 | 袖口 | 25分钟 | 20 分钟 | 15 分钟 | 20 分钟 | 60 ~ 8 分钟 |
| 29宫颈异质 | 袖口 | 31.9 分 | 21.1 分 | 5.1 分钟 | 28.5 分 | 57.8~3.9分钟 |
| 29宫颈异质 | 缝合 | 25.2 分 | 20.5 分 | 30.8 分 | 51.3 分 | 83.9~2.9分钟 |
| 我们协议中的宫颈异质性 | 袖口 | 15.5 分 | 10.9 分 | 4.4 分钟 | 15.3 分 | 35分钟 |
| （单次操作） | ||||||
| 23分钟 | ||||||
| （合作） |
表1：不同小鼠心脏移植技术不同阶段时间的比较。
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Discussion
小鼠心脏移植模型是移植免疫学研究的重要工具，因为评估和大量基因修饰小鼠的免疫机制的工具和材料是可用的。然而，显微外科技术挑战，如血管缝合和电子化，限制了其广泛使用。本研究对骨髓内心脏移植的某些核心技术挑战进行了调查，取得了良好的效果。协议的一个关键步骤是将内管插入流明中，作为支架，将容器壁戴在袖口上。此优化步骤解决了动脉容器因需要广泛拉伸而引起的技术挑战。没有显微外科技能的个人可以在两个月的培训后开始执行这项技术，这也将有助于该模型的广泛应用。
根据我们的经验，适当的内管将提高移植结果。内管的外径应略小于接受者血管的内径。此外，钝聚丙烯管或表面滑滑的圆柱体应用作临时内芯，以避免损坏血管内皮。在我们手中，5%的型号没有血栓形成，即使血栓是使用缝合技术进行脑膜形成后失败的主要因素。利用这些成熟的模型，我们的实验室已经发表了几篇基础研究文章，这些文章已经得到同行评议者14、15、16、17、18、19,15,16,17,18,的认可。
与传统的袖口技术相比，35分钟内进行的手术没有明显不同，但冷和热缺血时间明显低于其他技术（表1）。使用合作模型进一步将平均手术时间缩短到23-25分钟，这反映在接受小鼠的麻醉时间和供体心脏植入时间上。袖口技术的另一个优点是它限制了温暖的缺血时间（表1）。由于没有冰袋用于保护心脏移植免受小鼠接受者温暖的体温，温暖的缺血时间相当于脑膜形成时间。优化的袖口技术涉及在接受者上准备两个袖口，以简化阿胸腺手术，并相应地缩短阿胸病时间。因此，袖口技术将温暖缺血时间限制在平均 4.4 分钟。
但是，讨论新技术需要注意某些关键步骤。在宫颈异位性心脏移植30中，一定要保留接受小鼠的亚胚腺，因为亚胚腺可以用来修复心脏移植，避免血管扭曲。在隔离外颈静脉和胡萝卜动脉时，避免破坏迷走神经，因为损伤可能导致接受者颈部半痛。斗牛犬夹的压力应保持在 20-25 克，以避免夹伤害或容器泄漏。用0-4°C肝素盐水清洗血管和袖口的流明，以去除残留的血液和气泡;这防止再灌注后移植物的栓塞。使用 1 mL 注射器用 0-4 °C 肝素盐水使供体珀化，并加快速度至 50 μL/秒，以保持适当的压力。在异位症期间，不要将圆周 8-0 带带缝合（用于将不断更新的血管内皮固定到袖口）到移植动脉的流明中。
虽然合作模式存在局限性，包括需要显微外科技术、同时提供两台显微镜以及技术熟练的外科医生人数增加一倍，但已证明它是进行血管化器官移植的成功方法。其更广泛的应用可能有助于开发新的免疫抑制方案，并研究移植领域急性和慢性排斥的机制。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项工作得到了福建省健康教育联合研究项目（WKJ2016-2-20）、中国自然科学基金（81771271和81800664）、中国国家重点研发项目（2018YFA0）的支持。 108304）和福建省中青年教师教育科研项目（JAT170714）、中国湖南省自然科学基金（2019JJ50842）和湖南省湖湘青年人才（2019RS2013）。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Artery cuff | Self-made | Polyamide tube. diameter: 0.55 mm,length: 1.0 mm | |
| Artery inner tube | Self-made | Polyamide tube. Diameter: 0.28mm | |
| Micro curved forceps | Shanghai Medical Instruments (Group) Ltd., Corp. Surgical Instruments Factory | WA3050 | 1/8 arc, 0.3-mm tip without a hook |
| Micro needle holders | Shanghai Medical Instruments (Group) Ltd., Corp. Surgical Instruments Factory | WA2050 | 0.2-mm tip |
| Micro scissors | Shanghai Medical Instruments (Group) Ltd., Corp. Surgical Instruments Factory | WA1050 | Straight, blade length: 10 mm |
| Micro straight forceps | Shanghai Medical Instruments (Group) Ltd., Corp. Surgical Instruments Factory | WA3060 | 0.15-mm tip without a hook |
| Scanlan Vascu-Statt Bulldog Clamps | Scanlan International Inc | 1001-531 | Clamping pressure 20–25 grams |
| Vein cuff | Self-made | Polyamide tube. diameter: 0.9 mm,length: 1.2 mm | |
| Vein inner tube | Self-made | Polyamide tube. Diameter: 0.6 mm |
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