Summary
マウス子宮頸部異所性心臓移植のためのカフ技術にインナーチューブアプローチを導入し、カフ上の血管をエバートするのに役立ちます。我々は、2人の経験豊富な外科医間の協力が著しく手術時間を短縮することを発見した。
Abstract
マウス心臓移植は40年以上行われてきた。マイクロサージャストの進歩に伴い、外科的効率を向上させるために特定の新しい技術が使用されています。私たちの研究室では、2つの主要なステップでカフテクニックを最適化しました。まず、内部管技術を用いて、外的頸静脈および頸動脈血管に一時的な内管を挿入し、カフ上の血管の切開を容易にした。第2に、2人の経験豊富な外科医の協力を通じて、完全な異所性心臓移植を行った。これらの変更により、運用時間が25分に短縮され、成功率は95%となりました。このレポートでは、これらの手順を詳細に説明し、補足ビデオを提供します。この改善されたカフ技術に関するレポートは、マウス異所性心臓移植のための実用的なガイダンスを提供し、基礎研究のためのこのマウスモデルの有用性を高めると信じています。
Introduction
1973年に腹部内のエンドツーエンド吻当を介したマウス異所性心臓移植の確立は、基礎移植免疫学研究1における大きなマイルストーンであった。このモデルは、虚血再灌流傷害2、免疫不全、および許容範囲33、44のメカニズムを分析するための重要かつ有効なツールを提供した。しかし、複雑で時間のかかる手術の性質と感染症の可能性は、重度の周術期腹部癒着および炎症反応をもたらし、異所性心臓移植モデルの効率が低い結果をもたらす。
子宮頸部異所性心臓移植技術は、1991年5年に陳によって最初に記述された。このモデルでは、レシピエントの外部頸静脈は移植片の肺動脈に吻着され、頸動脈は上昇大動脈に吻着される。この方法の主な利点は、モニタリングの利便性とレシピエントへの外傷の軽減である。同年、松浦は改良された技術を説明し、外的頸静脈と頸動脈の末端をテフロンカフ上にエバートし、周縁絹合字6で固定した。一部の研究者はまた、レシピエント7の外部頸静脈に袖口を挿入する前に、ドナー心臓の右肺動脈にカフを固定した。これまでカフ技術は、肺8、肝臓9、腎10移植を含む様々な血管ペディクル移植モデルに広く適用されてきた。
現在までに、カフ技術に関連するいくつかの困難があります。例えば、頸動脈は、追加の弾力性のためにカフ上にエバーリングすることが困難であり、その結果、組織は後方に反転する。したがって、このステップを完了するには、追加の練習と微小拡張器が必要な場合があります。さらに、子宮頸部の容器の準備は25分までかかる場合がある。
これらの問題を解決するために、カフ技術に基づく内側チューブ技術を導入し、血管壁の発流に役立つ内側のチューブを使用して外部頸静脈および頸動脈のカフを固定することを含む。また、簡単なトレーニングでは、受講者の準備は15.5分に短縮されます。この技術は、操作の複雑さを軽減し、追加の練習や血管拡張器の使用を必要としません。すべての移植免疫研究において適用することができ、特にレシピエントが2つの心臓同種移植片を受け取る第三者の免疫寛容を検証するために、1つは腹部内、もう1つは頸部11に適用できる。また、2人の熟練した外科医の間で協力してこのモデルを確立し、一方の外科医がレシピエント動物を準備し、もう1人の外科医がドナー心臓を収穫して移植することを推奨する。このようなコラボレーションにより、操作時間を25分に短縮できます。この最適化された手順を使用して、我々は、同種異系、同種異,系12、13、14、15、16、17、18、19、,13,および異種マウス心臓移植モデル20を確立しました。14,15,16,17,1819
内部チューブ技術の開発の根拠は、マウス心臓移植モデルの確立のための運転時間を高い成功率で短縮することであった。子宮頸部心臓移植モデルの最適化は、従来の縫合糸およびカフ技術21と比較して、短期間の手術時間における高い成功率の獲得を促進する。また、協調モデルは、単一のオペレータで行われる手術と比較して、ドナー心臓の温かい虚血時間をさらに短縮することができる。
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Protocol
動物(BALB/c、C57BL/6、オス、8-12週)は、厦門大学実験動物センターの特定の病原体のない施設に収容されています。C57BL/6は受領者として使用され、BALB/cはドナーとして使用される。すべての手順は、制度的動物管理使用委員会(IACUC)のガイドラインに従って行われます。
注:マイクロシザー、マイクロストレート鉗子、マイクロ湾曲鉗子およびマイクロ針のホールダーを含む微小外科の器械のセットは操作のために必要である(テーブルおよび材料、図1、B、D、E)。シングルユースブルドッグクランプ(図1F)が1組必要です。外的頸静脈および頸動脈のための2つの袖口は顕微鏡の下のNo.10メスでカスタマイズされたポリアミド管を切断することによって準備される。静脈と動脈カフの直径はそれぞれ0.9mmと0.55mmです。また、対応する静脈カフ用のインナーチューブの直径は0.6mmであり、対応する動脈カフ用のこれらの内管の直径は0.28mmである(図1G)。
1. 受取人の準備
- ペントバルビタール(60mg/kg、i.p)でレシピエントマウスを麻酔します。右横頸部領域で毛髪を除去するために、外傷性の機械的なバリカンを使用してください。
- 滅菌綿の先端アプリケーターを使用して、ヨウ素消毒剤で手術領域を拭き、その後70%エタノールを使用します。
- 操作プラットフォームの上のsupineの位置にマウスを置きます。無菌ガーゼでマウスを覆います。
- 眼科用はさみを使用して、下半角の首の中線から右肩鎖骨関節への横断切開を行います。
- 右外部頸静脈をマイクロ湾曲した鉗子で分離して十分な長さを露出させ、電気凝固によって枝を切り落とし、6-0シルク縫合を使用して遠位端で容器をリゲートする。
- ブルドッグクランプを使用して外部頸静脈を近位でクランプし、マイクロハサミを使用して静脈を合字に近似してトランセクトします。
- 100 U/mL 0-4 °Cヘパリン化生理満液で容器の内腔を洗浄し、残留血液を除去します。
- マイクロストレート鉗子を使用して静脈カフを通して外部頸静脈を引っ張る;静脈の内側のチューブをステントとして管腔に挿入し、マイクロストレート鉗子でカフの上に血管壁をエバーする(図2A)。
- 周回8-0を使用してカフの近位端にエバートされた容器内皮を固定する絹糸縫合(図2B)。
- 静脈容器から静脈の内管を引き出すためにマイクロストレート鉗子を使用しなさい。
- 微小湾曲した鉗子で鈍い解剖を行い、胸膜内端に隣接する右頸動脈を分離する。
- ブルドッグクランプを使用して右頸動脈を近位にクランプし、6-0シルク縫合糸を使用して頸動脈を遠位にリゲートし、マイクロハサミを使用して頸動脈を合字に近似して転写する。
- 100 U/mL 0-4 °Cヘパリン化生理生理で頸動脈を洗浄し、残留血液を除去します。
- 頸動脈を動脈カフを通し、マイクロストレート鉗子を用いて動脈内管を動脈血管に挿入する(図2C)。
- マイクロストレート鉗子を使用してカフの上に容器をエバーン;周回8-0を使用して、エバートされた船内皮を固定するシルク縫合糸(図2D)。
- マイクロストレート鉗子で動脈血管から動脈内管を引き出す。
注: 受信者の顎腺を保持します。
2. ドナー準備
- ペントバルビタール(60mg/kg、i.p)でドナーマウスを麻酔します。外傷性の機械的なバリカンを使用して、腹部の毛髪を除去します。
- 操作プラットフォームの上のsupineの位置にマウスを置きます。無菌ガーゼでマウスを覆います。
- 滅菌綿の先端アプリケーターを使用して、ヨウ素消毒剤で手術領域を拭き、その後70%エタノールを使用します。
- 眼科はさみで腹部中線切開を行い、腹腔を露出させる。
- マイクロカーブした鉗子を使用して下の静脈を露出させ、下の大静脈を通して体重当たり200 U/mL 0-4 °Cヘパリン化生理生理生理の200 μLを静脈内に注入する。
- 眼科はさみで胸部切開術を行い、両側の中軸線切開部を通して肋骨を切断し、胸部壁の外側を裏返して胸腔を露出させる。
- マイクロ湾曲した鉗子で胸腺を切り物にする。
- 大動脈を露出し、大動脈弓を通して100 U/mL 0-4 °Cヘパリン化生理生理生理の200 μLを大動脈に浸透させた。
注:ドナーの心臓に気泡を浸透させないようにしてください。 - マイクロハサミを使用して、大動脈弓の始めに上昇大動脈をトランセクトします。
- マイクロはさみで2つの主要な枝の始まりの肺動脈を移す。
- 6-0シルク縫合糸を使用して上の大静脈と下の大静脈を近接してリゲートし、マイクロハサミを使用して合字に遠位静脈をトランセクトします。
- 肺静脈を一緒にリゲートし、周回、単一の6-0シルク縫合糸を使用し、マイクロハサミを使用して合字に遠位に静脈枝を切断する。
- 周囲の軟部組織から心臓移植片を除去する;0-4 °Cのヘパリン化生理焼失分に保存してください。
3. 心臓移植
- ドナーの心臓を、受取人の右首領域に逆さまに置きます。
- ドナー心臓の肺動脈をマイクロストレート鉗子で6-0シルクループに入力します。
- 静脈の袖口のまわりで容器のルーメンを包み、次に袖口のまわりの6-0絹の縫合ループを締めて容器の接合をバンドにする。
- ステップ3.2に記載のステップに従って、移植片および動脈カフの大動脈の吻合を行う。
- クランプされた頸静脈を解放し、その後にクランプされた頸動脈を解放する。血管関節をねじれずに保ち、血流が妨げられないようにします。
注意:1分で200回以上戻る大線のリズムは正常と見なされます。 - 温かい(37°C)生理を使用してドナー心臓を湿らせ、移植片が出血しているかどうかを検査する。脈動する心臓移植片を皮下腔にセットし、切開を縫合する。
4. 術後ケアと移植片の評価
- 正常な正常なしなじりリズムまでの時間と、クランプ解放後少なくとも5分間正常な正常な正常な正常なしなじりのリズムの保存を記録して、術後移植機能を監視する。
- レシピエントが麻酔から目を覚ますまで、レシピエントを暖かい毛布の上に一人で置きます。ブプレノルフィン鎮痛、0.05mg/kg、s.c、手術終了時、手術後72時間ごとに12時間ごとに投与する。
- 毎日、受取人の体重と術後回復状態を記録します。手術日に比べて>15%の体重減少の場合、片麻痺性麻痺、または感染は、末期イオブルラン吸入21を介してレシピエントを安楽死させる。
- 毎日触診によって移植片の生存を監視する。マウス同種移植片が72時間生存した場合、手術は成功すると考えられる。前に報告したように、グラフト機能をグレード22: スケール 3 - 激しく脈動と周波数;スケール2 - 少ない脈動;スケール1 - 細動と差し迫った拒絶;またはスケール - 0、心臓の鼓動の損失と完全な拒絶反応。
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Representative Results
手術時間
訓練後、熟練した外科医は、受け手の準備に約15.5分、ドナーの準備に10.9分、ドナー心臓のアナストモーセに4.4分が必要である内管技術を使用して35分以内に手術を正常に行うことができる。冷温および温かい虚血時間(ドナー剤調製から心臓移植まで)は、内管技術および縫合技術を伴わないカフ技術を用いた操作に比べ15.3分に短縮される(表1)21。21
操作の効率をさらに向上させるため、協力モデルを設計しました。図表に示すように(図3)、1人の外科医が最初にレシピエント準備を行い始め、その後、4〜5分後に第2の外科医によるドナー準備の開始を開始する。15〜16分後、最初の外科医はレシピエントの準備を終えるべきであり、その時点で2人目の外科医はドナー心臓の収穫を終え、レシピエント内でドナー心臓の吻合を始めるべきである。この協力モデルでは、各外科医はカフ技術の一部のみで訓練を受ける必要があり、総手術時間をさらに約25分に短縮します。厦門大学の臓器移植研究所で過去2年間に2人の外科医の協力を通じて行われた>600異所性マウス移植の分析は、最大95%のこの技術を使用して心臓移植の成功率を示しています。
主要組織適合性複合体心臓ミスマッチおよび一致した心臓移植片の生存
「H-2」と指定された主要組織適合性複合体(MHC)は、遺伝的格差および類似点を決定するために使用されてきた。ドナー不一致MHC抗原は、レシピエントT細胞と直接相互作用することによって、またはレシピエントMHC分子23に発現するドナーMHC由来ペプチドとして間接的に相互作用することによって移植片拒絶反応を引き起こすことができる。完全にMHCの不一致BALB/c(H-2d)同種移植片心臓は拒絶することができ、C57BL/6(H-2b)レシピエントマウスへの移植後の生存時間の中央値は7.5日である(図4A)。d我々の研究では、同系心臓移植は、手術前の正常体重と比較して15%の体重減少によるまれな症例を除いて、100日以上生き残った。
心臓同種移植片は拒絶の時の組織病理学的検査のために収穫することができる。図4Bは、炎症性細胞浸潤、組織浮腫、および微小血管閉塞などの著示された細胞介在拒絶特性の外観を示す。異質移植片は、筋細胞壊死または炎症性細胞浸潤の証拠を有しない正常に近い。
血管内皮に及ぼす内管の効果
内管を内腔に挿入した後の血管内皮の損傷を評価するために、同種性心臓移植後100日後、吻当部位の血管内皮を免疫蛍光により採取し染色することができる。この分析では、血管壁の明らかな狭小化、血栓症、またはインティマの肥厚は観察されなかった(図4C)。電子顕微鏡イメージングは、滑らかな内皮および規則的な縦紋形成を明らかにし、内皮細胞をきちんと密接に配置し、表面に明らかな堆積物を有していない(図4D)。
図1:滅菌手術用器具のセット:
(A)ファイン鉗子と眼用はさみ;(B) マイクロ湾曲鉗子;(C) マイクロストレート鉗子;(D) マイクロ針ホルダー;(E) マイクロハサミ;(F)ブルドッグクランプ;(G)静脈内管(黒点矢印)とカフ(黒い固体矢印)と一緒に動脈内管(赤い点線の矢印)と袖口(黒い固体矢印)。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:受取人の準備
(A) 静脈内管を外部頸静脈血管に挿入する。(B) 袖口の上に静脈の容器をエバートし、円周8-0を使用してそれを固定するシルク縫合糸;(C)動脈内管を動脈血管の内腔に挿入する。(D) 袖口の上に静脈容器をエベトし、周回8-0を使用してそれを固定しますシルク縫合糸。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:異所性マウス移植における各ステップの動作時間この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図4:(A)心臓移植片生存時間。AC57BL/6レシピエントマウス(n=12マウス/群)に移植されたドナーマウスからの心臓同種移植片(BALB/c)および同系移植片(C57BL/6)の生存を示すカプランマイヤープロット。(B)移植後7日目にC57BL/6(左)等形移植片および野生型BALB/c同種移植片(右)の顕微鏡検査(スケールバー、50um;拡大×400);(C)免疫蛍光(スケールバー、50μm、倍率×400)(D)移植Dにおける血管内皮の電子顕微鏡スキャン(左)およびナイーブ(右)レシピエント。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
| 吻吻法 | 受取人の準備時間 | ドナー準備時間 | 心臓移植時間 | 寒さと暖かい虚血時間 | 合計工程時間 | |
| 5子宮頸部異所性 | 縫合 | N | N | N | < 45分 | N |
| 6子宮頸部異所性 | カフ | 45分 | 15分 | 10分 | N | N |
| 24子宮頸部異所性 | カフ | 15分 | 20分 | 15分 | 25~40分 | < 60分 |
| 25腹部異所性 | 縫合 | N | N | N | N | 35分 |
| 7子宮頸部異所性 | カフ | N | 20分 | N | 30分 | 35分 |
| 26子宮頸部異所性 | カフ | N | 20分 | 20分 | < 35分 | N |
| 4腹部異所性 | 縫合 | 60~70分 | 6~7分 | N | N | 75分 |
| 21子宮頸部異所性 | カフ | N | N | 7分 | 20分 | 45分 |
| 27腹部異所性 | 縫合 | N | 10~15分 | N | N | 45-60分 |
| 28子宮頸部異所性 | カフ | 25分 | 20分 | 15分 | 20分 | 60 ± 8分 |
| 29子宮頸部異所性 | カフ | 31.9分 | 21.1分 | 5.1分 | 28.5分 | 57.8±3.9分 |
| 29子宮頸部異所性 | 縫合 | 25.2分 | 20.5分 | 30.8分 | 51.3分 | 83.9±2.9分 |
| プロトコルにおける子宮頸部異所性 | カフ | 15.5分 | 10.9分 | 4.4分 | 15.3分 | 35分 |
| (単一操作) | ||||||
| 23分 | ||||||
| (協力) |
表1:異なるマウス心臓移植技術における異なる段階の時間の比較。
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Discussion
マウスの心臓移植モデルは、このモデルの免疫機構を評価するためのツールや材料や多数の遺伝子改変マウスが利用可能な移植免疫学研究のための重要なツールです。しかし、血管縫合や脳の流れなどの微小外科的技術的課題は、その広範な使用を制限している。本研究では、マウスの心臓移植に関する特定の技術的課題を調査し、良好な成果を得ています。プロトコルの重要なステップは、袖口の上に血管壁をエバートするステントとして内腔に挿入する。この最適化ステップは広範囲の伸張のための必要性のために動脈の容器を全面化することの技術的な挑戦を解決する。微小外科的スキルを持たない個人は、このモデルの広範な適用にも役立つ2ヶ月のトレーニングの後に技術を実行し始めることができます。
私たちの経験では、適切なインナーチューブが移植結果を高めます。内管の外径は、レシピエント血管の内径よりもわずかに小さくする必要があります。さらに、滑りやすい表面を有する鈍いポリプロピレン管またはシリンダーは、血管内皮を損傷することを避けるために一時的な内核として使用されるべきである。私たちの手では、縫合技術を使用した吻合後の故障の主な要因である血栓にもかかわらず、失敗したモデルの5%に血栓症は発生しなかった。,これらの成熟したモデルを使用して、私たちの研究室は、ピアレビュアー,14、15、16、17、18、19によって認識されているいくつかの基本的な研究記事14,15,1618を19発表しました。17
35分以内に行われた手術は従来のカフ技術と比べて有意に異ならなかったが、寒さと暖かい虚血時間は他の技術よりも有意に低かった(表1)。協力モデルを使用すると、平均運転時間をさらに23〜25分に短縮し、レシピエントマウスの麻酔時間およびドナー心臓移植時間に反映される。カフ技術のもう一つの利点は、暖かい虚血時間を制限すること(表1)。マウスのレシピエントの温かい体温から心臓移植片を保護するためにアイスバッグが使用されていないので、暖かい虚血時間は吻合時間と同等である。最適化されたカフ技術は、吻合手順を簡素化し、それに応じて吻合時間を短縮するために、受信者に両方のカフの調製を伴う。したがって、カフ技術は、暖かい虚血時間を平均4.4分に制限します。
ただし、説明した新しい手法には、注意すべき重要な手順があります。子宮頸部異所性心臓移植30においてレシピエントマウスの顎下腺を保存するようにしてください。損傷はレシピエントの頸部片麻痺につながる可能性がありますので、外部頸静脈および頸動脈を単離する際に迷走神経を損傷を避ける。クリップの損傷や容器の漏れを避けるために、ブルドッグクランプの圧力を20〜25グラムに維持する必要があります。残りの血液および気泡を除去するために0-4 °Cヘパリン化生理焼香で容器と袖口の内腔を洗浄します。これは、再灌流後の移植片における塞栓症を防ぐ。1 mL の注射器を使用して、ドナーに0-4 °Cのヘパリン化食前食い生理食音を加温し、速度を 50 μL/秒に上げ、適切な圧力を維持します。吻合中は、周回8-0をバンドしないでください縫合糸(カフスに全位血管内皮を固定するために使用される)、移植片動脈の内腔に。
協力モデルには、微小手術技術の必要性、2つの同時顕微鏡の利用可能性、および熟練した外科医の数の2倍を含む限界があるが、それにもかかわらず、血管化された臓器移植を行うための成功したアプローチであることが示されている。そのより広範な適用は、新しい免疫抑制プロトコルの開発および移植領域における急性および慢性拒絶反応のメカニズムの研究にさらに寄与するかもしれない。
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Disclosures
著者らは開示するものは何もない。
Acknowledgments
この研究は、福建省保健教育共同研究プロジェクト(WKJ2016-2-20)、中国国立自然科学財団(81771271および81800664)、中国国家主要研究開発プログラム(2018YFA0108)によって支援されました 304)と福建省の若年・中年教師のための教育科学研究プロジェクト(JAT170714)、中国湖南省自然科学財団(2019JJ50842)、湖南省の湖西若手才能(2019RS2013)。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Artery cuff | Self-made | Polyamide tube. diameter: 0.55 mm,length: 1.0 mm | |
| Artery inner tube | Self-made | Polyamide tube. Diameter: 0.28mm | |
| Micro curved forceps | Shanghai Medical Instruments (Group) Ltd., Corp. Surgical Instruments Factory | WA3050 | 1/8 arc, 0.3-mm tip without a hook |
| Micro needle holders | Shanghai Medical Instruments (Group) Ltd., Corp. Surgical Instruments Factory | WA2050 | 0.2-mm tip |
| Micro scissors | Shanghai Medical Instruments (Group) Ltd., Corp. Surgical Instruments Factory | WA1050 | Straight, blade length: 10 mm |
| Micro straight forceps | Shanghai Medical Instruments (Group) Ltd., Corp. Surgical Instruments Factory | WA3060 | 0.15-mm tip without a hook |
| Scanlan Vascu-Statt Bulldog Clamps | Scanlan International Inc | 1001-531 | Clamping pressure 20–25 grams |
| Vein cuff | Self-made | Polyamide tube. diameter: 0.9 mm,length: 1.2 mm | |
| Vein inner tube | Self-made | Polyamide tube. Diameter: 0.6 mm |
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