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Medicine

허혈성 심장 질환 및 심장 근막 수축의 비디오 기반 비교 모델

Published: May 5, 2020 doi: 10.3791/61104
Automatic Translation
*1, *1, *1, 1, 2, 1, 1
1Department of Cardiovascular Physiology, Graduate School of Medicine, Dentistry and Pharmaceutical Sciences, Okayama University, 2Institute of Laboratory Animals, Graduate School of Medicine, Kyoto University
* These authors contributed equally

Summary

인간 유도만능 줄기세포로부터 유래된 심근세포를 이용한 허혈성 심장질환 모델을 제시하고, 허혈에 의한 조직 손상의 정량적 평가를 위한 방법을 제시한다. 이 모델은 약물 검진및 허혈성 심장 질환에 대한 추가 연구를위한 유용한 플랫폼을 제공 할 수 있습니다.

Abstract

허혈성 심장 질환은 전 세계적으로 중요한 사망 원인입니다. 따라서 설치류와 같은 작은 동물 모델과 함께 엄청난 양의 연구의 대상이되었습니다. 그러나, 인간 적인 심혼의 생리학은 심장병을 공부하기 위하여 임상적으로 관련있는 모형에 대한 필요를 강조하는 설치류 심혼의 것과 현저하게 다릅니다. 여기서, 인간 유도만능 줄기세포(hiPS-CM)와 차별화된 심근세포를 이용하여 허혈성 심장질환을 모델링하고 허혈성 심근세포의 손상 및 기능적 장애를 정량화하는 프로토콜을 제시한다. 포도당과 혈청이없는 2 %의 산소에 노출되면 부상당한 세포의 비율을 증가시켜, 이는 프로피듐 요오드와 핵의 염색에 의해 표시되고, 세포 생존가능성을 감소시킨다. 이러한 조건은 또한 현미경 비디오 이미지의 변위 벡터 필드 분석에 의해 확인된 바와 같이 hiPS-CM의 수축도 감소한다. 이 프로토콜은 또한 개별 환자로부터 hiPS 세포의 사용을 촉진하여 개인화 된 약물 스크리닝을위한 편리한 방법을 제공 할 수 있습니다. 따라서, 인간 기원의 iPS-CM을 기반으로 하는 허혈성 심장질환의 이 모형은, 약물 검열을 위한 유용한 플랫폼 및 허혈성 심장병에 대한 추가 연구를 제공할 수 있습니다.

Introduction

허혈성 심장 질환 (IHD)은 전 세계적으로 사망의 주요 원인으로 인식되고 있으며 2016 년1에서 9 백만 명 이상의 사망자를 책임지는 것으로 추정되었습니다. 심혈관 질환의 보급은 계속 증가하고 있으며, 세계화는 개발도상국의 심장 질환 위험 요소의 보급에 기여한 것으로 보입니다. 따라서 IHD의 연구는 점점 더 긴급해지고 있다2.

심혈관 질환의 실험 모델은 질병의 메커니즘, 진단의 정확성 및 새로운 치료법의 개발을 연구하는 데 중요합니다. 몇몇 실험적인 모형은 많은 실험실에 의해 제안되었습니다. 중요한 장점을 가진 모델을 선택하는 것이 가장 중요합니다. 인체 질환에 대한 타당성, 반복성 및 유사성은 심혈관 질환 모델3의선택에 핵심적인 요소입니다. 특정 심근병증 관련 돌연변이를 운반하는 인간 유도 만능 줄기 세포(hiPSCs)는 동물 모델4에대한 유망한 대안이다. ,iPSC5,6,,7,88,9를사용하여 심근세포를 유도하는 데 많은 전략이 설명되어 왔지만, 여기서는 마커를 사용하여 심근세포의 힘든 선택이 적용되지 않는 hiPSC에서 분화된 심근세포를 사용하여 IHD 모델을 생성하는 간단한 방법을 제공합니다., 이 방법에서, 심근세포는 자발적인 수축을 분석하여 기능적으로 선택된다.

hiPSCs를 사용하여 심근세포의 유도는 동물 희생및 기술적으로 어려운 수술을 피합니다. IHD의 동물 모델을 확립하려면 도전적인 수술 기술10이필요합니다. 설치류의 생리학에서 심박수 및 행동 잠재력과 같은 인간의 심장 질환의 다양한 병리학적 측면을 완벽하게 시뮬레이션하는 것은 거의 불가능합니다. 동물 모델 사용의 도덕성과 윤리와 결합하여 동물 모델 이외의 새로운 실험 모델의 개발이 필수적입니다. 인간 iPS 세포와 분화된 심근세포는 인간의 심장의 생리적 상태를 더 잘 모방한다. 이 프로토콜에서는 hiPS 세포(hiPS-CM)에서 파생된 심근세포(hiPS-CM)를 사용하여 IHD 모델을 설정합니다. 우리의 모형에서, 산소와 포도당의 박탈은 hiPS-CM의 수축 힘 그리고 생존의 감소로 이끌어 냅니다. 우리의 방법은 IHD 모형에 새로운 접근을 제공하고 이 질병의 연구를 위한 새로운 플랫폼을 보여줍니다.

Protocol

1. hiPSC 유지 보수 문화

  1. 라미닌(재료의 표)와6 웰 문화 판을 코팅합니다.
    1. 인산완충식식염수(PBS)에서 라미닌을 0.5 μg/mL로 희석시켰다.
    2. 희석된 라미닌을 2.0mL/웰의 부피로 6웰 플레이트에 넣습니다.
    3. 37°C에서 30분 동안 플레이트를 배양합니다.
  2. 우물에서 라미닌 용액을 제거합니다.
  3. iPSC 유지 보수매체(재료표)의2mL의 시드 hiPSCs는 표면을 건조하지 않고 3× 104 셀/웰의 밀도로 코팅된 우물에 코팅된 우물에.
  4. hiPSC를 하위 배양합니다.
    1. 0.5× 세포 해리효소(재료 표) 용액을준비하십시오.
      1. 0.5 M 에틸렌디아민테트라아세틱(EDTA)의 10μL과 PBS 10mL을 혼합하여 0.5mM EDTA/PBS를 만듭니다.
      2. 10mL의 10mL를 1× 세포 해리 효소를 0.5× 로 희석하여 0.5mMMEDTA/PBS의 10mL를 첨가하였다.
    2. 우물에서 소비 된 매체를 흡인.
    3. PBS의 2mL /웰을 추가하여 세포를 씻은 다음 PBS를 폐기하십시오.
    4. 0.5× 세포 해리 효소의 800 μL을 추가하고, 5%CO2를포함하는 가습된 인큐베이터에서 37°C에서 7분 동안 세포를 배양한다.
      참고: 0.05% 트립신-EDTA를 사용하여 세포를 분리할 수 있습니다.
    5. 0.5× 세포 해리 효소 용액을 부드럽게 제거합니다.
    6. 2mL PBS로 셀을 씻은 다음 PBS를 폐기하십시오.
      참고: 세포 해리 효소 용액을 첨가한 후 세포가 쉽게 분리되기 때문에 부드럽게 하십시오.
    7. 10 μM Y-27632를 포함하는 iPS 유지 보수매체(재료 표)의1mL를 추가합니다.
      참고: Y-27632를 추가하면 hiPSC의 생존율이 증가합니다.
    8. 세포 스크레이퍼를 사용하여 세포를 빼내고 15mL 원심분리기 튜브에서 수집합니다.
    9. 셀 수를 계산합니다. 10 μM Y-27632를 포함하는 iPS 유지 보수 매체를 추가하여 1.5 × 104 셀/mL로 세포 밀도를 조정합니다.
      참고: 세포 손상을 방지하기 위해 원심 분리를 사용하지 마십시오.
    10. 라미닌 코팅 6웰 플레이트에 셀 혼합물의 종자 2 mL (최종 밀도 : 3 × 104 세포 / 웰).
    11. 5%CO2를포함하는 가습된 인큐베이터에서 세포를 37°C로 배양한다.
    12. 배양 배지를 1일, 4일, 5일 및 6일에 Y-27632 없이 iPS 유지 보수 매체로 교체한다.
  5. 7일째에 세포를 하위 배양합니다.
    참고: hiPSC의 임의분화를 억제하기 위해 7일까지 세포를 하위 배양합니다.

2. hiPSC의 심장 분화 유도

  1. 라미닌(재료의 표)와96 웰 문화 판을 코팅합니다.
    1. PBS로 라미닌을 1.675 μg/mL로 희석합니다.
    2. 희석 된 라미닌 용액을 0.1 mL / 웰의 부피로 96 웰 플레이트에 추가합니다.
    3. 37°C에서 30분 동안 플레이트를 배양합니다.
  2. 종자 hiPSCs의 밀도에서 96 웰 플레이트에 3 × 104 세포/웰.
  3. 5%CO2를포함하는 가습된 인큐베이터에서 37°C에서 hiPSC를 증식한다.
    1. 하루 후, 배지를 200 μL/웰 iPS 성장매체(재료 표)로바꿉니다.
    2. 세포가 70%-80%에 도달할 때까지 2-3일 동안 매일 배지를 변경합니다.
  4. 차별화 미디어를 적용합니다.
    1. 소비된 매체를 흡기하고 200 μL/웰의 미리 데워진 분화 매체A(재료표)로천천히 교체한다.
    2. 플레이트를 37°C로 5%CO2가함유한 가습인 인큐베이터에 놓습니다.
    3. 48h 후, 매체를 흡인하고 천천히 200 μL/웰의 미리 따뜻워진 분화 매체B(재료표)로대체한다.
    4. 플레이트를 37°C로 5%CO2가함유한 가습인 인큐베이터에 놓습니다.
      참고: 차별화 미디어를 신선하게 유지하는 것이 매우 중요합니다. 그들은 점차적으로 그들의 차별화 효과 잃게 됩니다., 일반적으로 2 주 이내에. 필요한 경우, 알리쿼트 신선한 매체와 저장 -20 °C.
  5. 심근세포 유지 보수 매체를 적용합니다.
    1. 48h 후, 배지를 흡인하고 천천히 200 μL/웰의 미리 데워진 심근세포 유지 보수매체(재료표)로 대체한다.
    2. 플레이트를 37°C로 5%CO2가함유한 가습인 인큐베이터에 놓습니다.
    3. 심근세포 분화 배지를 매일 30일까지 교체하십시오.
      참고: 분화 매체 A와 B의 적용 기간이 48h로 정확하게 설정되어 분화에 필요한 유전자의 정확한 발현 서열을 보장하는 것이 중요합니다.

3. 허혈에 노출

  1. 영양분과 산소의 배양 매체를 박탈.
    1. 포도당과 혈청없이 덜벡코의 수정 된 독수리 매체 (DMEM)를 준비하십시오.
    2. hiPS-CM을 포함하는 96웰 플레이트의 우물에서 흡인 배양 배지.
    3. 200 μL/웰의 부피로 영양박탈 배지를 우물에 넣습니다.
  2. 저산소 인큐베이터(재료의 표)에배양 판을 놓습니다.
  3. 질소 가스를 주입하고, 24시간 동안 내부 산소 농도를 2% 및CO2 농도5%로 유지한다.
  4. 원하는 분석으로 진행하십시오: 예를 들어,생존 가능성 분석, 수축 평가 또는 세포 손상 평가.

4. MTT 분석기를 사용하여 세포 생존 가능성 평가

  1. MTT 분석키트(재료 표)를사용하여 세포의 생존 가능성을 정량적으로 평가합니다.
    참고: DMEM에서 과산화수소 1m에 1h에 노출하여 세포를 손상시키는 데 사용할 수 있습니다(양성 제어). DMEM에서 과산화수소 0m에 노출하는 것은 음의 제어에 사용될 수 있다.
    1. 반복 피펫을 사용하여 MTT 시약 10 μL을 셀에 추가합니다.
    2. 궤도 셰이커에 1분간 부드럽게 섞는다.
    3. 5% CO2 인큐베이터에서 3-4h의 세포를 37°C에서 배양한다. 인큐베이션 후, 세포에서 생성된 포르마잔은 우물 바닥에 어두운 결정으로 나타납니다.
    4. 상체를 제거한 후, 불용성 포르마잔 결정을 디메틸 설옥산화물 용액(DMSO)의 100μL로 용해한다. 이 솔루션은 포마잔 결정을 용해하여 보라색 용액을 생성합니다.
      주의: DMSO는 눈, 호흡기 및 피부를 자극할 수 있습니다. 적절한 장갑과 눈/얼굴 보호 기능을 착용하십시오.
    5. 570 nm의 파장에서 마이크로 플레이트 판독기로 각 샘플의 흡광도를 측정합니다.

5. iPS-CM의 계약성 평가

  1. 설치하지 않은 경우, https://sites.google.com/site/qingzongtseng/piv 파티클 이미지 Velocimetry ImageJ 플러그인(11)을 얻고 설치하십시오.
  2. 상 대비 현미경을 사용하여 초당 ~20 프레임에서 ~20 프레임에서 4× 객관적인 렌즈를 사용하여 hiPS-CM의 비디오 이미지를 기록하고 "analyze.avi"로 저장합니다. 허혈 전후의 수축을 비교하기 위해 관심 위치가 기록되어 있는지 확인하십시오.
    참고: 자동화된 스테이지를 갖춘 현미경은 관심 있는 위치를 타겟팅하는 데 유용합니다. 동영상 파일은 이후 분석을 위해 .avi 형식으로 되어 있어야 합니다. 그렇지 않은 경우 영화를 .avi로 변환합니다.
  3. 그림 1에표시된 대로 폴더 구조를 만듭니다. "joblist.txt"의 예는 보충 파일에 표시됩니다.
  4. 셀룰러 변위의 이산 2차원 벡터 필드를 분석합니다.
    1. 시작 피지 (ImageJ) 소프트웨어12,플러그인으로 이동 > 매크로 > 편집및 열기 "vector_analysis.ijm"(보충 코딩 파일).
    2. 실행 실행을클릭합니다. 분석은 자동으로 수행됩니다.
      참고: 변위 벡터 D(x,y)는 기준 프레임(첫 번째 프레임)과 모든 후속 프레임(프레임 1 대 2, 1 대 3, 1 대 4 등) 사이의 16× 16픽셀에 대해 계산됩니다. 결과는 모든 프레임에 대해 계산되고 "vec_x.txt"(x는 프레임 번호)로 저장됩니다.x 최대 변위, M(x, y)의 벡터는 다음과 같이 모든(x, y) 쌍에 대해 정의됩니다.
      Equation 1
      여기서 k는 프레임 번호를 나타내는 | DK (x, y)= = 최대 [| D2 (x, y)| | D3 (x, y)|, ..., | Dn (x,y)|] 및 n은 마지막 프레임을 나타냅니다. 결과는 "Max_vector.txt"로 저장됩니다. | M(x, y)| 분석 점(x, y)에서 심근세포 수축으로 인한 최대 변위를 나타냅니다. 임의 단위의 계약값 C는 다음과 같이 계산됩니다.
      Equation 2
      이 값은 "Max_vector.txt"의 열 7, 행 1에 저장됩니다. C는 모든(x, y)에 대한 변위 합계를 나타냅니다. 심근 수축으로 인한 변위가 큰 부분이 클수록 C의 값이 클 수 있습니다. 최대 변위M(x, y)의 벡터 필드는 첫 번째 프레임("Phase_contrast.png")의 위상 대비 이미지로 오버레이되어 "Overlaid.png"로 저장됩니다. 변위 벡터의 크기는 비디오의 첫 번째 프레임에 기초하여 계산되기 때문에, hiPS-CM이 첫 번째 프레임에 대한 확장기 동안 휴식하는 것이 바람직하다.

6. 유동 세포측정을 이용한 세포손상 평가

  1. PBS에서 프로피듐 요오드의 1 mg/mL 용액을 1:1,000으로 희석하십시오.
  2. 프로디듐 요오드로 분리 된 세포를 얼룩.
    1. 매체를 흡인하고 적절한 크기의 원심분리기 튜브에 놓습니다.
    2. 1,000 g에서 튜브를 5 분 동안 × 원심 분리하고 퇴적세포를 잃지 않도록 상체를 조심스럽게 제거하십시오.
    3. 어둠 속에서 15 분 동안 실온에서 희석 된 프로피듐 요오드 용액으로 세포를 배양하십시오.
    4. 1,000 g에서 튜브를 5 분 동안 × 원심 분리하고 퇴적세포를 잃지 않도록 상체를 조심스럽게 제거하십시오.
    5. PBS의 ~1 mL에서 세포를 재구성한다.
      참고: 세포 손상을 정확하게 정량화하기 위해 배지에서 분리된 부동 세포를 수집하는 것이 중요합니다.
  3. 프로피듐 요오드와 함께 세포를 부착 한 스테인.
    1. PBS로 부착 된 세포를 두 번 씻은 다음 PBS를 폐기하십시오.
    2. 암흑에서 15 분 동안 희석 된 프로피듐 요오드 용액으로 세포를 배양하십시오.
    3. 프로피듐 요오드 용액을 흡인.
    4. 0.25%의 트립신을 사용하여 세포를 분리합니다. 세포 용액을 원심분리기 튜브로 이동합니다.
    5. 1,000 g에서 튜브를 5 분 동안 × 원심 분리하고 퇴적세포를 잃지 않도록 상체를 조심스럽게 제거하십시오.
    6. PBS의 ~1 mL에서 세포를 재구성한다.
  4. 형광 활성화 셀 정렬 (FACS) 분석을 위해 부동 및 부착 된 세포를 혼합합니다.
  5. 30 μm 필터를 통해 셀 용액을 전달합니다.
    참고: 정확한 FACS 측정을 위해 셀을 필터에 전달하는 것은 매우 중요합니다.
  6. FACS 시스템을 사용하여 샘플을 분석합니다.

7. 면역 염색

  1. 셀 샘플을 수정합니다.
    1. 배양 배지를 흡인한다.
    2. 실온에서 10분 동안 PBS에 4%의 파라포름알데히드를 추가합니다.
    3. PBS로 셀을 세 번 씻으시면 됩니다.
      참고: 최적의 고정을 위해 신선한 파라포름알데히드 솔루션을 권장합니다.
  2. 15 분 동안 0.2 % 트리톤 X-100으로 세포를 투약한 다음 시약을 폐기하십시오.
  3. 3% 소 세럼 알부민을 추가하여 30분 동안 세포를 차단합니다.
  4. 1 차적인 항체를 적용하십시오.
    1. 배양판에서 소세럼 알부민 용액을 폐기하십시오.
    2. 4°C에서 하룻밤 사이에 1차 항체로 세포를 배양한다.
    3. 항체 용액을 제거합니다.
    4. PBS로 셀을 세 번 씻으시면 됩니다.
  5. 이차 항체를 적용합니다.
    1. 배양 판에서 PBS 용액을 폐기합니다.
    2. 어둠 속에서 실온에서 30 분 동안 이차 항체로 세포를 배양하십시오.
      참고: 1차 항심장 트로포닌 T(TNNT2) 마우스 단일클론 항체는 3% BSA에서 1:750의 희석에 사용된다. 알렉사 플루어 488-공주 된 이차 염소 항 마우스 항체는 3 % BSA에서 1:1,000으로 희석된다.
  6. 핵과 액틴 섬유의 추가 염색.
    1. 항체 용액을 제거합니다.
    2. 핵 염색시약(재료의 표)과액틴 염색 시약(재료표)에서Table of Materials세포를 실내 온도에서 30분 동안 PBS에서 배양한다.
      참고: 4', 6-디아미디노-2-페닐린돌(DAPI) 또는 호흐트스트 33342는 핵 염색에 사용될 수 있다.
    3. PBS로 셀을 세 번 씻으시면 됩니다.
  7. 형광 현미경을 사용하여 형광 이미지를 캡처합니다.

Representative Results

성공적으로 분화 된 세포는 현미경(비디오 1)에서자발적인 수축을 보여줍니다. 일반적으로, 우물의 50%는 & 20일(보충도 1)에서 자발적인수축을나타낸다. 심장 마커 단백질(예를 들어, cTnT)은 성공적인 분화를 확인하는 데 사용될 수있다(도 2).

전형적으로, 허혈성 군으로부터의 세포는 MTT애사(도 3A)와 수축(도3E, F, 보충도 2)에서보다 낮은 생존력을 나타내며, 이는 노목시 대조군으로부터의 세포보다 낮은 생존력을 보여준다. 또한, 프로피듐 요오드 양성 세포의 비율은 더 높은 세포 손상을 나타내는 대조군(도3B-D)보다허혈성 군에서 더 높다.

Figure 1
그림 1: imageJ를 사용하여 변위 벡터 분석을 위한 폴더 구조입니다.
"joblist.txt"는 각 줄마다 영화 파일에 대한 경로를 설명합니다. 분석할 파일이 세 개 있으면 "analyze.avi"(관심 있는 영화)를 배치해야 하는 세 개의 폴더(movie1, movie2 및 movie3)가 있습니다. "vector_analysis.ijm" 코드에 의해 분석을 수행하면 각 동영상 폴더에서 파일이 생성됩니다(파란색으로 표시). 각 파일에 저장된 정보는 주 텍스트에 자세히 설명되어 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 2
그림 2: 심장 마커 염색의 대표적인 이미지.
심장 마커 단백질 심장 트로포닌 T (cTnT)의 발현. 파란색: 4',6-디아미드노-2-페닐린돌 (DAPI), 빨간색 : 액틴, 녹색 : cTnT. 인세트: 사코프레 구조에 해당하는 cTnT의 줄무늬 발현. 스케일 바, 50 μm. 이 수치는 웨이 외13에서수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 3
그림 3: 셀룰러 생존 가능성 분석, 세포 손상 평가 및 수축의 대표적인 이미지.
(A) 세포 생존가능성 비교(MTT 분석). 흡수율이 높을수록 생존가능성이 높아지음을 나타냅니다. n = 각 조건에 대해 5. (B, C, D) 프로피듐 요오드 (PI)-스테인드 세포의 유동 세포 측정 분석. 허혈세포는 대조군과 비교하여 전방 산란 강도와 증가된 PI 형광을 나타낸다. (D) 유동 세포 분석에서 PI 염색 된 세포의 백분율. n = 각 조건에 대해 3. (E) ImageJ 소프트웨어를 사용하여 iPS-MC 수축분석. 빨간색과 파란색 벡터는 각각 가장 크고 가장 작은 수축을 나타냅니다. 스케일 바, 100 μm. (F) 코드를 사용하여 iPS-CM 수축성을 정량적 분석합니다. n = 3 컨트롤용 및 허혈 상태에 대한 n = 8. 오류 막대는 평균의 표준 오류를 나타냅니다. 통계 분석을 위해 쌍이 없는 두 꼬리 학생의 t-테스트가 수행되었습니다. *: p < 0.05, **: p < 0.01. : p p&0.0001. 이 그림은 Wei외. 13에서인용된다이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

비디오 1: 분화 된 세포는 현미경의 밑에 자발적인 수축을 보여줍니다. 이 비디오를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 도 1: 자발적인 수축 없이 샘플의 백분율의 카플란 마이어 분석. iPS-CM 샘플의 50%는 20일째에 수축을 보였다. 30일째, 샘플의 64.4%가 수축을 보였다. n = 83. 이 그림을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 그림 2: 심장 수축의 평가. 수축 C를 분석점(x, y)의 수로 나누어 얻은 스케일링된 수축성은 24h 저산소증에 노출되기 전과 후에 제어 및 허혈성 군을 위해 플롯되었다. n = 3 컨트롤용 및 허혈 상태에 대한 n = 8. 이 그림을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 도 3: 심근세포의 함량 평가. 96 웰 플레이트에 심장 마커 단백질의 면역 염색. 녹색: cTnT, 블루: DAPI. 분화된 세포의 비율은 DAPI 염색 부위의 cTnT 염색 부위를 분할하여 20.7 ± 9.6%로 계산되었다. 스케일 바 = 제어 조건에 대한 1mm. n = 4. 이 그림을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 코딩 파일. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

Discussion

연구원은 종종 IHD 실험을 수행하기 위해 실험실 작은 동물 모델을 사용합니다. 여기서, 우리는 그러한 실험을 수행하기 위하여 인간 IHD의 세포 배양 모형을 개발했습니다.

이 프로토콜의 사용자가 직면 할 수있는 주요 문제는 차별화 된 심근세포의 낮은 비율입니다. 성공적인 분화 속도를 향상시키기 위해 세심한 주의를 기울여 몇 가지 단계를 수행해야합니다: (a) 세포가 세포 해리 효소 시약을 첨가한 후 쉽게 분리되기 때문에 파이펫팅 시 부드럽게 해야 하며, (b) Y-27632를 첨가하면 분리시 iPS 세포의 생존율이 증가하고, (c) 분화 의 시작 시 중간 변화의 타이밍은 분화에 관여하는 유전자의 통제된 발현을 보장하기 위해 정확하게 48h 떨어져 있어야 한다.

배양판의 표면을 코팅하는 데 사용되는 세포외 매트릭스 단백질에 관해서는, 본 프로토콜에 사용된 라미닌 이외의 물질을 사용할 수 있다. 예를 들어,마트리겔(14),15,및 젤라틴(16)16,17은 hiPSC의 피더 프리 유지 보수 문화에 사용된다. 하라구치 외에 따르면, 마트리겔에 시드된 hiPSCs는 심장 세포 시트18로성공적으로 분화되었다.

hiPSCs에서 파생된 심근세포를 사용하여 질병 모델링을 위한 배양 모델에 관하여 선행 한 연구는 많이 있습니다. 허혈 재관류 손상의 모델링에 관해서는, 고칼륨혈증, 산증 및 젖산 축적과 같은 세포 환경의 조작이19개도입되었다. 다른 방법으로는 산소확산(20)과 시안화물(21)을 이용한 대사21억제를 방해하는 세포 펠릿을 포함한다. 현재 프로토콜에서, 세포 상해는 상대적으로 간단한 방법, 즉 산소와 양분의 24 시간 박탈에 의해 달성되었다. 그러나, 3차원 세포 환경 및 혈액의 존재 또는 부재와 같은 현재 프로토콜의 생체 내 질환과 질병 모델 사이에 실제로 차이가 있기 때문에 허혈성 심장 질환의 정확한 병리학적 과정을 고려해야 한다.

심근세포 기능의 평가의 기술적 측면에 대해 Toepfer 외.는 hiPS-CM22에서사코프레 수축 및 이완을 결정하는 MatLab 기반 알고리즘을 보고했다. Smith 외.는 hiPS-CM에서 유래한 흥분성 세포의 고처리량 전기생리학적 분석의 고급 방법을 보고하여 정교한 나노지형 패턴 멀티 전기극어레이(23,,24)를이용하여 보고하였다. 우리의 프로토콜의 장점은 imageJ 소프트웨어 및 96 웰 플레이트와 같은 기존의 소프트웨어 및 소모품만 필요하다는 것입니다.

심장의 산소 수준에 대하여, 심혼에 도달하는 정맥에 있는 산소 압력은 40 mmHg25로생각됩니다. McDougal 외.에 따르면, 저산소증 하에서 세포 외 산소 압력은 추정된다 <12.8 mmHg26. Rounds etal.27의방법을 적용함으로써, 현재 프로토콜로 처리된 37°C에서 저산소 상태(2%산소)하에서 배양 배지(salinity: 35°)의 산소 압은 위의 추정치보다 높은 14.9mmHg로 계산된다. 흥미롭게도, Al-Ani 등은 배양 배지에 산소 압의 그라데이션이 있고, 산소 압력이 세포 형, 종자 밀도 및 중간부피(28)에의해 영향을 받는것으로 보고되었다. 전형적으로, 세포가 거주하는 배양판의 바닥에 있는 산소 농도는 가장 낮다. 따라서 배양 배지의 깊이의 효과는 hiPS-CM 근처의 효과적인 산소 압력을 더욱 감소시킬 것이다. 저산소 상태를 사용하여 hiPS-CM에 충분한 손상을 유도하기 위해서는 중간 깊이 및 세포 밀도에 주의를 기울여야 합니다.

인간의 심장 심근세포의 생리적 조건에 매우 가까운 우리의 hiPS-CM 모델은 인간 IHD를 유리하게 모방합니다. 동물 모델 기반 접근 방식에는 윤리적, 기술적 및 학문적 문제가 포함됩니다. 특히, 생체 내 모델은 재현 가능한 데이터를 달성하기 위해 미세 수술의 고급 기술이 필요합니다: 예를 들어, 설치류3에서좌측 관상 동맥의 전방 내림차순 분기의 폐색. 본 명세서에 설명된 hiPS-CM 모델은 이러한 중요한 장벽을 극복하고 심혈관 질환에 대한 유용하고 관련성이 있으며 반복 가능한 플랫폼을 제공합니다.

그러나 몇 가지 제한 사항에 유의해야 합니다. iPS 유도 심근세포와 일반 심근세포 사이의 명백한 차이점은 T-tubules29의부재이며, 우리는 백혈구에 의해 유도된 조직 손상 및 우리의 연구에서 보완 시스템의 활성화와 같은 유머 인자를 포함하지 않았습니다. 더욱이, 본 모델에서 차별화된 심근세포의 비율(20.7± 9.6%, 보충도 3)의비율이 향상되어야 한다. 할로인 외에 의한 최근 간행물은마커(30)에의한 임의의 선택 요건 없이 화학적 WNT 통로 변조기에 의한 hiPS-CM 순도및 95%를 유도하는 확장가능하고 화학적으로 정의된 방법을 설명한다. 그럼에도 불구하고, 인간 IHD의 우리의 모형은 상대적으로 간단하고 임상적으로 적용됩니다 (예를 들면, 환자 유래 iPS 세포를 이용한 약 검열). 우리의 모델은 또한 ID의 기본 메커니즘을 더 해명할 수있는 독특한 플랫폼입니다.

Disclosures

저자는 공개 할 것이 없습니다.

Acknowledgments

이 연구는 JSPS KAKENHI에 의해 지원되었다, 공동 국제 연구 (공동 국제 연구 육성) 기금, 17KK0168. 저자는 FACS의 도움을 위해 중앙 연구소, 오카야마 대학 의과 대학을 감사하게 인정합니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Actin staining reagent (ActinRed 555 ReadyProbes Reagent) Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA R37112
Anti cardiac troponin T antibody Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA MA5-12960
Cardiomyocyte maintenance medium (PSC Cardiomyocyte Differentiation Kit) Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA A2921201
Cell dissociation enzymes (TrypLE Select) Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA 12563011
Differentiation medium A (PSC Cardiomyocyte Differentiation Kit) Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA A2921201
Differentiation medium B (PSC Cardiomyocyte Differentiation Kit) Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA A2921201
FACS Aria III system BD Biosciences, San Jose, CA, USA
Fluorescenct microscope KEYENCE, Osaka, Japan BZ-X710
Goat anti-mouse Alexa Fluor 488 secondary antibody Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA A28175
Human iPS cells RIKEN, Tsukuba, Japan 201B7
Hypoxic incubator SANYO, Osaka, Japan MCO-175M
iPSC growth medium (Essential 8 Medium) Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA A1517001
iPSC maintenance medium (StemFit AK02N) Ajinomoto, Tokyo, Japan RCAK02N
Laminin (iMatrix-511) Nippi, Tokyo, Japan iMatrix-511
MTT assay kit (MTT Cell Proliferation Assay Kit) Cayman Chemical Company, Ann Arbor, MI, USA 10009365
Nucleus staining reagent (NucBlue Fixed Cell ReadyProbes Reagent) Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA R37606
Triton X-100 Nacalai Tesque, Kyoto, Japan 35501-02

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References

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