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Medicine

इस्कीमिक हृदय रोग का मॉडल और हिग्प्स-व्युत्पन्न कार्डियोमायोसाइट्स का उपयोग करके कार्डियोमायोसाइट संकुचन की वीडियो-आधारित तुलना

Published: May 5, 2020 doi: 10.3791/61104
Automatic Translation
*1, *1, *1, 1, 2, 1, 1
1Department of Cardiovascular Physiology, Graduate School of Medicine, Dentistry and Pharmaceutical Sciences, Okayama University, 2Institute of Laboratory Animals, Graduate School of Medicine, Kyoto University
* These authors contributed equally

Summary

हम इस्केमिया के कारण ऊतक क्षति के मात्रात्मक मूल्यांकन के लिए एक विधि के साथ, मानव प्रेरित pluripotent स्टेम कोशिकाओं से प्राप्त कार्डियोमायोसाइट्स का उपयोग कर इस्कीमिक हृदय रोग का एक मॉडल प्रस्तुत करते हैं। यह मॉडल दवा स्क्रीनिंग और इस्कीमिक हृदय रोग पर आगे अनुसंधान के लिए एक उपयोगी मंच प्रदान कर सकता है।

Abstract

इस्कीमिक हृदय रोग दुनिया भर में मौत का एक महत्वपूर्ण कारण है। इसलिए यह अनुसंधान की एक जबरदस्त राशि का विषय रहा है, अक्सर छोटे जानवरों के मॉडल जैसे कृंतक के साथ। हालांकि, मानव हृदय का शरीर विज्ञान कृंतक दिल से काफी अलग है, हृदय रोग का अध्ययन करने के लिए चिकित्सकीय रूप से प्रासंगिक मॉडलों की आवश्यकता को रेखांकित करता है। यहां, हम मानव प्रेरित pluripotent स्टेम सेल (hiPS-CMs) से विभेदित कार्डियोमायोसाइट्स का उपयोग करके मॉडल इस्कीमिक हृदय रोग के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं और इस्केमिक कार्डियोमायोसाइट्स के नुकसान और कार्यात्मक हानि की मात्रा निर्धारित करते हैं। ग्लूकोज और सीरम के बिना 2% ऑक्सीजन के संपर्क में घायल कोशिकाओं का प्रतिशत बढ़ जाता है, जो प्रोपिडियम आयोडाइड के साथ नाभिक के धुंधला द्वारा इंगित किया जाता है, और सेलुलर व्यवहार्यता कम हो जाती है । ये स्थितियां आईआईपीएस-सीएम की संकुचनता को भी कम करती हैं जैसा कि माइक्रोस्कोपिक वीडियो छवियों के विस्थापन वेक्टर फील्ड विश्लेषण द्वारा पुष्टि की गई है। इसके अलावा यह प्रोटोकॉल व्यक्तिगत रोगियों से एचआईपीएस कोशिकाओं के उपयोग को सुविधाजनक बनाकर व्यक्तिगत दवा स्क्रीनिंग के लिए एक सुविधाजनक तरीका प्रदान कर सकता है। इसलिए, मानव मूल के आईपीएस-सीएम पर आधारित इस्कीमिक हृदय रोग का यह मॉडल दवा स्क्रीनिंग और इस्कीमिक हृदय रोग पर आगे अनुसंधान के लिए एक उपयोगी मंच प्रदान कर सकता है।

Introduction

इस्कीमिक हृदय रोग (आईएचडी) को दुनिया भर में मौत के प्रमुख कारण के रूप में पहचाना जाता है, और 20161में 9 मिलियन से अधिक मौत के लिए जिम्मेदार होने का अनुमान लगाया गया था। हृदय रोग की व्यापकता में वृद्धि जारी है, और वैश्वीकरण के लिए विकासशील देशों में हृदय रोग जोखिम कारकों की व्यापकता में योगदान दिया है लगता है । इसलिए, आईएचडी का अध्ययन तेजी से अधिकजरूरीहोता जा रहा है ।

हृदय रोग के प्रयोगात्मक मॉडल रोग के तंत्र, निदान की सटीकता, और नए उपचारों के विकास का अध्ययन करने के लिए महत्वपूर्ण हैं। कई प्रयोगशालाओं द्वारा कई प्रायोगिक मॉडल प्रस्तावित किए गए हैं। महत्वपूर्ण फायदों के साथ मॉडल चुनना अत्यंत महत्वपूर्ण है; व्यवहार्यता, पुनरावृत्ति और मानव रोग के लिए समानता हृदय रोग मॉडल3के चयन में महत्वपूर्ण कारक हैं . विशिष्ट कार्डियोमायोपैथी से जुड़े उत्परिवर्तनों को ले जाने वाले मानव प्रेरित pluripotent स्टेम सेल (hiPSCs) पशु मॉडल4के लिए एक आशाजनक विकल्प हैं । यद्यपि आईपीएससी5,6,,7,,8,,9 का उपयोग करके कार्डियोमायोसाइट्स को प्रेरित करने के लिए कई रणनीतियों का वर्णन किया गया है, यहां हम लिचएससी से विभेदित कार्डियोमायोसाइट का उपयोग करके आईएचडी मॉडल का उत्पादन करने के लिए एक सरल विधि प्रदान करते हैं, जिसमें मार्कर का उपयोग करके कार्डियोमायोसाइट का श्रमसाध्य चयन लागू नहीं कियाजाताहै।, इस विधि में, कार्डियोमायोसाइट्स को सहज संकुचन का विश्लेषण करके कार्यात्मक रूप से चुना जाता है।

आईआईपीएससी का उपयोग करके कार्डियोमायोसाइट्स को शामिल करने से पशु बलि और तकनीकी रूप से कठिन सर्जरी से बचा जाता है। आईएचडी के पशु मॉडल स्थापित करने के लिए चुनौतीपूर्ण सर्जिकल तकनीकों की आवश्यकता होती है10. कृंतक के शरीर विज्ञान से हृदय गति और कार्रवाई क्षमता जैसे मानव हृदय रोग के विभिन्न रोगविज्ञानी पहलुओं का पूरी तरह से अनुकरण करना लगभग असंभव है। पशु मॉडलों का उपयोग करने की नैतिकता और नैतिकता के साथ मिलकर, पशु मॉडल के अलावा अन्य नए प्रयोगात्मक मॉडलों का विकास जरूरी है । मानव आईपीएस कोशिकाओं से विभेदित कार्डियोमायोसाइट्स मानव हृदय की शारीरिक स्थिति की बेहतर नकल करते हैं। इस प्रोटोकॉल में, हम एचआईपीएस कोशिकाओं (एचआईपीएस-सीएम) से प्राप्त कार्डियोमायोसाइट्स का उपयोग करके आईएचडी का एक मॉडल स्थापित करते हैं। हमारे मॉडल में, ऑक्सीजन और ग्लूकोज के अभाव में अनुबंध बल और एचआईपीएस-सीएम की व्यवहार्यता में कमी आती है। हमारी विधि मॉडल आईएचडी के लिए एक नया दृष्टिकोण प्रदान करती है और इस बीमारी के अध्ययन के लिए एक नया मंच दर्शाती है।

Protocol

1. एचएसएससी रखरखाव संस्कृति

  1. लेमिनिन(सामग्री की तालिका)के साथ एक छह अच्छी तरह से संस्कृति प्लेट कोट ।
    1. फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) में तनु लेमिनिन ०.५ μg/mL ।
    2. 2.0 एमएल/वेल की मात्रा में छह-अच्छी प्लेट में पतला लेमिनिन जोड़ें।
    3. 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर प्लेट को इनक्यूबेट करें।
  2. कुओं से लेमिनिन समाधान निकालें।
  3. सतह को सुखाने के बिना 3 × 10 4कोशिकाओं/अच्छीतरह से लेपित कुओं पर आईपीएससी अनुरक्षण माध्यम (सामग्री की तालिका) के2 एमसीएल में बीज हिप्ससी ।
  4. सबकल्चर हिप्ससी।
    1. 0.5× सेल वियोजन एंजाइम(सामग्री की तालिका)समाधान तैयार करें।
      1. 0.5 एम एएफटीए/पीबीएस बनाने के लिए 0.5 एम एथिलेंडिमीनेटएक्टेटिक (ईडीटीए) और 10 एमएल पीबीएस के 10 माइक्रोल मिलाएं।
      2. 0.5 m EDTA/PBS के 10 एमएल जोड़कर 1× सेल वियोजन एंजाइमों को 0.5× के लिए पतला।
    2. कुओं से खर्च किए गए माध्यम को आकांक्षी करें।
    3. कोशिकाओं को धोने के लिए पीबीएस के 2 एमएल/वेल जोड़ें, फिर पीबीएस को त्यागें ।
    4. 0.5× कोशिका वियोजन एंजाइमों के 800 μL जोड़ें, और 5% सीओ2युक्त आर्द्रीकृत इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर 7 मिनट के लिए कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें।
      नोट: कोशिकाओं को अलग करने के लिए 0.05% ट्राइप्सिन-ईडीटीए का उपयोग किया जा सकता है।
    5. धीरे-धीरे 0.5× सेल वियोजन एंजाइमों के समाधान को हटा दें।
    6. कोशिकाओं को 2 एमएल पीबीएस से धोएं, फिर पीबीएस को त्यागें।
      नोट: कोमल रहें क्योंकि कोशिकाएं कोशिका वियोजन एंजाइमों के समाधान को जोड़ने के बाद आसानी से अलग हो जाते हैं।
    7. 10 माइक्रोन वाई-27632 युक्त आईपीएस रखरखाव माध्यम(सामग्री की तालिका)का 1 एमएल जोड़ें।
      नोट: वाई-27632 जोड़ने से एचएसएससी की जीवित रहने की दर बढ़ जाती है।
    8. सेल स्क्रैपर का उपयोग करके कोशिकाओं को उखाड़ फेंकना, और उन्हें 15 एमएल सेंट्रलाइज ट्यूब में इकट्ठा करें।
    9. कोशिकाओं की संख्या गिनें। सेल डेंसिटी को 1.5 × 104 सेल/एमएल में आईपीपीएस मेंटेनेंस मीडियम जोड़कर समायोजित करें जिसमें 10 माइक्रोन वाई-27632 होता है।
      नोट: सेल क्षति को रोकने के लिए अपकेंद्रित्र का उपयोग न करें।
    10. लेमिनिन-लेपित छह-अच्छी प्लेट पर सेल मिश्रण के बीज 2 एमएल (अंतिम घनत्व: 3 × 104 कोशिकाएं/
    11. कोशिकाओं को 37 डिग्री सेल्सियस पर एक आर्द्रीकृत इनक्यूबेटर में इनक्यूबेट करें जिसमें 5% सीओ2होते हैं।
    12. 1, 4, 5, और 6 दिन पर वाई-27632 के बिना आईपीएस रखरखाव माध्यम के साथ संस्कृति माध्यम की जगह।
  5. 7 दिन की कोशिकाओं को उपसंस्कृति ।
    नोट: एचआईपीएससी के यादृच्छिक भेदभाव को बाधित करने के लिए 7 दिन तक कोशिकाओं को उपसंस्कृति।

2. एचआईपीएससी के कार्डियक भेदभाव को शामिल करना

  1. लेमिनिन(सामग्री की तालिका)के साथ एक 96-अच्छी संस्कृति प्लेट कोट करें।
    1. पीबीएस के साथ 1.675 μg/mL को पतला लेमिनिन।
    2. 0.1 मिलील की मात्रा में 96-वेल प्लेट में पतला लेमिनिन समाधान जोड़ें।
    3. 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर प्लेट को इनक्यूबेट करें।
  2. 3 × 104 कोशिकाओं/
  3. 5% सीओ2वाले आर्द्रीकृत इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर हाइप्ससी को बढ़ाया।
    1. एक दिन बाद, माध्यम को 200 μL/अच्छी तरह से आईपीएस विकास माध्यम(सामग्री की तालिका) के साथ प्रतिस्थापित करें।
    2. अतिरिक्त 2-3 दिनों के लिए हर दिन माध्यम बदलें जब तक कि कोशिकाएं 70%-80% तक न पहुंच जाएं।
  4. भेदभाव मीडिया लागू करें।
    1. खर्च किए गए माध्यम को एस्पिरेट करें और इसे धीरे-धीरे 200 माइक्रोन/वेल ऑफ प्री-वार्म्ड विभेदन माध्यम ए(सामग्री की तालिका) सेबदल दें।
    2. प्लेट को 37 डिग्री सेल्सियस पर एक आर्द्रीकृत इनक्यूबेटर में रखें जिसमें 5% सीओ2होता है।
    3. 48 घंटे के बाद, माध्यम को एस्पिरेट करें और धीरे-धीरे इसे 200 माइक्रोन/वेल ऑफ प्री-वार्म्ड विभेदन माध्यम बी(सामग्री की तालिका) सेबदल दें।
    4. प्लेट को 37 डिग्री सेल्सियस पर एक आर्द्रीकृत इनक्यूबेटर में रखें जिसमें 5% सीओ2होता है।
      नोट: यह अत्यंत महत्वपूर्ण है कि भेदभाव मीडिया ताजा रखा जाता है । वे धीरे-धीरे अपने भेदभाव प्रभाव को खो देंगे, आमतौर पर दो सप्ताह के भीतर। यदि आवश्यक हो, तो ताजा माध्यम को अलीकोट करें और −20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  5. कार्डियोमायोसाइट मेंटेनेंस मीडियम लगाएं।
    1. 48 घंटे के बाद, माध्यम को एस्पिरेट करें और धीरे-धीरे इसे प्री-गर्म कार्डियोमायोसाइट रखरखाव माध्यम(सामग्रीकी तालिका) के 200 μL/well से बदल दें।
    2. प्लेट को 37 डिग्री सेल्सियस पर एक आर्द्रीकृत इनक्यूबेटर में रखें जिसमें 5% सीओ2होता है।
    3. कार्डियोमायोसाइट विभेदन माध्यम को हर दूसरे दिन 30 दिन तक बदलें।
      नोट: यह महत्वपूर्ण है कि भेदभाव मीडिया ए और बी के आवेदन की अवधि सही 48 घंटे के लिए सेट करने के लिए भेदभाव के लिए आवश्यक जीन के सटीक अभिव्यक्ति अनुक्रम सुनिश्चित करने के लिए है।

3. इस्केमिया के लिए एक्सपोजर

  1. पोषक तत्वों और ऑक्सीजन के संस्कृति माध्यम से वंचित।
    1. ग्लूकोज और सीरम के बिना दुलबेको के संशोधित ईगल माध्यम (डीएमईएम) तैयार करें।
    2. ९६-अच्छी तरह से hiPS-सीएम युक्त थाली के कुओं से संस्कृति माध्यम aspirate ।
    3. 200 माइक्रोन/वेल की मात्रा में कुओं में पोषक तत्वों से वंचित माध्यम जोड़ें।
  2. संस्कृति प्लेट को एक हाइपोक्सिक इनक्यूबेटर(सामग्री की तालिका)में रखें।
  3. नाइट्रोजन गैस का संचार करें, और 24 घंटे के लिए 2% और सीओ2 एकाग्रता पर 5% पर आंतरिक ऑक्सीजन एकाग्रता बनाए रखें।
  4. वांछित विश्लेषण करने के लिए आगे बढ़ें: उदाहरण के लिए,व्यवहार्यता परख, संकुचन का आकलन, या सेलुलर क्षति का आकलन।

4. एमटीटी परख का उपयोग करके सेलुलर व्यवहार्यता का आकलन

  1. कोशिकाओं की व्यवहार्यता का मात्रात्मक आकलन करने के लिए एमटीटी परख किट(सामग्रीकी तालिका) का उपयोग करें।
    नोट: 1 घंटे के लिए डीएमईएम में 1 एमएम हाइड्रोजन पेरोक्साइड के संपर्क में आने से कोशिकाओं (सकारात्मक नियंत्रण) को नुकसान पहुंचाया जा सकता है। डीएमईएम में 0 एमएम हाइड्रोजन पेरोक्साइड के संपर्क में आने से नकारात्मक नियंत्रण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।
    1. एक दोहरा पिपेटर का उपयोग कर कोशिकाओं के लिए MTT रिएजेंट के 10 μL जोड़ें ।
    2. एक कक्षीय शेखर पर एक मिनट के लिए धीरे मिलाएं।
    3. 5% सीओ 2 इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर3-4 घंटे के लिए कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें। इनक्यूबेशन बाद, कोशिकाओं में उत्पादित फॉर्माजान कुओं के तल में गहरे क्रिस्टल के रूप में दिखाई देगा।
    4. सुपरनेट को हटाने के बाद, डिमेथिल सल्फॉक्साइड समाधान (डीएमएसओ) के 100 माइक्रोल में अघुलनशील फोरमैजान क्रिस्टल को भंग करें। यह समाधान बैंगनी समाधान का उत्पादन करते हुए, formazan क्रिस्टल को भंग कर देगा।
      सावधानी: DMSO आंखों, श्वसन प्रणाली, और त्वचा परेशान कर सकते हैं । उपयुक्त दस्ताने पहनें और आंख/चेहरे की सुरक्षा।
    5. 570 एनएम की तरंगदैर्ध्य पर एक माइक्रोप्लेट रीडर के साथ प्रत्येक नमूने के अवशोषण को मापें।

5. आईपीएस-सीएम की अनुबंधीयता का आकलन

  1. यदि स्थापित नहीं है, तो https://sites.google.com/site/qingzongtseng/piv पर कण इमेज वेलोसिमेट्री इमेजजे प्लगइन11 प्राप्त करें और स्थापित करें।
  2. एक चरण विपरीत माइक्रोस्कोप का उपयोग करके, ~ 10 एस के लिए ~ 20 फ्रेम प्रति सेकंड पर 4× उद्देश्य लेंस का उपयोग करके हाइप्स-सीएम की वीडियो छवियों को रिकॉर्ड करें, और "विश्लेषण.avi" के रूप में बचाएं। इस्केमिया से पहले और बाद के बीच संकुचन की तुलना के लिए, इस बात की पुष्टि करें कि ब्याज का स्थान दर्ज किया गया है।
    नोट: एक स्वचालित चरण के साथ एक माइक्रोस्कोप ब्याज के स्थान को लक्षित करने के लिए उपयोगी है । बाद में विश्लेषण के लिए फिल्म फ़ाइल .avi प्रारूप में होनी चाहिए। यदि नहीं, तो फिल्म को .avi में परिवर्तित करें ।
  3. चित्रा 1में दर्शाए गए फ़ोल्डर संरचना बनाएं। अनुपूरक फाइल में "joblist.txt" का एक उदाहरण दर्शाया गया है।
  4. सेलुलर विस्थापन के असतत दो आयामी वेक्टर क्षेत्रों का विश्लेषण करें।
    1. लॉन्च फिजी (ImageJ) सॉफ्टवेयर12, प्लगइन्स और जीटी; मैक्रोस एंड जीटी पर जाएं; एडिट करें और "vector_analysis.ijm" (सप्लीमेंट्री कोडिंग फाइल) खोलें।
    2. रन परक्लिक करें । विश्लेषण स्वचालित रूप से किया जाएगा।
      नोट: विस्थापन वैक्टर डी (x, y) संदर्भ फ्रेम (पहले फ्रेम) और बाद के सभी फ्रेम (फ्रेम 1 बनाम 2, 1 बनाम 3, 1 बनाम 4, आदि) के बीच हर 16 × 16 पिक्सल के लिए गणना कर रहे हैं । परिणाम हर फ्रेम के लिए गणना की जाती है और "vec_एक्स.txt"(x एक फ्रेम नंबर है) के रूप में सहेजा जाता है। अधिकतम विस्थापन का एक वेक्टर, एम (एक्स, वाई), प्रत्येक (x, वाई) जोड़ी के लिए इस प्रकार परिभाषित किया गया है:
      Equation 1
      जहां कश्मीर फ्रेम नंबर का प्रतिनिधित्व करता है जिस पर । डीके (x,y). = अधिकतम [। D2 (x,y)., । D3 (x,y).,,,. Dn (x,y).] और एन अंतिम फ्रेम को दर्शाता है। परिणाम "Max_vector.txt" के रूप में सहेजा जाता है। | एम (एक्स, वाई)। विश्लेषण बिंदु (एक्स, वाई) पर कार्डियोमायोसाइट संकुचन के कारण अधिकतम विस्थापन का प्रतिनिधित्व करता है। मनमाने ढंग से इकाइयों में अनुबंध मूल्य सी की गणना इस प्रकार है:
      Equation 2
      यह मान कॉलम 7, पंक्ति 1 पर "Max_vector.txt" में सहेजा गया है। सी सभी (x, y) के लिए विस्थापन के योग का प्रतिनिधित्व करता है। जितना बड़ा हिस्सा मायोकार्डियल संकुचन के कारण विस्थापन बड़ा होता है, वह सी का मूल्य जितना बड़ा होता है। अधिकतम विस्थापन का वेक्टर क्षेत्र, एम (एक्स, वाई), पहले फ्रेम ("Phase_contrast.पीएनजी") की चरण विपरीत छवि के साथ मढ़ा जाता है और "मढ़ा.पीएनजी" के रूप में बचाया जाता है। चूंकि विस्थापन वेक्टर के परिमाण की गणना वीडियो के पहले फ्रेम के आधार पर की जाती है, इसलिए पहले फ्रेम के लिए डायस्टोलिक अवधि को आराम देना एचआईपीएस-सीएम के लिए बेहतर है।

6. प्रवाह साइटोमेट्री का उपयोग कर सेलुलर क्षति का आकलन

  1. पीबीएस में प्रोपिडियम आयोडाइड का 1 मिलीग्राम/एमएल समाधान 1:1,000 तक पतला करें।
  2. प्रोपिडियम आयोडाइड के साथ अलग कोशिकाओं को दाग।
    1. माध्यम को एस्पिरेट करें और इसे उचित आकार की सेंट्रलाइज ट्यूब में रखें।
    2. 5 मिनट के लिए 1,000 × ग्राम पर ट्यूब अपकेंद्रित्र करें, और ध्यान से सुपरनैंट को हटा दें ताकि तलछट कोशिकाओं को न खोना पड़े।
    3. अंधेरे में 15 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर पतला प्रोपिडियम आयोडाइड समाधान के साथ कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें।
    4. 5 मिनट के लिए 1,000 × ग्राम पर ट्यूब अपकेंद्रित्र करें, और ध्यान से सुपरनैंट को हटा दें ताकि तलछट कोशिकाओं को न खोना पड़े।
    5. पीबीएस के ~ 1 एमएल में कोशिकाओं का पुनर्गठन करें।
      नोट: सेलुलर क्षति की सही मात्रा निर्धारित करने के लिए माध्यम से अलग फ्लोटिंग कोशिकाओं को इकट्ठा करना महत्वपूर्ण है।
  3. दाग से जुड़ी कोशिकाएं प्रोपिडियम आयोडाइड के साथ।
    1. पीबीएस के साथ दो बार संलग्न कोशिकाओं को धीरे से धोएं, फिर पीबीएस को त्यागें।
    2. अंधेरे में 15 मिनट के लिए पतला प्रोपिडियम आयोडाइड समाधान के साथ कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें।
    3. प्रोपिडियम आयोडाइड समाधान को एस्पिरेट करें।
    4. 0.25% ट्राइप्सिन का उपयोग करके कोशिकाओं को अलग करें। सेल समाधान को एक अपकेंद्रित्र ट्यूब में ले जाएं।
    5. 5 मिनट के लिए 1,000 × ग्राम पर ट्यूब अपकेंद्रित्र करें, और ध्यान से सुपरनैंट को हटा दें ताकि तलछट कोशिकाओं को न खोना पड़े।
    6. पीबीएस के ~ 1 एमएल में कोशिकाओं का पुनर्गठन करें।
  4. फ्लोरेसेंस एक्टिवेटेड सेल सॉर्टिंग (FACS) विश्लेषण के लिए फ्लोटिंग और अटैच कोशिकाओं को मिलाएं।
  5. सेल समाधान को 30 माइक्रोन फिल्टर के माध्यम से पास करें।
    नोट: एक फिल्टर करने के लिए कोशिकाओं को पासिंग एक सटीक FACS माप के लिए बहुत महत्वपूर्ण है।
  6. एक FACS प्रणाली का उपयोग कर नमूनों का विश्लेषण करें।

7. इम्यूनोदाता

  1. सेल सैंपल को ठीक करें।
    1. संस्कृति माध्यम को आकांक्षी करें।
    2. कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए पीबीएस में 4% पैराफॉर्मल्डिहाइड जोड़ें।
    3. कोशिकाओं को पीबीएस के साथ तीन बार धोएं।
      नोट: इष्टतम निर्धारण के लिए ताजा पैराफॉर्मलडिहाइड समाधान की सिफारिश की जाती है।
  2. 15 मिनट के लिए 0.2% ट्राइटन एक्स-100 के साथ कोशिकाओं को पार करें, फिर रिएजेंट को त्यागें।
  3. कोशिकाओं को 30 मिनट के लिए ब्लॉक करने के लिए 3% गोजातीय सीरम एल्बुमिन जोड़ें।
  4. प्राथमिक एंटीबॉडी लागू करें।
    1. संस्कृति की थाली से गोजातीय सीरम एल्बुमिन समाधान त्यागें।
    2. 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें।
    3. एंटीबॉडी समाधान निकालें।
    4. कोशिकाओं को पीबीएस के साथ तीन बार धोएं।
  5. सेकेंडरी एंटीबॉडी लगाएं।
    1. संस्कृति की थाली से पीबीएस समाधान त्यागें।
    2. अंधेरे में कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें।
      नोट: प्राथमिक एंटी-कार्डियक ट्रोपोनिन टी (टीएनएनटी2) माउस मोनोक्लोनल एंटीबॉडी का उपयोग 3% बीएसए में 1:750 के कमजोर पड़ने पर किया जाता है। एलेक्सा फ्लोर 488-संयुग्मित माध्यमिक बकरी एंटी-माउस एंटीबॉडी को 3% बीएसए में 1:1,000 तक पतला किया जाता है।
  6. नाभिक और ऐक्टिन फाइबर का अतिरिक्त धुंधला।
    1. एंटीबॉडी समाधान निकालें।
    2. नाभिक धुंधला अभिकर्ण(सामग्री की मेज)और ऐक्टिन धुंधला अभिवात(सामग्री की मेज)में कोशिकाओं को अंधेरे में कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए पीबीएस में इनक्यूबेटिंग अभिवात ।
      नोट: 4', 6-diamidino-2-फेनीलिंडोल (DAPI) या Hoechst ३३३४२ परमाणु धुंधला के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।
    3. कोशिकाओं को पीबीएस के साथ तीन बार धोएं।
  7. फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप का उपयोग करके फ्लोरेसेंस छवियों को कैप्चर करें।

Representative Results

सफलतापूर्वक विभेदित कोशिकाएं माइक्रोस्कोप(वीडियो 1)के तहत सहज संकुचन दिखाती हैं। आमतौर पर, 50% कुओं में सहज संकुचन दिखाई दिया और <20 दिनों(अनुपूरक चित्रा 1)। कार्डियक मार्कर प्रोटीन (जैसे, सीटीएनटी) का उपयोग सफल भेदभाव(चित्रा 2)की पुष्टि करने के लिए किया जा सकता है।

आमतौर पर, इस्कीमिक समूह की कोशिकाएं नॉर्मॉक्सिक नियंत्रण समूह की तुलना में एमटीटी परख(चित्रा 3 ए)और अनुबंध(चित्रा 3ई, एफ, अनुपूरक चित्रा 2)में कम व्यवहार्यता दिखाती हैं। इसके अलावा, कंट्रोल ग्रुप(चित्रा 3बी-डी)की तुलना में इस्कीमिक ग्रुप में प्रॉपिडियम आयोडाइड पॉजिटिव सेल्स का अनुपात ज्यादा होता है, जो हायर सेलुलर डैमेज को इंगित करता है ।

Figure 1
चित्रा 1: इमेजजे का उपयोग करके विस्थापन वेक्टर विश्लेषण के लिए फ़ोल्डर संरचना।
"joblist.txt" फिल्म फ़ाइलें प्रत्येक पंक्ति के लिए पथ का वर्णन करता है । यदि विश्लेषण करने के लिए तीन फाइलें हैं, तो तीन फ़ोल्डर (movie1, movie2, और movie3) होंगे, जिसमें "विश्लेषण.avi" (ब्याज की फिल्म) रखा जाना चाहिए। विश्लेषण "vector_analysis.ijm" कोड द्वारा किए जाने के बाद, प्रत्येक मूवी फ़ोल्डर में फ़ाइलें (नीले रंग में इंगित) उत्पन्न होंगी। प्रत्येक फाइल में संग्रहीत जानकारी मुख्य पाठ में विस्तार से समझाई गई है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: कार्डियक मार्कर धुंधला की प्रतिनिधि छवि।
कार्डियक मार्कर प्रोटीन कार्डियक ट्रोपोनिन टी (सीटीएनटी) की अभिव्यक्ति। नीला: 4', 6-डायमिडिनो-2-फेनिलिलडोल (DAPI), लाल: ऐक्टिन, ग्रीन: सीटीएनटी। इनसेट: सीटीएनटी की स्ट्राइडेड अभिव्यक्ति, जो सारकोमेरे संरचना से मेल खाती है। स्केल बार, 50 माइक्रोन। इस आंकड़े को वी एट अल13से संशोधित किया गया है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: सेलुलर व्यवहार्यता परख, सेलुलर क्षति का आकलन, और संकुचन के प्रतिनिधि छवियां।
(क) सेलुलर व्यवहार्यता (एमटीटी परख) की तुलना। उच्च अवशोषण उच्च व्यवहार्यता को इंगित करता है। n = 5 प्रत्येक स्थिति के लिए। (बी, सी, और डी) प्रोपिडियम आयोडाइड (पीआई) दाग कोशिकाओं का फ्लो साइटोमेट्री विश्लेषण। इस्कीमिक कोशिकाएं नियंत्रण की तुलना में कम आगे स्कैटर तीव्रता और बढ़ी हुई पीआई फ्लोरेसेंस का प्रदर्शन करती हैं। (घ) प्रवाह साइटोमेट्री विश्लेषण में पीआई-दाग कोशिकाओं का प्रतिशत। n = 3 प्रत्येक स्थिति के लिए। (ङ) इमेजजे सॉफ्टवेयर का उपयोग करके आईपीएस-सीएम का अनुबंध। लाल और नीले वैक्टर क्रमशः सबसे बड़े और छोटे संकुचन का संकेत देते हैं। स्केल बार, 100 माइक्रोन। (च) कोड का उपयोग करके आईपीएस-सीएम अनुबंध का मात्रात्मक विश्लेषण। n = नियंत्रण के लिए 3 और इस्कीमिक स्थिति के लिए एन = 8। n त्रुटि सलाखों के मतलब के मानक त्रुटि का प्रतिनिधित्व करते हैं । सांख्यिकीय विश्लेषण के लिए, बिना किसी दो पूंछ वाले छात्र का टी-टेस्ट किया गया । *: पी एंड एलटी; 0.05, **: पी एंड एलटी; 0.01। : पी एंड एलटी; 0.0001। यह आंकड़ा वी एट अल से उद्धृत किया गया है ।13कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

वीडियो 1: विभेदित कोशिकाएं माइक्रोस्कोप के नीचे सहज संकुचन दिखाती हैं। कृपया इस वीडियो को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।

अनुपूरक चित्रा 1: सहज संकुचन के बिना नमूनों के प्रतिशत कायोजन-Meier विश्लेषण। 50% आईपीएस - सीएम के नमूनों में 20 दिन में संकुचन दिखाया गया। 30 दिन, ६४.४% नमूनों में संकुचन दिखाया गया । द = 83। इस आंकड़े को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।

अनुपूरक चित्रा 2: कार्डियक संकुचन का आकलन। विश्लेषण बिंदुओं (एक्स, वाई) की संख्या से अनुबंध सी को विभाजित करके प्राप्त अनुबंध को 24 एच हाइपोक्सिया के संपर्क में आने से पहले और बाद में नियंत्रण और इस्कीमिक समूहों के लिए प्लॉट किया गया था। n = नियंत्रण के लिए 3 और इस्कीमिक स्थिति के लिए एन = 8। n इस आंकड़े को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।

अनुपूरक चित्र 3: कार्डियोमायोसाइट्स की सामग्री का आकलन। 96 अच्छी प्लेट पर कार्डियक मार्कर प्रोटीन का इम्यूनोस्टेटिंग। ग्रीन: सीटीएनटी, ब्लू: DAPI। डीवाईपी-दाग क्षेत्र द्वारा सीटीएनटी-दाग वाले क्षेत्र के क्षेत्र को विभाजित करके विभेदित कोशिकाओं की दर 20.7 ± 9.6% होने की गणना की गई थी। नियंत्रण स्थिति के लिए स्केल बार = 1 मिमी एन = 4। इस आंकड़े को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।

सप्लीमेंट्री कोडिंग फाइल। इस फाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

Discussion

शोधकर्ता अक्सर आईएचडी प्रयोगों का संचालन करने के लिए प्रयोगशाला छोटे-पशु मॉडलों का उपयोग करते हैं। यहां, हमने इस तरह के प्रयोगों को संचालित करने के लिए मानव आईएचडी का एक सेल संस्कृति मॉडल विकसित किया।

मुख्य समस्या इस प्रोटोकॉल के एक उपयोगकर्ता का सामना करना पड़ सकता है विभेदित कार्डियोमायोसाइट्स की कम दर है। सफल भेदभाव की दर में सुधार करने के लिए बहुत सावधानी के साथ कई कदम उठाए जाने चाहिए: (क) पिपटिंग करते समय कोमल रहें क्योंकि कोशिकाएं कोशिका वियोजन एंजाइमों को पुनः जोड़कर आसानी से अलग कर देती हैं, (ख) वाई-27632 जोड़ने से अलग होने पर आईपीएस कोशिकाओं की जीवित रहने की दर में वृद्धि होती है, और (ग) भेदभाव की शुरुआत में मध्यम परिवर्तनों का समय ठीक 48 एच के अलावा होना चाहिए ताकि विभेदन में शामिल जीनों की नियंत्रित अभिव्यक्ति सुनिश्चित की जा सके।

संस्कृति प्लेट की सतह कोटिंग के लिए उपयोग किए जाने वाले बाह्राश मैट्रिक्स प्रोटीन के बारे में, इस प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाने वाले लेमिनिन की तुलना में अन्य सामग्रियों का उपयोग किया जा सकता है। उदाहरण के लिए,14, 15,15और जिलेटिन16, 17,17 का उपयोग एचआईपीएससी की फीडर-मुक्त रखरखाव संस्कृति के लिए किया जाता है। हरगुची एट अल के अनुसार, मातृगेल पर वरीयता प्राप्त हाइप्स को सफलतापूर्वक कार्डियक सेल शीट18में अंतरित किया गया था।

एचआईपीएससी से प्राप्त कार्डियोमायोसाइट्स का उपयोग करके रोग मॉडलिंग के लिए संस्कृति मॉडल के बारे में कई पूर्ववर्ती अध्ययन हैं। इस्केमिया-रिपरफ्यूजन इंजरी के मॉडलिंग के बारे में सेलुलर एनवायरमेंट जैसे हाइपरकालेमिया, एसिडोसिस और लैक्टेट संचय के जोड़तोड़19पेश किए गए हैं । अन्य तरीकों में ऑक्सीजन प्रसार20 में बाधा डालने के लिए सेल पेलेटिंग और सायनाइड21का उपयोग करके मेटाबोलिक अवरोध शामिल हैं । वर्तमान प्रोटोकॉल में, कोशिका की चोट अपेक्षाकृत सरल विधि, अर्थात् ऑक्सीजन और पोषक तत्वों के 24 घंटे अभाव द्वारा प्राप्त किया गया था । हालांकि, इस्कीमिक हृदय रोग की सटीक रोगविज्ञानी प्रक्रियाओं पर विचार करने के लिए देखभाल की जानी चाहिए, क्योंकि वास्तव में वीवो में बीमारी और वर्तमान प्रोटोकॉल के रोग मॉडल के बीच अंतर हैं, जैसे कि तीन आयामी सेलुलर पर्यावरण और रक्त की उपस्थिति या अनुपस्थिति।

कार्डियोमायोसाइट फ़ंक्शन के मूल्यांकन के तकनीकी पहलू के बारे में, टोएफर एट अल ने एचआईपीएस-सीएम22में सारकोमेरे संकुचन और विश्राम निर्धारित करने के लिए एक मैटलैब-आधारित एल्गोरिदम की सूचना दी। स्मिथ एट अल ने एचआईपीएस-सीएम से प्राप्त उत्तेजनीय कोशिकाओं के उच्च-थ्रूपुट इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल विश्लेषण की एक उन्नत विधि की सूचना दी, जिसमें परिष्कृत नैनोटोपोग्राफिक रूप से पैटर्न वाले मल्टीइलेक्ट्रोड सरणी23,,24का उपयोग किया गया। हमारे प्रोटोकॉल का लाभ यह है कि यह केवल पारंपरिक सॉफ्टवेयर और उपभोग्य सामग्री, जैसे ImageJ सॉफ्टवेयर और ९६-अच्छी प्लेटों की आवश्यकता है ।

दिल में ऑक्सीजन के स्तर के संबंध में, दिल तक पहुंचने वाली नसों में ऑक्सीजन का दबाव 40 एमएमएचजी25माना जाता है। मैकडूगल एट अल के अनुसार, हाइपोक्सिया के तहत एक्सट्रासेलुलर ऑक्सीजन प्रेशर <12.8 mmHg26होने का अनुमान है । राउंड एट अल27की विधि को लागू करके, वर्तमान प्रोटोकॉल के साथ इलाज किए गए 37 डिग्री सेल्सियस पर हाइपोक्सिक स्थिति (2% ऑक्सीजन) के तहत संस्कृति माध्यम (लवणता: 35‰) में ऑक्सीजन दबाव 14.9 एमएमएचजी की गणना की जाती है, जो ऊपर के अनुमान से अधिक है। दिलचस्प बात यह है कि अल-एएनआई एट अल ने बताया कि संस्कृति माध्यम में ऑक्सीजन दबाव का एक ढाल है, और ऑक्सीजन दबाव सेल प्रकार, सीडिंग घनत्व और मध्यम मात्रा28से प्रभावित होता है। आमतौर पर, संस्कृति प्लेट के तल पर ऑक्सीजन एकाग्रता जहां कोशिकाओं रहते हैं सबसे कम है । इसलिए, संस्कृति माध्यम में गहराई के प्रभाव से एचआईपीएस-सीएम के पास प्रभावी ऑक्सीजन दबाव और कम हो जाएगा। हाइपोक्सिक स्थिति का उपयोग करके एचआईपीएस-सीएम को पर्याप्त क्षति पहुंचाने के लिए, मध्यम की गहराई और कोशिकाओं के घनत्व पर सावधानीपूर्वक ध्यान दिया जाना चाहिए।

हमारा एचआईपीएस-सीएम मॉडल, जो मानव हृदय मायोसाइट्स की शारीरिक स्थितियों के बहुत करीब है, लाभप्रद रूप से मानव आईएचडी की नकल करता है। पशु मॉडल आधारित दृष्टिकोण नैतिक, तकनीकी, और अकादमिक मुद्दों में शामिल हैं । विशेष रूप से, वीवो मॉडल में प्रजनन योग्य डेटा प्राप्त करने के लिए माइक्रोसर्जरी की एक उन्नत तकनीक की आवश्यकता होती है: उदाहरण के लिए, कृंतक3में बाएं कोरोनरी धमनी की पूर्ववर्ती उतरते शाखा का ऑक्सीलेशन। यहां वर्णित एचआईपीएस-सीएम मॉडल इन महत्वपूर्ण बाधाओं पर काबू पा रहा है और हृदय रोग के लिए एक उपयोगी, प्रासंगिक और दोहराने योग्य मंच प्रदान करता है।

हालांकि, कुछ सीमाओं पर ध्यान दिया जाना चाहिए। आईपीएस-प्रेरित कार्डियोमायोसाइट्स और सामान्य कार्डियोमायोसाइट्स के बीच एक स्पष्ट अंतर टी-ट्यूबल्स29की अनुपस्थिति है, और हमने अपने अध्ययन में ल्यूकोसाइट्स द्वारा प्रेरित ऊतक क्षति और एक पूरक प्रणाली की सक्रियता जैसे विनोदी कारकों को शामिल नहीं किया। इसके अलावा, इस मॉडल में विभेदित कार्डियोमायोसाइट्स की दर (20.7 ± 9.6%, अनुपूरक चित्रा 3)में सुधार किया जाना चाहिए। हैलोइन एट अल द्वारा हाल ही में प्रकाशित एक स्केलेबल, रासायनिक रूप से परिभाषित विधि का वर्णन करता है ताकि मार्कर30द्वारा किसी भी चयन की आवश्यकता के बिना रासायनिक डब्ल्यूएनटी पाथवे मॉड्यूलर्स द्वारा >95% की हाइप्स-सीएम शुद्धता को प्रेरित किया जा सके। फिर भी, मानव आईएचडी का हमारा मॉडल अपेक्षाकृत सरल और चिकित्सकीय रूप से लागू है (उदाहरण के लिए, रोगी-व्युत्पन्न आईपीएस कोशिकाओं का उपयोग करके दवा स्क्रीनिंग)। हमारा मॉडल आईएचडी अंतर्निहित तंत्रों को और स्पष्ट करने के लिए एक अनूठा मंच भी है।

Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

इस अध्ययन को जेएसपीएस काकेनही, फंड फॉर द प्रमोशन ऑफ ज्वाइंट इंटरनेशनल रिसर्च (ज्वाइंट इंटरनेशनल रिसर्च को बढ़ावा देना), 17KK0168 द्वारा समर्थित किया गया था। लेखकों कृतज्ञता से FACS की सहायता के लिए केंद्रीय अनुसंधान प्रयोगशाला, ओकायामा विश्वविद्यालय मेडिकल स्कूल स्वीकार करते हैं ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Actin staining reagent (ActinRed 555 ReadyProbes Reagent) Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA R37112
Anti cardiac troponin T antibody Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA MA5-12960
Cardiomyocyte maintenance medium (PSC Cardiomyocyte Differentiation Kit) Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA A2921201
Cell dissociation enzymes (TrypLE Select) Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA 12563011
Differentiation medium A (PSC Cardiomyocyte Differentiation Kit) Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA A2921201
Differentiation medium B (PSC Cardiomyocyte Differentiation Kit) Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA A2921201
FACS Aria III system BD Biosciences, San Jose, CA, USA
Fluorescenct microscope KEYENCE, Osaka, Japan BZ-X710
Goat anti-mouse Alexa Fluor 488 secondary antibody Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA A28175
Human iPS cells RIKEN, Tsukuba, Japan 201B7
Hypoxic incubator SANYO, Osaka, Japan MCO-175M
iPSC growth medium (Essential 8 Medium) Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA A1517001
iPSC maintenance medium (StemFit AK02N) Ajinomoto, Tokyo, Japan RCAK02N
Laminin (iMatrix-511) Nippi, Tokyo, Japan iMatrix-511
MTT assay kit (MTT Cell Proliferation Assay Kit) Cayman Chemical Company, Ann Arbor, MI, USA 10009365
Nucleus staining reagent (NucBlue Fixed Cell ReadyProbes Reagent) Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA R37606
Triton X-100 Nacalai Tesque, Kyoto, Japan 35501-02

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References

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Liu, Y., Liang, Y., Wang, M., Wang, C., Wei, H., Naruse, K., Takahashi, K. Model of Ischemic Heart Disease and Video-Based Comparison of Cardiomyocyte Contraction Using hiPSC-Derived Cardiomyocytes. J. Vis. Exp. (159), e61104, doi:10.3791/61104 (2020).

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