Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Modell av iskemisk hjertesykdom og videobasert sammenligning av kardiomyocytter sammentrekning ved hjelp av hiPSC-avledede kardiomyocytter

Published: May 5, 2020 doi: 10.3791/61104
Automatic Translation
*1, *1, *1, 1, 2, 1, 1
1Department of Cardiovascular Physiology, Graduate School of Medicine, Dentistry and Pharmaceutical Sciences, Okayama University, 2Institute of Laboratory Animals, Graduate School of Medicine, Kyoto University
* These authors contributed equally

Summary

Vi presenterer en modell av iskemisk hjertesykdom ved hjelp av kardiomyocytter avledet fra humane induserte pluripotente stamceller, sammen med en metode for kvantitativ evaluering av vevsskade forårsaket av iskemi. Denne modellen kan gi en nyttig plattform for narkotikascreening og videre forskning på iskemisk hjertesykdom.

Abstract

Iskemisk hjertesykdom er en betydelig dødsårsak over hele verden. Det har derfor vært gjenstand for en enorm mengde forskning, ofte med smådyrmodeller som gnagere. Imidlertid er fysiologien til det menneskelige hjerte betydelig forskjellig fra gnagerhjertet, og understreker behovet for klinisk relevante modeller for å studere hjertesykdom. Her presenterer vi en protokoll for å modellere iskemisk hjertesykdom ved hjelp av kardiomyocytter differensiert fra humane induserte pluripotente stamceller (hiPS-CMs) og for å kvantifisere skaden og funksjonsnedsettelsen av iskemiske kardiomyocytter. Eksponering for 2% oksygen uten glukose og serum øker prosentandelen av skadede celler, som indikeres ved farging av kjernen med propidiumjodid, og reduserer cellulær levedyktighet. Disse betingelsene reduserer også kontraktiliteten til hiPS-CMs som bekreftet ved forskyvning vektorfeltanalyse av mikroskopiske videobilder. Denne protokollen kan videre gi en praktisk metode for personlig legemiddelscreening ved å legge til rette for bruk av hiPS-celler fra individuelle pasienter. Derfor kan denne modellen av iskemisk hjertesykdom, basert på iPS-CMs av menneskelig opprinnelse, gi en nyttig plattform for narkotikascreening og videre forskning på iskemisk hjertesykdom.

Introduction

Iskemisk hjertesykdom (IHD) er anerkjent over hele verden som den ledende dødsårsaken, og det ble anslått å være ansvarlig for mer enn ni millioner dødsfall i 20161. Forekomsten av hjerte- og karsykdommer fortsetter å stige, og globaliseringen synes å ha bidratt til forekomsten av risikofaktorer for hjertesykdom i utviklingsland. Derfor blir studien av IHD stadig mer presserende2.

Eksperimentelle modeller av kardiovaskulær sykdom er avgjørende for å studere sykdomsmekanismer, nøyaktighet av diagnose og utvikling av nye terapier. Flere eksperimentelle modeller har blitt foreslått av mange laboratorier. Det er av største betydning å velge en modell med betydelige fordeler; gjennomførbarhet, repeterbarhet og likhet med menneskelig sykdom er viktige faktorer i valg av kardiovaskulær sykdom modeller3. Humane induserte pluripotente stamceller (hiPSCer) som bærer spesifikke kardiomyopati-assosierte mutasjoner er et lovende alternativ til dyremodeller4. Selv om mange strategier har blitt beskrevet for å indusere kardiomyocytter ved hjelp av iPSCs5,6,7,8,9, her gir vi en enkel metode for å produsere en IHD-modell ved hjelp av kardiomyocytter differensiert fra hiPSCer, der arbeidskrevende utvalg av kardiomyocytter ved hjelp av markører ikke brukes. I denne metoden velges kardiomyocytter funksjonelt ved å analysere spontan sammentrekning.

Induksjon av kardiomyocytter ved hjelp av hiPSCer unngår dyreoffer og teknisk vanskelig kirurgi. Etablering av dyremodeller av IHD krever utfordrende kirurgiske teknikker10. Perfekt simulere de ulike patofysilogiske aspektene ved menneskelig hjertesykdom som hjertefrekvens og virkningspotensialer fra fysiologi av gnagere er nesten umulig. Kombinert med moralen og etikken ved å bruke dyremodeller, er utviklingen av nye eksperimentelle modeller enn dyremodeller avgjørende. Kardiomyocytter differensiert fra menneskelige iPS-celler etterligner bedre den fysiologiske tilstanden til det menneskelige hjertet. I denne protokollen etablerer vi en modell av IHD ved hjelp av kardiomyocytter avledet fra hiPS-celler (hiPS-CMs). I vår modell fører deprivasjon av oksygen og glukose til en reduksjon i kontraktil kraft og levedyktighet av hiPS-CMs. Vår metode gir en ny tilnærming til modell IHD og demonstrerer en ny plattform for studiet av denne sykdommen.

Protocol

1. hiPSC vedlikehold kultur

  1. Coat en seks-brønns kulturplate med laminin (Table of Materials).
    1. Fortynn laminin til 0,5 μg/ml i fosfatbufret saltvann (PBS).
    2. Tilsett fortynnet laminin til en seksbrønns plate med et volum på 2,0 ml/brønn.
    3. Inkuber platen ved 37 °C i 30 min.
  2. Fjern lamininløsningen fra brønnene.
  3. Frø hiPSCs i 2 ml iPSC vedlikeholdsmedium(Table of Materials) på de belagte brønnene med en tetthet på 3 × 104 celler / godt uten å tørke overflaten.
  4. Subkultur hiPSCs.
    1. Forbered 0,5× celledissosiasjonsenzymer (Materialtabell) oppløsning.
      1. Bland 10 μL på 0,5 M Etylenenediaminetetraacetic (EDTA) og 10 ml PBS for å lage 0,5 mM EDTA/PBS.
      2. Fortynn 10 ml 1× celledissosiasjonsenzymer til 0,5× ved å tilsette 10 ml 0,5 mM EDTA/PBS.
    2. Aspirer det brukte mediet fra brønnene.
    3. Tilsett 2 ml/brønn med PBS for å vaske cellene, og kast deretter PBS.
    4. Tilsett 800 μL av 0,5× celledissosiasjonsenzymene, og inkuber cellene i 7 min ved 37 °C i en fuktet inkubator som inneholder 5 % CO2.
      MERK: 0,05% trypsin-EDTA kan brukes til å ta avstand fra celler.
    5. Fjern forsiktig 0,5× celledissosiasjonsenzymer løsning.
    6. Vask cellene med 2 ml PBS, og kast deretter PBS.
      MERK: Vær forsiktig fordi cellene lett løsner etter å ha lagt til celledissosiasjonsenzymer løsning.
    7. Tilsett 1 ml iPS vedlikeholdsmedium (Materialsekk) som inneholder 10 μM Y-27632.
      MERK: Hvis du legger til Y-27632, øker overlevelsesraten for hiPSCer.
    8. Løsne celler ved hjelp av en celleskraper, og samle dem i en 15 ml sentrifugerør.
    9. Telle antall celler. Juster celletettheten til 1,5 × 104 celler/ml ved å legge til iPS-vedlikeholdsmedium som inneholder 10 μM Y-27632.
      MERK: Ikke bruk sentrifugering for å forhindre celleskade.
    10. Frø 2 ml celleblanding på lamininbelagt seksbrønnsplate (endelig tetthet: 3 × 104 celler/brønn).
    11. Inkuber cellene ved 37 °C i en fuktet inkubator som inneholder 5 % CO2.
    12. Bytt ut kulturmediet med iPS-vedlikeholdsmedium uten Y-27632 på dag 1, 4, 5 og 6.
  5. Subkultur cellene på dag 7.
    MERK: Subkultur cellene etter dag 7 for å hemme tilfeldig differensiering av hiPSCer.

2. Induksjon av hjertedilatering av hiPSCer

  1. Coat en 96-brønns kulturplate med laminin (Table of Materials).
    1. Fortynn laminin til 1,675 μg/ml med PBS.
    2. Tilsett den fortynnede lamininoppløsningen til en 96-brønns plate med et volum på 0,1 ml/brønn.
    3. Inkuber platen ved 37 °C i 30 min.
  2. Seed hiPSCs på en 96-brønns plate med en tetthet på 3 × 104 celler / brønn.
  3. Spre hiPSC ved 37 °C i en fuktet inkubator som inneholder 5 % CO2.
    1. En dag senere, erstatte mediet med 200 μL / brønn iPS vekst medium (Table of Materials).
    2. Endre mediet hver dag i ytterligere 2–3 dager til cellene når 70 %–80 % samløpet.
  4. Bruk differensieringsmedier.
    1. Aspirer det brukte mediet og bytt det sakte ut med 200 μL/brønn med forhåndsoppvarmet differensieringsmedium A (Materialtabell).
    2. Plasser platen ved 37 °C i en fuktet inkubator som inneholder 5 % CO2.
    3. Etter 48 timer, aspirer mediet og sakte erstatte det med 200 μL / brønn av forhåndsoppvarmet differensiering medium B (Table of Materials).
    4. Plasser platen ved 37 °C i en fuktet inkubator som inneholder 5 % CO2.
      MERK: Det er svært viktig at differensieringsmediene holdes friske. De vil gradvis miste sin differensieringseffekt, vanligvis innen to uker. Om nødvendig må du se friskt medium og oppbevares ved -20 °C.
  5. Påfør kardiomyocytt vedlikeholdsmedium.
    1. Etter 48 timer, aspirer mediet og sakte erstatte det med 200 μL / brønn av pre-oppvarmet kardiomyocyte vedlikeholdsmedium (Table of Materials).
    2. Plasser platen ved 37 °C i en fuktet inkubator som inneholder 5 % CO2.
    3. Erstatt kardiomyocyttdilatensiorasjonen annenhver dag opp til dag 30.
      MERK: Det er viktig at varigheten av anvendelsen av differensieringsmedier A og B er nøyaktig satt til 48 timer for å sikre den nøyaktige uttrykkssekvensen av gener som kreves for differensiering.

3. Eksponering for iskemi

  1. Frata kulturmediet av næringsstoffer og oksygen.
    1. Forbered Dulbeccos modifiserte Eagle medium (DMEM) uten glukose og serum.
    2. Aspirer kulturmedium fra brønnene til 96-brønnplaten som inneholder hiPS-CMs.
    3. Tilsett næringsfattig medium til brønnene med et volum på 200 μL / brønn.
  2. Plasser kulturplaten i en hypoksisk inkubator (Materialsekk).
  3. Infuse nitrogengass, og opprettholde den interne oksygenkonsentrasjonen på 2% og CO2 konsentrasjon på 5% for 24 h.
  4. Gå videre til ønskede analyser: f.eks.

4. Vurdering av cellulær levedyktighet ved hjelp av MTT-analyse

  1. Bruk MTT-analysesettet (Materials table) til kvantitativt å vurdere levedyktigheten til celler.
    MERK: Eksponering for 1 mM hydrogenperoksid i DMEM i 1 time kan brukes til å skade celler (positiv kontroll). Eksponering for 0 mM hydrogenperoksid i DMEM kan brukes til negativ kontroll.
    1. Tilsett 10 μL MTT-reagens til cellene ved hjelp av en gjentatt pipettor.
    2. Bland forsiktig i ett minutt på en orbital shaker.
    3. Inkuber cellene i 3–4 timer ved 37 °C i en 5 % CO2 inkubator. Etter inkubasjon vil formazanen som produseres i cellene vises som mørke krystaller i bunnen av brønnene.
    4. Etter fjerning av det overnaturlige, oppløs de uoppløselige formazankrysene i 100 μL dimetylsulfoksidoppløsning (DMSO). Denne løsningen vil oppløse de formazan krystaller, produsere en lilla løsning.
      FORSIKTIG: DMSO kan irritere øyne, luftveier og hud. Bruk egnede hansker og øye-/ansiktsbeskyttelse.
    5. Mål absorbansen til hver prøve med en mikroplateleser ved en bølgelengde på 570 nm.

5. Vurdering av kontraktilitet av iPS-CMs

  1. Hvis ikke installert, få Particle Image Velocimetry ImageJ plugin11 på https://sites.google.com/site/qingzongtseng/piv og installere.
  2. Ved hjelp av et fasekontrastmikroskop, ta opp videobildene av hiPS-CMs ved hjelp av 4× objektivobjektiv på ~ 20 bilder per sekund for ~ 10 s, og lagre som "analyze.avi". For en sammenligning av kontraktilitet mellom før og etter iskemi, bekrefter at plasseringen av interesse er registrert.
    MERK: Et mikroskop med et automatisert stadium er nyttig for å målrette interessestedet. Movie fil bør være i .avi format for senere analyse. Hvis ikke, konvertere filmen til .avi.
  3. Opprett mappestruktur som angitt i figur 1. Et eksempel på "joblist.txt" er angitt i tilleggsfilen.
  4. Analyser diskrete todimensjonale vektorfelt for cellulær forskyvning.
    1. Start Fiji (ImageJ) programvare12, gå til Plugins > Makroer > Rediger og åpne "vector_analysis.ijm" (Supplerende Coding File).
    2. Klikk Kjør. Analyse vil bli utført automatisk.
      MERK: Deplasement vektorer D (x,y) beregnes for hver 16 × 16 piksler mellom referanserammen (den første rammen) og alle etterfølgende rammer (rammer 1 vs. 2, 1 vs. 3, 1 vs. 4, etc.). Resultatet beregnes for hver ramme og lagres som "vec_x.txt" (x er et rammenummer). En vektor med maksimal forskyvning, M(x, y), er definert for hvert (x, y) par som følger:
      Equation 1
      der k representerer rammenummeret som | Dk (x,y)| = maks [| D2 (x,y)|, | D3 (x,y)|, ..., | Dn (x,y)|] og n betegner den siste rammen. Resultatet lagres som "Max_vector.txt". | M(x, y)| representerer maksimal forskyvning forårsaket av kardiomyocytt sammentrekning på analysepunktet (x, y). Kontraktilitetsverdi C i vilkårlige enheter beregnes på følgende måte:
      Equation 2
      Denne verdien lagres i kolonne 7, rad 1 i "Max_vector.txt". C representerer summen av forskyvning for alle (x, y). Jo større delen der forskyvningen på grunn av hjerteinfarkt er stor, desto større er verdien av C. Vektorfeltet med maksimal forskyvning, M(x, y), er overlaid med fasekontrastbilde av den første rammen ("Phase_contrast.png") og lagret som "Overlaid.png". Etter hvert som størrelsen på forskyvningsvektoren beregnes basert på den første rammen av videoen, er det å foretrekke for hiPS-CMs å være i hvile diastolisk periode for den første rammen.

6. Vurdering av cellulær skade ved bruk av strømningscytometri

  1. Fortynn en 1 mg/ml oppløsning propidiumjodid til 1:1000 i PBS.
  2. Beis de frittliggende cellene med propidiumjodid.
    1. Aspirer mediet og legg det i et sentrifugerør i riktig størrelse.
    2. Sentrifuger røret ved 1000 × g i 5 min, og fjern forsiktig supernatanten for ikke å miste sedimenterte celler.
    3. Inkuber cellene med fortynnet propidiumjodidløsning ved romtemperatur i 15 min i mørket.
    4. Sentrifuger røret ved 1000 × g i 5 min, og fjern forsiktig supernatanten for ikke å miste sedimenterte celler.
    5. Rekonstituer cellene i ~ 1 ml PBS.
      MERK: Det er viktig å samle løsrevet flytende celler fra mediet for å kvantifisere cellulær skade nøyaktig.
  3. Flekk festet celler med propidiumjodid.
    1. Vask vedlagte celler to ganger med PBS forsiktig, og kast deretter PBS.
    2. Inkuber cellene med fortynnet propidiumjodidoppløsning i 15 min i mørket.
    3. Aspirer propidiumjodidoppløsningen.
    4. Koble cellene ved hjelp av 0,25% trypsin. Flytt celleløsningen til et sentrifugerør.
    5. Sentrifuger røret ved 1000 × g i 5 min, og fjern forsiktig supernatanten for ikke å miste sedimenterte celler.
    6. Rekonstituer cellene i ~ 1 ml PBS.
  4. Bland de flytende og vedlagte cellene for fluorescensaktivert cellesorteringsanalyse (FACS).
  5. Før celleløsningen gjennom et 30 μm filter.
    MERK: Det er svært viktig å sende cellene til et filter for en nøyaktig FACS-måling.
  6. Analyser eksemplene ved hjelp av et FACS-system.

7. Immunstaining

  1. Fiks celleprøven.
    1. Aspirer kulturmediet.
    2. Tilsett 4% paraformaldehyd i PBS i 10 min ved romtemperatur.
    3. Vask cellene tre ganger med PBS.
      MERK: Fersk paraformaldehydoppløsning anbefales for optimal fiksering.
  2. Permeabilize cellene med 0,2% Triton X-100 i 15 min, og kast deretter reagensen.
  3. Tilsett 3% storfe serum albumin for å blokkere cellene i 30 min.
  4. Påfør primært antistoff.
    1. Kast storfe serum albumin løsning fra kulturplaten.
    2. Inkuber cellene med primære antistoffer over natten ved 4 °C.
    3. Fjern antistoffoppløsningen.
    4. Vask cellene tre ganger med PBS.
  5. Påfør sekundært antistoff.
    1. Kast PBS-oppløsningen fra kulturplaten.
    2. Inkuber cellene med sekundære antistoffer i 30 min ved romtemperatur i mørket.
      MERK: Primær anti-hjertetroponin T (TNNT2) mus monoklonalt antistoff brukes ved en fortynning på 1:750 i 3% BSA. Alexa Fluor 488-konjugert sekundærgeit anti-mus antistoff fortynnes til 1:1000 i 3% BSA.
  6. Ytterligere farging av kjerne- og aktinfibre.
    1. Fjern antistoffoppløsningen.
    2. Inkuber cellene i kjernefargingsreagens ( Materialsegenser ) og actinfargingsreagens (Materialstable ) i PBS i 30 min ved romtemperatur i mørket.Table of Materials
      MERK: 4', 6-diamidino-2-fenylindol (DAPI) eller Hoechst 33342 kan brukes til kjernefysisk farging.
    3. Vask cellene tre ganger med PBS.
  7. Ta bilder fra fluorescens ved hjelp av et fluorescensmikroskop.

Representative Results

Differensierte celler viser spontan sammentrekning under mikroskopet (Video 1). Vanligvis viser 50% av brønnene spontan sammentrekning i <20 dager( Supplerende figur 1). Hjertemarkørprotein (f.eks. cTnT) kan brukes til å bekrefte vellykket differensiering (figur 2).

Celler fra den iskemiske gruppen viser vanligvis lavere levedyktighet i MTT-analyser (figur 3A) og kontraktilitet (figur 3E,F, supplerende figur 2) enn de fra normoksisk kontrollgruppe. Forholdet mellom propidiumjodidpositive celler er også høyere i den iskemiske gruppen enn i kontrollgruppen (figur 3B–D), noe som indikerer høyere cellulær skade.

Figure 1
Figur 1: Mappestruktur for forskyvningsvektoranalyse ved hjelp av imageJ.
"joblist.txt" beskriver banen til filmfiler hver linje. Hvis det er tre filer å analysere, vil det være tre mapper (movie1, movie2 og movie3), der "analyze.avi" (filmen av interesse) skal plasseres. Etter at analysen er utført av "vector_analysis.ijm" kode, vil filer bli generert (angitt i blått) i hver filmmappe. Informasjon som er lagret i hver fil, forklares i detalj i hovedteksten. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Representativt bilde av hjertemarkørfarging.
Uttrykk for hjertemarkørproteinet hjertetroponin T (cTnT). Blå: 4',6-diamidino-2-fenylindol (DAPI), rød: actin, grønn: cTnT. Inntredelse: striated uttrykk for cTnT, som tilsvarer sarcomere struktur. Vektstangen, 50 μm. Dette tallet er endret fra Wei et al.13. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Representative bilder av mobilnettets levedyktighetsanalyse, vurdering av cellulær skade og kontraktilitet.
(A) Sammenligning av cellulær levedyktighet (MTT-analyse). Høyere absorbans indikerer høyere levedyktighet. n = 5 for hver betingelse. (B, C og D) Flow cytometri analyse av propidiumjodid (PI)-farget celler. Iskemiske celler viser en redusert fremoversp scatter intensitet og økt PI fluorescens, sammenlignet med kontrollen. (D) Prosentandel av PI-beisede celler i flytcytometrianalysen. n = 3 for hver betingelse. (E) Analyse av iPS-CMs kontraktilitet ved hjelp av ImageJ-programvare. De røde og blå vektorene indikerer henholdsvis de største og minste sammentrekningene. Vektstangen, 100 μm. (F) Kvantitativ analyse av iPS-CM kontraktilitet ved hjelp av kode. n = 3 for kontroll og n = 8 for iskemisk tilstand. Feilfelt representerer standardfeil i gjennomsnittet. For den statistiske analysen ble unpaired to-tailed Student's t-test utført. *: p < 0,05, **: p < 0,01. : p < 0,0001. Denne figuren er sitert fra Wei et al.13 Vennligst klikkher for å se en større versjon av denne figuren.

Video 1: Differensierte celler viser spontan sammentrekning under mikroskopet. Vennligst klikk her for å laste ned denne videoen.

Tilleggstall 1: Kaplan-Meier analyse av prosentandel av prøver uten spontan sammentrekning. 50% av iPS-CM-prøvene viste sammentrekning på dag 20. På dag 30 viste 64,4% av prøvene sammentrekning. n = 83. Vennligst klikk her for å laste ned dette tallet.

Tilleggstall 2: Vurdering av hjertekontraktilitet. Skalert kontraktilitet oppnådd ved å dele kontraktilitet C med antall analysepunkter (x, y) ble plottet for kontroll og iskemiske grupper før og etter eksponeringen for 24 h hypoksi. n = 3 for kontroll og n = 8 for iskemisk tilstand. Vennligst klikk her for å laste ned dette tallet.

Supplerende figur 3: Vurdering av innholdet i kardiomyocytter. Immunstaining av hjertemarkørprotein på en 96 brønnplate. Grønn: cTnT, Blå: DAPI. Frekvensen av de differensierte cellene ble beregnet til å være 20,7 ± 9,6% ved å dele arealet av cTnT-farget område med dapi-farget område. Vektstangen = 1 mm. n = 4 for kontrolltilstand. Vennligst klikk her for å laste ned dette tallet.

Supplerende kodefil. Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.

Discussion

Forskere bruker ofte laboratoriemodeller for små dyr til å gjennomføre IHD-eksperimenter. Her utviklet vi en cellekulturmodell av menneskelig IHD for å utføre slike eksperimenter.

Hovedproblemet en bruker av denne protokollen kan møte er lav hastighet på differensierte kardiomyocytter. Flere trinn bør tas med stor forsiktighet for å forbedre frekvensen av vellykket differensiering: (a) være forsiktig når de pipettering fordi cellene lett løsner etter tilsetning av celledissosiasjonsenzymer reagens, (b) å legge til Y-27632 øker overlevelsesraten til iPS-celler ved løsrivelse, og (c) tidspunktet for middels endringer i begynnelsen av differensiering bør være nøyaktig 48 h fra hverandre for å sikre kontrollert uttrykk for gener involvert i differensiering.

Når det gjelder ekstracellulære matriseproteiner som brukes til å belegge overflaten av kulturplaten, kan andre materialer enn laminin vi brukte i denne protokollen brukes. Matrigel14,15oggelatin16,17 brukes for materfri vedlikeholdskultur av hiPSCer. Ifølge Haraguchi et al., hiPSCs seeded på Matrigel ble vellykket differensiert i hjertecelleark18.

Det finnes en rekke tidligere studier om kulturmodeller for sykdomsmodellering ved hjelp av kardiomyocytter avledet fra hiPSCer. Når det gjelder modellering av iskemi-reperfusjonsskade, har manipulasjoner av cellemiljøet, som hyperkalemi, acidose og laktatakkumulering, blittintrodusert 19. Andre metoder inkluderer cellepelleting for å hindre oksygendiffusjon20 og metabolsk hemming ved hjelp avcyanid 21. I den nåværende protokollen ble celleskade oppnådd ved relativt enkel metode, nemlig 24 h deprivasjon av oksygen og næringsstoffer. Det bør imidlertid tas hensyn til å vurdere nøyaktige patofysilogiske prosesser av den iskemiske hjertesykdommen, da det faktisk er forskjeller mellom sykdommen in vivo og sykdomsmodellen av den nåværende protokollen, for eksempel tilstedeværelse eller fravær av tredimensjonalt cellulært miljø og blod.

Når det gjelder det teknologiske aspektet ved evalueringen av kardiomyocyte-funksjonen, rapporterte Toepfer et al. en MatLab-basert algoritme for å bestemme sarcomere sammentrekning og avslapning i hiPS-CMs22. Smith et al. rapporterte en avansert metode for høy gjennomstrømning elektrofysiologisk analyse av spennende celler avledet fra hiPS-CMs, ved hjelp av sofistikerte nanotopografisk mønstrede multielektrodarrayer23,,24. Fordelen med vår protokoll er at den bare krever konvensjonell programvare og forbruksvarer, for eksempel imageJ-programvare og 96-brønnplater.

Med hensyn til oksygennivået i hjertet, oksygentrykket i årer som når hjertet antas å være 40 mmHg25. Ifølge McDougal et al., ekstracellulært oksygentrykk under hypoksi er anslått å være <12.8 mmHg26. Ved å bruke metoden for runder et al.27, er oksygentrykket i kulturmediet (saltholdighet: 35‰) under hypoksisk tilstand (2% oksygen) ved 37 °C behandlet med gjeldende protokoll beregnet til å være 14,9 mmHg, som er høyere enn estimeringen ovenfor. Interessant, Al-Ani et al. rapporterte at det er en gradient av oksygentrykk i kulturmediet, og oksygentrykket påvirkes av celletype, såetetthet og middels volum28. Vanligvis er oksygenkonsentrasjonen på bunnen av kulturplaten der cellene bor den laveste. Derfor vil effekten av dybde i kulturmediet ytterligere redusere det effektive oksygentrykket nær hiPS-CMs. For å indusere tilstrekkelig skade på hiPS-CMs ved hjelp av hypoksisk tilstand, må nøye oppmerksomhet rettes mot dybden av middels og tettheten av celler.

Vår hiPS-CM-modell, som ligger svært nær de fysiologiske forholdene til humane hjerte myocytter, etterligner fordelaktig menneskelig IHD. Dyremodellbaserte tilnærminger inkluderer etiske, tekniske og akademiske problemstillinger. Spesielt krever in vivo-modeller en avansert teknikk for mikrokirurgi for å oppnå reproduserbare data: f.eks. okklusjon av den fremre synkende grenen av venstre koronararterie hos gnagere3. HiPS-CM-modellen som er beskrevet her, overvinner disse kritiske barrierene og gir en nyttig, relevant og repeterbar plattform for kardiovaskulær sykdom.

Noen begrensninger bør imidlertid noteres. En åpenbar forskjell mellom iPS-induserte kardiomyocytter og normale kardiomyocytter er fraværet av T-tubuli29, og vi inkluderte ikke humorale faktorer som vevsskade indusert av leukocytter og aktivering av et komplementsystem i vår studie. Videre bør frekvensen av differensierte kardiomyocytter i denne modellen (20,7 ± 9,6%, Supplerende figur 3) forbedres. Den nylige publikasjonen av Halloin et al. beskriver en skalerbar, kjemisk definert metode for å indusere hiPS-CM renhet på > 95% av kjemiske WNT pathway modulatorer uten krav om valg av markører30. Likevel er vår modell av menneskelig IHD relativt enkel og klinisk anvendelig (f.eks. legemiddelscreening ved hjelp av pasientavledede iPS-celler). Vår modell er også en unik plattform for ytterligere å belyse mekanismer underliggende IHDer.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Denne studien ble støttet av JSPS KAKENHI, Fund for the Promotion of Joint International Research (Fostering Joint International Research), 17KK0168. Forfatterne takknemlig anerkjenne Central Research Laboratory, Okayama University Medical School for hjelp av FACS.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Actin staining reagent (ActinRed 555 ReadyProbes Reagent) Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA R37112
Anti cardiac troponin T antibody Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA MA5-12960
Cardiomyocyte maintenance medium (PSC Cardiomyocyte Differentiation Kit) Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA A2921201
Cell dissociation enzymes (TrypLE Select) Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA 12563011
Differentiation medium A (PSC Cardiomyocyte Differentiation Kit) Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA A2921201
Differentiation medium B (PSC Cardiomyocyte Differentiation Kit) Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA A2921201
FACS Aria III system BD Biosciences, San Jose, CA, USA
Fluorescenct microscope KEYENCE, Osaka, Japan BZ-X710
Goat anti-mouse Alexa Fluor 488 secondary antibody Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA A28175
Human iPS cells RIKEN, Tsukuba, Japan 201B7
Hypoxic incubator SANYO, Osaka, Japan MCO-175M
iPSC growth medium (Essential 8 Medium) Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA A1517001
iPSC maintenance medium (StemFit AK02N) Ajinomoto, Tokyo, Japan RCAK02N
Laminin (iMatrix-511) Nippi, Tokyo, Japan iMatrix-511
MTT assay kit (MTT Cell Proliferation Assay Kit) Cayman Chemical Company, Ann Arbor, MI, USA 10009365
Nucleus staining reagent (NucBlue Fixed Cell ReadyProbes Reagent) Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA R37606
Triton X-100 Nacalai Tesque, Kyoto, Japan 35501-02

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Naghavi, M. Global Burden of Disease Self-Harm, C. Global, regional, and national burden of suicide mortality 1990 to 2016: systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2016. BMJ. 364, 94 (2019).
  2. Nowbar, A. N., Gitto, M., Howard, J. P., Francis, D. P., Al-Lamee, R. Mortality From Ischemic Heart Disease. Circulation: Cardiovascular Quality and Outcomes. 12 (6), 005375 (2019).
  3. Oh, J. G., Ishikawa, K. Experimental Models of Cardiovascular Diseases: Overview. Methods in Molecular Biology. 1816, 3-14 (2018).
  4. Brodehl, A., et al. Human Induced Pluripotent Stem-Cell-Derived Cardiomyocytes as Models for Genetic Cardiomyopathies. International Journal of Molecular Sciences. 20 (18), (2019).
  5. Garbern, J. C., et al. Inhibition of mTOR Signaling Enhances Maturation of Cardiomyocytes Derived from Human Induced Pluripotent Stem Cells via p53-Induced Quiescence. Circulation. , (2019).
  6. Horikoshi, Y., et al. Fatty Acid-Treated Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Human Cardiomyocytes Exhibit Adult Cardiomyocyte-Like Energy Metabolism Phenotypes. Cells. 8 (9), (2019).
  7. Hu, D., et al. Metabolic Maturation of Human Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes by Inhibition of HIF1alpha and LDHA. Circulation Research. 123 (9), 1066-1079 (2018).
  8. Correia, C., et al. Distinct carbon sources affect structural and functional maturation of cardiomyocytes derived from human pluripotent stem cells. Scientific Reports. 7 (1), 8590 (2017).
  9. Yang, X., et al. Tri-iodo-l-thyronine promotes the maturation of human cardiomyocytes-derived from induced pluripotent stem cells. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 72, 296-304 (2014).
  10. Tamargo, J., et al. Genetically engineered mice as a model for studying cardiac arrhythmias. Frontiers in Bioscience. 12, 22-38 (2007).
  11. Tseng, Q., et al. Spatial organization of the extracellular matrix regulates cell-cell junction positioning. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (5), 1506-1511 (2012).
  12. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
  13. Wei, H., Wang, C., Guo, R., Takahashi, K., Naruse, K. Development of a model of ischemic heart disease using cardiomyocytes differentiated from human induced pluripotent stem cells. Biochemical and Biophysical Research Communications. 520 (3), 600-605 (2019).
  14. Ghaedi, M., Niklason, L. E. Human Pluripotent Stem Cells (iPSC) Generation, Culture, and Differentiation to Lung Progenitor Cells. Methods in Molecular Biology. 1576, 55-92 (2019).
  15. Hou, J., et al. Retaining mTeSR1 Medium during Hepatic Differentiation Facilitates Hepatocyte-Like Cell Survival by Decreasing Apoptosis. Cellular Physiology and Biochemistry. 51 (4), 1533-1543 (2018).
  16. Yoshida, K., et al. Differentiation of mouse iPS cells into ameloblast-like cells in cultures using medium conditioned by epithelial cell rests of Malassez and gelatin-coated dishes. Medical Molecular Morphology. 48 (3), 138-145 (2015).
  17. Guzzo, R. M., Drissi, H. Differentiation of Human Induced Pluripotent Stem Cells to Chondrocytes. Methods in Molecular Biology. 1340, 79-95 (2015).
  18. Haraguchi, Y., Matsuura, K., Shimizu, T., Yamato, M., Okano, T. Simple suspension culture system of human iPS cells maintaining their pluripotency for cardiac cell sheet engineering. Journal of Tissue Engineering and Regenerative. 9 (12), 1363-1375 (2015).
  19. Chen, T., Vunjak-Novakovic, G. In vitro Models of Ischemia-Reperfusion Injury. Regenerative Engineering and Translational Medicine. 4 (3), 142-153 (2018).
  20. Strijdom, H., Genade, S., Lochner, A. Nitric Oxide synthase (NOS) does not contribute to simulated ischaemic preconditioning in an isolated rat cardiomyocyte model. Cardiovascular Drugs and Therapy. 18 (2), 99-112 (2004).
  21. Cavalheiro, R. A., et al. Potent cardioprotective effect of the 4-anilinoquinazoline derivative PD153035: involvement of mitochondrial K(ATP) channel activation. PLoS One. 5 (5), 10666 (2010).
  22. Toepfer, C. N., et al. SarcTrack. Circulation Research. 124 (8), 1172-1183 (2019).
  23. Smith, A. S. T., et al. NanoMEA: A Tool for High-Throughput, Electrophysiological Phenotyping of Patterned Excitable Cells. Nano Letters. , (2019).
  24. Smith, A. S., Macadangdang, J., Leung, W., Laflamme, M. A., Kim, D. H. Human iPSC-derived cardiomyocytes and tissue engineering strategies for disease modeling and drug screening. Biotechnology Advances. 35 (1), 77-94 (2017).
  25. Sitkovsky, M., Lukashev, D. Regulation of immune cells by local-tissue oxygen tension: HIF1 alpha and adenosine receptors. Nature Reviews Immunology. 5 (9), 712-721 (2005).
  26. McDougal, A. D., Dewey, C. F. Modeling oxygen requirements in ischemic cardiomyocytes. Journal of Biological Chemistry. 292 (28), 11760-11776 (2017).
  27. Rounds, S. A., Wilde, F. D., Ritz, G. F. Chapter A6. Section 6.2. Dissolved oxygen. Report No. 09-A6.2. , Reston, VA. (2006).
  28. Al-Ani, A., et al. Oxygenation in cell culture: Critical parameters for reproducibility are routinely not reported. PLoS One. 13 (10), 0204269 (2018).
  29. Cadet, J. S., Kamp, T. J. A Recipe for T-Tubules in Human iPS Cell-Derived Cardiomyocytes. Circulation Research. 121 (12), 1294-1295 (2017).
  30. Halloin, C., et al. Continuous WNT Control Enables Advanced hPSC Cardiac Processing and Prognostic Surface Marker Identification in Chemically Defined Suspension Culture. Stem Cell Reports. 13 (2), 366-379 (2019).

Tags

Medisin Utgave 159 Iskemisk hjertesykdom hypoksi Hjerteinfarkt Human indusert pluripotente stamceller cellulær differensiering Kardiomyocytter
Modell av iskemisk hjertesykdom og videobasert sammenligning av kardiomyocytter sammentrekning ved hjelp av hiPSC-avledede kardiomyocytter
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Liu, Y., Liang, Y., Wang, M., Wang,… More

Liu, Y., Liang, Y., Wang, M., Wang, C., Wei, H., Naruse, K., Takahashi, K. Model of Ischemic Heart Disease and Video-Based Comparison of Cardiomyocyte Contraction Using hiPSC-Derived Cardiomyocytes. J. Vis. Exp. (159), e61104, doi:10.3791/61104 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter