הדמיה חיה של מחזור החיים של החיידק טורף Bdellovibrio bacteriovorus באמצעות מיקרוסקופית פלואורסצני זמן לשגות
Summary
מוצג כאן פרוטוקול המתאר ניטור של מחזור החיים המלא של חיידק טורף Bdellovibrio bacteriovorus באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצני זמן לשגות בשילוב עם כרית agarose ומנות הדמיה תא.
Abstract
Bdellovibrio bacteriovorus הוא קטן גרם שלילי, חיידק טורף חובה שהורג חיידקים אחרים גרם שלילי, כולל פתוגנים מזיקים. לכן, הוא נחשב אנטיביוטיקה חיה. כדי להחיל B. bacteriovorus כאנטיביוטיקה חיה, זה הראשון הכרחי כדי להבין את השלבים העיקריים של מחזור החיים המורכב שלה, במיוחד התפשטותו בתוך טרף. עד כה, זה היה מאתגר לעקוב אחר שלבים רצופים של מחזור החיים הטורף בזמן אמת. מוצג כאן פרוטוקול מקיף להדמיה בזמן אמת של מחזור החיים המלא של B. bacteriovorus, במיוחד במהלך הצמיחה שלה בתוך המארח. לשם כך, מערכת המורכבת משטח agarose משמש בשילוב עם צחות הדמיה תא, שבו התאים הטורפים יכולים לנוע בחופשיות מתחת למשטח agarose בעוד תאי טרף משותקים מסוגלים ליצור bdelloplasts. היישום של זן המייצר שפעת מתויגת β-subunit של פולימראז DNA III עוד יותר מאפשר שכפול כרומוזום להיות במעקב במהלך שלב הרבייה של מחזור החיים B. bacteriovorus.
Introduction
Bdellovibrio bacteriovorus הוא קטן (0.3-0.5 μm על ידי 0.5-1.4 μm) חיידק גרם שלילי הטורף חיידקים אחרים גרם שלילי, כולל פתוגנים מזיקים כגון Klebsiella דלקת ריאות, פסאודומונס aeruginosa, ו Shigella flexneri1,,2,3.3 מאז B. bacteriovorus הורג פתוגנים, הוא נחשב אנטיביוטיקה חיה פוטנציאלית שניתן להחיל כדי להילחם בזיהומים חיידקיים, במיוחד אלה הנגרמת על ידי זנים עמידים לתרופות מרובות.
ב. bacteriovorus מציג מחזור חיים מוזר המורכב משני שלבים: שלב התקפה חיים חופשיים שאינם משוכפלים ושלב רבייה תאית(איור 1). בשלב החיים החופשיים, החיידק המוטיב הזה, אשר נע במהירויות של עד 160 μm / s, מחפש את טרפו. לאחר הצמדה לממברנה החוצה של הטרף, הוא נכנס פריפלסמה4,5. במהלך שלב הרבייה הבין-פריפלסמית, ב. בקטריובוס משתמש בשפע של אנזימים הידרולטיסיים כדי להשפיל את המקרומולקולות של המארח ולהשתמש בהם מחדש לצמיחה שלו. זמן קצר לאחר הפלישה פריפלסמה, התא המארח מת ומתנפח לתוך מבנה כדורי הנקרא bdelloplast, שבו התא הטורף מארכת ושכפול כרומוזומים שלה. תהליך השכפול מתחיל במקור השכפול (oriC)6 וממשיך עד שמספר עותקים של הכרומוזום מסונתזיםלחלוטין 7. מעניין, שכפול של כל כרומוזום אינו מלווה על ידי חלוקת תאים. במקום זאת, הטורף מתעצם כדי ליצור תא ארוך, רב-גרעיני ונימה. עם דלדול תזונתי, חוט החוט עובר ספיגה סינכרונית ותאי הצבי משתחררים bdelloplast8.
לפני B. bacteriovorus יכול לשמש כאנטיביוטיקה חיה נגד זיהומים חיידקיים, זה חיוני כדי להבין את השלבים העיקריים של מחזור החיים שלה, במיוחד אלה הקשורים להתפשטותו בתוך הטרף. הדמיה חיה של ב. בקטריובוס הייתה מאתגרת, בשל הצורות המורפולוגיות השונות של הטורף וטרפו במהלך מחזור החיים המורכב. עד כה, האינטראקציות בין B. bacteriovorus והתא המארח שלה נחקרו בעיקר על ידי מיקרוסקופאלקטרונים וניתוח snap-shot 2,9,10, שניהם יש מגבלות, במיוחד כאשר הם משמשים כדי לפקח על שלביםרצופיםשל מחזורהחייםהטורף. שיטות אלה מספקות תמונות ברזולוציה גבוהה של תאי B. bacteriovorus ומאפשרות התבוננות טורף קטן במהלך שלב ההתקפה או הצמיחה. עם זאת, הם אינם מאפשרים מעקב אחר תאים B. bacteriovorus יחיד לאורך שני שלבי מחזור החיים.
מוצג כאן פרוטוקול מקיף לשימוש מיקרוסקופית פלואורסצנית זמן לשגות (TLFM) כדי לפקח על מחזור החיים המלא של B. bacteriovorus. מערכת המורכבת משטח agarose משמש בשילוב עם צלחת הדמיה תא, שבו התאים הטורפים יכולים לנוע בחופשיות מתחת למשטח agarose בעוד תאי טרף משותקים מסוגלים ליצור bdelloplasts(איור 2). הגדרה זו מוכנה בהתבסס על זנים ספציפיים של חיידקי אי-קולי ו-B. bacteriovorus, אך ניתן לשנות את הפרוטוקול בקלות כך שיתאים לזנים האישיים של המשתמש (לדוגמה, נשיאת סמני בחירה שונים, חלבונים המותכים לפלואורופורים שונים וכו’).
במקרה זה, כדי לדמיין B. bacteriovorus במהלך שלב ההתקפה, זן ספציפי (HD100 DnaN-mNeonGreen / PilZ-mCherry) נבנה המבטא גרסה מתויגת פלורסנטית של חלבון cytoplasmic, PilZ (זמין במעבדה שלנו על פי בקשה)7. זן זה בנוסף מייצר DnaN (β-הזזה מהדק), תת-אחד של הולוגאנזים DNA פולימראז השלישי, התמזגו עם חלבון פלורסנט. זה מאפשר שכפול DNA מתמשך להיות במעקב בתוך התאים הטורפים כפי שהם גדלים בתוך bdelloplasts.
למרות הפרוטוקול המתואר והתוכנה המשמשים לרכישת תמונה מתייחסים מיקרוסקופ הפוך המסופק על ידי יצרן מסוים (ראה טבלת חומרים),טכניקה זו עשויה להיות מותאמת עבור כל מיקרוסקופ הפוך מצויד תא סביבתי או מחזיק חימום חיצוני אחר ומסוגל הדמיה לשגות זמן. עבור ניתוח נתונים, משתמשים יכולים לבחור כל תוכנה זמינה התואמת לתבניות פלט בודדות.
איור 1: מחזור חיים ב. bacteriovorus ב E. coli כתא מארח. במהלך שלב ההתקפה, תא B. bacteriovorus שחיה חופשית מחפש ומתחבר לתא E. coli מארח. לאחר הפלישה, התא הטורף הופך למקומי בפריפלסמה של הטרף, משנה את צורת התא המארח ויוצר bdelloplast. שלב הרבייה מתחיל במבנה bdelloplast. התא הטורף מעכל את תא הטרף ומהשתמש מחדש בתרכובות פשוטות כדי לבנות מבנים משלו. ב. bacteriovorus גדל כתרימה אחת ארוכה בתוך פריפלסמה של המארח. כאשר המשאבים של תא הטרף מוצו, חוט החיידק B. סינכרוני ספיגה ויוצר תאים צגידים. לאחר שתאי הצולה מפתחים את הפלגלה שלהם, הם מלקטים את ה-bdelloplast. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.
Protocol
Representative Results
Discussion
בשל העניין המוגבר בשימוש B. bacteriovorus כאנטיביוטיקה חיה, כלים חדשים להתבוננות במחזור החיים הטורף, במיוחד אינטראקציות טורפים-פתוגן, נדרשים. הפרוטוקול המוצג משמש למעקב אחר כל מחזור החיים B. bacteriovorus, במיוחד במהלך הצמיחה שלה בתוך המארח, בזמן אמת. יתר על כן, היישום של זן המייצר פלואורסצנט מ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מחקר זה נתמך על ידי מענק מרכז המדע הלאומי אופוס 2018/29/B/NZ6/00539 לג’יי.זי.סי.
Materials
| Centrifuge | MPW MED. INSTRUMENTS | MPW-260R | Rotor ref. 12183 |
| CertifiedMolecular Biology Agarose | BIO-RAD | 161-3100 | low fluorescence agarose for agarose pad |
| Fiji | ImageJ | https://imagej.net/Fiji | Open source image processing package |
| Glass Bottom Dish 35 mm | ibidi | 81218-200 | uncoated glass |
| Microscope | GE | DeltaVision Elite | Microtiter Stage, ultimate focus laser module, DV Elite CoolSnap HQ2 Camera, SSI assembly FP DV, kit obj. Oly 100x oil 1.4 NA, prism Nomarski 100x LWD DIC, ENV ctrl IX71 uTiter opaQ 240 V |
| Minisart Filter 0.45 µm | Sartorius | 16555———-K | Cellulose Acetate, Sterile, Luer Lock Outlet |
| Start SoftWoRx | GE | Manufacturer-supplied imaging software |
References
- Shatzkes, K., et al. Predatory Bacteria Attenuate Klebsiella pneumoniae Burden in Rat Lungs. mBio. 7 (6), (2016).
- Iebba, V., et al. Bdellovibrio bacteriovorus directly attacks Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus aureus Cystic fibrosis isolates. Frontiers in Microbiology. 5, (2014).
- Willis, A. R., et al. Injections of Predatory Bacteria Work Alongside Host Immune Cells to Treat Shigella Infection in Zebrafish Larvae. Current biology: CB. 26 (24), 3343-3351 (2016).
- Lambert, C., et al. Characterizing the flagellar filament and the role of motility in bacterial prey-penetration by Bdellovibrio bacteriovorus. Molecular Microbiology. 60 (2), 274-286 (2006).
- Lambert, C., et al. A Predatory Patchwork: Membrane and Surface Structures of Bdellovibrio bacteriovorus. Advances in Microbial Physiology. 54, 313-361 (2008).
- Makowski, &. #. 3. 2. 1. ;., et al. Initiation of Chromosomal Replication in Predatory Bacterium Bdellovibrio bacteriovorus. Frontiers in Microbiology. 7, 1898 (2016).
- Makowski, &. #. 3. 2. 1. ;., et al. Dynamics of Chromosome Replication and Its Relationship to Predatory Attack Lifestyles in Bdellovibrio bacteriovorus. Applied and Environmental Microbiology. 85 (14), (2019).
- Fenton, A. K., Kanna, M., Woods, R. D., Aizawa, S. I., Sockett, R. E. Shadowing the actions of a predator: backlit fluorescent microscopy reveals synchronous nonbinary septation of predatory Bdellovibrio inside prey and exit through discrete bdelloplast pores. Journal of Bacteriology. 192 (24), 6329-6335 (2010).
- Kuru, E., et al. Fluorescent D-amino-acids reveal bi-cellular cell wall modifications important for Bdellovibrio bacteriovorus predation. Nature Microbiology. 2 (12), 1648-1657 (2017).
- Dashiff, A., Junka, R. A., Libera, M., Kadouri, D. E. Predation of human pathogens by the predatory bacteria Micavibrio aeruginosavorus and Bdellovibrio bacteriovorus. Journal of Applied Microbiology. 110 (2), 431-444 (2011).
