Imaging a cellule vive del ciclo di vita del predatore batterico Bdellovibrio bacteriovorus utilizzando la microscopia a fluorescenza Time-Lapse
Summary
Qui è presentato un protocollo che descrive il monitoraggio dell’intero ciclo di vita del batterio predatorio Bdellovibrio bacteriovorus utilizzando la microscopia a fluorescenza time-lapse in combinazione con un cuscinetto di agarose e piatti di imaging cellulare.
Abstract
Bdellovibrio bacteriovorus è un piccolo batterio predatorio negativo e obbligato che uccide altri batteri gram-negativi, compresi gli agenti patogeni nocivi. Pertanto, è considerato un antibiotico vivente. Per applicare B. bacteriovorus come antibiotico vivente, è prima necessario comprendere le principali fasi del suo complesso ciclo di vita, in particolare la sua proliferazione all’interno della preda. Finora, è stato difficile monitorare le fasi successive del ciclo di vita predatorio in tempo reale. Presentato qui è un protocollo completo per l’imaging in tempo reale dell’intero ciclo di vita di B. bacteriovorus, soprattutto durante la sua crescita all’interno dell’host. A tale scopo, viene utilizzato un sistema costituito da un cuscinetto di agarose in combinazione con piatti di imaging cellulare, in cui le cellule predatorie possono muoversi liberamente sotto il cuscinetto di agarose mentre le cellule di preda immobilizzate sono in grado di formare bdelloplasts. L’applicazione di un ceppo che produce una β-sottounità di polimerasi del DNA III consente inoltre di monitorare la replicazione cromosomia durante la fase di riproduzione del ciclo di vita B. batteriovorus.
Introduction
Bdellovibrio bacteriovorus è un piccolo batterio gram-negativo che preda altri batteri gram-negativi, tra cui patogeni nocivi come Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa e Shigella flexneri1,2,3. Poiché B. bacteriovorus uccide agenti patogeni, è considerato un potenziale antibiotico vivente che può essere applicato per combattere le infezioni batteriche, in particolare quelle causate da ceppi multifarmacori.
B. bacteriovorus presenta un ciclo di vita particolare costituito da due fasi: una fase di attacco non replicativo e una fase riproduttiva intracellulare (Figura 1). Nella fase di vita libera, questo batterio altamente motile, che si muove a velocità fino a 160 m/s, cerca la sua preda. Dopo essersi attaccata alla membrana esterna della preda, entra nel periplasma4,5. Durante la fase riproduttiva interperiplasmica, B. bacteriovorus utilizza una pletora di enzimi idrolitici per degradare le macromolecole dell’ospite e riutilizzarle per la propria crescita. Poco dopo aver invaso il periplasma, la cellula ospite muore e si gonfia in una struttura sferica chiamata bdelloplast, all’interno della quale la cellula predatoria allunga e replica i suoi cromosomi. Il processo di replica inizia dall’origine della replica (oriC)6 e procede fino a quando diverse copie del cromosoma non sono state completamente sintetizzate7. È interessante notare che la replica di ogni cromosoma non è seguita dalla divisione cellulare. Invece, il predatore si allunga per formare una cellula lunga, multinucleoide e filamentosa. Al momento dell’esaurimento dei nutrienti, il filamento subisce setto sincrono e le cellule della progenie vengono rilasciate dal bdelloplast8.
Prima che B. bacteriovorus possa essere usato come antibiotico vivente contro le infezioni batteriche, è fondamentale comprendere le principali fasi del suo ciclo di vita, in particolare quelle legate alla sua proliferazione all’interno della preda. L’imaging a cellule vive di B. bacteriovorus è stato impegnativo, a causa delle varie forme morfologiche del predatore e della sua preda durante il complesso ciclo di vita. Finora, le interazioni tra B. bacteriovorus e la sua cellula ospite sono state studiate principalmente dalla microscopia elettronica e dall’analisi a scatto a scatto2,9,10, entrambe con limitazioni, soprattutto quando vengono utilizzate per monitorare le fasi successive del ciclo di vita predatorio. Questi metodi forniscono immagini ad alta risoluzione di cellule B. batteriovorus e consentono l’osservazione di un piccolo predatore durante la fase di attacco o di crescita. Tuttavia, non consentono il tracciamento di singole cellule B. batteriovorus durante entrambe le fasi del ciclo di vita.
Presentato qui è un protocollo completo per l’utilizzo di microscopia a fluorescenza time-lapse (TLFM) per monitorare l’intero ciclo di vita di B. bacteriovorus. Un sistema costituito da un cuscinetto di agarose viene utilizzato in combinazione con un piatto di imaging cellulare, in cui le cellule predatorie possono muoversi liberamente sotto il cuscinetto di agarose mentre le cellule preda immobilizzate sono in grado di formare bdelloplasts (Figura 2). Questo set-up è preparato sulla base di ceppi specifici di E. coli e B. bacteriovorus, ma il protocollo può essere facilmente modificato per adattarsi ai singoli ceppi di un utente (ad esempio, portando diversi marcatori di selezione, proteine fuse con fluorofori diversi, ecc.).
In questo caso, per visualizzare B. bacteriovorus durante la fase di attacco, è stato costruito un ceppo specifico (HD100 DnaN-mNeonGreen/Pil-mCherry) che esprime una versione fluorescente della proteina citoplasmica, Pil , (disponibile nel nostro laboratorio su richiesta)7. Questo ceppo produce inoltre DnaN (il morsetto β-sliding), una sottounità di oloenzima della polimerasi del DNA III, fusa con una proteina fluorescente. Ciò consente di monitorare la replicazione del DNA in corso all’interno delle cellule predatorie man mano che crescono all’interno dei bdelloplasts.
Sebbene il protocollo e il software descritti utilizzati per l’acquisizione delle immagini si riferis facciano riferimento a un microscopio invertito fornito da un produttore specifico (c’è la tabella dei materiali), questa tecnica può essere regolata per qualsiasi microscopio invertito dotato di camera ambientale o di un altro supporto di riscaldamento esterno e in grado di imaging time-lapse. Per l’analisi dei dati, gli utenti possono scegliere qualsiasi software disponibile compatibile con i singoli formati di output.
Figura 1: B. ciclo di vita batterivoro in E. coli come cella ospite. Durante la fase di attacco, una cellula B. bacteriovorus che nuota libera cerca e si attacca a una cellula E. coli ospitante. Dopo l’invasione, la cellula predatoria viene localizzata nel periplasma della preda, cambiando la forma della cellula ospite e formando un bdelloplast. La fase riproduttiva inizia con la formazione di bdelloplastica. La cellula predatoria digerisce la cellula preda e riutilizza semplici composti per costruire le proprie strutture. B. bacteriovorus cresce come un lungo filamento singolo all’interno del periplasma dell’ospite. Quando le risorse della cellula preda sono esaurite, il filamento B. bacteriovorus si setta in modo sincrono e forma cellule progenie. Dopo che le cellule della progenie sviluppano i loro flagelli, elivano il bdelloplast. Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Protocol
Representative Results
Discussion
A causa del crescente interesse per l’uso di B. bacteriovorus come antibiotico vivente, sono necessari nuovi strumenti per osservare il ciclo di vita predatorio, in particolare le interazioni predatore-patogeno. Il protocollo presentato viene utilizzato per tracciare l’intero ciclo di vita B. bacteriovorus, soprattutto durante la sua crescita all’interno dell’host, in tempo reale. Inoltre, l’applicazione di un ceppo che produce morsetto beta fluorescente della polimerasi DEL DNA III holoenzyme ha permes…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo studio è stato sostenuto dalla sovvenzione del National Science Centre Opus 2018/29/B/N’6/00539 a J.
Materials
| Centrifuge | MPW MED. INSTRUMENTS | MPW-260R | Rotor ref. 12183 |
| CertifiedMolecular Biology Agarose | BIO-RAD | 161-3100 | low fluorescence agarose for agarose pad |
| Fiji | ImageJ | https://imagej.net/Fiji | Open source image processing package |
| Glass Bottom Dish 35 mm | ibidi | 81218-200 | uncoated glass |
| Microscope | GE | DeltaVision Elite | Microtiter Stage, ultimate focus laser module, DV Elite CoolSnap HQ2 Camera, SSI assembly FP DV, kit obj. Oly 100x oil 1.4 NA, prism Nomarski 100x LWD DIC, ENV ctrl IX71 uTiter opaQ 240 V |
| Minisart Filter 0.45 µm | Sartorius | 16555———-K | Cellulose Acetate, Sterile, Luer Lock Outlet |
| Start SoftWoRx | GE | Manufacturer-supplied imaging software |
References
- Shatzkes, K., et al. Predatory Bacteria Attenuate Klebsiella pneumoniae Burden in Rat Lungs. mBio. 7 (6), (2016).
- Iebba, V., et al. Bdellovibrio bacteriovorus directly attacks Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus aureus Cystic fibrosis isolates. Frontiers in Microbiology. 5, (2014).
- Willis, A. R., et al. Injections of Predatory Bacteria Work Alongside Host Immune Cells to Treat Shigella Infection in Zebrafish Larvae. Current biology: CB. 26 (24), 3343-3351 (2016).
- Lambert, C., et al. Characterizing the flagellar filament and the role of motility in bacterial prey-penetration by Bdellovibrio bacteriovorus. Molecular Microbiology. 60 (2), 274-286 (2006).
- Lambert, C., et al. A Predatory Patchwork: Membrane and Surface Structures of Bdellovibrio bacteriovorus. Advances in Microbial Physiology. 54, 313-361 (2008).
- Makowski, &. #. 3. 2. 1. ;., et al. Initiation of Chromosomal Replication in Predatory Bacterium Bdellovibrio bacteriovorus. Frontiers in Microbiology. 7, 1898 (2016).
- Makowski, &. #. 3. 2. 1. ;., et al. Dynamics of Chromosome Replication and Its Relationship to Predatory Attack Lifestyles in Bdellovibrio bacteriovorus. Applied and Environmental Microbiology. 85 (14), (2019).
- Fenton, A. K., Kanna, M., Woods, R. D., Aizawa, S. I., Sockett, R. E. Shadowing the actions of a predator: backlit fluorescent microscopy reveals synchronous nonbinary septation of predatory Bdellovibrio inside prey and exit through discrete bdelloplast pores. Journal of Bacteriology. 192 (24), 6329-6335 (2010).
- Kuru, E., et al. Fluorescent D-amino-acids reveal bi-cellular cell wall modifications important for Bdellovibrio bacteriovorus predation. Nature Microbiology. 2 (12), 1648-1657 (2017).
- Dashiff, A., Junka, R. A., Libera, M., Kadouri, D. E. Predation of human pathogens by the predatory bacteria Micavibrio aeruginosavorus and Bdellovibrio bacteriovorus. Journal of Applied Microbiology. 110 (2), 431-444 (2011).
