Summary
تم تصميم الطرق الحالية لقياس حساسية الكحول في دروسوفيلا لاختبار مجموعات من الذباب. نحن نقدم بسيطة، منخفضة التكلفة، وعالية الإنتاجية قياس لتقييم حساسية حساسية التأنق الكحول في أعداد كبيرة من الذباب واحد. لا تتطلب الطريقة أدوات متخصصة ويمكن إجراؤها في أي مختبر باستخدام مواد مشتركة.
Abstract
Drosophila melanogaster يوفر نموذجا ممتازا لدراسة الأسس الوراثية لحساسية الكحول. وعلى النقيض من الدراسات التي أجريت على السكان، يسمح نموذج دروسوفيلا بمراقبة صارمة على الخلفية الوراثية، ويمكن تربية أعداد غير محدودة تقريباً من الأفراد من نفس النمط الجيني بسرعة في ظل ظروف بيئية خاضعة للرقابة المشددة دون قيود تنظيمية وبتكلفة منخفضة نسبياً. يخضع الذباب المعرض للإيثانول لتغيرات فسيولوجية وسلوكية تشبه تسمم الكحول البشري ، بما في ذلك فقدان التحكم الوضعي ، والتخدير ، وتطوير التسامح. هنا ، نحن نصف بسيطة ، منخفضة التكلفة ، وعالية الإنتاجية قياس لتقييم حساسية حساسية التكبير في كمية كبيرة من الذباب واحد. ويستند هذا المنزى على تسجيل الفيديو من الذباب واحد أدخلت دون تخدير في لوحات ثقافة الخلية 24 بئر اعلى في مجموعة المتابعة التي تمكن من بدء متزامن من التعرض للكحول. ويمكّن النظام شخصاً واحداً من جمع بيانات فردية عن التأنّع الأيثانول على ما يصل إلى 2000 ذبابة خلال فترة عمل تبلغ 8 سات. ويمكن، من حيث المبدأ، توسيع نطاق الفحص لتقييم آثار التعرض لأي مادة متطايرة وتطبيقه لقياس آثار السمية الحادة للتطايرات على الحشرات الأخرى، بما في ذلك أنواع الذباب الأخرى.
Introduction
ويفيد المعهد الوطني لتعاطي الكحول وإدمان الكحول أنه في عام 2015، أثر الإفراط في استهلاك الكحول، الذي تم تصنيفه على أنه "اضطراب تعاطي الكحول"، على ما يقدر بـ 16 مليون شخص في الولايات المتحدة. تعاطي الكحول يسبب مجموعة واسعة من الآثار الفسيولوجية السلبية وهو سبب رئيسي للوفاة في الولايات المتحدة. في البشر ، وانخفاض الحساسية ، أو انخفاض مستوى الاستجابة للكحول ، لديه مكون وراثي قوي ويرتبط بارتفاع خطر الإصابة باضطرابات تعاطي الكحول1،2،3،4. إن دراسات المخاطر الوراثية على السكان تشكل تحدياً بسبب خليط السكان، وتنوع تاريخ النمو والتعرض البيئي، والاعتماد على الاستبيانات المبلغ عنها ذاتياً لتحديد الأنماط الظاهرية المرتبطة بالكحول، والتي غالباً ما تكون مُخلطة مع حالات عصبية نفسية أخرى.
Drosophila melanogaster يوفر نموذجا ممتازا لدراسة الأسس الوراثية للحساسية الكحول5,6,7,8. يسمح نموذج Drosophila بمراقبة صارمة على الخلفية الوراثية ، ويمكن تربية أعداد غير محدودة تقريبًا من الأفراد من نفس النمط الجيني بسرعة في ظل ظروف بيئية خاضعة للرقابة بشكل جيد دون قيود تنظيمية وبتكلفة منخفضة نسبيًا. بالإضافة إلى الطفرات المتاحة للجمهور وخطوط RNAI التي تستهدف غالبية الجينات في الجينوم ، فإن توافر لوحة المراجع الوراثية Drosophila melanogaster (DGRP) ، وهي مجموعة من 205 خطوط مشتقة من البرية مع تسلسل الجينوم الكامل ، قد مكنت دراسات الارتباط على نطاق الجينوم9،10. وقد حددت هذه الدراسات الشبكات الوراثية المرتبطة بالآثار على وقت التنمية والجدوى عند التعرض التنموي للإيثانول11,12. الحفظ التطوري للعمليات البيولوجية الأساسية تمكن الاستدلالات الانتقالية يمكن استخلاصها عن طريق فرض تقويم العظام البشري على نظرائهم ذبابة.
الذباب المعرض للإيثانول يخضع لتغيرات فسيولوجية وسلوكية تشبه تسمم الكحول البشري ، بما في ذلك فقدان السيطرة الوضعية8، التخدير ، وتطوير التسامح13،14،15. يمكن قياس التأنيب الناجم عن الكحول في دروسوفيلا كميًا باستخدام مقاييس inebriometers. هذه هي أعمدة زجاجية عمودية طولها 122 سم مع أقسام شبكية مائلة يمكن أن نعلق عليها الذباب16،17،18. يتم إدخال مجموعة من ما لا يقل عن 50 ذبابة (يمكن تحليل الجنس بشكل منفصل) في الجزء العلوي من العمود وتعرضها لأبخرة الإيثانول. الذباب الذي يفقد السيطرة الوضعية تقع من خلال العمود ويتم جمعها على فترات 1 دقيقة. يعني وقت elution بمثابة مقياس للحساسية لتسمم الكحول. عندما يتعرض الذباب للكحول للمرة الثانية بعد التعافي من التعرض الأول ، فإنها يمكن أن تتطور التسامح ، كما يتضح من التحول في متوسط زمن الإلوتيون13،15،19،20. في حين أن المقالات inebriometer أدت إلى تحديد الجينات والشبكات الوراثية والمسارات الخلوية المرتبطة بحساسية حساسية التأنق الكحولي وتطور التسامح12،13،14،21، فإن الفحص يستغرق وقتًا طويلاً ، ومنخفض الإنتاجية ، وغير فعال لقياس حساسية الكحول في الذباب الواحد.
الاختبارات البديلة لجرعات الايثانول التي لا تتطلب إعداد مقياس inebriometer تفصيلا تسمح لقياسات أكثر ملاءمة ولكن لا تزال محدودة في الإنتاجية وتتطلب عموما تحليلات لمجموعات من الذباب بدلا من الأفراد21,22,23,24,25.25 إن تقييم الذباب الواحد يقلل من احتمال حدوث تأثيرات محيرة بسبب التفاعلات الجماعية، مثل تلك الناجمة عن السلوكيات الاجتماعية. هنا ، نقدم فحصًا بسيطًا ومنخفض التكلفة وعالي الإنتاجية لتقييم حساسية حساسية تناول الكحول في أعداد كبيرة من الذباب الواحد.
Protocol
1- بناء جهاز الاختبار
- إنشاء قالب من الورق المقوى بحجم لوحة ثقافة الخلية 24 بئرًا عن طريق التتبع حول اللوحة على الورق المقوى والاستغناء عن المنطقة المعينة.
- قطع قطعة من شبكة شاشة الحشرات الصغيرة حجم لوحة ثقافة الخلية باستخدام قالب الورق المقوى من الخطوة 1.1.
- إعداد لوحة ثقافة الخلية 24 بئرا عن طريق وضع خط صغير من الغراء الساخن حول محيط الجزء العلوي من لوحة باستخدام بندقية الغراء الساخن ولصق شبكة الشاشة على رأس الآبار المفتوحة.
- تأمين عصا الحرفية الخشبية إلى كل من ثلاثة جوانب من لوحة ثقافة الخلية نفسها من الخطوة 1.3 باستخدام بندقية الغراء الساخن. يجب أن تشبه لوحة ثقافة الخلية المعدلة الآن الرسم التخطيطي لللوحة المعروضة في الشكل 1A والإعداد التجريبي المبين في الشكل 2.
ملاحظة: إعداد ما لا يقل عن العديد من لوحات ثقافة الخلية كما سوف يصلح في غرف التصوير (انظر أدناه).
الشكل 1: رسم بياني لجهاز الاختبار وغرفة التصوير. (أ)الرسوم البيانية العليا. يتم عرض وجهات النظر العلوية والجانبية والأمامية لجهاز الاختبار ، على التوالي. شبكة الشاشة يضع شقة على رأس لوحة ثقافة الخلية 24 بئرا. وترتبط العصي الحرفية الخشبية، التي يمثلها رؤوس الأسهم، بثلاثة جوانب متجاورة للحصول على مساعدات الاستقرار والمحاذاة، واثنين على جانب لوحة البئر مع ستة آبار وواحد على جانب اللوحة مع أربعة آبار. جميع المرفقات ساخنة لصقها على الجهاز. (ب)انخفاض الرسوم البيانية. يتم عرض طرق العرض العلوية والجانبية والأمامية لإعداد المشاهدة، على التوالي. يتم قطع شق في الجانب الأيمن من مربع، من فتح للغطاء إلى الجزء الخلفي من الفتحة، مع الجزء السفلي من مستوى الشق إلى السطح الداخلي. توسيط الثقب الموجود في الجزء العلوي من الصندوق ، وهو السطح الموازي للأرض ، للتعرض الأقصى للفيديو. يمثل المربع المعلّم كاميرا الفيديو. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: صورة لنظام الإكناوى. يتم وضع كاميرا الفيديو على رأس غرفة البوليسترين، مع العدسة إدراجها في حفرة قطع التدريجي، ويتضح في الرسوم البيانية من الشكل 1B. مجموعتين من لوحات الثقافة الخلية المعدلة 24 بئرا بقية على رأس لوحة الإضاءة التي يتم إدراجها في شق من خلال جانب الغرفة. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
2- بناء غرفة التصوير
- إنشاء غرفة تصوير عن طريق قطع حفرة في حجم عدسة كاميرا الفيديو على جانب مربع البوليسترين. قطع شق إضافي عرض لوحة الإضاءة في الجانب الآخر من مربع البوليسترين. يجب أن تشبه غرفة التصوير غرفة التصوير المعروضة في الشكل 1B والشكل 2.
- إعداد غرفة التصوير للاستخدام عن طريق إدخال لوحة الإضاءة في الشق ووضع الكاميرا في ثقب العدسة فوق لوحة الإضاءة.
- ضع جميع المواد وقم بإجراء جميع الاختبارات اللاحقة في بيئة خاضعة للرقابة ، ويفضل أن تكون غرفة سلوكية مع رطوبة 30٪ تقريبًا ، ودرجة حرارة 25 درجة مئوية ، وتدفق الهواء الموحد ، ومستويات الضوضاء أقل من 65 ديسيبل.
3. إعداد جهاز الاختبار والذباب
- Pipette 1 مل من الإيثانول 100٪ من خلال شبكة الشاشة في كل بئر.
- تجفيف شبكة الشاشة مع قطعة من قماش الجبن.
- قطع قطعتين من القماش الجبن أبعاد لوحة ثقافة الخلية باستخدام قالب الورق المقوى التي تم إنشاؤها في الخطوة 1.1. ضعها فوق شبكة الشاشة الجافة للوحة ثقافة الخلية المعدلة التي تحتوي على الإيثانول من الخطوة 3.2.
- قم بإنشاء قطعة صغيرة من لوحة القطع البلاستيكية الرقيقة والمرنة من خلال التتبع حول قالب الورق المقوى الذي تم إنشاؤه في الخطوة 1.1 كدليل عام وتوسيع المنطقة المقتبة بمقدار 1-2 سم على أحد الجوانب القصيرة. قطع المنطقة الموسعة تتبع من رقيقة ومرنة لوحة القطع البلاستيكية. بعد القطع، تأكد من أن البلاستيك لا يزال يناسب بين العصي الحرفية الخشبية الثلاثة على جهاز الاختبار، ولكن معلقة قبالة نهاية واحدة من 1-2 سم.
- (اختياري) إذا كان هناك حاجة إلى إنشاء aspirator، وتجميع الطامح مثل واحد هو مبين في الشكل 3 عن طريق قطع أول طرف P1000 ماصة في النصف. إدراج قطعة مع قطر أكبر في نهاية واحدة من ~ 30 سم قطعة من أنابيب مرنة لتكون بمثابة لسان حال.
الشكل 3: a a fly aspirator التي يتم فيها جمع الذباب مع بوق قابل للتبديل تعلق على أنابيب مرنة وpipette serological تحمل واسعة مع سدادة الشاش القطن. يمكن للمشغل أن يستنشق ذبابة واحدة في الماصة لنقلها دون تخدير. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
- (اختياري) لإكمال الجمعية الطامحة، وتغطي نهاية واسعة من قطعة 10 سم من الماصة المصلية مع الشاش لمنع الذباب من الدخول في الأنابيب وإدراج الماصة، شاش أولا، في نهاية مفتوحة من الأنابيب لتكون بمثابة غرفة ذبابة. يجب أن يشبه الطامح الذي يظهر في الشكل 3.
- باستخدام aspirator(الشكل 3، الخطوات 3.5 و 3.6) ، ونسخذبابة واحدة في البئر إلى لوحة منفصلة لثقافة الخلية 24 بئرًا. استخدم البلاستيك المرن لتغطية أي آبار تحتوي على الذباب المنتقاً سابقًا. تسجيل موقف البئر وأي معلومات ذات صلة بالنمط الجيني أو النمط الظاهري لكل ذبابة.
- عقد تدفق البلاستيك مرنة مع الجزء العلوي من لوحة ثقافة الخلية التي تحتوي على الذباب لمنع هروبهم وعكس لوحة على الجزء العلوي من لوحة ثقافة الخلية المعدلة مع الإيثانول. يجب أن تكون ورقة من البلاستيك المرن يستريح على رأس صفائح من قماش الجبن. قم بمحاذاة لوحة ثقافة الخلية المقلوبة التي تحتوي على الذباب باستخدام العصي الحرفية لضمان كل بئر مع محاذاة الإيثانول مع كل بئر يحتوي على ذبابة.
- يجب أن يشبه الإعداد التجريبي الشكل 2.
4. اختبار الذباب
- تأكد من إضاءة لوحة الإضاءة بسطوع كامل للحصول على أقصى تباين مرئي. ابدأ التسجيل باستخدام كاميرا الفيديو.
- لكشف الذباب إلى الإيثانول، قم بإزالة البلاستيك بعناية من بين لوحة البئر وجهاز الاختبار، مع الحرص على عدم إزاحة قماش الجبن.
- إنهاء تسجيل الفيديو بمجرد فقدان جميع الذباب التحكم الوضعي. بمجرد الاشتباه في أن جميع الذباب قد فقدت السيطرة الوضعية ، اضغط بقوة في وسط اللوحة لضمان أن جميع الذباب قد فقدت السيطرة الوضعية تمامًا. إذا كانت هناك حركة، استمر في التسجيل. استمر في الاستفادة بشكل دوري (كل 1-2 دقيقة) حتى لا تحدث أي حركة.
- (اختياري) لاستعادة الذباب بسرعة، قم بإزالة اللوحة العلوية فقط من جهاز الاختبار، مما يكشف عن الذباب المُحَسَس الذي يستريح على قطعة قماش الجبن. يُستنشق الذباب الفردي في حاويات مختارة للاسترداد.
- استبدل الإيثانول في لوحات ثقافة الخلايا المعدلة بـ 1 مل من الإيثانول الطازج 100% على الأقل 1x كل ساعة للتحكم في تبخر وترطيب الإيثانول والحفاظ على التعرض المستمر للإيثانول طوال فترة التعامس. تجفيف شبكة الشاشة مع قماش الجبن.
- كرر لأكبر عدد من العينات على النحو المطلوب.
ملاحظة: للحصول على أعلى إنتاجية، استنشق الجولة التالية من الذباب إلى لوحات ثقافة الخلايا الجديدة أثناء تسجيل الفيديو. يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتًا هنا ، حيث يمكن مراجعة تسجيل الفيديو لاحقًا.
5. تحديد وقت التأنق الطيران
- سجل وقت التصيد لكل ذبابة فردية من خلال مشاهدة تسجيل الفيديو. يتم تعريف وقت التأنق بأنه اللحظة التي تفقد فيها الذبابة التحكم الوضعي الكامل والقدرة الحركية. من المستحسن مشاهدة الفيلم في الاتجاه المعاكس وتسجيل الوقت الذي تبدأ فيه الذبابة في التحرك لضمان الدقة.
Representative Results
يمكن للوحتين ميكروتيتر 24 بئرا توليد بيانات في وقت واحد على 48 ذبابة فردية في غضون أقل من 10 دقيقة. الجدول 1 يسرد قياسات أوقات التأنول ل48 ذباب فردي، ذكورا وإناثا بشكل منفصل، من خطين DGRP مع حساسيات مختلفة للتعرض للكحول في وقت التنمية وقابلية البقاء13. وكانت ذبابات الخط RAL_555 أقل حساسية من خط RAL_177(الشكل 4، الجدول 2؛ p < 0.0001 ، ANOVA). لم يظهر الذكور والإناث من RAL_177 أي تأثير متحول جنسيًا(الشكل 4، الجدول 2؛ p > 0.1 ، ANOVA) ، في حين كانت الإناث من الخط RAL_555 أقل حساسية للتعرض للإيثانول من الذكور(الشكل 4، الجدول 2؛ p < 0.006 ، ANOVA). يمكن أن يزيد العدد الكبير من الذباب الذي يمكن قياسه في وقت واحد والقدرة على قياس الجنسين والخطوط المختلفة بشكل متزامن من الدقة عن طريق تقليل الخطأ بسبب الاختلاف البيئي.
| أ. | الإيثانول S s s s | ب. | الإيثانول S s s s | ||||||||||
| الاناث | الذكور | الاناث | الذكور | ||||||||||
| 414 | 365 | 477 | 423 | 568 | 309 | 937 | 742 | 622 | 460 | 331 | 498 | ||
| 201 | 384 | 498 | 411 | 523 | 626 | 791 | 619 | 197 | 467 | 455 | 562 | ||
| 228 | 364 | 333 | 440 | 403 | 267 | 504 | 744 | 513 | 570 | 582 | 506 | ||
| 440 | 416 | 404 | 408 | 422 | 384 | 970 | 540 | 369 | 865 | 533 | 492 | ||
| 888 | 283 | 285 | 322 | 369 | 287 | 595 | 550 | 606 | 392 | 544 | 345 | ||
| 1079 | 519 | 315 | 393 | 376 | 284 | 418 | 709 | 553 | 308 | 477 | 388 | ||
| 718 | 287 | 432 | 275 | 206 | 411 | 366 | 564 | 558 | 385 | 576 | 377 | ||
| 598 | 337 | 398 | 279 | 631 | 372 | 437 | 692 | 578 | 460 | 511 | 412 | ||
| 241 | 398 | 364 | 347 | 374 | 808 | 665 | 729 | 484 | 532 | 425 | 354 | ||
| 229 | 423 | 534 | 386 | 396 | 628 | 312 | 576 | 305 | 334 | 531 | 506 | ||
| 388 | 488 | 451 | 523 | 322 | 533 | 682 | 638 | 420 | 560 | 548 | 379 | ||
| 252 | 529 | 375 | 427 | 330 | 540 | 1045 | 741 | 708 | 832 | 509 | 472 | ||
| 674 | 401 | 303 | 401 | 307 | 311 | 394 | 675 | 381 | 477 | 449 | 784 | ||
| 303 | 453 | 351 | 429 | 525 | 262 | 540 | 690 | 520 | 556 | 495 | 226 | ||
| 258 | 483 | 302 | 389 | 562 | 319 | 356 | 615 | 336 | 454 | 524 | 590 | ||
| 346 | 426 | 385 | 416 | 596 | 287 | 626 | 678 | 840 | 634 | 677 | 509 | ||
الجدول 1: قياسات أوقات تقاند الإيثانول (s) من الذباب الفردي من (أ) خطوط DGRP RAL_177 و (ب) RAL_555 للجنسين المنفصلين (ن = 48).. انظر أيضا الجدول 2، الشكل 4.
الشكل 4: أوقات تناول الكحول في خطوط DGRP RAL_177 RAL_555. تمثل الأشرطة الوسائل وأشرطة الخطأ SEM (n = 48). وكانت أوقات التأنق للذباب RAL_177 أقل من تلك الخاصة بالذباب RAL_55 (p< 0.0001, ANOVA). يشار إلى نقاط البيانات الفردية في الجدول 1. ويشار في النص وفي الجدول 2إلى اختلافات إضافية ذات دلالة إحصائية بين الجنسين والأسطر. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| تحليل | مصدر الاختلاف | مدافع | Ss | F-القيمة | P-القيمة |
| نموذج كامل مجمعة | خط | 1 | 769627 | 34.869 | < 0.0001 |
| الجنس | 1 | 105001 | 4.757 | 0.0304 | |
| خط x الجنس | 1 | 86021 | 3.897 | 0.0498 | |
| الخطا | 188 | 4149491 | |||
| انخفاض نموذج الإناث | خط | 1 | 685126 | 23.58 | < 0.0001 |
| الخطا | 94 | 2730718 | |||
| انخفاض نموذج الذكور | خط | 1 | 170522 | 11.3 | 0.0011 |
| الخطا | 94 | 1418774 | |||
| انخفاض نموذج RAL_177 | الجنس | 1 | 473 | 0.023 | 0.8800 |
| الخطا | 94 | 1943741 | |||
| انخفاض نموذج RAL_555 | الجنس | 1 | 190549 | 8.12 | 0.0054 |
| الخطا | 94 | 2205751 | |||
الجدول 2:تحليلات التباين لوقت التأنيب عبر الجنس وخط DGRP. كان النموذج المستخدم Y = μ + L + L + LxS + ο، حيث μ هو المتوسط العام ، L هو التأثير الثابت لخط DGRP (RAL_177 ، RAL_555) ، S هو التأثير الثابت للجنس (ذكر ، أنثى) ، LxS هو مصطلح التفاعل (ثابت) ، وهو مصطلح الخطأ. تم استخدام النماذج Y = μ + L + ο و Y = μ + S + ο للنماذج المخفضة. الخط والجنس ، وخط العاشر الجنس التفاعل المصطلح كلها كبيرة في النموذج الكامل في α < 0.05. نماذج مخفضة حسب الجنس وDGRP خط RAL_555 كانت كبيرة أيضا في α < 0.01. انظر أيضا الجدول 1، الشكل 4. df = درجات الحرية، SS = النوع الأول مبالغ المربعات.
Discussion
هنا، ونحن نقدم طريقة بسيطة وغير مكلفة، وارتفاع الإنتاجية لتقييم وقت التأنق بسبب التعرض الإيثانول في drosophila melanogaster. على عكس العديد من الطرق الحالية ، والتي تتطلب تحليلات جماعية ، فإن هذا القول يمكّن شخصًا واحدًا من جمع بيانات وقت التأنق الفردية لـ ~ 2000 ذباب خلال فترة عمل 8 ساعة. وجدنا أن الشخص الواحد يمكن أن يسجل 48 ذبابة لوقت التأنق في حوالي 5 دقيقة. على هذا المعدل، يمكن تسجيل 2000 ذبابة في حوالي 4 ساعات، على الرغم من أن التهديف يمكن أن يتم في وقت لاحق. مع ازمنا، يتراوح وقت التأنق المسجل لمعظم الذباب من 5-15 دقيقة عند التعرض إلى 1 مل من الإيثانول بنسبة 100٪. وسيؤدي انخفاض تركيزات الإيثانول أو أحجام التسليم الأصغر إلى فترات أطول للتكبير.
تتطلب الطرق الحالية لتقييم وقت الرضاعة اختبار أعداد كبيرة من الذباب دون تمكين القياسات بسهولة على الأفراد العازبين15،16،17،18،19،20، 21،,22،23،24،25،26.2126 تعتمد العديد من المقالات الحالية للتأنس والحساسية على ST5022،23،24، النقطة الزمنية التي يتم فيها تكبير 50٪ من الذباب نتيجة التعرض للإيثانول. على الرغم من أن الحصول على ST50 لمجموعات من الذباب لم يكن الدافع الرئيسي لتطوير هذا الفحص ، فإن تسجيلات الفيديو تظهر فائدة أعلى مقارنة بالأساليب الحالية ، حيث يمكن استخدام التسجيلات للتأكد من ST50 لمجموعات الذباب المختبر ة بشكل فردي وقياس النسبة المئوية للذباب التي تفي بمعيار معين (على سبيل المثال ، فقدان التحكم الوضعي) في أي وقت. وتجدر الإشارة إلى أن تحليلات الفيديو هذه ستتطلب وقتا إضافيا.
على عكس المقالات الحالية لمفعل يُقدر، فإن الطريقة التي نصفها لا تتطلب أدوات متخصصة لإعدادها ويمكن إجراؤها في أي مختبر باستخدام مواد شائعة. باستخدام هذه الطريقة، حصلنا على أوقات تكبير موثوقة ومتسقة للذباب الفردية. ويمكن، من حيث المبدأ، توسيع نطاق الفحص لتقييم آثار التعرض لأي مادة متطايرة. ويمكن أيضا تطبيق الفحص لقياس آثار السمية الحادة للتطايرات على الحشرات الأخرى، بما في ذلك أنواع الذباب الأخرى. ويمكن استخدام بيانات وقت التأنيب الفردية لتقييم مدى التباين الفينوتيبي بين السكان، مثل DGRP.
استخدمنا شبكة شاشة الحشرات الصغيرة لمنع الاتصال المباشر مع محلول الإيثانول مع السماح بكميات كافية من أبخرة الإيثانول للوصول إلى الذبابة. توفر طبقة قماش الجبن الأبيض أعلى شبكة الشاشة تباينًا بصريًا بين الذبابة والسطح أدناه وتضمن عدم القبض على الذباب في شبكة الشاشة ، مما قد يؤدي إلى تحديد غامض لفقدان التحكم الوضعي. أعطت الأغشية المتاحة تجاريًا التي يتم اختراقها في الماء والهواء نتائج غير متسقة وكانت غير قابلة للاختراق بشكل كاف ٍ لأبخرة الإيثانول. استخدمنا عمدا شبكة شاشة الحشرات الصغيرة لأنها مادة مسامية بشكل موحد تقلل من الاختلاف في التعرض للإيثانول نتيجة لموقع الذبابة داخل البئر. يمكن إجراء تعديلات على هذا البروتوكول استنادًا إلى المواد المتاحة ، على الرغم من أننا نوصي بغرفة سلوكية خاضعة للرقابة ، والوصول إلى 90٪ - 100٪ إيثانول قريب من الذبابة ، والتعرض الموحد للإيثانول.
يجب أن يكون موضع الطيران داخل لوحات ثقافة الخلية معشاً بين النسخ المتماثل لتجنب التحيز الموضعي. بالنسبة للتجارب الأكبر التي تتطلب استخدام هذا الفحص عبر عدة أيام وبالتالي تخضع للتباين البيئي الذي يمكن أن يؤثر على نتائج الفحص (على سبيل المثال، التغيرات في الضغط البارومتري)27، نوصي بشدة باختبار الذباب في نفس الوقت كل يوم وعشوائية داخل وعبر الأيام ، خاصة إذا كانت الخطوط المختلفة و / أو الجنس يجب مقارنتها ببعضها البعض.
الطريقة التي طورناها هي الأنسب لقياس تأثير التعرض الحاد للكحول ولكنها ليست مناسبة للحصول على بيانات الاستهلاك أو إدمان النمذجة. ومع ذلك، يمكن دمج بيانات حساسية التأنق الكحولي التي تم الحصول عليها من هذا الفحص مع مقاييس أخرى للأنماط الظاهرية المرتبطة بالكحول. أحد قيود النظام هو أن الارتفاع الرأسي للوحات ثقافة الخلايا القياسية يسمح بحركة الطيران الرأسية التي لا يمكن تتبعها بسهولة عن طريق الفيديو لإجراء تقييم مفصل للنشاط العام أو الحركة. ومع ذلك، لا يؤثر هذا القيد على التقييم الدقيق لوقت التأنيب. عند استخدام الذباب من أنواع جينية مختلفة (على سبيل المثال، في المجموعات السكانية الأصيلة المشتقة من DGRP28)،تمكن هذه الإمكانية أيضًا من استرجاع الذباب الفردي لجمع برك من الذباب مع أنماط ظاهرية متناقضة لتسلسل الحمض النووي السائب ورسم خرائط QTL القصوى29،30. وعموما، يسمح هذا القول بجمع سريع وغير مكلف لبيانات تعاطي الكحول على أعداد كبيرة من الذباب الواحد.
Disclosures
وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.
Acknowledgments
وقد دعم هذا العمل من خلال المنح DA041613 وGM128974 من المعاهد الوطنية للصحة إلى TFCM وRRHA.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24-well Cell Culture Plates | Corning | 3526 | Flat-bottomed; will house flies throughout assay |
| Aspirator | |||
| Cheesecloth | Genesee Scientific | 53-100 | Widely available. |
| Ethanol | Decon Labs | V1001 | Widely available. |
| Flexible Plastic Cutting Board (Plate Cover) | Walmart | 550098612 | Any flat plastic that can slide easily and cover a 24-well plate completely. Flexible plastic cutting board works well. |
| Gauze (for aspirator) | Honeywell North | 67622 | Widely available. |
| Illumination Pad | Amazon (AGPtek) | ASIN B00YA9GP0G | Any light pad to provide contrast is suitable. |
| Jumbo Craft Sticks | Michaels | 10334892 | Any craft stick at least 7 cm long is suitable. |
| P1000 Pipette Tip (for aspirator) | Genesee Scientific | 24-165RL | Any P1000 pipette tip is suitable. |
| Serological Pipette (for aspirator) | Genesee Scientific | 12-104 | |
| Small Insect Screen Mesh | Lowe's (Saint-Gobain ADFORS) | 89322 | Any small insect screen mesh is suitable. |
| Testing Chamber | Interior space dimension big enough to encompass light pad. Can be constructed from a polystyrene box. | ||
| Tygon Tubing (for aspirator) | Grainger | 9CUG7 | Widely available. |
| Video Camera | Canon | 1959C001AA | Any video camera is suitable. |
References
- Heath, A. C., et al. Genetic differences in alcohol sensitivity and the inheritance of alcoholism risk. Psychological Medicine. 29 (5), 1069-1081 (1999).
- Schuckit, M. A., Smith, T. L. The relationships of a family history of alcohol dependence, a low level of response to alcohol and six domains of life functioning to the development of alcohol use disorders. Journal of Studies on Alcohol. 61 (6), 827-835 (2000).
- Trim, R. S., Schuckit, M. A., Smith, T. L. The relationships of the level of response to alcohol and additional characteristics to alcohol use disorders across adulthood: a discrete-time survival analysis. Alcoholism: Clinical and Experimental Research. 33 (9), 1562-1570 (2009).
- Schuckit, M. A., Smith, T. L. Onset and course of alcoholism over 25 years in middle class men. Drug and Alcohol Dependence. 113 (1), 21-28 (2011).
- Morozova, T. V., Mackay, T. F. C., Anholt, R. R. H. Genetics and genomics of alcohol sensitivity. Molecular Genetics and Genomics. 289 (3), 253-269 (2014).
- Heberlein, U., Wolf, F. W., Rothenfluh, A., Guarnieri, D. J. Molecular genetic analysis of ethanol intoxication in Drosophila melanogaster. Integrative and Comparative Biology. 44 (4), 269-274 (2004).
- Engel, G. L., Taber, K., Vinton, E., Crocker, A. J. Studying alcohol use disorder using Drosophila melanogaster in the era of 'Big Data'. Behavioral and Brain Functions. 15 (1), 7 (2019).
- Singh, C. M., Heberlein, U. Genetic control of acute ethanol-induced behaviors in Drosophila. Alcoholism: Clinical and Experimental Research. 24 (8), 1127-1136 (2000).
- Mackay, T. F. C., et al. The Drosophila melanogaster Genetic Reference Panel. Nature. 482 (7384), 173-178 (2012).
- Huang, W., et al. Natural variation in genome architecture among 205 Drosophila melanogaster Genetic Reference Panel lines. Genome Research. 24 (7), 1193-1208 (2014).
- Morozova, T. V., et al. A Cyclin E centered genetic network contributes to alcohol-induced variation in Drosophila development. G3. 8 (8), Bethesda, Md. 2643-2653 (2018).
- Morozova, T. V., et al. Polymorphisms in early neurodevelopmental genes affect natural variation in alcohol sensitivity in adult drosophila. BMC Genomics. 16, 865 (2015).
- Scholz, H., Ramond, J., Singh, C. M., Heberlein, U. Functional ethanol tolerance in Drosophila. Neuron. 28 (1), 261-271 (2000).
- Berger, K. H., Heberlein, U., Moore, M. S. Rapid and chronic: two distinct forms of ethanol tolerance in Drosophila. Alcoholism: Clinical and Experimental Research. 28 (10), 1469-1480 (2004).
- Morozova, T. V., Anholt, R. R. H., Mackay, T. F. C. Transcriptional response to alcohol exposure in Drosophila melanogaster. Genome Biology. 7 (10), 95 (2006).
- Weber, K. E. An apparatus for measurement of resistance to gas-phase agents. Drosophila Information Service. 67, 91-93 (1988).
- Weber, K. E., Diggins, L. T. Increased selection response in larger populations. II. Selection for ethanol vapor resistance in Drosophila melanogaster at two population sizes. Genetics. 125 (3), 585-597 (1990).
- Cohan, F. M., Graf, J. D. Latitudinal cline in Drosophila melanogaster for knockdown resistance to ethanol fumes and for rates of response to selection for further resistance. Evolution. 39 (2), 278-293 (1985).
- Scholz, H., Franz, M., Heberlein, U. The hangover gene defines a stress pathway required for ethanol tolerance development. Nature. 436 (7052), 845-847 (2005).
- Morozova, T. V., Anholt, R. R. H., Mackay, T. F. C. Phenotypic and transcriptional response to selection for alcohol sensitivity in Drosophila melanogaster. Genome Biology. 8 (10), 231 (2007).
- Morozova, T. V., et al. Alcohol sensitivity in Drosophila: Translational potential of systems genetics. Genetics. 83, 733-745 (2009).
- Bhandari, P., Kendler, K. S., Bettinger, J. C., Davies, A. G., Grotewiel, M. An assay for evoked locomotor behavior in Drosophila reveals a role for integrins in ethanol sensitivity and rapid ethanol tolerance. Alcoholism: Clinical and Experimental Research. 33 (10), 1794-1805 (2009).
- Sandhu, S., Kollah, A. P., Lewellyn, L., Chan, R. F., Grotewiel, M. An inexpensive, scalable behavioral assay for measuring ethanol sedation sensitivity and rapid tolerance in Drosophila. Journal of Visualized Experiments. (98), e52676 (2015).
- Urizar, N. L., Yang, Z., Edenberg, H. J., Davis, R. L. Drosophila homer is required in a small set of neurons including the ellipsoid body for normal ethanol sensitivity and tolerance. The Journal of Neuroscience. 27 (17), 4541-4551 (2007).
- Wolf, F. W., Rodan, A. R., Tsai, L. T., Heberlein, U. High-resolution analysis of ethanol-induced locomotor stimulation in Drosophila. The Journal of Neuroscience. 22 (24), 11035-11044 (2002).
- Cohan, F. M., Hoffmann, A. A. Genetic divergence under uniform selection. II. Different responses to selection for knockdown resistance to ethanol among Drosophila melanogaster populations and their replicate lines. Genetics. 114 (1), 145-164 (1986).
- Pohl, J. B., et al. Circadian genes differentially affect tolerance to ethanol in Drosophila. Alcoholism: Clinical and Experimental Research. 37 (11), 1862-1871 (2013).
- Huang, W., et al. Epistasis dominates the genetic architecture of Drosophila quantitative traits. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 15553-15559 (2012).
- Ehrenreich, I. M., et al. Dissection of genetically complex traits with extremely large pools of yeast segregants. Nature. 464 (7291), 1039-1042 (2010).
- Anholt, R. R. H., Mackay, T. F. C. The road less traveled: From genotype to phenotype in flies and humans. Mammalian Genome. 29, 5-23 (2018).
