Summary
Drosophila alkol duyarlılığını ölçmek için geçerli yöntemler sinek grupları test etmek için tasarlanmıştır. Çok sayıda tek sinekte alkol sedasyon hassasiyetini değerlendirmek için basit, düşük maliyetli, yüksek iş çıkışlı bir çalışma salıyoruz. Yöntem özel araçlar gerektirmez ve ortak malzemeler kullanılarak herhangi bir laboratuvarda yapılabilir.
Abstract
Drosophila melanogaster alkol duyarlılığı genetik temelleri incelemek için mükemmel bir model sağlar. İnsan popülasyonlarında yapılan çalışmaların aksine, Drosophila modeli genetik arka plan üzerinde sıkı kontrol sağlar, ve aynı genotip bireylerin neredeyse sınırsız sayıda düzenleyici kısıtlamalar olmadan ve nispeten düşük maliyetle iyi kontrollü çevre koşulları altında hızla yetiştirilebilir. Etanol maruz sinekler postural kontrol kaybı da dahil olmak üzere, insan alkol zehirlenmesi benzer fizyolojik ve davranışsal değişiklikler e-posta, sedasyon, ve tolerans gelişimi uğrar. Burada, tek sinekçok sayıda alkol sedasyon duyarlılığı değerlendirmek için basit, düşük maliyetli, yüksek ölçekli bir çalışma sonucu tanımlıyoruz. Test, alkole maruz kalmanın senkron başlatılmasını sağlayan bir kurulumda 24 kuyulu hücre kültür plakalarında anestezi olmadan tanıtılan tek sineklerin video kaydına dayanıyor. Sistem tek bir kişi kadar 2.000 sinekler 8 saat çalışma süresi içinde bireysel etanol sedasyon verileri toplamak için olanak sağlar. Tetki, prensipte, herhangi bir uçucu maddeye maruz kalmanın etkilerini değerlendirmek için genişletilebilir ve diğer sinek türleri de dahil olmak üzere diğer böcekler üzerinde uçucu ların akut toksisite etkilerini ölçmek için uygulanır.
Introduction
Ulusal Alkol Bağımlılığı ve Alkolizm Enstitüsü, 2015 yılında "alkol kullanım bozukluğu" olarak tanımlanan aşırı alkol tüketiminin ABD'de yaklaşık 16 milyon kişiyi etkilediğini bildirmektedir. Alkol kullanımı olumsuz fizyolojik etkileri geniş bir yelpazede neden olur ve ABD'de ölüm önemli bir nedenidir. İnsanlarda, azalmış duyarlılık, ya da alkole yanıt düşük düzeyde, güçlü bir genetik bileşeni vardır ve alkol kullanım bozuklukları geliştirme riski ile ilişkilidir1,2,3,4. İnsan popülasyonları üzerinde yapılan genetik risk çalışmaları, popülasyon karışımı, çeşitli gelişimsel geçmişler ve çevresel maruziyetler ve alkole bağlı fenomentipleri ölçmek için kendi kendine rapor edilen anketlere güvenmek nedeniyle zordur, ki bunlar genellikle diğer nöropsikiyatrik koşullarla birlikte ortaya çıkar.
Drosophila melanogaster alkol duyarlılığıgenetiktemelleri çalışmak için mükemmel bir model sağlar 5,6,7,8. Drosophila modeli genetik arka plan üzerinde sıkı kontrol sağlar, ve aynı genotip bireylerin hemen hemen sınırsız sayıda düzenleyici kısıtlamalar olmadan ve nispeten düşük maliyetle iyi kontrollü çevre koşulları altında hızla yetiştirilebilir. Genomdaki genlerin çoğunluğunu hedef alan halka açık mutasyonlara ve RNAi hatlarına ek olarak, tam genom dizilimi olan 205 inbred yabani kaynaklı çizgilerden oluşan Drosophila melanogaster Genetik Referans Paneli'nin (DGRP) kullanılabilirliği, genom çapında ilişki çalışmaları9,10'usağlamıştır. Bu tür çalışmalar etanol,11,12gelişimsel maruziyet üzerine geliştirme süresi ve canlılık üzerindeki etkileri ile ilişkili genetik ağlar tespit etmiş. Temel biyolojik süreçlerin evrimsel olarak korunması, insan ortolojilerinin uçtaki benzerlerine üst üste bindirilerek çevirisel çıkarımların çizilmesini sağlar.
Etanol maruz sinekler postural kontrolkaybı dadahil olmak üzere insan alkol zehirlenmesi benzer fizyolojik ve davranışdeğişiklikleri geçmesi 8 , sedasyon, ve tolerans gelişimi13,14,15. Drosophila alkol kaynaklı sedasyon inebriometers kullanılarak ölçülebilir. Bu sinekler,16,17,18ekleyebilirsiniz eğimli örgü bölümleri ile 122 cm uzunluğunda dikey cam sütunlar vardır. En az 50 sinekten oluşan bir grup (cinsiyetler ayrı ayrı analiz edilebilir) sütunun üst kısmında tanıtıldı ve etanol buharına maruz kaldı. Postural kontrolü kaybeden sinekler sütundan düşer ve 1 dk aralıklarla toplanır. Ortalama elüsyon süresi alkol zehirlenmesine karşı duyarlılığın bir ölçüsü olarak hizmet vermektedir. Sinekler ilk maruz iyelik ten sonra ikinci kez alkole maruz kaldığında, ortalama elüsyon süresi13,15,,19,20bir kayma belirgin olarak, tolerans gelişebilir. Inebriometer tahliller genlerin belirlenmesine yol açmıştır, genetik ağlar, ve alkol sedasyon duyarlılığı ve tolerans gelişimi ile ilişkili hücresel yollar12,13,14,21, tahlil zaman alıcı, düşük-iş ilişkisi, ve tek sineklerde alkol duyarlılığını ölçmek için etkisiz.
Alternatif etanol sedasyon tahlilleri ayrıntılı inebriometer kurulum gerektirmeyen daha uygun ölçümler için izin ama yine de iş ortalığı sınırlıdır ve genellikle bireyler yerine sinek gruplarının analizleri gerektirir21,22,23,24,25. Tek sineklerin değerlendirilmesi, sosyal davranışlardan kaynaklananlar gibi grup etkileşimleri nedeniyle kafa karıştırıcı etkiler potansiyelini en aza indirir. Burada, tek sinekçok sayıda alkol sedasyon duyarlılığı değerlendirmek için basit, düşük maliyetli, yüksek ölçekli bir çalışma teşp.
Protocol
1. Test cihazlarının yapımı
- Karton üzerindeki plakanın etrafını izleyerek ve belirlenen alanı keserek 24 kuyulu hücre kültür plakası büyüklüğünde bir karton şablon oluşturun.
- Adım 1.1 karton şablonu kullanarak hücre kültür plakası büyüklüğünde küçük böcek ekran örgü bir parça kesin.
- Sıcak bir tutkal tabancası kullanarak plakanın üst çevresine küçük bir sıcak tutkal hattı yerleştirerek ve açık kuyuların üzerine ekran örgü yapıştırarak 24 kuyulu hücre kültür plakası hazırlayın.
- Sıcak bir tutkal tabancası kullanarak adım 1.3 aynı hücre kültürü plakasının üç tarafının her birine ahşap bir zanaat çubuğu yerleştirin. Değiştirilmiş hücre kültür plakası artık Şekil 1A'da gösterilen plaka diyagramına ve Şekil 2'degösterilen deneysel kuruluma benzemelidir.
NOT: En az çekim odalarına sığacak kadar hücre kültürü plakası hazırlayın (aşağıya bakın).
Şekil 1: Test cihazlarının ve çekim odasının diyagramı. (A) Üst Diyagramlar. Test cihazının üst, yan ve ön görünümleri sırasıyla gösterilir. Bir ekran örgü 24-iyi hücre kültür plakası üstüne düz yatıyor. Ahşap zanaat sopalar, ok başları ile temsil, istikrar ve hizalama yardımı için üç bitişik tarafa bağlı, altı kuyu ile kuyu plaka tarafında iki ve dört kuyu ile plaka tarafında bir. Tüm ekler aparata sıcak yapıştırılır. (B) Alt Diyagramlar. Teşp kurulumunun üst, yan ve ön görünümleri sırasıyla gösterilir. Bir yarık kutunun sağ tarafında kesilir, kapak için açılış tan açılış arkasına, yarık seviyesinin alt iç yüzeye. Kutunun üstündeki delik, yere paralel yüzey, maksimum video pozlama için ortalanır. Gölgeli kutu video kamerayı temsil eder. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Bira sisteminin fotoğrafı. Video kamera polistiren odasının üstüne yerleştirilir, mercek kesme deliğine yerleştirilir, Şekil 1Bdiyagramlarında gösterilmiştir. Modifiye edilmiş 24 kuyulu hücre kültürü plakaları iki set odanın yan yoluyla bir yarık yerleştirilir bir aydınlatma pedi üstüne dinlenir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
2. Çekim odasının inşaatı
- Polistiren kutusunun yan tarafındaki video kamera lensi büyüklüğünde bir delik açarak bir çekim odası oluşturun. Polistiren kutusunun karşı tarafındaki aydınlatma yastığının genişliğini ek bir yarık kesin. Çekim odası Şekil 1B ve Şekil 2'degösterilen çekim odasına benzemelidir.
- Aydınlatma yastığını yarık içine yerleştirerek ve kamerayı aydınlatma yastığının üzerindeki lens deliğine yerleştirerek çekim odasını kullanıma hazırlayın.
- Tüm malzemeleri yerleştirin ve daha sonraki tüm testleri kontrollü bir ortamda, tercihen yaklaşık %30 nem, 25 °C sıcaklık, tek tip hava akışı ve 65 dB'den daha az gürültü seviyesine sahip bir davranış odası olarak gerçekleştirin.
3. Test cihazlarının ve sineklerin hazırlanması
- Pipet 1 mL% 100 etanol ekran örgü ile her kuyuya.
- Ekran örgüsünün bir parça peynir bezi ile kurutuldu.
- Adım 1.1'de oluşturulan karton şablonu kullanarak hücre kültür plakası boyutları nda iki parça peynir bezi kesin. Adım 3.2 etanol içeren değiştirilmiş hücre kültürü plaka kuru ekran örgü üstüne yerleştirin.
- Genel bir kılavuz olarak adım 1.1'de oluşturulan karton şablonun etrafında izleyerek ve izlenen alanı kısa kenarlardan birinde 1-2 cm genişleterek ince, esnek plastik kesme tahtasından küçük bir parça oluşturun. İnce, esnek plastik kesme tahtasından genişletilmiş iz alanı kesin. Kestikten sonra, plastik hala test aparatı üzerinde üç ahşap zanaat sopalar arasında uygun olduğundan emin olun, ama 1-2 cm tarafından bir ucundan kapalı asılı.
- (İsteğe bağlı) Bir aspiratör oluşturulması gerekiyorsa, ilk olarak bir P1000 pipet ucunu ikiye bölerek Şekil 3'te gösterilen gibi bir aspiratör monte edin. Bir ağızlık olarak hizmet etmek için esnek boru ~ 30 cm parça bir ucunun içine daha büyük bir çapı olan parça yerleştirin.
Şekil 3: Sineklerin esnek boruya bağlı değiştirilebilir bir ağızlık ve pamukgazlı gazlı bez durdurucu geniş bir serolojik pipet le toplandığı bir sinek aspiratör. Operatör anestezi olmadan transfer için pipet içine tek bir sinek aspire edebilirsiniz. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
- (İsteğe bağlı) Aspiratör montajını tamamlamak için, 10 cm'lik serolojik pipet parçasının geniş ucunu gazlı bezle kaplayarak sineklerin boruya girmesini önleyin ve pipeti önce borunun açık ucuna takın ve sinek odası olarak hizmet edin. Aspiratör Şekil 3'tegösterilene benzemelidir.
- Bir aspiratör kullanarak(Şekil 3, adımlar 3.5 ve 3.6), ayrı bir 24-iyi hücre kültür plaka içine iyi başına bir sinek aspire. Daha önce emişli sinekler içeren kuyuları kapsayacak şekilde esnek plastik kullanın. Her bir sineğin iyi konumunu ve ilgili genotip veya fenotip bilgilerini kaydedin.
- Onların kaçışönlemek ve etanol ile değiştirilmiş hücre kültürü plakaüstüne plaka ters sinekler içeren hücre kültürü plakaüst ile esnek plastik floş tutun. Esnek plastik levha peynir bezi levha üstüne dinlenme olmalıdır. Her kuyuda etanol ile her kuyunun bir sinek içeren her kuyuyla hizalandığından emin olmak için zanaat çubuklarını kullanarak sinekler içeren ters hücre kültür plakasını hizalayın.
- Deneysel kurulum Şekil 2'yebenzemelidir.
4. Sineklerin test edilmesi
- Aydınlatma pedinin maksimum görsel kontrast için tam parlaklıkta yandığından emin olun. Video kamera ile kayıt başlayın.
- Sinekleri etanolmaruz bırakmak için, peynir bezini çıkarmamaya özen göstererek, kuyu plakası ile test cihazları arasındaki plastiği dikkatlice çıkarın.
- Tüm sinekler postural kontrolü kaybettikten sonra video kaydını sonlandırın. Bir kez tüm sinekler postural kontrol kaybetmiş olduğundan şüphelenilir, tüm sinekler postural kontrol tam kaybı olduğundan emin olmak için plakanın ortasında sıkıca dokunun. Hareket varsa, kaydetmeye devam edin. Hiçbir hareket oluşmayana kadar periyodik olarak (her 1-2 dakikada bir) dokunmaya devam edin.
- (İsteğe bağlı) Sinekleri hızlı bir şekilde kurtarmak için, test cihazından sadece üst tabağı çıkarın ve peynir bezinin üzerinde dinlenen sakinleştirilmiş sinekleri ortaya çıkarın. Aspire bireysel kurtarma için seçilen kaplar içine uçar.
- Modifiye hücre kültürü plakalarında etanol ünevleştirilmesi ve etanolün nemlendirilmesini kontrol etmek ve tüm tayı korumak için saatte en az 100% taze %100 etanol ile değiştirin. Ekran örgüsüne peynir bezi ile kurutun.
- İstenilen sayıda örnek için tekrarlayın.
NOT: En yüksek iş için, video kaydı sırasında yeni hücre kültürü plakaları içine sinekler bir sonraki tur aspire. Video kaydı daha sonra gözden geçirilebildiği için protokol burada duraklatılabilir.
5. Sinek sedasyon süresinin belirlenmesi
- Video kaydını izleyerek her bir sinek için sedasyon süresini kaydedin. Sedasyon süresi, bir sineğin tam postural kontrolü ve lokomotor yeteneğini kaybettiği an olarak tanımlanır. Filmi tersten izlemeli ve doğruluğu sağlamak için sineğin hareket etmeye başladığı zamanı kaydetmeli.
Representative Results
İki 24-iyi mikrotiter plakaları aynı anda 48 bireysel sinekler 10 dk gibi az içinde veri üretebilir. Tablo 1 geliştirme süresi ve canlılık alkol maruz kalma farklı hassasiyetleri ile iki DGRP hatları, 48 bireysel sinekler, erkekler ve kadınlar için etanol sedasyon süreleri ölçümleri listeler13. Hat RAL_555 sinekleri hat RAL_177 daha az duyarlıydı(Şekil 4, Tablo 2; p < 0.0001, ANOVA). RAL_177 erkeklerve dişiler cinsel dimorfik etki göstermedi(Şekil 4, Tablo 2; p > 0.1, ANOVA), RAL_555 çizgi dişileri etanol maruziyetine erkeklerden daha az duyarlıydı(Şekil 4, Tablo 2; p < 0.006, ANOVA). Aynı anda ölçülebilen çok sayıda sinek ve cinsiyetleri ve farklı çizgileri eş zamanlı olarak ölçebilme yeteneği, çevresel farklılıklara bağlı hatayı azaltarak doğruluğu artırabilir.
| A. | Etanol Sedasyon Süresi (ler) | B. | Etanol Sedasyon Süresi (ler) | ||||||||||
| Kadın | Erkek | Kadın | Erkek | ||||||||||
| 414 | 365 | 477 | 423 | 568 | 309 | 937 | 742 | 622 | 460 | 331 | 498 | ||
| 201 | 384 | 498 | 411 | 523 | 626 | 791 | 619 | 197 | 467 | 455 | 562 | ||
| 228 | 364 | 333 | 440 | 403 | 267 | 504 | 744 | 513 | 570 | 582 | 506 | ||
| 440 | 416 | 404 | 408 | 422 | 384 | 970 | 540 | 369 | 865 | 533 | 492 | ||
| 888 | 283 | 285 | 322 | 369 | 287 | 595 | 550 | 606 | 392 | 544 | 345 | ||
| 1079 | 519 | 315 | 393 | 376 | 284 | 418 | 709 | 553 | 308 | 477 | 388 | ||
| 718 | 287 | 432 | 275 | 206 | 411 | 366 | 564 | 558 | 385 | 576 | 377 | ||
| 598 | 337 | 398 | 279 | 631 | 372 | 437 | 692 | 578 | 460 | 511 | 412 | ||
| 241 | 398 | 364 | 347 | 374 | 808 | 665 | 729 | 484 | 532 | 425 | 354 | ||
| 229 | 423 | 534 | 386 | 396 | 628 | 312 | 576 | 305 | 334 | 531 | 506 | ||
| 388 | 488 | 451 | 523 | 322 | 533 | 682 | 638 | 420 | 560 | 548 | 379 | ||
| 252 | 529 | 375 | 427 | 330 | 540 | 1045 | 741 | 708 | 832 | 509 | 472 | ||
| 674 | 401 | 303 | 401 | 307 | 311 | 394 | 675 | 381 | 477 | 449 | 784 | ||
| 303 | 453 | 351 | 429 | 525 | 262 | 540 | 690 | 520 | 556 | 495 | 226 | ||
| 258 | 483 | 302 | 389 | 562 | 319 | 356 | 615 | 336 | 454 | 524 | 590 | ||
| 346 | 426 | 385 | 416 | 596 | 287 | 626 | 678 | 840 | 634 | 677 | 509 | ||
Tablo 1: (A) DGRP çizgileri RAL_177 ve (B) ayrı cinsiyetler için RAL_555 ( n =48) tek tek sineklerin etanol sedasyon süreleri (s) ölçümleri. Ayrıca bakınız Tablo 2, Şekil 4.
Şekil 4: DGRP hatlarının alkol sedasyon süreleri RAL_177 ve RAL_555. Çubuklar anlamına gelir ve hata çubukları SEM (n = 48) temsil eder. RAL_177 sinekler için sedasyon süreleri RAL_55 sinekler için daha azdı (p < 0.0001, ANOVA). Tek tek veri noktaları Tablo 1'debelirtilmiştir. Cinsiyetler ve çizgiler arasındaki ek istatistiksel anlamlı farklar metinde ve Tablo 2'de belirtilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| Analysis | Varyasyon Kaynağı | Df | Ss | F-Değeri | P değeri |
| Tam Model Havuzlu | Satır | 1 | 769627 | 34.869 | <0.0001 |
| Seks | 1 | 105001 | 4.757 | 0.0304 | |
| Çizgi x Seks | 1 | 86021 | 3.897 | 0.0498 | |
| Hata | 188 | 4149491 | |||
| İndirimli Model Kadınlar | Satır | 1 | 685126 | 23.58 | <0.0001 |
| Hata | 94 | 2730718 | |||
| İndirimli Model Erkekler | Satır | 1 | 170522 | 11.3 | 0.0011 |
| Hata | 94 | 1418774 | |||
| İndirimli Model RAL_177 | Seks | 1 | 473 | 0.023 | 0.8800 |
| Hata | 94 | 1943741 | |||
| İndirimli Model RAL_555 | Seks | 1 | 190549 | 8.12 | 0.0054 |
| Hata | 94 | 2205751 | |||
Tablo 2: Cinsiyet ve DGRP hattında sedasyon süresi için varyans analizleri. Kullanılan model Y = μ + L + S + LxS + ε, burada μ genel ortalama, L DGRP hattının sabit etkisidir (RAL_177, RAL_555), S seks sabit etkisidir (erkek, kadın), LxS etkileşim terimidir (sabit) ve ε hata terimidir. İndirimli modeller için Y = μ + L + ε ve Y = μ + S + ε modelleri kullanılmıştır. Line, Sex ve Line x Seks etkileşim iline ait tüm terim α < 0.05'teki tam modelde anlamlıydı. Cinsiyet ve DGRP serisine göre azaltılmış modeller RAL_555 α < 0.01'de de önemliydi. Ayrıca bakınız Tablo 1, Şekil 4. df = serbestlik dereceleri, SS = Karelerin Türü I Toplamları.
Discussion
Burada, Drosophila melanogasteretanol maruziyeti nedeniyle sedasyon süresini değerlendirmek için basit, ucuz ve yüksek iş verme yöntemi salıyoruz. Grup analizleri gerektiren birçok mevcut yöntemin aksine, bu analiz tek bir kişinin 8 saat çalışma süresi içinde ~2.000 sinek için bireysel sedasyon süresi verilerini toplamasını sağlar. Biz tek bir kişi yaklaşık 5 dakika içinde sedasyon süresi için 48 sinek puan bulundu. Bu hızla, 2.000 sinek yaklaşık 4 saat içinde puanlanabilir, ancak puanlama daha sonra yapılabilir. Bizim tsur, çoğu sinek için kaydedilen sedasyon süresi 5-15 dakika arasında bir pozlama 1 mL 100 etanol arasında değişmektedir. Etanol veya daha küçük teslimat hacimlerinin daha düşük konsantrasyonları daha uzun sedasyon süreleri neden olacaktır.
Sedasyon süresini değerlendirmek için geçerli yöntemler, tek bireyler üzerinde ölçümleri kolayca etkinleştirmeden çok sayıda sinek test gerektirir15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26. Birçok akım sedasyon ve duyarlılık tahlilleri ST5022,23,,24, sineklerin% 50 etanol maruziyeti sonucu yatıştırıcı olduğu zaman noktası güveniyor. Sinek grupları için ST50'yi elde etmek bu testi geliştirmek için birincil motivasyon olmasa da, video kayıtları mevcut yöntemlere göre daha yüksek bir yarar göstermekte, çünkü kayıtlar, ayrı ayrı test edilmiş sinek grupları için ST50'yi tespit etmek ve belirli bir ölçüte (örn. postural kontrol kaybı) herhangi bir zaman noktasında gelen sineklerin yüzdesini ölçmek için kullanılabilir. Bu tür video analizleri ek zaman gerektireceği unutulmamalıdır.
Mevcut inebriometer tahlillerinden farklı olarak, tanımladığımız yöntem, kurulum için özel araçlar gerektirmez ve ortak malzemeler kullanılarak herhangi bir laboratuvarda gerçekleştirilebilir. Bu yöntemi kullanarak, bireysel sinekler için güvenilir ve tutarlı sedasyon süreleri elde ettik. Tetki, prensipte, herhangi bir uçucu maddeye maruz kalma etkilerini değerlendirmek için uzatılabilir. Tetki, diğer sinek türleri de dahil olmak üzere diğer böcekler üzerinde uçucu akut toksisite etkilerini ölçmek için de uygulanabilir. Bireysel sedasyon süresi verileri, DGRP gibi bir popülasyoniçindeki phenotipik varyasyonun kapsamını değerlendirmek için kullanılabilir.
Biz etanol çözeltisi ile doğrudan temas önlemek için küçük böcek ekran örgü kullanılırken etanol buharı yeterli miktarda sinek ulaşmak için izin verir. Ekran örgü üstünde beyaz peynir bezi tabakası sinek ve aşağıdaki yüzey arasında görsel kontrast sağlar ve sinek ler postural kontrol kaybı belirsiz belirlenmesine yol açabilir ekran örgü, yakalanmış alamadım sağlar. Su ve hava gözenekli ticari olarak kullanılabilir membranlar tutarsız sonuçlar verdi ve yetersiz etanol buharları için transetrable edildi. Biz kasıtlı olarak küçük böcek ekran örgü kullanılan bir kuyu içinde sinek konumu sonucu etanol maruz kalma varyasyonunu en aza indiren bir düzgün gözenekli malzemedir çünkü. Kontrollü bir davranış odası, sineğe yakın %90-%100 etanol erişimi ve tek tip etanol maruziyeti önersek de, mevcut malzemelere dayalı olarak bu protokolde değişiklikler yapılabilir.
Hücre kültür plakaları içinde Sinek konumu konumsal önyargı önlemek için çoğaltmalar arasında randomize edilmelidir. Bu tahkikatın birden çok gün içinde kullanılmasını gerektiren ve bu nedenle taht sonuçlarını etkileyebilecek çevresel farklılıklara tabi olan daha büyük deneyler için (örneğin, barometrik basınçtaki değişiklikler)27, özellikle farklı çizgiler ve/veya cinsiyetler birbirleriyle karşılaştırıldığında, sineklerin her gün aynı anda test edilmesini ve hem gün içinde hem de gün içinde rastgele yapılmasını şiddetle tavsiye ederiz.
Geliştirdiğimiz yöntem en iyi akut alkole maruz kalma nın etkisini ölçmek için uygundur, ancak tüketim verileri elde etmek veya bağımlılık modellemek için uygun değildir. Bu tözden elde edilen alkol sedasyon duyarlılık verileri, ancak, alkole bağlı fenotiplerin diğer önlemler ile entegre edilebilir. Sistemin bir sınırlama standart hücre kültürü plakaları dikey yüksekliği kolayca genel aktivite veya hareket ayrıntılı değerlendirme için video ile takip edilemez dikey sinek hareketi için izin verir. Ancak, bu sınırlama sedasyon süresinin doğru değerlendirilmesini etkilemez. Farklı genotiplerden sinekler kullanırken (örneğin, DGRP kaynaklı dış kaynaklı popülasyonlarda28),bu tetkik aynı zamanda toplu DNA sıralaması ve aşırı QTL haritalama29,30için zıt fenotipler ile sinek havuzları toplamak için bireysel sineklerin alınmasını sağlar. Genel olarak, bu titreşme tek sinekler çok sayıda alkol sedasyon verilerinin hızlı, ucuz toplama izin verir.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Bu çalışma, Ulusal Sağlık Enstitüleri'nden TFCM ve RRHA'ya da041613 ve GM128974 hibeleri ile desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24-well Cell Culture Plates | Corning | 3526 | Flat-bottomed; will house flies throughout assay |
| Aspirator | |||
| Cheesecloth | Genesee Scientific | 53-100 | Widely available. |
| Ethanol | Decon Labs | V1001 | Widely available. |
| Flexible Plastic Cutting Board (Plate Cover) | Walmart | 550098612 | Any flat plastic that can slide easily and cover a 24-well plate completely. Flexible plastic cutting board works well. |
| Gauze (for aspirator) | Honeywell North | 67622 | Widely available. |
| Illumination Pad | Amazon (AGPtek) | ASIN B00YA9GP0G | Any light pad to provide contrast is suitable. |
| Jumbo Craft Sticks | Michaels | 10334892 | Any craft stick at least 7 cm long is suitable. |
| P1000 Pipette Tip (for aspirator) | Genesee Scientific | 24-165RL | Any P1000 pipette tip is suitable. |
| Serological Pipette (for aspirator) | Genesee Scientific | 12-104 | |
| Small Insect Screen Mesh | Lowe's (Saint-Gobain ADFORS) | 89322 | Any small insect screen mesh is suitable. |
| Testing Chamber | Interior space dimension big enough to encompass light pad. Can be constructed from a polystyrene box. | ||
| Tygon Tubing (for aspirator) | Grainger | 9CUG7 | Widely available. |
| Video Camera | Canon | 1959C001AA | Any video camera is suitable. |
References
- Heath, A. C., et al. Genetic differences in alcohol sensitivity and the inheritance of alcoholism risk. Psychological Medicine. 29 (5), 1069-1081 (1999).
- Schuckit, M. A., Smith, T. L. The relationships of a family history of alcohol dependence, a low level of response to alcohol and six domains of life functioning to the development of alcohol use disorders. Journal of Studies on Alcohol. 61 (6), 827-835 (2000).
- Trim, R. S., Schuckit, M. A., Smith, T. L. The relationships of the level of response to alcohol and additional characteristics to alcohol use disorders across adulthood: a discrete-time survival analysis. Alcoholism: Clinical and Experimental Research. 33 (9), 1562-1570 (2009).
- Schuckit, M. A., Smith, T. L. Onset and course of alcoholism over 25 years in middle class men. Drug and Alcohol Dependence. 113 (1), 21-28 (2011).
- Morozova, T. V., Mackay, T. F. C., Anholt, R. R. H. Genetics and genomics of alcohol sensitivity. Molecular Genetics and Genomics. 289 (3), 253-269 (2014).
- Heberlein, U., Wolf, F. W., Rothenfluh, A., Guarnieri, D. J. Molecular genetic analysis of ethanol intoxication in Drosophila melanogaster. Integrative and Comparative Biology. 44 (4), 269-274 (2004).
- Engel, G. L., Taber, K., Vinton, E., Crocker, A. J. Studying alcohol use disorder using Drosophila melanogaster in the era of 'Big Data'. Behavioral and Brain Functions. 15 (1), 7 (2019).
- Singh, C. M., Heberlein, U. Genetic control of acute ethanol-induced behaviors in Drosophila. Alcoholism: Clinical and Experimental Research. 24 (8), 1127-1136 (2000).
- Mackay, T. F. C., et al. The Drosophila melanogaster Genetic Reference Panel. Nature. 482 (7384), 173-178 (2012).
- Huang, W., et al. Natural variation in genome architecture among 205 Drosophila melanogaster Genetic Reference Panel lines. Genome Research. 24 (7), 1193-1208 (2014).
- Morozova, T. V., et al. A Cyclin E centered genetic network contributes to alcohol-induced variation in Drosophila development. G3. 8 (8), Bethesda, Md. 2643-2653 (2018).
- Morozova, T. V., et al. Polymorphisms in early neurodevelopmental genes affect natural variation in alcohol sensitivity in adult drosophila. BMC Genomics. 16, 865 (2015).
- Scholz, H., Ramond, J., Singh, C. M., Heberlein, U. Functional ethanol tolerance in Drosophila. Neuron. 28 (1), 261-271 (2000).
- Berger, K. H., Heberlein, U., Moore, M. S. Rapid and chronic: two distinct forms of ethanol tolerance in Drosophila. Alcoholism: Clinical and Experimental Research. 28 (10), 1469-1480 (2004).
- Morozova, T. V., Anholt, R. R. H., Mackay, T. F. C. Transcriptional response to alcohol exposure in Drosophila melanogaster. Genome Biology. 7 (10), 95 (2006).
- Weber, K. E. An apparatus for measurement of resistance to gas-phase agents. Drosophila Information Service. 67, 91-93 (1988).
- Weber, K. E., Diggins, L. T. Increased selection response in larger populations. II. Selection for ethanol vapor resistance in Drosophila melanogaster at two population sizes. Genetics. 125 (3), 585-597 (1990).
- Cohan, F. M., Graf, J. D. Latitudinal cline in Drosophila melanogaster for knockdown resistance to ethanol fumes and for rates of response to selection for further resistance. Evolution. 39 (2), 278-293 (1985).
- Scholz, H., Franz, M., Heberlein, U. The hangover gene defines a stress pathway required for ethanol tolerance development. Nature. 436 (7052), 845-847 (2005).
- Morozova, T. V., Anholt, R. R. H., Mackay, T. F. C. Phenotypic and transcriptional response to selection for alcohol sensitivity in Drosophila melanogaster. Genome Biology. 8 (10), 231 (2007).
- Morozova, T. V., et al. Alcohol sensitivity in Drosophila: Translational potential of systems genetics. Genetics. 83, 733-745 (2009).
- Bhandari, P., Kendler, K. S., Bettinger, J. C., Davies, A. G., Grotewiel, M. An assay for evoked locomotor behavior in Drosophila reveals a role for integrins in ethanol sensitivity and rapid ethanol tolerance. Alcoholism: Clinical and Experimental Research. 33 (10), 1794-1805 (2009).
- Sandhu, S., Kollah, A. P., Lewellyn, L., Chan, R. F., Grotewiel, M. An inexpensive, scalable behavioral assay for measuring ethanol sedation sensitivity and rapid tolerance in Drosophila. Journal of Visualized Experiments. (98), e52676 (2015).
- Urizar, N. L., Yang, Z., Edenberg, H. J., Davis, R. L. Drosophila homer is required in a small set of neurons including the ellipsoid body for normal ethanol sensitivity and tolerance. The Journal of Neuroscience. 27 (17), 4541-4551 (2007).
- Wolf, F. W., Rodan, A. R., Tsai, L. T., Heberlein, U. High-resolution analysis of ethanol-induced locomotor stimulation in Drosophila. The Journal of Neuroscience. 22 (24), 11035-11044 (2002).
- Cohan, F. M., Hoffmann, A. A. Genetic divergence under uniform selection. II. Different responses to selection for knockdown resistance to ethanol among Drosophila melanogaster populations and their replicate lines. Genetics. 114 (1), 145-164 (1986).
- Pohl, J. B., et al. Circadian genes differentially affect tolerance to ethanol in Drosophila. Alcoholism: Clinical and Experimental Research. 37 (11), 1862-1871 (2013).
- Huang, W., et al. Epistasis dominates the genetic architecture of Drosophila quantitative traits. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 15553-15559 (2012).
- Ehrenreich, I. M., et al. Dissection of genetically complex traits with extremely large pools of yeast segregants. Nature. 464 (7291), 1039-1042 (2010).
- Anholt, R. R. H., Mackay, T. F. C. The road less traveled: From genotype to phenotype in flies and humans. Mammalian Genome. 29, 5-23 (2018).
