Summary
Astrocyter kakel hjärnbarken enhetligt, vilket gör analysen av deras komplexa morfologi utmanande på cellnivå. Protokollet som tillhandahålls här använder flerfärgsmärkning baserad på in utero-elektroporering för att peka ut kortikala astrocyter och analysera deras volym och morfologi med en användarvänlig bildanalyspipeline.
Abstract
Protoplasmic astrocyter (PrA) som ligger i mus hjärnbarken är tätt juxtaposed, bildar en till synes kontinuerlig tredimensionell matris i vuxna stadier. Hittills kan ingen immunostaining strategi peka ut dem och segmentera deras morfologi i mogna djur och under loppet av kortikogenes. När prA härstammar från stamceller som ligger i dorsala pallium och kan enkelt riktas med hjälp av in utero elektroporering av integrativa vektorer. Ett protokoll presenteras här för att märka dessa celler med den multiaddressable genomintegrerande färgen (MAGIC) Markers strategi, som förlitar sig på piggyBac/ Tol2 införlivande och Cre /lox rekombination för att stochastically uttrycka distinkt fluorescerande proteiner (blå, cyan, gul och röd) adresserad till specifika subcellulära fack. Denna strategi för kartläggning av flerfärgade öden gör det möjligt att markera på plats närliggande närliggande stamceller med kombinationer av färgmarkörer före starten av gliogenes och spåra deras ättlingar, inklusive astrocyter, från embryonala till vuxna stadier på individcellsnivå. Halvsmakande märkning uppnås genom att justera koncentrationen av elektroporerade vektorer och färgkontraster som tillhandahålls av Multiaddressable Genome-Integrating Color Markers (MAGIC Markers eller MM) gör det möjligt att individualisera astrocyter och peka ut deras territorium och komplexa morfologi trots deras täta anatomiska arrangemang. Presenteras här är ett omfattande experimentellt arbetsflöde inklusive detaljer om elektroporeringsproceduren, förvärv av flerkanaliga bildstaplar genom konfokal mikroskopi och datorstödd tredimensionell segmentering som gör det möjligt för experimenteraren att bedöma individuell PrA-volym och morfologi. Sammanfattningsvis ger elektroporering av MAGIC Markers en bekväm metod för att individuellt märka många astrocyter och få tillgång till deras anatomiska funktioner i olika utvecklingsstadier. Denna teknik kommer att vara användbar för att analysera när astrocyt morfologiska egenskaper i olika musmodeller utan att tillgripa komplexa kors med transgena reporter linjer.
Introduction
Astrocyter spelar många vitala funktioner i hjärnans utveckling och fysiologi1. Förutom sin roll vid blod- hjärnbarriären där de reglerar näringsupptag och blodflöde bidrar de aktivt till synapsbildning och funktion samtidigt som de producerar neuromodulatorer som kan förändra neuronal aktivitet och beteende2. Dessutom bidrar astrocyt dysfunktion till en mängd olika neurologiska störningar3. Astrocyter som ligger i hjärnbarken visar en utarbetad morfologi som möjliggör omfattande kontakt med neuronala processer. Dessa kontakter, väsentliga för kretsfunktion, kontrollerar också astrocyt morfogenes och synaptogenes genom cell-vidhäftningsproteiner4. Neuroforskare behöver praktiska och robusta verktyg för att undersöka astrocytutveckling och morfogenes i sina neurologiska modeller av intresse. Men på grund av den nära appositionen av astrocyter till sina grannar och deras enhetliga tredimensionella kakel, är det utmanande att peka ut när astrocyter och omfattande bedöma deras morfologi med hjälp av immunomarkörer.
För närvarande möjliggör två huvudsakliga genteknikstrategier märkning och individualisering av kortikala astrocyter på plats: sparse reporter aktivering i transgena muslinjer eller somatisk transgenes med hjälp av elektroporering av reporterplasmider. Den första strategin bygger på att odla en floxed reporter muslinje med möss som uttrycker en inducerbar form av Cre rekombinas aktiveras specifikt i astrocyter vid tamoxifen leverans (t.ex. Aldh1l1-CreERT25). Flera nackdelar är förknippade med denna strategi. För det första kräver uppfödning av transgena möss ett stort antal djur och flera analyser behövs vanligtvis för att bestämma rätt dos tamoxifen för att ge tillräckligt gles märkning av kortikala astrocyter. Analysera när astrocyt fenotyper i en genetisk mus modell av intresse kommer att kräva ännu mer avel och mus konsumtion. Dessutom, in utero tamoxifen injektion är känd för att störa förlossningen, vilket gör denna strategi svår att tillämpa för studier av de tidigaste stadierna av astrocyt utveckling. In vivo DNA-elektroporering är en alternativ tamoxifenfri strategi som förlitar sig på ett minsta antal djur6. Detta tillvägagångssätt utförs antingen i embryonala eller postnatala stadier och består av att injicera reporterplasmider i gnagarnas laterala ventriklar följt av elektriska pulser som skapar porer i cellmembranet, vilket gör det möjligt för DNA att komma in i stamceller som fodrar ventrikeln. Därefter bearbetas reportertransgenerna som bärs av de elektroporerade plasmiderna av den riktade cellmaskinen och uttrycks7. Två elektroporationsmetoder har tidigare beskrivits för att märka musen när astrocyter: 1) Postnatal Astrocyte Labeling by Electroporation (PALE), som bygger på elektroporation av 1-2 enfärgade episomala reporterplasmider i tidiga postnatala stadier4; 2) StarTrack-strategin baserad på in utero electroporation (IUE) av flera enfärgade integrativa reporterplasmider8,9,10. Även om dessa två tekniker effektivt märker PrA i hjärnbarken, presenterar de också vissa begränsningar. I sin ursprungliga version förlitar sig båda metoderna på en glial fibrillary acidic protein (GFAP) promotor för att driva uttryck i astrocyter, vilket kan vinkla märkningen mot radiell glia samt pial och reaktiva astrocyter som uttrycker GFAP starkare än normala vila PrA11,12. När det gäller PALE är andra nackdelar det sena skedet av elektroporation, vilket förhindrar märkning av tidigfödd PrA (eller de som härrör från tidiga delaminerande stamceller) och analys av tidiga stadier av astrogliautveckling och användning av episomala vektorer som späds ut genom successiva uppdelningar under den massiva spridning som PrA genomgår under den första postnatala vecka13,14. I motsats till PALE är StarTrack baserat på embryonal elektroporation av integrativa reporterplasmider som gör det möjligt att spåra bidraget från både embryonala och postnatala stamceller till PrA. Ett uppdaterat StarTrack-system som förlitar sig på ubiquitin C-promotorn (UbC-StarTrack)uppnår bredare uttryck för fluorescerande reportrar i både neuronal och glial nedstigning (astrocyter ingår) av neurala föregångare15,16,17. I sin nuvarande version är dock genomförandet av detta tillvägagångssätt komplicerat, eftersom det förlitar sig på en ekmolär blandning av 12 distinkta plasmider som uttrycker sex fluorescerande proteiner (FP) med partiell excitation och utsläppsspektra överlappning.
Presenteras här är en okomplicerad in utero elektroporationsbaserad flerfärgad märkning metod med hjälp av integrativa reporter konstruktioner drivs av en stark och brett aktiv promotor för att peka ut när astrocyter14. Dessutom tillhandahålls en enkel bildanalyspipeline med både licensierad (t.ex. Imaris) och öppen åtkomst (Vaa3D18,19,20) bildanalysprogramvara för segment astrocytterritoriell volym respektive arborization. Jämfört med de tidigare beskrivna metoderna förlitar sig denna strategi endast på 1–2 flerfärgade integrativa transgener multiaddressable genomintegrerande färgmarkörer (MAGIC-markörer eller MM21) riktade till det cytoplasmiska och (valfritt) kärncellsfacket vars uttryck drivs av en syntetisk CAG-promotor bestående av en cytomegalovirusförstärkare, kyckling β-actin promotor, och kanin β-globin skarv acceptor plats22. Detta möjliggör märkning och spårning av när astrocyter, från embryonala till sena postnatala stadier, oberoende av GFAP-uttryck14,23. Var och en av dessa transgener bär följande fyra distinkta FP: eBFP, mTurquoise2/mCerulean, EYFP och tdTomato/mCherry, som visar minimal spektral överlappning som lätt kan kringgås med 1) Sekventiell kanalförvärv; 2) Optimerad excitationskraft och insamlingsvinst; och 3) Specifika tärande filter för att samla in smala FP-utsläppsfönster. MM-strategin använder Cre/lox rekombination med en självexcisable Cre rekombinas (seCre) för att driva stokastiska uttryck av FP i en cellulär population. En enda kopia av MM transgene uttrycker FP på ett ömsesidigt uteslutande sätt, medan flera transgener ger upphov till FP-kombinationer, vilket skapar dussintals distinkta nyanser. Genomisk integration av transgenerna drivs av piggyBac (PB) eller Tol2 införlivande system24,25,26. Genom in utero-elektroporering möjliggör därför MM-verktygssatsen och den flerfärgade "mosaik" som den genererar samtidig märkning av flera angränsande närprogenitorer och spårning av deras glianedstigning, inklusive när astrocyter, under långa perioder. Färgkontraster som härrör från uttrycket av distinkt FP-tillståndsavgränsning av PrAs kontur och därefter extrahera viktig information om deras territoriella volym (med hjälp av IMARIS) och komplex morfologi (med Vaa3D). Den flerfärgade strategi som presenteras i detalj här är en bekväm och robust metod som ger snabb och enkel tillgång till den kortikala astrocytytan och morfologin hos vilda möss i olika utvecklingsstadier, och är lätt anpassningsbar för att undersöka astrocyt anatomiska funktioner i musmodeller av neurologiska sjukdomar utan att använda transgena reporterlinjer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla djurförsök som beskrivs här utfördes i enlighet med institutionella riktlinjer. Djurprotokoll har godkänts av Charles Darwin animal experiment ethical board (CEEACD/N°5).
1. Beredning av endotoxinfria plasmider för MAGIC-markörer i utero-elektroporering
- Bakteriell omvandling
- Tina DH5 alfa kompetenta celler lagrade vid -70 °C på is.
- Värm upp agarplattorna som innehåller lämpligt antibiotikum (100 μg/mL ampicillin eller 50 μg/mL kanamycin) vid 37 °C.
- Tillsätt 1 μL 5–50 ng MAGIC Markers plasmid-DNA i 10 μL tinade DH5 alfa-kompetenta celler och inkubera på is i 10 minuter utan blandning.
- För värmechocktransformationen, placera alikvoten i ett 42 °C vattenbad i 45 s, placera sedan omedelbart på is och vänta 3-5 min.
- Tillsätt 230 μL SOC-medium under sterila förhållanden och inkubera i 1 timme vid 37 °C.
- Sprid alikvotens innehåll över agarplattan och inkubera över natten vid 37 °C.
- Plasmid kultur
- Följande morgon, under sterila förhållanden, plocka upp en koloni från agarplattan och lägg den i ett 14 ml-rör som innehåller 2 ml LB-medium med lämpligt antibiotikum. Låt den inkubera för dagen vid 37 °C i en skakande inkubator vid 300 varv/min.
- I slutet av dagen frö 300 ml LB med antibiotika med hjälp av 2 ml startkultur från steg 1.2.1 och inkubera över natten vid 37 °C i en skakande inkubator vid 300 varv/min.
- Plasmid DNA-beredning
- Följande morgon fortsätter reningen av MAGIC Markers plasmid-DNA (dvs. PB-CAG-Cytbow och Tol2-CAG-Nucbow samt CAG-drivna plasmider som uttrycker PB- och Tol2-transpokalysaser och Cre rekombinas) med hjälp av ett endotoxinfritt maxiprep-kit enligt tillverkarens protokoll.
- Eluera DNA i 200 μL sterilt vatten och uppskatta dess koncentration med hjälp av en spektrofotometer före lagring vid -20 °C.
2. Förberedelse för MAGIC-markörer i utero-elektroporering (MM IUE)
- Lösningsberedning
- Värm 30 ml 0,9% saltlösning vid 37 °C i ett vattenbad och håll det varmt under hela operationen.
- Bered en plasmidblandning som innehåller PB-CAG-Cytbow och Tol2-CAG-Nucbow (slutlig koncentration, 0,8 μg/μL vardera), PB- och Tol2-transpokalar (slutlig koncentration, 0,4 μg/μL vardera), CAG-seCre (slutlig koncentration, 0,16 μg/μL) och 0,01 % snabbgrön färgämne i PBS utan Ca2+ och Mg2+.
OBS: För astrocyt anatomiska återuppbyggnad ändamål, Tol2-CAG-Nucbow konstruktion kan utelämnas. Denna plasmid är dock användbar för att skilja dubbletter av nära sammanflätade astrocyter och när du använder MAGIC Markers för att undersöka kloniska relationer mellan astrocyter14. - Bered bedövningslösning som innehåller 100 μL ketamin (100 mg/ml) och 100 μL xylazin (20 mg/ml) utspädd i 2 ml saltlösning.
- Bered smärtstillande lösning genom att späda ut 0,3 mg/ml buprenorfinbuljonglösning 1:10 i saltlösning.
- Förberedelse av operationsmaterialet
- Sterilisera de kirurgiska verktygen (se Materialförteckningen)vid hög temperatur i en glaspläderingssterilisator eller motsvarande.
- Placera en droppe elektrodgel i en 35 mm skål.
- Sätt in mikropipetten i mikroinjektorhållaren, bryt mikropipetens spets och aspirera PÅ DNA-lösningen.
- Placera en 1 μL droppe Fast Green-lösning (0,01%) i locket på en 3 cm skål och, med den som referens, justera diametern på mikropipettespetsen genom att bryta spetsen med fina tångar. Justera tryckparametern så att motsvarande storleksdroppara medel produceras av mikroinjektorn, vilket möjliggör leverans av cirka 1 μL DNA-lösning per injektion.
- Förberedelse av den gravida kvinnliga musen
- Väg RjOrl:SWISS gravid mus.
- Utför en intraperitoneal injektion med 12,5 μL per gram kroppsvikt (BW) anestesilösning. Vänta i 5 minuter och kontrollera att musen sover genom att nypa t.ex.
- När djuret inte svarar för att nypa, injicera det subkutant med 1,6 μL/g BW smärtstillande lösning.
- Tillsätt en droppe okulär gel på varje öga för att förhindra torkning under operationen och placera djurmagen på uppvärmningsplattan.
- Raka försiktigt buken, rengör den med en kudde blöt med jod och sanera det rakade området med en alkoholplatta.
- Ordna ett operationsfält genom att placera sterila kompresser runt det rakade, rengjorda och sanerade området.
3. In utero elektroporation (IUE)
- Intraventricular injektion
- Skär ett 2 cm vertikalt snitt längs mittlinjen med början i nedre delen av buken, genom huden och sedan genom den underliggande muskeln. Exponera livmoderhornen genom att försiktigt manipulera de embryonala påsarna och bedöma livmoderhalsens placering och antalet embryonala påsar på varje sida av livmoderhalsen.
- Orientera hjärnan hos E15.5 embryot som ska elektroporeras för att se bregma, lätt igenkänd som dess plats matchar med korsningen av de tre viktigaste blodkärlen som löper längs cerebrala sprickor.
- Föreställ dig en virtuell linje mellan bregma (synlig genom skallen) och ögat; introducera mikropipette mellan den virtuella linjen och den längsgående sprickan och tryck sedan på injektorns fotpedal för att leverera 1 μL DNA-lösning i den laterala ventrikeln på den riktade halvklotet.
OBS: När den injiceras på rätt plats verkar den fyllda laterala ventrikeln blå, vilket indikerar att den har fyllts med DNA-lösningen.
- Elektroporering
- Applicera elektroderna (se Materialförteckning),som tidigare doppats i elektrodgel, på båda sidor av det injicerade embryot med anoden som täcker det injicerade halvklotet. Tryck på elektroporatorns fotpedal för att leverera en serie av fyra 50 ms pulser på 35 V, var och en separerad med ett intervall på 950 ms.
- Fukta embryot med uppvärmd saltlösning.
OBS: Embryona ska hållas fuktiga med hjälp av uppvärmd saltlösning under hela operationen och livmodern ska inte torka ut. - Upprepa steg 3.1.2–3.2.2 för varje embryo.
- När alla riktade embryon har elektroporerats, byt ut livmoderhornen i buken genom att försiktigt trycka dem med tång tillbaka till sin ursprungliga position. Fyll bukhålan med uppvärmd saltlösning för att förhindra att livmodern torkar medan suturer tillverkas.
- Stäng först bukmuskeln med en kontinuerlig absorberbar sutur, och sedan huden med flera individuella stygn (~ 10) med 4-0 sutur.
- Lägg djuret i en ren bur, lägg på sidan på en ren pappershandduk och vänd djuret till andra sidan var 5-10 min tills det vaknar och börjar röra sig på egen hand.
- Utvärdera djurets tillstånd följande dag, särskilt om ett bo har gjorts.
OBS: Ingen postsurgery behandling krävs. I avsaknad av ett bo, eventuella tecken på smärta (t.ex. prostration, shaggy päls) och / eller tung blödning, bör djuret avlivas utan dröjsmål.
4. Vävnadsskörd och sektionering
- Insamling av vävnad
- Injicera fenobarbital (100 mg/kg BW) intraperitoneally för terminalbedövning vid önskad skördetid. I det här fallet var skördetiderna på postnatala (P) dagar P4, P7 och P21.
- Utför intrakardiell perfusion med kall förgjord paraformaldehydbaserad lösning.
- Dissekera ut hjärnan och placera den över natten vid 4 °C i den paraformaldehydbaserade lösningen för postfixering.
- Histologi
- Följande morgon skölj hjärnan 3x i 10 min med 1x PBS.
- Bädda in hjärnan i 3% agarose upplöst i 1x PBS.
- Skär 80 μm sektioner med en vibrerande bladmikrotom.
- Samla sektioner i en 24 brunnsplatta förfylld med 1x PBS.
- Montera sektioner i monteringsmediet (se Materialförteckningen)mellan bilden och täckglaset. Håll de monterade rutschkanorna på -20 °C för optimal fluorescerande proteinbevarande och långsiktig lagring.
5. Konfokal avbildning med flera kanaler
- Inställningar för mikroskop
- Ställ in konfigurationen av det konfokala mikroskopet för att separat excitera mCerulean/mTurquoise2, EYFP, tdTomato/mCherry med laserlinjerna 440, 515 respektive 559 nm.
- Använd ett mål på 20x 0,8 NA (eller högre NA) och justera XY-sampling och Z-stegstorlek enligt Nyquists kriterier.
OBS: Bilder som förvärvats med högre upplösning (t.ex. 60x 1,4 NA-oljemål) och dekonvolutionsalgoritmer kommer att möjliggöra återuppbyggnad av de finare detaljerna i astrocyt arbors. Experimenteraren bör dock komma ihåg att de finaste astrocytprocesserna kanske inte löses genom konventionell optisk avbildning.
- Bildförvärv
- Hitta de ljusaste astrocyterna i det elektroporerade området.
- Eftersom märkta celler som ligger nära ytan kan se ljusare ut än de som är djupare i segmentet justerar du anskaffningsinställningarna på ytcellerna för att undvika att mätta bilderna.
- Justera anskaffningsinställningarna separat för var och en av de tre kanalerna samtidigt som du ser till att undvika pixelmättnad med HiLo LUT, som visar nollvärden som blå och maximala pixelvärden som röda.
OBS: En tillräckligt balanserad bild bör bara visa några få blå och nästan inga röda pixlar. - Skaffa kaklade Z-staplar på 1 024 x 1 024 pixlar med hjälp av mikroskopets motoriserade stadium, med en 10% överlappning mellan intilliggande staplar för att därefter möjliggöra mosaikrekonstruktioner av det elektroporerade området eller intressezonen.
6. Segmentering av territoriella volymer i Astrocyte
OBS: Detta utförs med hjälp av ett kommersiellt program (t.ex. IMARIS).
-
Förberedelse av datauppsättningen
- Beskär de märkta astrocyterna inom 3D-rekonstruktionen (250 x 250 pixlar) genom att välja celler som är helt inneslutna i den bildade vävnadssektionen.
OBS: Det är också möjligt att arbeta direkt på större volymer om datorn som används kan hantera dem. - Klicka på knappen Blå yta i verktygsfältet Objekt i vyn Överträffa för att skapa en ny Surface för varje astrocyt.
- Om du vill få bättre visualiseringskontrast justerar du först de minimala och maximala färgkontrastvärdena genom att klicka på Redigera | Visa alternativet Justering av bildskärm och dra i båda handtagen. Om det behövs ändrar du kanalfärgen genom att klicka direkt på kanalnamnet i fönstret Visningsjustering för att välja en ny färg.
OBS: Fungerar företrädesvis alltid med samma färgdisplay för att förhindra visuell partiskhet. - Klicka på Redigera | Bildegenskaper för att manuellt ange voxelstorleken i mikrometrar. Om voxelstorleken inte är korrekt blir volymberäkningarna felaktiga.
- Spara de nya inställningarna.
- Beskär de märkta astrocyterna inom 3D-rekonstruktionen (250 x 250 pixlar) genom att välja celler som är helt inneslutna i den bildade vävnadssektionen.
-
Ytsegmentering
- Använd den blå ikonen för att introducera en yta. En Surface-ikon och ruta visas i scenlistan. En volymruta gör det möjligt att se/dölja datauppsättningen.
- Markera ytlinjen och klicka på Hoppa över automatisk skapande | Redigera manuellt.
- Klicka på Contour | Synlighet och klicka på Ingen. Gå sedan till vyn Markera och klicka på knappen Rita.
- Klicka på Läge för att välja ritläge.
- Använd det snabba och effektiva isoline halvautomatiska ritverktyget. Definiera cellkonturen genom att flytta muspekaren på den. Om isolineförhandsgranskningen inte matchar astrocytkonturen justerar du muspekarens position. Om du vill validera förhandsgranskningen vänsterklickar du på markeringen. Om du vill korrigera eventuella misstag använder du brädfönstret för att ta bort den aktuella Z-plankonturen eller trycker på Ctrl + Z.
- Använda segment | Position för att navigera genom Z-planen, flytta till nästa plan genom att ändra Z-planets nummer och starta en ny kontur. Börja företrädesvis från mitten av cellen och flytta sedan till extremiteterna.
- När konturer har ritats i alla Z-plan som innehåller astrocyten klickar du på Skapa yta. Innan du skapar en yta kontrollerar du att alla komponenter är anslutna. Om inte, välj de största eller anslut relevanta innan du exporterar volymdata.
- Kontrollera de kvantitativa data som visas på datapanelen och exportera statistik i kalkylbladsformat, spara volymvärde och enhet.
- Spara ytan under ett nytt namn för att komma åt den senare.
7. Spåra astrocyt arborization
Obs: Detta görs med hjälp av open access programvara Vaa3D.
- Förberedelse av datauppsättningen
- Läs in bildstacken och sök efter isolerade astrocyter eller närliggande astrocyter som visar distinkta färger.
OBS: Rekonstruktionens upplösning kan förbättras genom att öka det objektiva NA och provtagningen. I slutändan, på grund av upplösningsgränsen för konfokal mikroskopi, kan de finaste astrocytprocesserna inte spåras exakt. Försiktighet bör vidtas för att undvika översegmentering utöver upplösningen av de förvärvade bilderna. - Använd Fiji, beskär 250 x 250 pixelbild staplar runt varje astrocyt.
- Eftersom Vaa3D-spårning endast utförs på en färg väljer du en kanal och inaktiverar de andra kanalerna.
- Konvertera bilden till RGB och spara den i .tiff format.
- Läs in bildstacken och sök efter isolerade astrocyter eller närliggande astrocyter som visar distinkta färger.
- Arbor-spårning
- Öppna RGB-bilden i Vaa3D. Gå till Bild | Data | Geometri sedan bild omsampling, och justera X /Y och Z voxel storlek värden.
OBS: Vid rekonstruktion av astrocytarbor bör man vara noga med att inte spåra detaljer som är finare än den upplösning som bilderna ger. - Öppna ett 3D-fönster genom att klicka på Visualisera | 3D-visning för hela bilden. Högerklicka på en 3D-bild och välj 1-högerklicka för att definiera markör. Peka med markören i mitten av astrocyten och högerklicka sedan för att ställa in en markör.
OBS: Klicka på Escape för att få tillgång till 3D-vyn igen. - Gå till Avancerad | 3D-| Vaa3D-Neuron2-automatisk spårning.
- I det nyöppnade fönstret väljer du den kanal där plugin-programmet ska tillämpas.
- Välj ett bakgrundströskelvärde (ofta mellan 30 och 90). Anpassa detta värde för varje astrocyt om det behövs.
- Avmarkera Radie från 2D och håll auto-down-exempel och automatisk återförsäljning kontrollerad.
- Set cnn_type 3, length_thresh klockan 1 och SR_ratio 0,1.
- När du har klickatpå ok kontrollerar du att plugin-programmet automatiskt genererar två filer baserat på det ursprungliga namnet. Suffixet –ini.swc och -coordinateX–coordinateY-coordinateZ-app2.swc läggs till. Lägg manuellt till en särskiljande etikett i dessa namnfiler för att inte skriva över dem medan du fortsätter att köra plugin-programmet.
- Öppna Objekthanteraren, gå till Neuron | Linjestruktur, välj den spårade astrocyten, klicka på Visningslägeoch välj Alltid linjeläge.
- Gå tillbaka till 3D-fönstret, där ett skelett av astrocyten visas.
OBS: Om segmentering och signal inte matchar, upprepa steg 7.2.3–7.2.10 och justera tröskeln tills de gör det. Se till att ange de andra parametrarna igen när de återställs när plugin-programmet startas om. - Högerklicka på skelett och välj förstahandsval neuron | linje # 1 ... APP2_Tracing att komma åt kvantitativa mätningar som visas på ett nytt fönster Surface| Anteckning om objekt.
OBS: På grund av den begränsade upplösningen av ljusmikroskopi ger mätningar som visas under de listade objekten Antal grenar och Antal bifurcations endast en grov uppskattning av astrocyt arbor komplexitet.
- Öppna RGB-bilden i Vaa3D. Gå till Bild | Data | Geometri sedan bild omsampling, och justera X /Y och Z voxel storlek värden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Elektroporering av MAGISKA markörer i embryonala när avkomma möjliggör märkning av astrocyter från tidiga till sena stadier av hjärnbarkens utveckling (figur 1). Dessa astrocyter hittades i alla när lager i olika postnatala stadier (P4, P7, P21) som de spridda brett i hela hjärnbarken. De bedömdes med kaklade konfokala bilder förvärvade med ett mål på 20x 0,8 NA (eller högre NA) och monterades som Z-stackrekonstruktioner (figur 2). MAGIC Markers kombinatoriska märkning möjliggjorde individualisering av när astrocyter och extraktion av information om deras volym och morfologi. Med hjälp av programvaran för kommersiell bildanalys avgränsades konturen av enskilda astrocyter på varje enskild optisk del av konfokala bildstaplar för att segmentera och rekonstruera den territoriella domän som upptas av varje astrocyt (figur 3). Från samma Z-bildstaplar segmenterades den förgrenade morfologin hos utpekade kortikala astrocyter med hjälp av open access-programvaran som möjliggör extraktion av skelettet av de viktigaste astrocytprocesserna (figur 4). Dessa segmenterings- och spårningsverktyg gav en semiquantitativ bedömning av ökningen av den territoriella volymen (figur 3) och morfologisk komplexitet (figur 4) som inträffade för enskilda kortikala astrocyter från tidiga till sena postnatala stadier14. Dessa metoder visade också den heterogenitet i volym och morfologi som visas av distinkta när astrocyter i samma utvecklingsstadium, vilket illustreras i figur 2, figur 3och figur 4.
Figur 1: Schematisk representation av MAGIC Markers (MM) in utero electroporation (IUE) för att märka när avkommare och deras nedstigning under hjärnans utveckling. (A)MM-verktygslådan består av flera plasmider som kodar PB-Cytbow, Tol2-Nucbow,PB och Tol2-transpokalar och självexciserbar veckrekombinas (seCre). I MM-konstruktioner flankerar tre par inkompatibla loxplatser (loxN, lox2272och loxP)fyra distinkta FP-kodningssekvenser (EBFP2, mTurquoise2/mCerulean, EYFP, tdTomato/mCherry) och skapar ömsesidigt uteslutande möjligheter till excision vid cre-rekombination. Före Cre-åtgärden uttrycks endast den första genen (EBFP2). Efter Cre-medierad excision framkallad av seCre uttrycks antingen tdTomato/mCherry (röd FP), EYFP (grön FP) eller mTurquoise2/mCerulean (cyan FP). Samuttryck av FP från flera MAGIC Markers-kopior ger färgkombinationer i cytoplasman (PB-CAG-Cytbow) eller kärnan (Tol2-CAG-Nucbow) av märkta celler. PB och Tol2 införlivande endfeet inramning MM kassetter tillåter deras integration i arvsmassan av när föregångare när MM konstruktioner är coelectroporated tillsammans med PB och Tol2 transposaser kodning plasmider. (B–G) Grafisk illustration av IUE successiva steg inklusive laparotomy av bedövade gravida möss (B), injektion av MM plasmid blandning (C) i de laterala ventriklarna i embryona (D), leverans av elektriska pulser genom noggrant placerade pincett (E) att rikta kortikala förfäder i en av de två hjärnhalvorna (F), och suturing av gravid mus buk (G). Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 2: Efter in utero-elektroporering av MAGIC Markers toolkit hittades flerfärgade astrocyter spridda i hela hjärnbarken i postnatala stadier. IUE av plasmider som kör MM, seCre, PB och Tol2 transposases uttryck i E15.5 mus när föregångare resulterade i märkning av lager 2-3 nervceller och astrocyter vid P4, P7 och P21. Uttrycksnivå och färgpalett berodde på antalet MM-transgener integrerade i arvsmassan hos närprogenitorer. Montage av maximal intensitet projektioner från kaklade confocal bild stackar förvärvade på 80 μm sagittal hjärnsektioner. Skalbar: 200 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Segmentering av när astrocyt territoriellt område i distinkta utvecklingsstadier. Maximala intensitetsprognoser för beskurna konfokala Z-stack-inramning av enskilda astrocyter(A–F)och deras tillhörande territoriella domän segmenterad med den kommersiella programvaran(A'-F)i tre olika utvecklingsstadier: P4 (A-B, A'-B'), P7 (C-D, C'-D') respektive P21 (E-F, E'-F). Skalbar: 20 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Spårning av kortikal astrocytarborisering. Exempel på två distinkta astrocyter beskurna från konfokala Z-staplar(A-D)och rekonstruktion av deras arborization grovt segmenterade med Vaa3D (A'-D ') samlade i två distinkta utvecklingsstadier: P7 (A-B, A '-B') respektive P21 (C-D, C'-D). Skalbar: 20 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I utero-elektroporation (IUE) av MAGIC-markörer i när avkommor (figur 1) möjliggjorde märkning av astrocyter i hela den postnatala hjärnbarken i olika postnatala stadier (P4-P7-P21, figur 2). Intressant nog är IUE-stadiet inte kritiskt, eftersom elektroporering som utförs från E13.5 till E15.5 ger liknande märkningsmönster för kortikala astrocyter14. Platsen för märkta pyramidala nervceller i när parenkym varierar dock med elektroporeringsstadiet. Faktum är att IUE utförde på E15 markerar lager 2-3 nervceller medan IUE utförs på E13 etiketter pyramidala nervceller i alla när lager, från lager 5 till lager 2-36,27. Denna gemensamma märkning av när pyramidala nervceller efter MM IUE är den viktigaste begränsningen av denna metod, eftersom det förhindrar halvautomatisk segmentering av astrocyt morfologi i lager där tät neuronal märkning stör astrocyt processer erkännande. Om det skulle vara ett problem kan MM elektroporeras i postnatala stadier som i PALE. På P4 kan märkning av radiella gliafibrer som fortfarande finns i det skedet också störa Vaa3D arbor segmentering. Även om det är besvärligt, är en lösning om man vill fortsätta med astrocyt arbor återuppbyggnad i detta skede att manuellt ta bort radiella gliafibrer genom att gradvis ersätta den radiella fibersignalen med svarta pixlar runt astrocyten av intresse med Adobe Photoshop.
Trots denna begränsning är MM IUE en kraftfull teknik när den utförs på ett adekvat sätt. Några kritiska steg måste hanteras varsamt: 1) embryon måste hållas fuktiga under hela operationen och manipuleras noggrant för att öka deras överlevnad; 2) Användning av kapillärer i glas med stor diameter eller klämning av embryonala påsar för hårt kan leda till att påsen spricker och därmed embryonas död. 3) Under DNA-injektionen måste blodkärl undvikas för att förhindra blödning. 4) Hela förfarandet bör inte pågå mer än 40 minuter från anestesi till sutur för att maximera embryoöverlevnaden. 5) stress spelar en avgörande roll för IUE framgång och därför måste extra källor till stress såsom byte av bur, transport, ljud och vibrationer undvikas från 5 dagar före kirurgi till 7 dagar efter födseln för att förhindra abort och kannibalism.
Observera att experimenterare som specifikt vill rikta in sig på celler födda i ett visst skede kan använda MM-verktygssatsen utan att lägga till piggyBac- och Tol2-transposaserna så att endast de celler som föddes vid elektroporationen uttrycker kombinatoriska etiketter. En annan fördel med metoden är den flexibilitet som den ger när det gäller densiteten hos märkta celler och deras läge i olika hjärnregioner. Tätare märkning av kortikala astrocyter kan faktiskt uppnås genom att öka den totala koncentrationen av MM-transgener samtidigt som plasmidförhållandet förblir konstant (1:10-förhållande för veckrekombinas/MM-konstruktioner och 1:2-förhållande för transpoaser/MM-konstruktioner). I motsats till monokroma metoder, såsom elektroporering av enfärgade transposoner eller creelektroporering hos Ai9-möss, där förmågan att peka ut enskilda astrocyter kräver gles märkning, möjliggör färgkontraster som erbjuds av MAGIC Markers-strategin individualiseringen av astrocyter över ett brett spektrum av märkningstätheter. Dessutom tillåter positionering av elektrodsonderna i distinkta orienteringar att rikta in sig på distinkta hjärnregioner som det prospektiva striatumet (anod i ventral position, mittemot den dorsala position som krävs för att uppnå elektroporation i hjärnbarken) eller hippocampus (anod i medial position)28. Slutligen kan IUE utföras i olika mössstammar som utrasade (OF1, schweiziska) och inavlade (C57BL/6J eller N) möss, vilket öppnar vägen för användning av MM-verktygslådan i transgena djursjukdomsmodeller. För att framgångsrikt uppnå IUE hos inavlade möss bör man dock anpassa antalet pulser (tre pulser för C57BL/6 möss jämfört med fem pulser i schweiziska), spänning (30 V istället för 35 V) och smärtstillande dos (0,15 mg/mL buprenorfin stamlösning och en injicerad volym på 0,8 μL/g BW).
I jämförelse med transgen djuruppfödning eller PALE- och StarTrack-metoderna erbjuder denna metod flera fördelar. Till att börja med, i motsats till avelsstrategin, använder den få djur. Det tillåter också märkning av kortikala astrocyter sedan de tidigaste stadierna av deras utveckling, inklusive embryonala stadier, till skillnad från PALE4, som förlitar sig på postnatal elektroporering. Dessutom, i jämförelse med de tolv reporterkonstruktioner som används i StarTrack-metoden8, förlitar sig denna strategi på endast två flerfärgade transgener, vilket gör DNA-blandningsberedning och avbildning enklare. Dessutom bestäms balansen mellan de olika färgerna stochastically av MM i sig av transgenernas struktur och beror inte på blandningen av olika komponenter av experimenteraren. Dessutom kan denna strategi sträcka sig bortom enkel anatomisk hänsyn och kan framgångsrikt tillämpas för multiklonal analys av astrocytutveckling, vilket framgår av tidigare publicerat arbete14. Detta arbete, med hjälp av sällsynta färgkombinationer av cytoplasmic och nukleära markörer för att definiera när astrocyt kloner, visat att de visar omfattande variation när det gäller rumslig fördelning, strukturell organisation, antal och undertyp av genererade celler.
Kortikala astrocyter födda från MM-märkta när avkomma visade betydande färgkontrast och spred sig brett över hela hjärnbarken (Figur 2). Enkla flerkanaliga Z-stackförvärv med konfokal mikroskopi användes för att få tillgång till viktiga astrocytfunktioner som deras territoriella volym (figur 3) och deras morfologiska komplexitet (figur 4) i flera postnatala stadier. Utöver astrocyter kan denna metodik anpassas för att studera morfologin hos andra gliaceller såsom oligodendrocyter. Man bör dock komma ihåg att den begränsade upplösning som konfokal mikroskopi erbjuder endast kan ge en partiell återgivning av astrocytmorfologisk komplexitet. Medan bilder som erhållits med högre upplösning (t.ex. 63x 1,4 NA-oljemål) och dekonvolutionsalgoritmer kan användas för att rekonstruera finare detaljer om astrocyt arbors14, kan de finaste processerna inte lösas med konventionell optisk avbildning. Strategin som presenteras här kommer dock att vara av intresse att screena effektivt för en potentiell fenotyp som påverkar när astrocytvolym eller morfologi i musmodeller av neurologiska sjukdomar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Vi tackar S. Fouquet och bild- och djurkärnanläggningarna i Institut de la Vision och Institut des Neurosciences de Montpellier (MRT och RAM) för teknisk hjälp. Detta arbete stöddes av stipendier från Région Ile-de-France och Fondation ARC pour la Recherche sur le Cancer till S.C och från Université Paris-Saclay (Initiatives Doctorales Interdisciplinaires) till L.A., genom finansiering från Europeiska forskningsrådet (ERC-SG 336331, PI J. Valette) till E.H., av Agence Nationale de la Recherche enligt kontrakt ANR-10-LABX-65 (LabEx LifeSenses), ANR-11-EQPX-0029 (Equipex Morphoscope2), ANR-10-INBS-04 (Frankrike BioImaging) , av Fondation pour la Recherche Médicale (Ref. DBI20141231328), av Europeiska forskningsrådet (ERC-CoG 649117, PI J. Livet) och av ATIP-Avenir-programmet (PI K. Loulier).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.1 Bacteria transformation | |||
| Ampicillin | Euromedex | EU0400-C | |
| DH5 alpha competent cells | Fisher Scientitic | 11563117 | |
| Ice box | Dutscher | 139959 | |
| Kanamycin | Sigma | 60615 | |
| LB Agar | Sigma | L2897 | |
| SOC medium | Fisher Scientitic | 11563117 | |
| Sterile petri dish- 10 cm | Thermo Fisher | 150350 | |
| Water bath | VWR | 462-0556H | |
| 1.2 Plasmid culture | |||
| 14 ml culture tube | Dutscher | 187262 | |
| Glass erlenmeyer- 2L | Fisher Scientitic | 11383454 | |
| LB medium | Sigma | L3522 | |
| 1.3 Plasmid DNA preparation | |||
| NucleoBond Xtra Maxi Plus EF | Macherey-Nagel | 740426.10 | |
| 2.1 Preparation of the solutions | |||
| 26 G x 1/2 needle | Terumo | 8AN2613R1 | |
| 30 G x 1/2 needle | Terumo | 8AN3013R1 | |
| Fast Green | Sigma Aldrich | F7272 | |
| NaCl | VWR | 27810.295 | |
| Single-use polypropylene syringe, 1 mL | Dutscher | 50002 | |
| 2.2 Preparation of the surgery material | |||
| Adson Forceps - DeBakey Pattern- 12.5 cm | FST | 11617-12 | |
| Arched tip Forceps- 10 cm | FST | 11071-10 | |
| Glass bead sterilizer Steri 250 | Sigma | Z378569 | |
| Glass micropipette 1 mm diameter | FHC | 10-10-L | |
| Graefe Forceps - Titanium 1 mm Tips Slight Curve- 10 cm | FST | 11651-10 | |
| Graefe Forceps - Titanium 1 mm Tips Straight- 10 cm | FST | 11650-10 | |
| Iris Scissors - Delicate Straight- 9 cm | FST | 14060-09 | |
| Laboratory tape | Fisher Scientitic | 11730454 | |
| Microinjector | INJECT+MATIC | No catalog number | |
| Olsen-Hegar Needle Holder - 12 cm | FST | 12002-12 | |
| Optical fiber | VWR | 631-1806 | |
| Plastic-coated white paper | Distrimed | 700103 | |
| Signagel electrode gel | Free-Med | 15-60 | |
| Sterile Petri dish- 35 mm | Dutscher | 056714 | |
| Sterilizer, glass dry bead, Steri 250 | Sigma | Z378569 | |
| 2.3 Preparation of the pregnant female mouse | |||
| Alcohol pad | Alcomed | 1731000 | |
| Buprecare | Axience | 0.3 mg/ml | |
| Compress | tRAFFIN | 70189 | |
| Ketamine | Merial | Imalgene 1000 | |
| Ocular gel | tvm lab | Ocry-gel | |
| RjOrl:SWISS mice | Janvier Labs | ||
| Vetadine, 10% solution | Vetoquinol | 4337400113B | |
| Warming pad | Harvard Apparatus | 72-0493 | |
| Xylazine | Bayer | Rompun 2% | |
| 3.2 Electroporation | |||
| Absorbable suture Size 4-0 45 cm Suture 1-Needle 19 mm Length 3/8 Circle Reverse | Novosyn | C0068220 | |
| Electroporateur Sonidel | Sonidel | NEPA 21 | |
| Sterile transfer pipets (individually wrapped) | Dutscher | 043202S | |
| Tweezers with 3 mm platinium disk electrodes | Sonidel | CUY650P3 | |
| 4.1 Tissue harvesting and sectioning | |||
| 24-well plate | Falcon | 353047 | |
| Agarose | Lonza | 50004 | |
| Antigenfix | Microm Microtech | U/P0014 | |
| Coverslip | Dutscher | 100266 | |
| Dolethal | Vetoquinol | DOL202 | |
| DPBS (10X), no calcium, no magnesium | Fisher Scientific | 11540486 | |
| Nail polish | EMS | 72180 | |
| Slide | Dutscher | 100001 | |
| Vectashield | Vectorlabs | H-1000 | |
| Vibratome | Leica | VT1000S | |
| 5. Multichannel confocal imaging | |||
| 20X oil NA 0.85 | Olympus | ||
| Confocal Laser Scanning Microscope | Carl Zeiss | LSM880 | |
| Confocal Laser Scanning Microscope | Olympus | FV1000 | |
| Plan Apochromat 20x/0.8 M27 | Carl Zeiss | ||
| 6. Astrocyte territorial volume segmentation | |||
| IMARIS 8.3 and later versions | Bitplane | ||
| 7. Astrocyte arborization tracing | |||
| 3D Visualization-Assisted Analysis software suite (Vaa3D) | HHMI - Janelia Research Campus /Allen Institute for Brain Science |
References
- Clarke, L. E., Barres, B. A. Emerging roles of astrocytes in neural circuit development. Nature Reviews Neuroscience. 14 (5), 311-321 (2013).
- Ma, Z., Stork, T., Bergles, D. E., Freeman, M. R. Neuromodulators signal through astrocytes to alter neural circuit activity and behaviour. Nature. 539 (7629), 428-432 (2016).
- Blanco-Suárez, E., Caldwell, A. L. M., Allen, N. J. Role of astrocyte-synapse interactions in CNS disorders: Astrocyte-synapse disease. The Journal of Physiology. 595 (6), 1903-1916 (2017).
- Stogsdill, J. A., et al. Astrocytic neuroligins control astrocyte morphogenesis and synaptogenesis. Nature. 551 (7679), 192-197 (2017).
- Srinivasan, R., et al. New Transgenic Mouse Lines for Selectively Targeting Astrocytes and Studying Calcium Signals in Astrocyte Processes in Situ and In Vivo. Neuron. 92 (6), 1181-1195 (2016).
- Tabata, H., Nakajima, K. Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: visualization of neuronal migration in the developing cortex. Neuroscience. 103 (4), 865-872 (2001).
- Shimogori, T., Ogawa, M. Gene application with in utero electroporation in mouse embryonic brain. Development, Growth & Differentiation. 50 (6), 499-506 (2008).
- García-Marqués, J., López-Mascaraque, L. Clonal Identity Determines Astrocyte Cortical Heterogeneity. Cerebral Cortex. 23 (6), 1463-1472 (2013).
- Martín-López, E., García-Marques, J., Núñez-Llaves, R., López-Mascaraque, L. Clonal Astrocytic Response to Cortical Injury. PLoS ONE. 8 (9), 74039 (2013).
- Gutiérrez, Y., et al. Sibling astrocytes share preferential coupling via gap junctions. Glia. 67 (10), 1852-1858 (2019).
- Lee, Y., Messing, A., Su, M., Brenner, M. GFAP promoter elements required for region-specific and astrocyte-specific expression. Glia. 56 (5), 481-493 (2008).
- Yoon, H., Walters, G., Paulsen, A. R., Scarisbrick, I. A. Astrocyte heterogeneity across the brain and spinal cord occurs developmentally, in adulthood and in response to demyelination. PloS One. 12 (7), 0180697 (2017).
- Ge, W. P., Miyawaki, A., Gage, F. H., Jan, Y. N., Jan, L. Y. Local generation of glia is a major astrocyte source in postnatal cortex. Nature. 484 (7394), 376-380 (2012).
- Clavreul, S., et al. Cortical astrocytes develop in a plastic manner at both clonal and cellular levels. Nature Communications. 10 (1), 4884 (2019).
- Figueres-Oñate, M., García-Marqués, J., López-Mascaraque, L. UbC-StarTrack, a clonal method to target the entire progeny of individual progenitors. Scientific Reports. 6 (1), 33896 (2016).
- Figueres-Oñate, M., García-Marqués, J., Pedraza, M., De Carlos, J. A., López-Mascaraque, L. Spatiotemporal analyses of neural lineages after embryonic and postnatal progenitor targeting combining different reporters. Frontiers in Neuroscience. 9, 87 (2015).
- Figueres-Oñate, M., Sánchez-Villalón, M., Sánchez-González, R., López-Mascaraque, L. Lineage Tracing and Cell Potential of Postnatal Single Progenitor Cells In Vivo. Stem Cell Reports. 13 (4), 700-712 (2019).
- Peng, H., Ruan, Z., Long, F., Simpson, J. H., Myers, E. W. V3D enables real-time 3D visualization and quantitative analysis of large-scale biological image data sets. Nature Biotechnology. 28 (4), 348-353 (2010).
- Peng, H., Bria, A., Zhou, Z., Iannello, G., Long, F. Extensible visualization and analysis for multidimensional images using Vaa3D. Nature Protocols. 9 (1), 193-208 (2014).
- Peng, H., et al. Virtual finger boosts three-dimensional imaging and microsurgery as well as terabyte volume image visualization and analysis. Nature Communications. 5 (1), 4342 (2014).
- Loulier, K., et al. Multiplex Cell and Lineage Tracking with Combinatorial Labels. Neuron. 81 (3), 505-520 (2014).
- Niwa, H., Yamamura, K., Miyazaki, J. Efficient selection for high-expression transfectants with a novel eukaryotic vector. Gene. 108 (2), 193-199 (1991).
- Abdeladim, L., et al. Multicolor multiscale brain imaging with chromatic multiphoton serial microscopy. Nature Communications. 10 (1), 1662 (2019).
- Chen, F., LoTurco, J. A method for stable transgenesis of radial glia lineage in rat neocortex by piggyBac mediated transposition. Journal of Neuroscience Methods. 207 (2), 172-180 (2012).
- Siddiqi, F., et al. Fate Mapping by PiggyBac Transposase Reveals That Neocortical GLAST+ Progenitors Generate More Astrocytes Than Nestin+ Progenitors in Rat Neocortex. Cerebral Cortex. 24 (2), 508-520 (2014).
- Yoshida, A., et al. Simultaneous expression of different transgenes in neurons and glia by combining in utero electroporation with the Tol2 transposon-mediated gene transfer system. Genes to Cells. 15 (5), 501-502 (2010).
- LoTurco, J., Manent, J. B., Sidiqi, F. New and Improved Tools for In Utero Electroporation Studies of Developing Cerebral Cortex. Cerebral Cortex. 19, suppl 1 120-125 (2009).
- Pacary, E., et al. Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using in utero Electroporation. Journal of Visualized Experiments. (65), e4163 (2012).
