Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Vektor kompetence analyser på Aedes aegypti Myg ved hjælp af Zika Virus

Published: May 31, 2020 doi: 10.3791/61112
Automatic Translation
1,2, 1,3,4
1Institute for Human Infections and Immunity, University of Texas Medical Branch, 2Department of Pathology, University of Texas Medical Branch, 3Department of Microbiology and Immunology, University of Texas Medical Branch, 4World Reference Center for Emerging Viruses and Arboviruses, University of Texas Medical Branch

Summary

Den præsenterede protokol kan bestemme vektorkompetenceN for Aedes aegypti mygpopulationer for en given virus, såsom zika, i en indeslutningsindstilling.

Abstract

De fremlagte procedurer beskriver en generel metode til at inficere Aedes aegypti myg med zikavirus under laboratorieforhold for at bestemme infektionsraten, formidlet infektion og potentiel overførsel af virus i den pågældende myggepopulation. Disse procedurer er bredt udnyttet med forskellige ændringer i vektor kompetence evalueringer globalt. De er vigtige for at bestemme den potentielle rolle, som en given myg (dvs. arter, population, individ) kan spille i transmissionen af et givet middel.

Introduction

Vektor kompetence er defineret som evnen på niveau med arter, befolkning, og endda en individuel, af en given leddyr såsom en myg, kryds, eller phlebotomine sand flyve, at erhverve og overføre et middel biologisk med replikation eller udvikling i leddyr1,2. Med hensyn til myg og leddyrbårne vira (dvs. arbovirus) er midlet imbibed fra en viremisk vært af en kvindelig myg. Efter indtagelse skal virussen produktivt inficere en af en lille population af midgut epitelceller3, overvinde forskellige fysiologiske forhindringer som proteolytisk nedbrydning af fordøjelsesenzymer, tilstedeværelsen af mikrobiota (midgut infektionsbarriere eller MIB) og den uds sekitære pertrofisk matrix. Infektion af midgut epitel skal efterfølges af replikation af virus og eventuel flugt fra midgut ind i myggens åbne kredsløbssystem, eller hæmolymph, som repræsenterer starten af en formidlet infektion overvinde midgut flugt barriere (MEB). På dette tidspunkt virus kan etablere infektioner i sekundære væv (f.eks nerver, muskler, og fedt organer) og fortsætte med at replikere, selv om en sådan sekundær replikation kan ikke være strengt nødvendigt for virus til at inficere acinare celler i spytkirtlerne (overvinde spytkirtel infektion barriere). Udgang fra spytkirtlen acinar celler i deres apikale hulrum og derefter bevægelse ind i spytkanalen muliggør podning af virus i efterfølgende værter på bidende, og fuldfører transmission cyklus1,2,4,5,6,7.

I betragtning af denne velkarakteriseret og generelt bevarede mekanisme for spredning inden for en myg vektor, laboratorie vektor kompetence vurderinger er ofte metodisk ens, selv om forskelle i protokoller findes1,2. Generelt, efter oral virus eksponering, myg dissekeres, således at individuelle væv såsom midgut, ben, æggestokke, eller spytkirtler kan analyseres for virusinfektion, formidlet infektion, formidlet infektion / potentielle transovarial transmission, og formidles infektion / potentiel transmission kompetence, henholdsvis8. Den blotte tilstedeværelse af en virus i spytkirtlerne er imidlertid ikke endelige beviser for overførselsevne, da der er tegn på en spytkirteludgang / udgangsbarriere (SGEB) i nogle vektor / viruskombinationer1,2,4,5,7,9. Standardmetoden til at bevise transmissionskompetence forbliver myggeoverførsel til et modtageligt dyr10,11,12. Men i betragtning af, at for mange arbovirus dette nødvendiggør brugen af immunkompromitterede murin modeller13,14,15,16, denne metode er ofte omkostnings-uoverkommelige. Et almindeligt anvendt alternativ er indsamlingen af myg spyt, som kan analyseres ved omvendt transskription-polymerase kædereaktion (RT-PCR) eller en smitsom analyse for at påvise tilstedeværelsen af den virale genom eller infektiøse partikler, henholdsvis. Det er værd at bemærke, at sådanne in vitro spyt indsamling metoder kan overvurdere12 eller undervurdere17 mængden af virus deponeret under in vivo fodring, hvilket indikerer, at sådanne data skal fortolkes med forsigtighed. Ikke desto mindre er in vitro-metoden meget værdifuld, når den analyseres ud fra den blotte tilstedeværelse af virus i spyt, hvilket indikerer transmissionspotentiale.

To vigtige tilgange findes til bestemmelse af myg vektorer i arboviral sygdom udbrud. Den første metode involverer feltovervågning, hvor myg indsamles i forbindelse med aktiv transmission18,19,20,21,22,23,24. Men i betragtning af at infektionsraterne typisk er ret lave (f.eks. kan den anslåede infektionsrate på 0,061 % af myg i områder med aktiv zikavirus (ZIKV) i USA21), inkriminering af potentielle vektorarter være stærkt forudindtaget ved at fange metode25,26 og tilfældig tilfældighed (f.eks. prøveudtagning af en inficeret person ud af 1.600 ikke-inficerede)21 . Under hensyntagen til dette kan en given undersøgelse ikke erhverve tilstrækkelige myg i både rå tal eller artsdiversitet til nøjagtigt at prøve myg, der er involveret i transmission. I modsætning hertil foretages vektorkompetenceanalyser i laboratorieindstilling, hvilket giver mulighed for streng kontrol af parametre som oral dosis. Selv om disse laboratorievurderinger ikke fuldt ud er i stand til at repræsentere den sande kompleksitet af myggeinfektion og transmissionskapacitet i en feltindstilling, forbliver de stadig kraftfulde værktøjer inden for arbovirologi.

Baseret på forskellige vektorkompetenceanalyser med ZIKV i flere myggearter, populationer og metoder27,28,29,30,31,32samt en nylig gennemgang af vektorkompetencevurderinger1beskriver vi her flere af protokollerne forbundet med en typisk vektorkompetencearbejdsgang. I disse forsøg blev tre Ae. aegypti-populationer fra Amerika (byen Salvador, Brasilien, Den Dominikanske Republik og den nedre Rio Grande Valley, TX, USA) udsat for en enkelt stamme af ZIKV (Mex 1-7, GenBank Accession: KX247632.1) ved 4, 5 eller 6 log10 fokusdannende enheder (FFU)/mL doser i form af kunstige blodmel. Efterfølgende blev de analyseret for tegn på infektion, formidlet infektion og overførselskompetence efter forskellige tidspunkter med ekstrinsisk inkubation (2, 4, 7, 10 og 14 dage) ved hjælp af dissektion og en cellekulturbaseret infektiøs analyse. Selvom den nuværende arbejdsgang/protokoller er optimeret til ZIKV, kan mange elementer oversættes direkte til andre myggebårne arbovirus i leddyrs indeslutning og biosikkerhedsniveau 2 og 3 (ACL/BSL2 eller ACL/BSL3).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle procedurer, der udføres i disse protokoller, blev udført i fuld overensstemmelse med protokoller, der blev godkendt af den institutionelle biosikkerhedskomité og den institutionelle dyrepleje- og brugskomité ved University of Texas Medical Branch i Galveston.

1. Forstærk ZIKV i Vero-celler

  1. Grow Vero-celler (CCL-81 eller VeroE6) i Dulbeccos modifikation af Eagles minimale essentielle medium (DMEM) suppleret med henholdsvis 10 % v/v varmeinaktiveret fosterkvægsserum (FBS) og 1 % (v/v) penicillin-streptomycin (henholdsvis 100 U/mL og 100 μg/mL) i en befugtet 37 °C inkubator med 5% CO2 til mellem 80−90% sammenløb i en 150 cm2 vævskultur kolbe.
  2. I et biosikkerhedskab (BSC) fjernes mediet og bortskaffes i enten 10% blegemiddel eller en fungerende fortynding af dobbelt quaternary ammonium (Materialetabel). Umiddelbart vaccinere monolayer med 1 mL af viral bestand, sigter mod 0,1−1 infektiøs viral partikel pr celle. Omrør kolben straks således, at inoculum kontakter monolayer i sin helhed.
  3. Fyld mediet op til et volumen på 5 mL ved hjælp af DMEM suppleret med 2% v/v varmeinaktiveret FBS og 1% (v/v) penicillin-streptomycin. Flyt derefter kolben ind i den befugtede 37 °C inkubator med 5% CO2 i 60 min.
  4. Fjern kolben fra inkubatoren og bring den ind i en BSC. Tilføj yderligere medium til en samlet volumen på 15 mL ved hjælp af DMEM suppleret med 2% v / v varmeinaktiveret FBS, og 1% (v / v) penicillin-streptomycin. Kolben flyttes ind i en befugtet 37 °C inkubator med 5 % CO2.
  5. Undersøg kolben dagligt under fase kontrastmikroskopi for tegn på cytopatiske virkninger (CPE). Fortsæt til virushøsten (trin 1.7), når kun ca. 40−50% af cellerne forbliver i monolag, generelt 3−5 dage efter infection afhængigt af stammen af ZIKV, der anvendes.
  6. Aspirere supernatant og sted i en 50 mL konisk hætteglas. Tydeliggør supernatanten af cellulær snavs ved centrifugering (3.500 x g i 20 min).
    BEMÆRK: Hvis flere kolber blev inficeret ens, kan supernatanter fra flere kolber kombineres i 50 mL koniske rør.
  7. Fjern supernatanten fra det 50 mL koniske rør til et nyt, og pas på ikke at forstyrre pelleten. Supernatanten suppleres med varmeinaktiveret FBS til en endelig koncentration på 30% (v/v). Hvis denne blanding hælder denne blanding i de enkelte skruehætterør, og den fryses ved -80 °C, indtil den anvendes.

2. Fremstilling af kunstige blodmel

  1. På dagen skal myg udsættes for smitsomme blodmel, tænde for strømkilden (Materialetabel) i et leddyrs indeslutningsanlæg, så fodringsenhederne (Materialetabel) forvarmes, når myggene er forberedt til eksponering.
  2. Forbered kunstige blodmel ved hjælp af en af de metoder, der er beskrevet nedenfor.
    1. Metode 1: Kombiner friskhøstet (inden for en uge) citrated eller hepariniseret humant blod købt kommercielt 1:1 v/v med viral bestand (fremstillet som beskrevet i afsnit 1).
      BEMÆRK: Denne metode er betinget af, at der ikke er antistoffer mod, at virus-/virusfamilien er til stede i blodet.
    2. Hvis fravær af antistoffer ikke kan bekræftes, eller blodkilden er kendt for at have forudgående flavivirus eksponering, vask og manuelt pack erythrocytter.
      1. I en BSC tilsættes 30 mL fuld humant blod til et 50 mL konisk rør og top op til 50 mL med fosfatbufferet saltvand (PBS).
      2. Centrifuge ved 3.500 x g i 20 min.
      3. Aspirere supernatant enten ved forsigtigt at hælde i en bakke pan indeholder enten 10% blegemiddel eller arbejder fortynding af dobbelt quaternary ammonium, passe på ikke at kassere erythrocyt pellet.
      4. Tilsæt 10 mL PBS og tryk forsigtigt bunden af det koniske rør mod bunden af BSC, så erythrocyt pellet er blevet rekonstitueret. Medbring affjedringen op til 50 mL med PBS. Bland af blid inversion.
      5. Gentag trin 2.2.2.1−2.2.2.4 i alt 4−6x. Bekræft, at supernatanten er klar eller kun lidt lyserød og ikke længere uigennemsigtig. Fjern alt supernatanten ved hjælp af en serologisk pipette. Resuspend erythrocyt pellet i 1−2 mL PBS.
      6. Saml blodmel: 350 μL emballerede erythrocytter, 100 μL på 10% saccharose, 200 μL varmeinaktiveret FBS, 900 μM rekombinant ATP og 2 mL passende fortyndet viruslager ved hjælp af DMEM suppleret med 2% v/v varmeinaktiveret FBS og 1% (v/v) penicillin-streptomycin.
  3. Overlejre en standard 3 mL reservoir enhed (Tabel over materialer) med huden af en ikke-inficeret mus (andre muligheder omfatter paraffin film, kollagen membraner, eller pølse kabinet).
  4. Placer det overdækkede reservoir på hvide papirhåndklæder. Tilsæt ~2 mL infektiøs blodmel til reservoiret 1 mL ad gangen. Undersøg håndklædet under føderen for tegn på lækage. Hvis der er lækager til stede, skal blodmelet genvindes fra fødefoderne og kassere dækslerne. Forsegl fødefoderne med stik. Endnu en gang bekræfte, at ingen lækager er til stede.

3. Backtitration af blodmel/plak assay

  1. Ved hjælp af den resterende mængde af det brændte blodmel skal du udføre en 10x seriel fortyndingsserie (dvs. 6 fortyndinger, der spænder fra fortyndet 10x til 1.000.000x) ved hjælp af DMEM suppleret med 2% v /v varmeinaktiveret FBS og 1% (v/v) penicillin-streptomycin.
  2. Aliquot 100 μL af fortyndingerne i brøndene på 24 eller 12 brøndplader fra de mest fortyndede til mest koncentrerede.
  3. Inkuberes i 1 time i en 37 °C, 5% CO2 inkubator.
  4. Ved afslutningen af inkubationsperioden på 1 time bringes pladerne tilbage i BSC og tilsættes 1 mL eller 2 mL methylcelluloseoverlejring til de 24 brønd- eller 12 brøndplader tilsvarende.
  5. Læg overlejrede plader tilbage i en 37 °C, 5 % CO 2-inkubator, og inkuber i 3−7 dage (virusstammeafhængig).
  6. Efter inkubation fjernes pladerne fra inkubatoren og bringes ind i BSC. Kassér methylcelluloseoverlejringen i en bakkepande, der indeholder 10% blegemiddel eller dobbelt quaternary ammonium desinfektionsmiddel.
  7. Vask hver brønd 2x med PBS, kassere vask i en bakke pan indeholder 10% blegemiddel eller dobbelt quaternary ammonium.
  8. Tilsæt ~1 ml methanol:acetone (1:1 v:v) og lad cellerne fastgøres på pladen i mindst 30 min i BSC ved stuetemperatur (RT). Kassér methanol:acetone i henhold til den institutionelle politik for organisk affald.
  9. Visualiser ZIKV ved hjælp af en af to metoder, der er beskrevet nedenfor.
    1. Efter fjernelse af methanol:acetone, plet straks med en krystal violet opløsning (0,25% w / v i 30% methanol) i 5 min. Skyl 2x i postevand og lad det tørre, og visualiser derefter direkte med øjet for tegn på plaques eller ødelæggelse af monolag.
    2. Alternativt kan du udføre fokus danner assay.
      1. Lad pladerne lufttørre, indtil der ikke er noget organisk fiksativ tilbage.
        BEMÆRK: Dette skal tage ~2−3 timer uden for BSC, men kan accelereres ved lufttørring i en BSC eller kemisk røghætte.
      2. Vask hver brønd 3x i 15 min hver i nonsterile PBS (Mg2 + og Ca2 + gratis) på en orbital plade rocker. Fjern PBS og tilsæt 1 mL blokeringsopløsning (PBS + 3% FBS) til hver brønd og sten i 15 minutter på RT.
      3. Der tilsættes 100 μL pr. brønd af α-ZIKV eller α-flavivirus primærantistof (f.eks. flavivirusgruppen hybridoma D1-4G2-4-15 [4G2]) ved en fortynding i en 1:2.000 fortynding ved blokeringsopløsning. Inkuberes med vuggende i mindst 4 timer (helst natten over, ikke over 18 timer) ved RT.
      4. Fjern det primære antistof og vask 3x i 15 min hver med PBS (Mg2 + og Ca2 + gratis) på en orbital plade rocker.
      5. Der tilsættes 100 μL pr. brønd af det sekundære antistof (ged α mus, HRP-mærket) fortyndet 1:2.000 i blokerende buffer. Inkuber med vuggende i 1 time på RT.
      6. Vask 3x i 15 min hver med PBS (Mg2 + og Ca2 + gratis) på en orbital plade rocker.
      7. Aliquot 100 μL substratudviklingsreagens (Materialetabel) pr. Brønd. Rockplader på RT i 15 minutter.
      8. Stop reaktionen ved udvikling af foci/plaques ved at fjerne substratet og skylle pladerne 2x med postevand. Hæld vand fra hanen og lad pladerne lufttørre, før du kvantificerer.
      9. Tæl viral foci for at bestemme antallet af FFU til stede i den givne prøve.

4. Administration af blodmel

  1. Brug Ae. aegypti myg 2−4 dage efter eclosion. Sorter kvindelige myg i 0,5 L papkartoner med screenede låg og fratage dem sukker (generelt 36−48 timer før det smitsomme blodmel). Giv ad libitum vand via vandmættede vatkugler.
  2. Fjern de vandmættede bomuldskugler om morgenen, at myggene vil blive udsat for det smitsomme blodmel.
  3. Fastgør reservoirer, der indeholder kunstige blodmel til fodring enhed fører i en klar plast handske boks.
  4. Inden for handskerummet placeres en 0,5 L papkarton med et screenet låg, der indeholder 50−100 udsultede Ae. aegypti myg, under fødeenheden fastgjort til reservoiret.
    BEMÆRK: Passende udsultede myg vil generelt fodre inden for 20 minutter. Fodring kan forlænges efter behov for at øge prøvestørrelsen i langsommere populationer, selv om dette ikke bør strække sig ud over 60 min, fordi (ZIKV) viral titer kan falde i føderen efter ~ 60 min.
  5. Efter afslutningen af fodring skal du fjerne reservoiret og nedsænke i frisklavet 10% blegemiddel.
  6. Koldbedøvelse myg ved inkubation i 30 s ved -20 °C eller i 5 min i køleskab.
  7. I handskerummet hældes myggene i en petriskål på is. Tæl og sorter de engorged hunner fra ikke-gorgede myg. Kassér de ikke-gorgede myg ved nedsænkning i et 50 mL rørrør fyldt med 70% ethanol. Mens myggene stadig bedøves, hæld dem tilbage i 0,5 L papkartonen og dæk hurtigt med skærmen og låget. Trim overskydende skærmnet ud af kartonen og fastgør masken med tape.
  8. Tilsæt en bomuldskugle mættet med steril filtreret 10% vandig saccharose til skærmen på hver karton. Placer alle myggekartoner i en stor plastik sekundær beholder med en fugtig svamp for at opretholde fugtigheden.
  9. Placer sekundær beholder, der indeholder kartoner af myg, i en inkubator med en temperatur på 27 ± 1 °C (eller i givet fald for at simulere forhold i interesseområde) med 80 % ± 10 % relativ luftfugtighed og en 16:8 lys:mørk cyklus). Vedligehold myggene med ad libitum adgang til 10% saccharose indtil afslutningen af forsøgene.

5. Erhvervelse og forarbejdning af stikprøver

  1. På bestemte dage efterfeeding aspirerer et forudbestemt antal myg fra de relevante kartoner ved hjælp af en mekanisk aspirator i en handskeboks. Cap indsamlingsrøret med en bomuldsrunde, efter at det nødvendige antal myg er erhvervet.
  2. Mygenemytter, der bedøves koldt, ved inkubation i 30 sekunder ved -20 °C eller i 5 minutter ved 4 °C.
  3. I handskerummet hældes myggene i en petriskål på is. Brug to par sammenkædninger, fjern alle seks af hver myg ben og sted i en prælabeled 2 mL runde bund mikrocentrifuge rør, der indeholder en steriliseret rustfrit stål kugleleje (7/32") og 500 μL af myg indsamling medier (MCM) bestående af DMEM, 2% FBS, 1% penicillin-streptomycin, og 2,5 μg/mL amphotericin.
  4. Placer forsigtigt myggen på en dråbe mineralsk olie for at begrænse den og sørge for ikke at tillade nogen kontakt mellem olien og myggens hoved og proboscis.
  5. Sæt myggesnabel i en 10 μL pipettespids fyldt med 10 μL varmeinaktiveret FBS.
    BEMÆRK: Alternativt kan pipetten fyldes med saccharose, blod eller mineralsk olie. Olien giver mulighed for direkte visualisering af spytbobler via lysmikroskopi.
  6. Lad myggen savle i 30 minutter. Skub mikropipettespidsen, der indeholder FBS + spyt, ud i et mikrocentrifugrør, der indeholder 100 μL MCM, og læg derefter slagtekroppen i et separat 2 mL rundt mikrocentrifugerør, der indeholder et steriliseret stålkugleleje og 500 μL MCM. Sørg for, at de rør, der anvendes til organer, ben og spyt er mærket, så det er klart, at alle tre prøver stammer fra den samme myg.
  7. Mens myggen (e) savler, skal du udføre trin 5.3−5.5 på de resterende myg.
  8. Transport af rør, der indeholder kroppe og ben, til en perlefræseringsvævs homogeniseringsanordning, der er indeholdt i en BSC. Triturere alle krops- og benprøver ved 26 Hz i 5 minutter for at frigøre viruspartikler ind i supernatanten. Afklare alle prøver ved centrifugering ved 200 x g i 5 min til pellet cellulære vragrester.
    BEMÆRK: På dette tidspunkt kan prøverne fryses ved -80 °C eller analyseres med det samme.

6. Påvisning af ZIKV ved infektiøs analyse

  1. I en BSC, forberede 24 godt væv kultur plader med Vero celler (105 celler pr godt) 24 timer før starten af den smitsomme analyse. Mærk hver brønd med identiteten af en enkelt myg / prøve.
  2. Hvis prøverne blev frosset ved -80 °C, skal du lade optø.
  3. Fjern mediet fra Vero-cellepladerne før podning med prøver en plade ad gangen.
  4. For prøver, der indeholder kroppe eller ben, skal du forsigtigt aliquot 100 μL af afklaret supernatant i hver brønd, idet der tages hånd om ikke at forstyrre myggecellerester fra pellet.
    BEMÆRK: Spytprøver kan fortyndes 1:1 (v/v) med MCM før podning på celler for at spare prøver til senere titrering, hvis det er nødvendigt.
  5. Bevæg pladerne i en 37 °C, 5% CO2-inkubator og inkuber i 1 time.
  6. Returner pladerne til BSC og tilsæt ~ 1 mL methylcellulose overlay til hver brønd. Anbring de overlejrede plader tilbage i en 37 °C, 5 % CO2-inkubator og inkuber i 3−7 dage (virus-/stammeafhængig).
  7. Udfør fiksering og visualisering som beskrevet i trin 3.6−3.9.
  8. Med hensyn til scoring via et fokus danner assay, kvantificere de positive brønde ved undersøgelse under et let mikroskop. Påvisning af intracytoplasmisk farvning af celler i en brønd indikerer tilstedeværelsen af virus. Prøverne er udelukkende scoret som fokus-positive eller -negative.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Tre populationer af Ae. aegypti fra Amerika (Salvador, Brasilien, Den Dominikanske Republik, og Rio Grande Valley, TX, USA) blev udsat for et udbrud stamme af ZIKV fra Amerika (ZIKV Mex 1-7, Chiapas Stat, Mexico, 2015) over en række blodmeal titers (4, 5, og 6 log10 FFU / mL) præsenteret i en vasket menneskelig erythrocyt-baserede kunstige blodmel. På dag 2, 4, 7, 10 og 14 postinfection blev delmængder af myg behandlet for at bestemme infektion, spredning og potentielle transmissionsrater.

Ved en blodmels titer på 4 log10 FFU/mL zikv Mex 1−7, Ae. aegypti fra Salvador, Brasilien blev smittet med hastigheder på 12,5% og 11,1% efter henholdsvis 4 og 14 dages ekstrinsisk inkubation, uden tegn på formidlet infektion observeret i de analyserede ben, og ingen virus opdaget i spyt (Figur 1a). Forøgelse af titer til 5 log10 FFU/ mL resulterede i en marginal stigning i infektionsevne med satser på henholdsvis 22,2%, 33,3% og 22,2% på dag 4, 10 og 14 postinfection. I lighed med det, der blev observeret i den kohorte, der blev eksponeret for 4 log10 FFU/mL, blev der ikke observeret nogen spredte infektioner eller transmissionskompetence på noget tidspunkt (figur 1b). Ved den højest undersøgte titer (6 log10 FFU/mL) blev der ikke identificeret nogen infektioner efter 2 dages inkubation, men der blev observeret infektioner på alle andre tidspunkter, hvilket toppede med 88,9% ved 10 dages ekstrinsisk inkubation. ZIKV blev påvist i benene på myg undersøgt på 10 og 14 dage efter infection (22,2% og 66,7%, hvilket indikerer, at ZIKV havde spredt sig til hæmocoel, selv om infektiøs ZIKV blev observeret i spyt på dette tidspunkt (Figur 1c).

Ae. aegypti-populationen fra Den Dominikanske Republik viste sig at være den mest modtagelige for ZIKV-infektion og blev sendt kompetent efter eksponering for alle testede blodmelstiter. Der blev observeret et vist infektionsniveau på alle tidspunkter ved alle tre testede doser, med den laveste rate observeret 2 dage efter infection ved 4 log10 FFU / mL (25%) (Figur 1d). Med blodmel titere på 5 log10 og 6 log10 FFU / mL betingelser infektionsraten toppede på 100%, med 100% infektion observeret så tidligt som 4 dage efter infection i populationen af myg udsat for 6 log10 FFU / mL ZIKV (Figur 1e,f). Myg fodret alle tre doser demonstreret formidling med 7 dage efter infection, toppede ved 44,4% (4 log10 FFU / mL, 14 dage efter infection), 88,9% (5 log10 FFU / mL, 1 og 14 dage efter infection), og 100% (6 log10 FFU / mL, 10 dage efter infekture). Transmissionskompetencen blev observeret efter alle tre doser (henholdsvis 11,1 %, 22,2 % og 22,2 % ved henholdsvis 4, 5 og 6 log10 FFU/mL), men kun efter en 14 dages ekstrinsisk inkubationsperiode (EIP) (figur 1d−f).

Ae. aegypti-befolkningen fra Rio Grande Valley, TX, viste sig at være relativt ildfast til infektion med ZIKV. Myg udsat for blodmeale titere på 4 log10 FFU / mL, blev smittet så tidligt som 4 dage efter infection, med infektion satser mellem 22,2% og 44,4%. Med disse eksponeringsforhold blev der observeret spredte infektioner ved 14 dages postinfektion med en hastighed på 11,1%, og der blev ikke observeret nogen transmissionskompetence (figur 1g). En tidobling af blodmeal titer gav et stort set lignende resultat, med infektioner observeret starter 4 dage eftereksponering (33,3% og 44,4%), mens spredte infektioner blev fundet efter 14 dages ekstrinsisk inkubation med en hastighed på 22,2% (Figur 1h). Endelig, i kohorten udsat for en 6 log10 FFU/ mL blodmel, infektion blev observeret begyndende fra 2 dages postinfection tid punkt (22,2%) og nåede toppe på 4, 10, og 14 dage efter infection (66,7%). Spredte infektioner i denne tilstand begyndte at blive observeret ved 7 dage efter infekturet (11,1%) og toppede ved 44,4% ved 14 dage efter infekturet. Kun en enkelt myg (11,1%) blev observeret at være transmission, der var i stand til at overføre ved 10 dages postinfektion (Figur 1i).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

De metoder, der er beskrevet her, giver en generaliseret arbejdsgang til at udføre vektorkompetenceanalyser. Som en generel ramme bevares mange af disse metoder i hele litteraturen. Der er dog plads til ændringer (gennemgået i Azar og Weaver1). Virus (f.eks. viral afstamning, opbevaring af udfordringsvirus, viral passagehistorie), entomologi (f.eks. laboratoriekolonisering af mygpopulationer, medfødt immunitet, myggemikrobiomet/viromet) og eksperimentelle variabler (f.eks. blodmelssammensætning, sekventiel blodfodring og inkubationstemperatur) er alle kendt for at påvirke vektorkompetencen. Metodisk variation i kompetenceundersøgelser har vist sig problematisk i forbindelse med ZIKV-udbruddet , fordi det har udelukket formelle metaanalyser1,33.

Inden for denne generelle metode kan betydningen af passende sult af myg og blodmel makeup ikke overvurderes. Dehydrering er kendt for at drive blod fodring adfærd myg i laboratoriet paradigmer34, understreger værdien af sukker og vand sult forud for at tilbyde en smitsom blodmel. Mens fratagelse af sukker i 36-48 timer og vand i 2-4 timer før eksponering for blodmel tolereres godt af Ae. aegypti, er det værd at bemærke, at disse myg er notorisk nemme at arbejde med under laboratorieforhold2. Sådanne aggressive regimer af sult kan ikke være nær så veltolereret af andre myg arter, hvilket nødvendiggør en vis grad af in-house optimering. Ligeledes kan blodfortynst indhold blive informeret af værten præference. For eksempel er det helt passende at bruge humant blod til at forberede et blodmel til antropophilic myg som Ae. aegypti, men humane blodmeler lavet til ornitophiliske arter som Culex quinquefasciatus kan vise sig mindre effektive35. Derudover er brugen af relativt friske blodprodukter med hensyn til blodmelasselse meget tilrådeligt at minimere hæmolyse af erythrocytter.

En af de største begrænsninger ved vektorkompetencevurdering som helhed og de procedurer, der er beskrevet heri, er, at disse undersøgelser i vid udstrækning er begrænset til at undersøge vira ved hjælp af myg, der kan opretholdes under laboratorieforhold. Ae. aegypti, mens en yderst relevant vektor for et væld af patogener af klinisk betydning, også sker for at være en af de nemmeste myg til at bageste og vedligeholde i laboratoriekolonier1,31,36,37. Ikke overraskende er Ae. aegypti-populationernes kompetence ofte derfor den bedst karakteriseret blandt almindelige vektormyg2. Dette er især problematisk i forbindelse med arbovirus, der opretholder både enzootiske og urbane transmissionscyklusser38,39,40, da vektorkompetence generelt kun udføres i forbindelse med de mere tractable urbane myg.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Vi anerkender personalet i World Reference Center for Emerging Virus and Arboviruses (WRCEVA): Dr. Robert Tesh, Hilda Guzman, Dr. Kenneth Plante, Dr. Jessica Plante, Dionna Scharton og Divya Mirchandani, for deres utrættelige arbejde med kuratering og levering af mange af de virale stammer, der anvendes til vores og andre gruppers vektorkompetence eksperimenter. Det præsenterede arbejde blev finansieret af McLaughlin Fellowship Fund (SRA) og NIH giver AI120942 og AI121452.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3mL Standard Reservoir R37P30 Hemotek Ltd Insectary Equipment
7/32" Stainless Steel 440 Grade C Balls 4RJH9 Grainger Grinding Media
Acetone, Histological Grade, Fisher Chemicals, Poly Bottle, 4L, 4/Case A16-P4 FisherScientific Fixative
Adenosine 5'-triphospate disodium salt hydrat, microbial, BioReagent, suitable for cell culture A6419-1G MilliporeSigma Reagent
Anti-Flavivirus Group Antigen Antibody, clone D1-4G2-4-15 MAB10216 MilliporeSigma Primary Antibody for focus forming assay
Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody, Human Serum Adsorbed and Peroxidase-Labeled, 1.0mL/Bottle 5450-0011 KPL/Seracare Secondary Antibody for focus forming assay
Bleach NC0427256 FisherScientific Decontamination
Corning, Cell Culture Treated Flasks, 150cm2, Vented Cap, Case of 50 10-126-34 FisherScientific Cell culture consumable
Costar Cell Culture Plates, 24-well, 5/bag, 100/case, Corning 07-200-740 FisherScientific Cell culture consumable
Costar Cell Culture Plates, 96-well, 5/bag, 100/case, Corning 07-200-91 FisherScientific Cell culture consumable
Crystal Violet C0775-100G MilliporeSigma Stain
Eppendorf Snap Cap Microcentrifuge Safe-Lock 2mL Tubes, 500/Case 05-402-7 FisherScientific Plastic consumable
Falcon 15mL Conical Centrigue Tubes 14-959-70C FisherScientific Plastic consumable
Falcon 50mL Conical Centrigue Tubes 14-959-49A FisherScientific Plastic consumable
Falcon Disposable Polystyrene Serological 10mL Pipets, 200/Case 13-675-20 FisherScientific Plastic consumable
Falcon Disposable Polystyrene Serological 1mL Pipets, 1000/Case 13-675-15B FisherScientific Plastic consumable
Falcon Disposable Polystyrene Serological 25mL Pipets, 200/Case 13-675-30 FisherScientific Plastic consumable
Falcon Disposable Polystyrene Serological 5mL Pipets, 200/Case 13-675-22 FisherScientific Plastic consumable
Falcon Standard Tissue Culture Dishes 08-772B FisherScientific Plastic consumable
Fetal Bovine Serum-Premium, 500mL S11150 Atlanta Biologicals Cell culture reagent
Fisherbrand Economy Plain Glass Microscope Slides 12-550-A3 FisherScientific Immobilization of Mosquitos
FU1 Feeder FU1-0 Hemotek Ltd Insectary Equipment; feeding units
Gibco DPBS with Calcium and Magnesium, 10 x 500mL Bottles 140-040-182 FisherScientific Cell culture reagent
Gibco Fungizone, Amphotericin B, 250μg/mL, 50mL/Bottle 15-290-026 Fisher Scientific Cell culture reagent
Gibco Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL), 100mL/Bottle, 20 Bottles/Case 15-140-163 FisherScientific Cell culture reagent
Gibco, Tryptsin-EDTA (.25%), Phenol red, 20 x 100mL Bottles 25-200-114 FisherScientific Cell culture reagent
Gibcom DMEM, High Glucose, 10 x 500mL Bottles 11-965-118 FisherScientific Cell culture reagent
Human Blood, Unspecified Gender, Na-Citrate, 1 Unit 7203706 Lampire Bloodmeal preparation
InsectaVac Aspirator 2809B Bioquip Insectary Equipment
Methanol, Certified ACS, Fisher Chemicals, Amber Glass Bottle, 4L, 4/Case A412-4 FisherScientific Fixative
Methyl cellulose, viscosity: 3,500-5,600 cP, 2 % in water(20 °C), 250g/Bottle M0512-250G MilliporeSigma Cell culture reagent
Micro-chem Plus Disinfectant Detergent C849T34 Thomas Scientific Decontamination; working dilution of dual quaternary ammonium
Mineral Oil, BioReagent, for molecular biology M5904-5X5ML MilliporeSigma Immobilization of Mosquitos
O-rings OR37-25 Hemotek Ltd Insectary Equipment
Plastic Plugs PP5-250 Hemotek Ltd Insectary Equipment
PS6 Power Unit (110-120V) PS6120 Hemotek Ltd Insectary Equipment; power source
Rubis Forceps, Offset blades, superfine points 4525 Bioquip Insectary Equipment
Sarstedt Inc, 2mL Screw Cap Microtube, Conical Bottom, O-ring Cap, Sterile, 1000/Case 50-809-242 FisherScientific Plastic consumable
Sucrose, BioUltra, for molecular biology 84097-250G MilliporeSigma Reagent
ThermoScientific, ART Barrier Low Retention 1000μL Pipette Tips, 100 tips/Rack, 8 Racks/Pack, 4 Packs/Case 21-402-487 FisherScientific Plastic consumable
ThermoScientific, ART Barrier Low Retention 200μL Pipette Tips, 96 tips/Rack, 10 Racks/Pack, 5 Packs/Case 21-402-486 FisherScientific Plastic consumable
ThermoScientific, ART Barrier Low Retention 20μL Pipette Tips, 96 tips/Rack, 10 Racks/Pack, 5 Packs/Case 21-402-484 FisherScientific Plastic consumable
ThermoScientific, ART Barrier Low Retention, Extended Reach 10μL Pipette Tips, 96 tips/Rack, 10 Racks/Pack, 5 Packs/Case 21-402-482 FisherScientific Plastic consumable
TissueLyser II 85300 QIAGEN Homogenization
TrueBlue Peroxidase Substrate Kit, 200mL 5510-0030 Seracare Developing solution for focus forming assay
Vero CCL-81 American Type Culture Collection Mammalian cell line to amplify virus and conduct infectious assay
Vero C1008 [Vero 76, clone E6, Vero E6] CRL-1586 American Type Culture Collection Mammalian cell line to amplify virus and conduct infectious assay

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Azar, S. R., Weaver, S. C. Vector Competence: What Has Zika Virus Taught Us. Viruses. 11 (9), 867 (2019).
  2. Souza-Neto, J. A., Powell, J. R., Bonizzoni, M. Aedes aegypti vector competence studies: A review. Infection, Genetics and Evolution. 67, 191-209 (2019).
  3. Smith, D. R., Adams, A. P., Kenney, J. L., Wang, E., Weaver, S. C. Venezuelan Equine Encephalitis Virus in the Mosquito Vector Aedes taeniorhynchus: Infection Initiated by a Small Number of Susceptible Epithelial Cells and a Population Bottleneck. Virology. 372 (1), 176-186 (2008).
  4. Forrester, N. L., Coffey, L. L., Weaver, S. C. Arboviral bottlenecks and challenges to maintaining diversity and fitness during mosquito transmission. Viruses. 6 (10), 3991-4004 (2014).
  5. Kramer, L. D., Ciota, A. T. Dissecting vectorial capacity for mosquito-borne viruses. Current Opinion in Virology. 15, 112-118 (2015).
  6. Kramer, L. D., Hardy, J. L., Presser, S. B., Houk, E. J. Dissemination Barriers for Western Equine Encephalomyelitis Virus in Culex tarsalis infected after Ingestion of Low Viral Doses. American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 30 (1), 190-197 (1981).
  7. Lounibos, L. P., Kramer, L. D. Invasiveness of Aedes aegypti and Aedes albopictus and Vectorial Capacity for Chikungunya Virus. The Journal of Infectious Diseases. 214, suppl 5 453-458 (2016).
  8. Heitmann, A., et al. Forced Salivation as a Method to Analyze Vector Competence of Mosquitoes. Journal of Visualized Experiments. (138), e57980 (2018).
  9. Beerntsen, B. T., James, A. A., Christensen, B. M. Genetics of Mosquito Vector Competence. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 64 (1), 115-137 (2000).
  10. Guo, X. X., et al. Culex pipiens quinquefasciatus: a potential vector to transmit Zika virus. Emerging Microbes & Infections. 5 (9), 102 (2016).
  11. Secundino, N. F. C., et al. Zika virus transmission to mouse ear by mosquito bite: a laboratory model that replicates the natural transmission process. Parasites & Vectors. 10 (1), 346 (2017).
  12. Smith, D. R., et al. Venezuelan Equine Encephalitis Virus Transmission and Effect on Pathogenesis. Emerging Infectious Diseases. 12 (8), 1190-1196 (2006).
  13. Lazear, H. M., et al. A Mouse Model of Zika Virus Pathogenesis. Cell Host Microbe. 19 (5), 720-730 (2016).
  14. Morrison, T. E., Diamond, M. S. Animal Models of Zika Virus Infection, Pathogenesis, and Immunity. Journal of Virology. 91 (8), 9-17 (2017).
  15. Reynolds, E. S., Hart, C. E., Hermance, M. E., Brining, D. L., Thangamani, S. An Overview of Animal Models for Arthropod-Borne Viruses. Comparative Medicine. 67 (3), 232-241 (2017).
  16. Rossi, S. L., et al. Characterization of a Novel Murine Model to Study Zika Virus. American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 94 (6), 1362-1369 (2016).
  17. Styer, L. M., et al. Mosquitoes inoculate high doses of West Nile virus as they probe and feed on live hosts. PLoS Pathogens. 3 (9), 1262-1270 (2007).
  18. Azar, S. R., Diaz-Gonzalez, E. E., Danis-Lonzano, R., Fernandez-Salas, I., Weaver, S. C. Naturally infected Aedes aegypti collected during a Zika virus outbreak have viral titres consistent with transmission. Emerging Microbes & Infections. 8 (1), 242-244 (2019).
  19. Dzul-Manzanilla, F., et al. Evidence of vertical transmission and co-circulation of chikungunya and dengue viruses in field populations of Aedes aegypti (L.) from Guerrero, Mexico. Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 110 (2), 141-144 (2016).
  20. Grard, G., et al. Zika virus in Gabon (Central Africa) – 2007: a new threat from Aedes albopictus. PLoS Neglected Tropical Diseases. 8 (2), 2681 (2014).
  21. Grubaugh, N. D., et al. Genomic epidemiology reveals multiple introductions of Zika virus into the United States. Nature. 546 (7658), 401-405 (2017).
  22. Guerbois, M., et al. Outbreak of Zika Virus Infection, Chiapas State, Mexico, 2015, and First Confirmed Transmission by Aedes aegyti Mosquitoes in the America. The Journal of Infectious Diseases. 214 (9), 1349-1356 (2016).
  23. Lundstrom, J. O., et al. Sindbis virus polyarthritis outbreak signalled by virus prevalence in the mosquito vectors. PLoS Neglected Tropical Diseases. 13 (8), 0007702 (2019).
  24. Miller, B. R., Monath, T. P., Tabachnik, W. J., Ezike, V. I. Epidemic yellow fever caused by an incompetent mosquito vector. Tropical Medicine and Parasitology. 40 (4), 396-399 (1989).
  25. Brown, H. E., et al. Effectiveness of Mosquito Traps in Measuring Species Abundance and Composition. Journal of Medical Entomology. 45 (3), 517-521 (2008).
  26. Gorsich, E. E., et al. A comparative assessment of adult mosquito trapping methods to estimate spatial patterns of abundance and community composition in southern Africa. Parasites & Vectors. 12 (1), 462 (2019).
  27. Azar, S. R., et al. ZIKV Demonstrates Minimal Pathologic Effects and Mosquito Infectivity in Viremic Cynomolgus Macaques. Viruses. 10 (11), 661 (2018).
  28. Azar, S. R., et al. Differential Vector Competency of Aedes albopictus Populations from the Americas for Zika Virus. American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 97 (2), 330-339 (2017).
  29. Hanley, K. A., Azar, S. R., Campos, R. K., Vasilakis, N., Rossi, S. L. Support for the Transmission-Clearance Trade-Off Hypothesis from a Study of Zika Virus Delivered by Mosquito Bite to Mice. Viruses. 11 (11), 1072 (2019).
  30. Hart, C. E., et al. Zika Virus Vector Competency of Mosquitoes, Gulf Coast, United States. Emerging Infectious Diseases. 23 (3), 559-560 (2017).
  31. Karna, A. K., et al. Colonized Sabethes cyaneus, a Sylvatic New World Mosquito Species, Shows a Low Vector Competence for Zika Virus Relative to Aedes aegypti. Viruses. 10 (8), 434 (2018).
  32. Roundy, C. M., et al. Variation in Aedes aegypti Mosquito Competence for Zika Virus Transmission. Emerging Infectious Diseases. 23 (4), 625-632 (2017).
  33. Wilson, A. J., Harrup, L. E. Reproducibility and relevance in insect-arbovirus infection studies. Current Opinion in Insect Science. 28, 105-112 (2018).
  34. Hagan, R. W., et al. Dehydration prompts increased activity and blood feeding by mosquitoes. Scientific Reports. 8 (1), 6804 (2018).
  35. Guo, X. X., et al. Host Feeding Patterns of Mosquitoes in a Rural Malaria-Endemic Region in Hainan Island, China. Journal of the American Mosquito Control Association. 30 (4), 309-311 (2014).
  36. Kuno, G. Early history of laboratory breeding of Aedes aegypti (Diptera: Culicidae) focusing on the origins and use of selected strains. Journal of Medical Entomology. 47 (6), 957-971 (2010).
  37. Mayilsamy, M. Extremely Long Viability of Aedes aegypti (Diptera: Culicidae) Eggs Stored Under Normal Room Condition. Journal of Medical Entomology. 56 (3), 878-880 (2019).
  38. Althouse, B. M., et al. Potential for Zika Virus to Establish a Sylvatic Transmission Cycle in the Americas. PLoS Neglected Tropical Diseases. 10 (12), 0002055 (2016).
  39. Vasilakis, N., Cardosa, J., Hanley, K. A., Holmes, E. C., Weaver, S. C. Fever from the forest: prospects for the continued emergence of sylvatic dengue virus and its impact on public health. Nature Reviews Microbiology. 9 (7), 532-541 (2011).
  40. Vasilakis, N., et al. Potential of ancestral sylvatic dengue-2 viruses to re-emerge. Virology. 358 (2), 402-412 (2007).

Tags

Immunologi og infektion myg vektor kompetence Aedes Aedes aegypti arbovirus Zika
Vektor kompetence analyser på <em>Aedes aegypti</em> Myg ved hjælp af Zika Virus
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Azar, S. R., Weaver, S. C. Vector… More

Azar, S. R., Weaver, S. C. Vector Competence Analyses on Aedes aegypti Mosquitoes using Zika Virus. J. Vis. Exp. (159), e61112, doi:10.3791/61112 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter