Summary
Eine Methode zur Abgabe neuronaler Stammzellen, anpassungsfähig für Injektionslösungen oder Suspensionen, durch die gemeinsame Halsschlagader (Maus) oder externe Halsschlagader (Ratte) nach ischämischem Schlaganfall wird berichtet. Injizierte Zellen sind breit über das Gehirn Parenchym verteilt und kann bis zu 30 d nach der Geburt nachgewiesen werden.
Abstract
Die Therapie mit neuronalen Stammzellen (NSC) ist eine neue innovative Behandlung bei Schlaganfall, traumatischen Hirnverletzungen und neurodegenerativen Erkrankungen. Im Vergleich zur intrakraniellen Verabreichung ist die intraarterielle Verabreichung von NSCs weniger invasiv und erzeugt eine diffusere Verteilung von NSCs innerhalb des Gehirnparenchyms. Darüber hinaus ermöglicht die intraarterielle Abgabe den Erstpasseffekt in der Hirnzirkulation, wodurch das Potenzial für das Einfangen von Zellen in peripheren Organen, wie Leber und Milz, verringert wird, eine Komplikation, die mit peripheren Injektionen verbunden ist. Hier beschreiben wir die Methodik, sowohl bei Mäusen als auch bei Ratten, für die Lieferung von NSCs durch die gemeinsame Halsschlagader (Maus) oder externe Halsschlagader (Ratte) an die ipsilaterale Hemisphäre nach einem ischämischen Schlaganfall. Anhand von GFP-markierten NSCs veranschaulichen wir die weitverbreitete Verteilung, die in der ipsilateralen Hemisphäre des Nagetiers bei 1 d, 1 Woche und 4 Wochen nach der postischen Verabreichung erreicht wird, mit einer höheren Dichte an oder in der Nähe der ischämischen Verletzungsstelle. Neben dem Langzeitüberleben zeigen wir Nachweise für eine Differenzierung von GFP-markierten Zellen nach 4 Wochen. Der hier für NSCs beschriebene intraarterielle Verabreichungsansatz kann auch für die Verabreichung therapeutischer Verbindungen verwendet werden und hat somit eine breite Anwendbarkeit auf verschiedene ZNS-Verletzungs- und Krankheitsmodelle über mehrere Arten hinweg.
Introduction
Die Stammzelltherapie (SC) birgt ein enormes Potenzial zur Behandlung neurologischer Erkrankungen wie Schlaganfall, Kopftrauma und Demenz1,2,3,4,5,6., Eine effiziente Methode zur Lieferung exogener SCs an das erkrankte Gehirn bleibt jedoch problematisch2,6,7,8,9,10,11,12,13. SCs, die über periphere Verabreichungswege, einschließlich intravenöser (IV) oder intraperitonealer (IP) Injektionen, geliefert werden, unterliegen einer Erstpassfilterung in der Mikrozirkulation, insbesondere in der Lunge, Leber, Milz und Muskel8,9,13,14, erhöhung der Wahrscheinlichkeit der Ansammlung von Zellen in Nicht-Ziel-Bereichen. Die invasive intracerebrale Injektionsmethode führt zu lokalisierten Hirngewebeschäden und einer sehr eingeschränkten Verteilung von SCs in der Nähe der Injektionsstelle2,6,8,14,15,16. Wir haben vor kurzem eine katheterbasierte intraarterielle Injektionsmethode eingeführt, um exogene neuronale SCs (NSCs) zu liefern, die hier in einem Nagetiermodell des fokalen ischämischen Schlaganfalls beschrieben wird. Wir induzieren vorübergehende (1 h) Ischämie-Reperfusionsverletzung in einer Hemisphäre mit einem Silikongummi beschichteten Filament, um die linke mittlere Hirnarterie (MCA) in der Maus oder Ratte17,18,19zu verschließen. In diesem Modell haben wir reproduzierbar etwa 75-85% Depression des zerebralen Blutflusses (CBF) in der ipsilateralen Hemisphäre mit Laser Doppler oder Laser speckle Imaging17,19beobachtet, was konsistente neurologische Defizite17,18,19ergibt.
Aus zeitsparenden Gründen wird das Video mit doppelter Normalgeschwindigkeit abgespielt und routinemäßige chirurgische Eingriffe wie Hautvorbereitung und Wundverschluss mit Naht und die Verwendung und Einrichtung der motorisierten Spritzenpumpe werden nicht dargestellt. Die Methode der intraarteriellen Abgabe von NSCs wird im Kontext des mittleren zerebralen Arterienverschlussmodells (MCAO) des experimentellen Schlaganfalls bei Nagetieren demonstriert. Daher schließen wir das transiente ischämische Schlaganfallverfahren ein, um später zu zeigen, wie die zweite Operation, die intraarterielle Injektion, mit der vorherigen chirurgischen Stelle am selben Tier durchgeführt wird. Die Durchführbarkeit der intraarteriellen NSC-Verabreichung in Nagetierschlagmodellen wird durch die Bewertung der Verteilung und des Überlebens exogener NSCs demonstriert. Die Wirksamkeit der NSC-Therapie zur Dämpfung der Hirnpathologie und neurologischen Dysfunktion wird separat berichtet.
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Protocol
Alle Verfahren zu tierischen Themen wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) der University of Kentucky genehmigt, und es wurde entsprechend darauf geachtet, Stress oder Schmerzen im Zusammenhang mit einer Operation zu minimieren.
1. Herstellung von Injektionskatheter und chirurgischen Haken
- Konstruieren Sie den Injektionskatheter (Abbildung 1). Sammeln Sie notwendige Materialien wie: MRE010, MRE025 und MRE050 Rohre, 20 G, 26 G und 27 G Injektionsnadeln (Abbildung 2A), 600 Sandpapier, Superkleber und Zweikomponenten 5-Minuten-Epoxid.
- 20 G und 26 G Nadeln bei 1 cm von der Nadelnbenabe schneiden und das Ende auf Schleifpapier polieren (Abbildung 2B). Spülen Sie die Nadeln mit 10 ml doppelt destilliertem Wasser, um die Nadelbohrung zu reinigen.
HINWEIS: Es werden zwei verschiedene Ausführungen verwendet (Abbildung 1). Design 1 verfügt über einen einzigen Steckverbinder und wird für die Injektion von Lösungen oder Suspensionen verwendet. Design 2 verfügt über 20 G und 26 G Luer-Sperrverbinder für die Injektion von Zellen (20 G Nadel) und Bündigung des Totvolumens (26 G Nadel), um die Lieferung des gesamten Volumens der NSC-haltigen Lösung zu gewährleisten.
- 20 G und 26 G Nadeln bei 1 cm von der Nadelnbenabe schneiden und das Ende auf Schleifpapier polieren (Abbildung 2B). Spülen Sie die Nadeln mit 10 ml doppelt destilliertem Wasser, um die Nadelbohrung zu reinigen.
- Ausführung 1: Legen Sie einen 3-4 cm langen MRE010 Katheter in einen 15 cm langen MRE025 Katheter ein und sichern Sie ihn mit Superkleber.
- Schließen Sie das andere Ende des MRE025-Rohrs an ein Segment des MRE050-Katheters an und sichern Sie es mit Superkleber. Eine abgestumpfte 20 G Nadel in das restliche Ende des MRE050 Katheters einlegen und mit Superkleber sichern (Abbildung 1).
- Verstärken Sie die Verbindungsstellen mit Epoxidkleber weiter. Dieses Katheter-Design ist optimal für die Injektion von Reagenzien (wie chemische oder medikamentöse Lösungen oder andere Biologika wie Zytokine).
- Design 2: Legen Sie einen 3-4 cm langen MRE010 Katheter in einen 15 cm langen MRE025 Katheter ein und sichern Sie ihn mit Superkleber.
- Schließen Sie das andere Ende des MRE025-Rohrs an ein Segment des MRE050-Katheters an und sichern Sie es mit Superkleber. Eine abgestumpfte 20 G Nadel in das restliche Ende des MRE050 Katheters einlegen und mit Superkleber sichern.
- Setzen Sie eine abgestumpfte 26 G Nadel in das MRE050-Rohr in der Nähe der Spitze der ersten Nadel, nach der Richtung des Injektionsflusses, und sichern Sie mit Superkleber (Abbildung 1 und Abbildung 2C). Verstärken Sie sowohl Nadeln als auch das Segment der MRE050-Röhre mit klarem Epoxid (Abbildung 2C). Dieses Design ermöglicht die Injektion der Fahrzeuglösung durch Nadel 2 (26 G) nach NSC-Injektion durch Nadel 1 (20 G), um das tote Volumen im Katheter in den Gehirnkreislauf zu spülen und so eine genauere Kontrolle der Injektionsvolumina zu erreichen.
- Verwenden Sie eine 20 G Nadel für die NSC-Injektion, um Schäden an den NSCs zu minimieren, die die Lebensfähigkeit beeinträchtigen könnten.
- Nach dem Bau die Katheter mit 10 ml doppelt destilliertem Wasser, gefolgt von 70% Ethanol, spülen und dann über Nacht in 70% Ethanol einweichen.
- Vor der Operation entfernen Sie die Katheter aus 70% Ethanol und spülen Sie sie mit 10 ml sterilem PBS, und legen Sie sie in eine autoklavierte chirurgische Werkzeugbox für lagerungs- und Transport.
- Vorbereitung der chirurgischen Haken
- Einen 1,5- 2 cm langen Nadelschaft aus einer 27 G Nadel schneiden und beide Enden auf Schleifpapier polieren, bis sie stumpf sind. Dann verwenden Sie eine kleine hämostatische Klemme, um die Welle in einen Haken an einem Ende und eine Ringform am anderen Ende zu biegen.
- Legen Sie einen 10-15 cm langen MRE025 Katheter durch den Ring und sichern Sie ihn mit klarem chirurgischem Klebeband (Abbildung 2D). Machen Sie 2 weitere Haken mit der gleichen Methode.
- Alle Haken und Kathetersysteme bis zur Verwendung in 70% Ethanol einweichen.
2. Tierzubereitung: Lieferung, Unterbringung, Umweltanpassung
- Männliche und weibliche C57BL/6-Mäuse (10-12 Wochen, n=10/Zeitpunkt) und Wistar-Ratten (10-12 Wochen, n=10) wurden in dieser Studie verwendet.
- Beherbergen Sie sie in einem umweltkontrollierten Tiervivarium mit Nahrung und Wasser ad libitum.
- Erlauben Sie ihnen, sich mindestens 1 Woche vor der Schlaganfalloperation an die Umwelt anzupassen.
HINWEIS: Eine Maus und eine Ratte starben nach einer Schlaganfalloperation bei 1 d und eine Maus wurde nach einem Schlaganfall vor der NSC-Injektion aus humanen Gründen wegen schwerer Lähmung eingeschläfert.
3. Kultur von mund- und rattenneuralen Stammzellen (NSCs)
HINWEIS: NSCs wurden nach einem etablierten Protokoll20isoliert und kultiviert.
- Maus
- Isolat wildtype (WT) und GFP-markierte NSCs aus dem E18 embryonalen Kortex von zeitschwangeren weiblichen C57BL/6-Mäusen, die mit GFP-positiven männlichen Mäusen (B6 ACTb-EGFP) gepaart sind. Um GFP (+)-Embryonen zu identifizieren, beobachten Sie die geernteten Embryonen auf einem Fluoreszenzmikroskop mit dem FITC-Kanal. GFP (+) Embryonen liefern grünes Fluoreszenzsignal, während WT-Embryonen nur eine schwache Autofluoreszenz aufweisen (Abbildung 3A).
- Ratte
- Isolieren Sie NSCs aus der subventrikulären Zone (SVZ) junger erwachsener WT-Ratten. Etikettieren Sie sie mit DiI kurz vor der Injektion nach Herstelleranleitung21.
- Kultur Maus oder Ratte NSCs, bis sie sich zu Neurosphären entwickeln, und durchsiet sie, wenn der Durchmesser der Kugel erreicht etwa 100 m (Abbildung 3B). Verwenden Sie die NSCs zur Injektion zwischen den Gängen 3 und 5.
- Überprüfen Sie ihre Stammzelleigenschaften mithilfe eines embryonalen Stammzellmarkerpanels (Abbildung 3C).
- Am Tag der Injektion NSC-Kugeln sammeln und mit der Zellablösung dissoziieren, in kalzium- und magnesiumfreiem PBS auf eine Konzentration von 107 Zellen/ml aussetzen und bis zur Injektion auf nasses Eis legen.
4. Chirurgische Präparation
- Markieren Sie vor der Operation einen Punkt auf der kommerziellen MCAO-Naht mit einem silbernen Markerstift bei 9 mm (für die Maus) oder 15 mm (für Ratten) von der Spitze für die in-chirurgische Referenz der Einstecklänge. Autoclavdien Sie die chirurgischen Werkzeuge (Schere, Zange) und Instrumente vor jeder Operation, und Wärme sterilisieren sie in einem Glasperlensterilisator zwischen den Operationen.
- Anästhesie bei Tieren mit 5% Isofluran durch Inhalation induzieren und Anästhesie mit 1-2% Isofluran aufrecht erhalten. Bewerten Sie die Tiefe der Anästhesie durch Beobachtung der allgemeinen Bedingungen (Atemmuster, Schnurrbartbewegung und spontane Körperkorrekturhaltung), Hornhautreflex und Reaktion auf Zehenkneifen.
- Legen Sie die tierische Suppe auf ein Heizkissen und bereiten Sie die chirurgische Stelle am Tier durch Clipping und Schrubben mit Betadinlösung, gefolgt von 70% Ethanol, vor. Schützen Sie die Augen des Tieres vor dem Trocknen, indem Sie während der Operation eine ophthalmologische Salbe (z. B. künstliche Tränensalbe) auftragen.
- Lassen Sie Chirurgen ihre Hände gründlich mit einem bakteriziden Peeling schrubben und eine Maske, sterile Handschuhe und einen sauberen Labormantel tragen.
5. Mittlere Zerebrale Arterienverschluss (MCAO) Schlaganfallchirurgie
HINWEIS: Die Operationen, um ischämischen Schlaganfall in einer Hemisphäre von Maus oder Ratte zu induzieren, sind ähnlich, da eine Naht in die innere Karotisarterie (ICA) eingeführt wird, um den Blutfluss zu verschließen (Abbildung 4)17,18,19,22. Die für das Einstecken der Nahtform ausgewählte Arterie unterscheidet sich jedoch je nach dem für die nachfolgende Stammzellinjektion erforderlichen Einsatzraum. Die Ratte hat genügend Platz im externen Carotisarterie (ECA) Segment, um zwei separate, sequenzielle Operationen (Schlag und NSC-Injektion) zu ermöglichen, aber die Maus nicht, erfordert einen alternativen Ansatz. Schlaganfall-induzierte hirnbedingte Blutflussveränderungen, Hirninfarktgröße und neurologische Defizite wurden berichtet, wie in den früheren Berichten der Autoren17,18,19berichtet.
- Um ischämischen Schlaganfall zu induzieren, beginnen Sie sowohl Maus- als auch Rattenoperationen mit einem Mittellinienschnitt im Gebärmutterhalsbereich und der Isolierung der linken gemeinsamen Halsschlagader (CCA), ECA und ICA (Abbildung 4). Seien Sie vorsichtig, um den CCA- oder Vagusnerv nicht zu dehnen, zu verdrängen oder zu drücken. Da die Auswahl der Arterie und der chirurgischen Schritte danach unterschiedlich sind, wird die MCAO-Operation an Maus und Ratte separat beschrieben.
- MCAO-Chirurgie an der Maus (Abbildung 4A)
- Legen Sie drei geflochtene 6-0 Nylonnähte unter die CCA(Abbildung 4A, Schritt 1), und machen Sie einen engen chirurgischen Knoten, um das Gefäß so weit wie möglich von der Bifurkation mit der proximalen Schnur zu verschließen (Abbildung 4A, Schritt 2). Trimmen Sie die Nähtenachlten nach unten.
- Machen Sie einen Slipknot an der distalen Seite von CCA (Vorsicht: nicht überziehen, da es in Schritt 6 freigegeben wird) und einen lockeren Slipknot zwischen den beiden angezogenen Knoten(Abbildung 4A,Schritt 2).
- Schneiden Sie einen kleinen Schnitt (ca. 1/4 - 1/3 des Umfangs) in der Nähe des proximalen Knotens auf der CCA mit Mikroschere(Abbildung 4A,Schritt 3), und legen Sie vorsichtig die kommerzielle Silikongummi beschichtet 7-0 massive Nylon Naht(Abbildung 4A, Schritt 4). Sichern Sie diese Naht mit der mittleren Schnur, ziehen Sie ausreichend(Abbildung 4A, Schritt 5), um sicherzustellen, dass kein Blutleck aus dem Schnitt und keine Bewegung des silikongummibeschichteten Nylon-Filaments durch den Rückfluss von ICA, während immer noch das Vorrücken der Naht in Richtung der ECA mit einem sanften Druck durch die Pinzette ermöglicht.
- Lassen Sie den oberen (distalen) Slipknot (Abbildung 4A, Schritt 6) los und bringen Sie die Nylonnaht in die ICA, bis ihre Spitze die Bifurkation für 9 mm passiert (mit dem silbernen Marker auf der Naht als Referenz). Ziehen Sie die oberen beiden Slipknots fest, um die Naht zu sichern und Blutrückfluss zu verhindern.
- Ziehen Sie das Filament 1 h später zurück(Abbildung 4A, Schritt 7) und ligaten Sie den CCA mit dem mittleren Knoten, um Blutungen zu verhindern (Abbildung 4A, Schritte 5-7 in umgekehrter Reihenfolge, Endergebnisse wie in Schritt 8). Lösen Sie den oberen Knoten. Schließen Sie die Wunde mit 4-0 chirurgische Naht.
- MCAO-Chirurgie an Ratten (Abbildung 4B)
- Legen Sie zwei geflochtene 6-0 Nylonnähte unter den ECA(Abbildung 4B, Schritt 1), und machen Sie einen engen Knoten am distalen Ende so weit wie möglich(Abbildung 4B, Schritt 2).
- Legen Sie Gefäßclips auf der ICA und CCA, um den arteriellen Blutfluss zu verschließen (Abbildung 4B, Schritt 3). Ein Slipknot kann als Alternative für einen Schiffsclip verwendet werden.
- Machen Sie einen kleinen Schnitt auf dem ECA mit Mikroschere(Abbildung 4B, Schritte 3-4), legen Sie ein kommerzielles Silikon gummibeschichtet 6-0 Nylon Filament(Abbildung 4B,Schritt 5), und sicheren Sie ordnungsgemäß mit einem Slipknot auf dem ECA.
- Lösen Sie den Gefäßclip auf der ICA, bringen Sie das Filament in die ICA vor, bis der Silbermarker (15 mm) die Bifurkation erreicht(Abbildung 4B,Schritt 6), und sichern Sie dann die Naht mit dem2. Knoten auf dem ECA(Abbildung 4B,Schritt 6).
- Nach 1 h Ischämie, ziehen Sie dieses Filament und ligate den Schnitt, um Blutungen zu verhindern(Abbildung 4B,Schritt 7), entfernen Sie den Gefäßclip von CCA (Endergebnis wie in Schritt 8), und schließen Sie die Wunde mit 4-0 chirurgische Naht.
6. Wiederherstellung
- Legen Sie die Tiere nach einer Schlaganfalloperation auf ein Heizkissen, bis sie das Bewusstsein wiedererlangen.
- Analgesie durch subkutane Injektion. Bringen Sie Tiere in ihre HeimischenKäfige mit Zugang zu Wasser und Nahrung ad libitum zurück.
7. Intraarterieninjektion
- Den gesamten Katheter mit 70% Ethanol waschen und über Nacht bis zum Gebrauch einweichen. Schließen Sie kurz vor der Injektion das Luer-Schloss der Nadel mit einer sterilen Spritze an und waschen Sie die gesamte Lumenseite des Kathetersystems mit 10 ml sterilem PBS.
- Zeitfenster und Vorbereitung für NSC-Injektion
HINWEIS: Basierend auf Erfahrungen und Berichten anderer Forschungsteams ist der Zeitpunkt für die NSC-Injektion entscheidend für das Überleben beider Probanden und exogener NSCs. In unserer Pilotstudie führte die Injektion von NSCs zu frühen Zeitpunkten (innerhalb der ersten 6 h nach Reperfusion) zu einer höheren Sterblichkeit. So testeten wir spätere Injektionszeitpunkte und ermittelten das Zeitfenster zwischen 2 d (48 h) bis 3 d (72 h) nach einem Schlaganfall ist sicher und für Tiere verträglich und ist effizient bei der Erreichung der intraparenchymalen Verteilung von NSCs. Die hier vorgestellten Ergebnisse stammen von Tieren, die nach einer Verletzung bei 3 d nSC injektionn wurden.- Stellen Sie die Injektionsrate der Spritzenpumpe auf 20 l/min für Mäuse und 50 l/min für Ratten ein. Übermäßige Geschwindigkeit oder Dauer der Injektion kann zu einer systemischen Volumenüberlastung führen, für die Mäuse anfälliger sind als Ratten.
- Kurz gesagt, bei 3 d nach Schlaganfall-Operation, befeuchten Sie die Tiere mit Isofluran und legen Sie sie auf einem Heizkissen.
- Öffnen Sie die Halswunde erneut und setzen Sie eCA, ICA und CCA erneut aus(Abbildung 5, Schritt 1). Wie bei den Schlaganfalloperationen, bestimmen Sie den Injektionsweg basierend auf der Art. Verwenden Sie die CCA für NSC-Injektion in der Maus und die ECA für die Ratte23.
- Intraarterielle Injektion durch das CCA in der Maus
- Platzieren Sie zwei 6-0 geflochtene NylonNähte unter dem CCA. Erstellen Sie einen lockeren Slipknot mit jedem von ihnen zwischen der Bifurkation und unteren Knoten aus der vorherigen Schlaganfall-Operation(Abbildung 5, Schritt 2).
- Ziehen Sie den oberen Slipknot fest und machen Sie dann einen kleinen Schnitt über dem unteren Knoten(Abbildung 5,Schritt 3). Legen Sie einen MRE010-Katheter durch den Einschnitt ein (Abbildung 5, Schritt 4) und sichern Sie ihn mit dem mittleren Knoten, ohne den Einspritzfluss zu blockieren(Abbildung 5, Schritt 5). Der Blutrückfluss sollte im Katheter sichtbar sein, wenn der obere Knoten losgelassen und die Katheterposition angepasst wird.
- Legen Sie einen Gefäßclip auf die ECA, injizieren Sie 1 x 106 GFP-NSCs durch diesen Katheter bei 20 l/min für 5 min mit einer Spritzenpumpe, gefolgt von einem Flush mit 50-100 l PBS bei gleicher Geschwindigkeit.
- Nach der Injektion den CCA über den Schnitt mit dem oberen Schlupfknoten legen und den MRE010-Katheter zurückziehen (Abbildung 5,Schritt 6). Ziehen und trimmen Sie den mittleren Knoten und den oberen Knoten. Entfernen Sie den Behälterclip aus dem EuRH. Siehe das endgültige Bild in Abbildung 5, Schritt 7.
- Schließen Sie die Wunde mit 4-0 chirurgische Naht.
- Nach ausreichender Erholung auf einem Heizkissen und subkutaner schmerzlindernder Injektion, kehren Sie die Tiere in ihren heimischen Käfig zurück.
- Intraarterielle Injektion durch den EuRH bei Ratten
- Vorübergehend den EuRH und CCA mit Gefäßclips ausblenden(Abbildung 5, Schritt 2).
- Machen Sie einen kleinen Schnitt an der proximalen Seite des ECA (Abbildung 5, Schritt 3), legen Sie den MRE010-Katheter ein und sichern Sie ihn mit einem Knoten(Abbildung 5, Schritt 4).
- Entfernen Sie beide Behälterclips, injizieren Sie 5 x 106 NSCs in 100 l PBS bei 50 l/min für 2 min, gefolgt von einem Flush mit 50-100 l PBS (Abbildung 5, Schritt 5) bei gleicher Geschwindigkeit, mit einer motorisierten Spritzenpumpe.
- Nach der Injektion die CCA und ECA mit Gefäßclips wieder abblenden und den ECA an der proximalen Seite des zweiten Einschnitts nach Abzug des Injektionskatheters aufstellen(Abbildung 5,Schritt 6).
- Entfernen Sie die beiden Gefäßclips(Abbildung 5, Schritt 7) und schließen Sie die Wunde mit 4-0 chirurgischen Naht.
- Nach ausreichender Erholung auf einem Heizkissen und subkutaner schmerzlindernder Injektion, kehren Sie die Tiere in ihren heimischen Käfig zurück.
- Histologischer Assay
- Sammeln Sie Gehirne von Mäusen und Ratten, die einen ischämischen Schlaganfall erhalten haben, gefolgt von einer Injektion von NSCs oder Fahrzeuglösung nach Euthanasie und intrakardialer Perfusion mit 4% Paraformaldehyd bei 1 d (Maus und Ratte), 7 d (Maus) und 30 d (Maus) nach der Injektion. Jede dieser vier Gruppen bestand aus 5 NSC und 5 injizierten Tieren.
- Fix Gehirne über Nacht und kryopreserve in 30% Saccharose für 3 d.
- Die Gehirne in OCT einbetten, mit einer Dicke von 40 m schneiden und die Verteilung von NSCs nach der Immunfärbung mit zellspezifischen Markern untersuchen, einschließlich glialfibrillären sauren Proteins (GFAP, Astrozyten), Tuj1 (reife Neuronen) und Doublecortin (DCX, unreife Neuronen).
HINWEIS: Aufgrund des Fehlens eines Rattenstamms, der GFP ausdrückt, haben wir DiI, ein transientes fluoreszierendes Etikett, für Ratten-NSCs verwendet, das nur eine relativ kurzfristige Beobachtung ermöglicht. Daher wurde die NSC-Verteilung erst bei 1 d nach einem Schlaganfall bei Ratten untersucht.
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Representative Results
GFP-markierte NSCs wurden im ischämischen Gehirn leicht nachgewiesen, vor allem in der ipsilateralen Hemisphäre, insbesondere im Penumbra und entlang des Verletzungsrands (Abbildung 6). Der Prüfer wurde während der Bildgebung und Analyse einmalig blind.
Zum Beispiel wurden bei 1 d nach der Injektion NSCs innerhalb des Maus-Hippocampus nachgewiesen. Eine Teilmenge von NSCs zeigte die Koexpression des unreifen Neuronenmarkers DCX im Dentate-Gyrus bereits zu diesem frühen Zeitpunkt (Abbildung 6A).
Bei 10 d nach schlaganfall (7 d nach NSC-Injektion) wurden exogene GFP-NSCs mit der höchsten Dichte am Rand der Verletzung (Wassereinzugsgebiet) im Striatum und Cortex beobachtet (Abbildung 6B). Es ist bemerkenswert, dass durch 7 d nach der Injektion viele der GFP-NSCs auch DCX (durch blaue Kreise gezeigt) ausdrückten, was auf ihr neuronales Schicksal hindeutet. Im Vergleich zu Tieren, die eine Injektion von Fahrzeuglösungen erhielten, erhöhte die NSC-Injektion auch die DCX-Färbung (rot) in der ipsilateralen Hemisphäre.
Bei 30 d nach der Injektion wurden NSCs noch im verletzten Kortex nachgewiesen, und ein Teil von ihnen zeigte die Expression des Gliamarkers GFAP (Abbildung 6C) oder des reifen neuronalen Markers Tuj1 (Abbildung 6D), was auf das Potenzial exogener NSCs hindeutet, sich entweder in ein gliales oder neuronales Schicksal zu differenzieren und bis zu 1 Monat im verletzten Gehirn zu überleben.
Abbildung 1: Schematische Konstruktionen von Injektionskathetern. Wir stellen zwei Designs vor, Design 1 für die Injektion von Verbundlösungslösungen und Design 2 für die Zellinjektion. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Vorbereitung des Katheters für die NSC-Injektion und der chirurgischen Haken. (A) Materialien für die Katheterkonstruktion: KAtheter MRE010, MRE025 und MRE050 Katheter mit einer Länge von 3 cm, 10-15 cm bzw. 3 cm Länge. (B) Nadelspitzen abschneiden und bis stumpf polieren. (C) Verbinden Sie jedes Segment und sichern Sie es mit Superkleber, und betten Sie dann sowohl Nadel-Luer-Schlösser als auch MRE050-Segment in Epoxid ein, um die Sanierung zu erhalten. (D) Machen Sie chirurgische Haken mit 27 G Nadelwelle und MRE025 Katheter. Maßstabsleiste: 5 mm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Kultur der neuronalen Stammzellen gfP (+). (A) Identifizieren Sie GFP (+) Embryonen mit Fluoreszenzmikroskop mit dem FITC-Kanal. (B) Isolieren und Kultur kortikale NSCs, bis sie Neurosphären bilden. Maßstabsbalken: 100 m (C) Untersuchen Sie die Neurosphäreneigenschaften mit einem Stammzellmarker-Panel. Maßstabsleiste: 50 m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Schematische Bilder der schrittweisen mittleren Hirnarterienverschlusschirurgie (MCAO) an Maus oder Ratte. Im Video finden Sie detaillierte chirurgische Eingriffe. ICA, interne Halsschlagader; ECA, äußere Halsschlagader; CCA, gemeinsame Halsschlagader. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 5: Schematische Bilder der intraarteriellen neuronalen Stammzellinjektion (NSC) bei Maus oder Ratte. Im Video finden Sie detaillierte chirurgische Eingriffe. ICA, interne Halsschlagader; ECA, äußere Halsschlagader; CCA, gemeinsame Halsschlagader. Der grüne Pfeil zeigt die Strömungsrichtung während der Injektion an. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 6: Verteilung, Überleben und Differenzierung neuronaler Stammzellen (NSCs) im ischämischen Gehirn. (A) Nachweis von GFP (+) NSCs innerhalb des Hippocampus-Dentat-Gyrus bei 1 d nach der Injektion. Stammzellen fluoreszierengrün; Doublecortin (DCX) Immunostainierung in rot dargestellt. Der weiße Pfeil zeigt einen GFP (+) NSC mit DCX-Ausdruck an. (B) Schematische Karte von GFP (+)-Zellen und DCX-markierten Zellen bei 10 d nach Ischämie-Reperfusion (I-R) in Scheinkontrollen (keine Injektion) und Fahrzeug (I-R) oder NSC (I-R + NSC) injizierte Mäuse. Die Topographie der ischämischen Beleidigung wird im letzten Schaltplan dargestellt, wo helleres und dunkleres Orange den Bereich darstellen, der ischämischen Herausforderungen und dem nekrotischen Kern ausgesetzt ist. Das blaue Band zeigt den Bereich "Wasserscheide" an. Die grauen Rechtecke zeigen die Orte, an denen Bilder für (C) und (D) aufgenommen wurden. (C,D) Exogene NSCs können sich nach der Entbindung in ein gliales Schicksal (GFAP, C) oder ein neuronales Schicksal (Tuj1, D) differenzieren. Im FITC-Kanal (GFP) wurden keine signifikanten Signale bei den Schlaganfalltieren beobachtet, die eine Fahrzeuginjektion erhielten (Fahrzeug in C und D), während bei NSC-injizierten Mäusen überlebende GFP-NSCs visualisiert und mit GFAP (C) oder Tuj1 (D) Färbung kolokalisiert wurden. Pfeile zeigen die Überlagerung von 2 Kanälen an. Maßstabsleiste: 20 m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Discussion
Die Stammzelltherapie bei neurologischen Erkrankungen befindet sich noch in einem frühen explorativen Stadium. Ein großes Problem ist, dass es keine etablierte Methode für eine ausreichende Bereitstellung von SCs oder NSCs in das Gehirn gibt.
Obwohl exogene SCs/NSCs im Gehirn nach intravenöser (IV), intraperitonealer (IP) oder intraparenchymaler/intracerebraler Injektion nachgewiesen werden können, hat jeder Verabreichungsansatz Nachteile. Die nachweisbare Population im Gehirn wird mit einer peripheren Injektion (IV oder IP) als sehr gering eingeschätzt, was nur einen kleinen Bruchteil der injizierten oder infundierten Zellen darstellt. Intracerebral Injektion ergibt eine sehr fokale Verteilung, und kann direkt induzieren Hirnverletzungen2,6,7,8,9,10,11,12,13. Daher haben wir die Machbarkeit der intraarteriellen Injektion als alternative Methode für die NSC-Verabreichung nach ischämischem Schlaganfall getestet. Diese Methode liefert NSCs durch die ipsilaterale zerebrale Perfusion nach einer Schlaganfallbeleidigung. Wenn sie früh nach einem Schlaganfall injiziert werden, können exogene NSCs die gestörte Blut-Hirn-Schranke (BBB) überqueren und eine breite Verteilung im gesamten Gehirn erreichen. Ein Vorteil der intraarteriellen Injektion ist, dass sie einen First-Pass-Effekt innerhalb des ZNS nutzt und das Potenzial für exogene NSCs maximiert, sich im Gehirn niederzulassen, im Gegensatz zu peripheren Verabreichungswegen, in denen die Zellen zuerst durch die reiche Mikrozirkulation von Filterorganen wie Lunge und Leber gehen.
Der hier beschriebene intraarterielle Ansatz ist vielseitig und kann an verschiedene Arten von Lieferparadigmen und Verletzungs- oder Krankheitsmodellen angepasst werden. Obwohl in der aktuellen Studie nur eine intraarterielle Injektion durchgeführt wird, kann der MRE025-Katheter an einen subkutan eingebetteten Mikroport angeschlossen werden, durch den Tiere repetitive intraarterielle Injektionen erhalten können12. Darüber hinaus kann mit dem einfacheren, einzigen Lumen-Design diese Injektionsmethode für die Lieferung von Reagenzien in Lösung12,23verwendet werden. Wenn die Lieferung mehrerer Therapeutika erforderlich ist, könnte das Dual-Lumen-Design verwendet werden, um eine erste Lösung gleichzeitig oder sequenziell mit einem zweiten Medikament oder einer zweiten Verbindung zu liefern. Für Anwendungen bei Nagetiermodellen der Neurodegeneration oder traumatischen Hirnverletzungen, bei denen die erste Schlaganfalloperation nicht erforderlich ist, kann eine Operation für die Installation des Injektionskatheters in der Maus auf der ECA durchgeführt werden (das gleiche Protokoll wie bei Ratten, entsprechend angepasst das Injektionsvolumen und die Rate in Schritt 7.4 für Mäuse), um eine mögliche Störung des zerebralen Blutflusses durch das CCA zu vermeiden.
Mehrere Nachteile und mögliche nachteilige Folgen dieser intraarteriellen Injektion sollten berücksichtigt werden. Tiere erhalten eine zweite Operation, die das Potenzial für Komplikationen im Zusammenhang mit Anästhesie oder Operation trägt. Der zerebrale Blutfluss durch die ipsilaterale CCA wird gestört, wenn auch vorübergehend (weniger als ein paar Minuten), was eine weitere vorübergehende Episode einer leichten Depression von CBF auslösen kann. Darüber hinaus ist BBB-Störung oder Öffnung für die intraarterielle NSC-Entbindung von entscheidender Bedeutung, was das therapeutische Fenster einschränkt. In der Pilotstudie wurden nach der intraarteriellen Injektion fast keine GFP (+) NSCs im naiven Gehirn nachgewiesen. Wenn das Subjekt jedoch Medikamente vertragen kann, die BBB vorübergehend öffnen können, wie z. B. Mannitol oder Kochsalzlösung mit hoher Osmolalität, könnte dies verwendet werden, um ein vorübergehendes Fenster der BBB-Öffnung für DieNSC-Injektion zu späteren Zeitpunkten zu erstellen. In vorläufigen Studien fanden wir heraus, dass die intraarterielle Injektion innerhalb der ersten 6 h nach einem Schlaganfall zu einer höheren Sterblichkeit führte als bei Schlaganfall allein beobachtet. Dies kann mit einer zweiten invasiven Operation nach einer relativ kurzen Phase der Genesung nach der ersten Operation zusammenhängen. Alternativ kann die verletzte Zerebrovaskulatur nach ischämischer Beleidigung eine höhere Tendenz haben, sich als Reaktion auf zusätzliche Reize, wie die Einführung des Katheters, zusätzliche Flüssigkeitsbelastung oder die Befestigung exogener NSCs an der Luminalwand nach der Injektion zu verengen. Eine weitere vernünftige Sorge in Bezug auf NSC-Lieferung nach Schlaganfall ist, dass NSCs Emboli bilden könnten, die Mikrogefäße weiter verschließen oder stören. In Übereinstimmung mit früheren Berichten8,16,24, fanden wir keine signifikanten Beweise für GFP (+) Emboli in der Mikrovaskulatur, obwohl wir GFP (+) NSCs im perivaskulären Raum (Virchow-Robin-Raum) in den frühen Tagen nach der Injektion gefunden haben. Nachdem wir das Zeitfenster für die Injektion optimiert hatten, gab es keinen Unterschied in der Komplikations- oder Sterblichkeitsrate zwischen Schlaganfallgruppen, die in der aktuellen Studie eine Fahrzeug- oder NSC-Injektion erhielten. Daher ist eine ordnungsgemäß konzipierte intraarterielle NSC-Injektion eine sichere und effiziente Methode zur NSC-Behandlung, die auf neurologische Erkrankungen abzielt.
Um eine erfolgreiche NSC-Injektion zu erreichen und die tierischen Ergebnisse zu verbessern, sollten mehrere Aspekte während der Schlaganfalloperation oder NSC-Injektion mit Vorsicht behandelt werden. Allgemeine chirurgische Unterstützung und Pflege, wie z. B. Schutz der Hornhaut und Aufrechterhaltung der Kerntemperatur, sollten praktiziert werden. Hier stellen wir einige mögliche Komplikationen dieser spezifischen Operation und Anleitung, um ihr Auftreten zu minimieren.
Es kann Stress auf dem Vagusnerv geben. Während der Operation sollte der Vagusnerv nicht gedehnt, zerkleinert, gekapselt oder stimuliert werden. Beiläufige Stimulation des Vagusnervs kann Arrhythmie wie Bradykardie, Herzstillstand oder sogar Tod induzieren.
Unsachgemäße Platzierung oder Verschärfung der Naht oder Fehlplatzierung oder Verrutschen eines Gefäßclips kann zu arteriellen Blutungen vom proximalen Ende von CCA (aus Herzleistung) oder distalen Ende durch den Kreis von Willis führen. Stellen Sie bei jedem Schritt sicher, dass der Gefäßclip oder die Knoten richtig platziert werden, um den Blutfluss zu verschließen. Wenn Blutungen auftreten, versuchen Sie, die korrekte Platzierung von Knoten oder Gefäßclips wiederherzustellen. Wenn das Gesichtsfeld mit Blut verwischt ist, legen Sie die Spitze eines sterilen Wattestäbchens auf den CCA und halten Sie mit Druck, um den Blutfluss zu stoppen. Hämoglobin aus Blutungen wird das Schließen des Schnittes auf der Arterie erleichtern. Nachdem die Blutung aufhört, ziehen Sie den Knoten fest oder platzieren Sie den Gefäßclip an der richtigen Stelle, reinigen Sie das Blut im Gesichtsfeld und setzen Sie die Operation fort.
Es kann Verletzungen oder Komplikationen durch Katheter-Einfügung geben. Trimmen Sie die MRE010-Spitze in einem 45°-Winkel, damit sie den kleinen Schnitt auf der Arterie leicht betreten kann, ohne gefäßverletzungen zu verursachen. In seltenen Fällen kann eine überschärfte Spitze in die Arterie eindringen oder den Raum zwischen Kellermembran und Tunika externa betreten. Um diese Verletzungen zu vermeiden, machen Sie einen richtigen Größenschnitt auf der Arterie. Wir empfehlen eine Größe von 1/4-1/3 den Umfang der Arterie, die groß genug ist, um den Eintritt der Katheterspitze zu ermöglichen, aber genügend Kraft in der Gefäßwand behält, um außerhalb des Katheters zu wickeln. Ein zu großer Schnitt kann zu einem Abriss der Arterie an der Einschnittstelle führen. Führen Sie die KAtheterspitze MRE010 vorsichtig an, um in den Einschnitt einzutreten. Zwingen Sie nicht den Eintritt der Katheterspitze oder das Vorrücken des Katheters. Bei Bedarf können scharfe Zangen verwendet werden, um die Kante des Einschnitts zu heben. Fördern Sie den Katheter mit einem niedrigen Winkel relativ zur Arterie, so dass Katheter und Arterie fast parallel sind.
Es gibt auch mögliche Injektionskomplikationen. Eine häufige Komplikation durch intraarterielle Injektion ist eine übermäßige Volumenbelastung, die zu akuter Herzüberlastung und Lungenödem führen kann. Schnelle Injektionsraten können diese Risiken verstärken und Schäden an der Gefäßwand verursachen8. Daher sollten sowohl die Rate als auch das Gesamtvolumen sorgfältig kontrolliert werden. Wir empfehlen 20 l/min als allgemein sicher für Mäuse, wenn sie über einen kurzen Zeitraum wie 5 Minuten verwendet werden. Wenn Symptome einer Volumenüberlastung festgestellt werden, wie schnelle, flache Atmung, rosa Blasen von Nares, oder Dysphorie-ähnliche aberrant Bewegung, sollte die Injektion gestoppt oder abgebrochen werden, und die Tiere erlaubt, sich zu erholen. Eine weitere mögliche Komplikation ist die Bildung von NSC Emboli im zerebrovaskulären System. Die Suspensionslösung sollte kein Kalzium oder Magnesium enthalten, von denen bekannt ist, dass sie die Zellaggregation fördern. Um die Wahrscheinlichkeit der Emboli zu verringern, sollten einzellige Suspensionen von NSCs kurz vor der Injektion unter dem Mikroskop untersucht werden, um das Fehlen von Zellclustern zu bestätigen. Wenn Zellcluster vorhanden sind, titrate mit einer sterilen 1 ml Pipette, bis eine einzellige Suspension erreicht ist.
Diese Studie untersucht die Durchführbarkeit des intraarteriellen Abgabeansatzes für Mäuse und Ratten und zeigt einige wichtige Merkmale dieser intraarteriellen Injektion von NSCs im Kontext eines ischämischen Schlaganfalls auf. Im Vergleich zur relativ fokalen Verteilung von NSCs, die im Hirnparenchym überleben, die typischerweise mit intrazerebraler Injektion1,7,9,11,,15,16berichtet wurden, beobachteten wir eine diffuse Verteilung über die ipsilaterale Hemisphäre, einschließlich Kortex, Hippocampus und Striatum. Somit eignet sich die intraarterielle Entbindung nicht nur für Schlaganfall, sondern auch für mehrere Verletzungsarten oder Krankheiten, die diffuse Hirnschäden mit sich bringen. In der Einstellung von MCAO wurde die höchste Konzentration von NSCs am Rand der Verletzungsstelle gefunden. Die erhöhte Dichte exogener NSCs in der Penumbra-Zone kann auf eine erhöhte Lieferung in diese Region durch Kollateralfluss aus wiederhergestellter Blutdurchblutung und Öffnung der BBB sowie auf die Migration von NSCs in den geschädigten Bereich zurückzuführen sein. Obwohl die IV-Lieferung von SCs zu einer diffusen Verteilung führen kann, wird die Anzahl der Zellen, die das Gehirn erreichen, auf einen kleinen Bruchteil der Gesamtmenge geschätzt, die zum Teil durch filtration durch periphere Organe8,13. Basierend auf einer früheren Studie über Hirnmetastasen12,intraarteriell injizierte Luziferase-markierte D122 Tumorzellen nutzten den First-Pass-Effekt, um sich in der zerebralen Vaskulatur niederzulassen und metastasierende Stellen im Gehirn anstatt in den peripheren Organen zu entwickeln. Zerebrale metastasierende Stellen aufgrund von exogenen Tumorzellen wurden im Gehirn ipsilateral zur Injektion bereits nach 1 Woche nach der Injektion mit einem IVIS-Bildgebungssystem nachgewiesen, um das biolumineszierende Signal durch den intakten Schädel und die Kopfhaut zu erkennen. Im Gegensatz dazu wurden Lumineszenzsignale (die auf die Tumorbelastung der exogenen Tumorzellen hinweisen) aus den peripheren Organen wie Leber, Lunge und Muskel erst 3-4 Wochen nach intraarterieller Injektion nachgewiesen. Daher erwarten wir, dass in einem ähnlichen Szenario die intraarterielle NSC-Abgabe auch vom Erstpasseffekt in der zerebralen Zirkulation profitieren wird, um die Lokalisierung des Gehirns im Vergleich zu peripheren Organen stark zu erhöhen.
Obwohl direkte intracerebrale Injektion verwendet werden kann, um eine große Anzahl von Zellen an das verletzte Gehirn zu liefern, führt der Ansatz zu zellulären Schäden oder Blutungen aufgrund der Nadelpenetration des Parenchyms, die lokalisierte Neuroinflammation auslöst, potenziell das Überleben und die Integration der neu gelieferten Zellen14,15,16,25,26. Der intraarterielle Ansatz für die NSC-Bereitstellung ist insofern vorteilhaft, als er diese lokalisierten Hirnschäden und Neuroinflammationn vermeidet und das langfristige Überleben von NSCs3,8,,9,14,24unterstützt. Wir beobachteten das Überleben und die Differenzierung der injizierten GPF-NSCs im verletzten Gehirn zu Zeitpunkten bis zu 30 d nach der Injektion. Obwohl wir NSCs gefunden haben, die sich in reife Neuronen und Astrozyten differenziert hatten, sind detaillierte Studien erforderlich, um die relative Verteilung verschiedener Zelltypen, die aus GFP-NSCs generiert wurden, und die Proportionen zu bestimmen, die bis in die chronische Nachverletzungsperiode überleben. Noch wichtiger ist, ob überlebende, exogene NSCs mit konstitutiven Gehirnzellen interagieren können, um das zerebrale Netzwerk wieder aufzubauen und die neurologische Funktion zu verändern, ist noch unklar und sollte erforscht werden.
Zusammen führen wir eine intraarterielle Verabreichungsmethode ein, um NSCs in das ischämische Gehirn zu liefern, was das langfristige Überleben in der ischämischen Hemisphäre und die Differenzierung in neuronale und gliale Zelltypen demonstriert. Der intraarterielle Verabreichungsansatz ist für zahlreiche Arten und mehrere Modelle von ZNS-Verletzungen und -Erkrankungen anpassungsfähig und kann für die Lieferung anderer Zelltypen oder einzelner oder mehrerer therapeutischer Verbindungen oder Biologika verwendet werden, was der neurowissenschaftlichen Gemeinschaft einen breiten Nutzen bietet.
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Disclosures
nichts.
Acknowledgments
Diese Forschung wurde unterstützt von den folgenden: AHA Award 14SDG20480186 für LC, Subject Innovation Team der Shanxi University of Chinese Medicine 2019-QN07 für BZ, und Kentucky Spinal Cord and Head Injury Research Trust Grant 14-12A für KES und LC.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 20 G needle | Becton & Dickinson | BD PrecisionGlide 305175 | preparation of injection catheter |
| 26 G needle | Becton & Dickinson | BD PrecisionGlide 305111 | preparation of injection catheter |
| 27 G needle | Becton & Dickinson | BD PrecisionGlide 305136 | preparation of injection catheter |
| 4-0 NFS-2 suture with needle | Henry Schein Animal Health | 56905 | surgery |
| 6-0 nylon suture | Teleflex/Braintree Scientific | 104-s | surgery |
| Accutase | STEMCELL Technologies | 7922 | cell detachment solution |
| blade | Bard-Parker | 10 | surgery |
| Buprenorphine-SR Lab | ZooPharm | Buprenorphine-SR Lab® | analgesia (0.6-1 mg/kg over 3 d) |
| Calcium/magnisum free PBS | VWR | 02-0119-0500 | NSC dissociation |
| DCX antibody | Millipore | AB2253 | immunostaining |
| GFAP antibody | Invitrogen | 180063 | immunostaining |
| Isoflurane | Henry Schein Animal Health | 50562-1 | surgery |
| MCAO filament for mouse | Doccol | 702223PK5Re | surgery |
| MCAO filament for rat | Doccol | 503334PK5Re | surgery |
| MRE010 catheter | Braintree Scientific | MRE010 | preparation of injection catheter |
| MRE025 catheter | Braintree Scientific | MRE025 | preparation of injection catheter |
| MRE050 catheter | Braintree Scientific | MRE050 | preparation of injection catheter |
| Nu-Tears Ointment | NuLife Pharmaceuticals | Nu-Tears Ointment | eye care during surgery |
| S&T Forceps - SuperGrip Tips JF-5TC Angled | Fine Science Tools | 00649-11 | surgery |
| S&T Forceps - SuperGrip Tips JF-5TC Straight | Fine Science Tools | 00632-11 | surgery |
| Superglue | Pacer Technology | 15187 | preparation of injection catheter |
| syringe pump | Kent Scientific | GenieTouch | surgery |
| Tuj1 antibody | Millipore | MAb1637 | immunostaining |
| two-component 5 minute epoxy | Devcon | 20445 | preparation of injection catheter |
| Vannas spring scissors | Fine Science Tools | 15000-08 | surgery |
| vascular clamps | Fine Science Tools | 00400-03 | surgery |
| Zeiss microscope | Zeiss | Axio Imager 2 | microscopy |
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