Summary
Iskemik inme sonrası yaygın karotis arter (fare) veya eksternal karotis arter (sıçan) yoluyla, enjekte çözeltileri veya süspansiyonlar için uyarlanabilir nöral kök hücreleri teslim etmek için bir yöntem bildirilmiştir. Enjekte edilen hücreler beyin parankim boyunca geniş bir şekilde dağıtılır ve doğumdan sonra 30 d'ye kadar tespit edilebilir.
Abstract
Nöral kök hücre (NSC) tedavisi inme, travmatik beyin hasarı ve nörodejeneratif bozukluklar için ortaya çıkan yenilikçi bir tedavi yöntemidir. İntrakranial doğumile karşılaştırıldığında, NSCs intra-arteriyel uygulama daha az invaziv ve beyin parankim içinde NSCs daha yaygın bir dağılım üretir. Ayrıca, intra-arteriyel doğum beyin dolaşımında ilk geçiş etkisi sağlar, periferik organlarda hücrelerin bindirme potansiyelini azaltarak, karaciğer ve dalak gibi, periferik enjeksiyonlar ile ilişkili bir komplikasyon. Burada, hem fare hem de sıçanlarda, iskemik inme sonrası ipsilateral hemisfere yaygın karotis arter (fare) veya harici karotis arter (sıçan) yoluyla NSC'lerin teslimi için metodolojiyi ayrıntılarıyla açıklıyoruz. GFP etiketli NSC'ler kullanarak, postiskemik doğumdan 1 d, 1 hafta ve 4 hafta sonra, iskemik yaralanma bölgesinin içinde veya yakınında daha yüksek yoğunlukta kemirgen ipsilateral yarımkürede elde edilen yaygın dağılımı gösteriyoruz. Uzun süreli sağkalıma ek olarak, 4 haftada GFP etiketli hücrelerin farklılaşmasına dair kanıtlar gösteriyoruz. NSC'ler için burada açıklanan intra-arteriyel doğum yaklaşımı terapötik bileşiklerin uygulanması için de kullanılabilir ve böylece birden fazla tür arasında çeşitli CNS yaralanma ve hastalık modelleri için geniş uygulanabilirlik vardır.
Introduction
Kök hücre (SC) tedavisi inme, kafa travması ve demans1,2,3,,4,5,6dahil olmak üzere nörolojik hastalıklar için bir tedavi olarak büyük bir potansiyele sahiptir. Ancak, hastalıklı beyne eksojen SCs sunmak için etkili bir yöntem sorunlu kalır2,6,7,,8,9,10,11,12,13. İntravenöz (IV) veya intraperitoneal (IP) enjeksiyonu da dahil olmak üzere periferik doğum yolları ile teslim edilen SC'ler, özellikle akciğer, karaciğer, dalak ve kas8,,9,13,14, hedef olmayan bölgelerde hücre birikimi şansını artırarak, mikrosirkülasyonda ilk geçiş filtreleme tabidir. İnvaziv intraserebral enjeksiyon yöntemi lokalize beyin dokusu hasarı ve enjeksiyon bölgesi 2 yakın SCs çok sınırlı dağılımı sonuçları2,,6,8,14,15,16. Yakın zamanda ekzojen nöral SCs (NSCs) sunmak için kateter bazlı intra-arteriyel enjeksiyon yöntemi kurduk, burada fokal iskemik inme bir kemirgen modelinde uygulanan açıklanan. Biz fare veya sıçan,17, 18,1819sol orta serebral arter (MCA) tıkamak için bir silikon kauçuk kaplı filament kullanarak bir yarımkürede geçici (1 saat) iskemi-reperfüzyon yaralanması indüklemek . Bu modelde laser Doppler veya Laser benkle,görüntüleme,17, 19,19, tutarlı nörolojik açıkları17,18,19ile ipsilateral hemisferde serebral kan akımının (CBF) yaklaşık% 75-85 depresyon tekrar gözlendi .
Zaman kazandıran amaçlar için video normal hızın iki katı hızda oynanacak şekilde ayarlanmıştır ve dikişle cilt hazırlama ve yara kapanması gibi rutin cerrahi işlemler ve motorlu şırınga pompasının kullanımı ve kurulumu sunulmamaktadır. NSC'lerin intra-arteriyel doğum yöntemi kemirgenlerde deneysel inme orta serebral arter oklüzyonu (MCAO) modeli bağlamında gösterilmiştir. Bu nedenle, ikinci ameliyatın, intra-arteriyel enjeksiyonun aynı hayvanın önceki cerrahi bölgesi kullanılarak nasıl yapıldığını göstermek için geçici iskemik inme prosedürünü de dahil ediyoruz. Kemirgen inme modellerinde intra-arteriyel NSC doğumunun fizibilitesi eksojen NSC'lerin dağılımı ve sağkalım ları değerlendirilerek gösterilmiştir. Beyin patolojisi ve nörolojik disfonksiyonu zayıflatmak için NSC tedavisinin etkinliği ayrı ayrı rapor edilecektir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Hayvan denelerine ilişkin tüm işlemler Kentucky Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylandı ve ameliyatla ilişkili stres veya ağrıyı en aza indirmek için uygun özen uygulandı.
1. Enjeksiyon kateteri ve cerrahi kancaların hazırlanması
- Enjeksiyon kateterini inşa edin (Şekil 1). MRE010, MRE025 ve MRE050 boru, 20 G, 26 G ve 27 G enjeksiyon iğneleri(Şekil 2A),600 kum kağıdı, süper yapıştırıcı ve iki bileşenli 5 dakikalık epoksi dahil olmak üzere gerekli malzemeleri toplayın.
- İğne göbeğinden 1 cm'ye 20 G ve 26 G iğneler kesin ve ucunu zımpara kağıdında parlatayın(Şekil 2B)parlayın. İğne deliklerini temizlemek için iğneleri 10 mL çift distile su yla yıkayın.
NOT: İki farklı tasarım(Şekil 1)kullanılmıştır. Design 1 tek bir konnektöre sahiptir ve çözelti veya süspansiyon enjeksiyonu için kullanılır. Tasarım 2, NSC içeren çözeltinin tam hacminin teslimedilmesini sağlamak için hücre enjeksiyonu (20 G iğne) ve ölü hacmin (26 G iğnesi) temizlenmesi için 20 G ve 26 G Luer kilit konektörlerine sahiptir.
- İğne göbeğinden 1 cm'ye 20 G ve 26 G iğneler kesin ve ucunu zımpara kağıdında parlatayın(Şekil 2B)parlayın. İğne deliklerini temizlemek için iğneleri 10 mL çift distile su yla yıkayın.
- Tasarım 1: 3-4 cm uzunluğunda mre010 kateteri 15 cm uzunluğundamitmitli MRE025 kateteri içine takın ve süper yapıştırıcı ile sabitleyin.
- MRE025 borunun diğer ucunu MRE050 kateterin bir bölümüne bağlayın ve süper yapıştırıcı ile sabitleyin. MRE050 kateterinin kalan ucuna donuk 20 G iğne yerleştirin ve süper yapıştırıcı ile sabitleyin(Şekil 1).
- Ayrıca epoksi tutkal ile bağlantı siteleri güçlendirmek. Bu kateter tasarımı reaktif enjeksiyonu için en uygun (kimyasal veya ilaç solüsyonları veya sitokinler gibi diğer biyolojik ler gibi).
- Tasarım 2: 3-4 cm uzunluğunda mre010 kateteri 15 cm uzunluğundamitmitli MRE025 kateteri içine takın ve süper yapıştırıcı ile sabitleyin.
- MRE025 borunun diğer ucunu MRE050 kateterin bir bölümüne bağlayın ve süper yapıştırıcı ile sabitleyin. MRE050 kateterinin kalan ucuna donuk 20 G iğne yerleştirin ve süper yapıştırıcı ile sabitleyin.
- MRE050 tüpüne ilk iğnenin ucuna yakın bir şekilde, enjeksiyon akışının yönünü takip eden donuk 26 G iğne yerleştirin ve süper yapıştırıcı ile sabitleyin(Şekil 1 ve Şekil 2C). Her iki iğneyi ve MRE050 tüp segmentini net epoksi(Şekil 2C)ile güçlendirin. Bu tasarım, nsc enjeksiyonundan sonra iğne 1 (20 G) iğne ile araç çözeltisinin beyin dolaşımına kateterdeki ölü hacmi niçin boşaltarak enjeksiyon hacimlerinin daha hassas bir şekilde kontrol altına alınmasını sağlar.
- NSC'lerin zarar görmesini en aza indirmek için NSC enjeksiyonu için 20 G iğne kullanın, bu da canlılığı olumsuz etkileyebilir.
- İnşaattan sonra kateterleri 10 mL çift distile su ile yıkayın ve ardından %70 etanol alın ve bir gecede %70 etanolle ıslatın.
- Ameliyattan önce kateterleri %70 etanolden çıkarın ve 10 mL steril PBS ile yıkayın ve depolama ve taşıma için otoklavlı cerrahi alet kutusuna yerleştirin.
- Cerrahi kancaların hazırlanması
- 27 G iğneden 1,5 cm uzunluğunda iğne mili kesin ve her iki ucunu da mat olana kadar zımpara kağıdında parlatalayın. Daha sonra bir ucunda bir kanca içine şaft ve diğer ucunda bir halka şeklinde şaft viraj için küçük bir hemostatik kelepçe kullanın.
- Halka nın içine 10-15 cm uzunluğunda bir MRE025 kateteri takın ve net cerrahi bantla sabitleyin(Şekil 2D). Aynı yöntemi kullanarak 2 daha fazla kanca olun.
- Tüm kancaları ve kateter sistemlerini kullanıma kadar %70 etanolle ıslatın.
2. Hayvan hazırlığı: Teslimat, barınma, çevreye uyum
- Bu çalışmada erkek ve dişi C57BL/6 fareler (10-12 hafta, n=10/zaman noktası) ve Wistar sıçanları (10-12 hafta, n=10) kullanıldı.
- Gıda ve su reklam libitum ile çevre kontrollü bir hayvan vivarium onları House.
- İnme ameliyatından en az 1 hafta önce çevreye uyum sağlamalarını bekleyin.
NOT: İnme ameliyatından sonra bir fare ve bir sıçan 1 d'de öldü ve bir fare ağır felç nedeniyle nsc enjeksiyonu öncesinde 3 d ötenazi yapıldı.
3. Fare ve sıçan nöral kök hücrelerinin kültürü (NSCs)
NOT: StC'ler,20 no'lubir protokole göre izole edilmiş ve kültürlüdür.
- Fare
- GFP pozitif erkek farelerle (B6 ACTb-EGFP) çiftleşmiş zamanlanmış gebelik dişi C57BL/6 farelerinden E18 embriyonik korteksinden yabani tip (WT) ve GFP etiketli NSC'leri izole edin. GFP (+) embriyoları tanımlamak için, FITC kanalını kullanarak bir floresan mikroskop üzerinde hasat edilen embriyoları gözlemleyin. GFP (+) embriyolar yeşil floresan sinyali verirken WT embriyoları sadece zayıf oto floresan gösterir(Şekil 3A).
- Sıçan
- Genç erişkin WT sıçanların subventriküler zonundan (SVZ) NSC'leri izole edin. Üreticinin talimatları21aşağıdaki enjeksiyon hemen önce DiI ile etiketleyin.
- Kültür faresi veya sıçan NSC'leri nörosferlere dönüşene kadar ve küre çapı 100 μm'ye ulaştığında bunları iletirler(Şekil 3B). 3 ve 5 pasajları arasında enjeksiyon için NSCs kullanın.
- Kök hücre özelliklerini embriyonik kök hücre belirteç paneli(Şekil 3C)kullanarak doğrulayın.
- Enjeksiyon gününde, NSC küreleri toplamak ve hücre ayırma çözeltisi ile ayrıştırmak, kalsiyum askıya- ve magnezyum içermeyen PBS bir konsantrasyon için 107 hücre /mL, ve enjeksiyon kadar ıslak buz üzerine yerleştirin.
4. Cerrahi hazırlık
- Ameliyattan önce, ticari MCAO sütürüzerinde, ekleme uzunluğunun cerrahi içi referansı için uçtan 9 mm (fare için) veya 15 mm (fare için) gümüş kalemle bir nokta işaretleyin. Otoklav cerrahi aletleri (makas, forceps) ve aletleri her ameliyattan önce, ve ısı ameliyatları arasında bir cam boncuk sterilizatör onları sterilize.
- İnhalasyon yoluyla %5 isofluran ile hayvanlarda anestezi yi tirve %1-2 isofluran ile anesteziyi sürdürün. Genel koşulların gözlemi (solunum paterni, bıyık hareketi ve spontan vücut düzeltme duruşu), kornea refleksi ve ayak ucuna yanıt yoluyla anestezi derinliğini değerlendirin.
- Bir ısıtma yastığı üzerine hayvan supine lay ve kırpma ve betadine çözeltisi ile ovma tarafından hayvan üzerinde cerrahi site hazırlamak% 70 etanol izledi. Ameliyat sırasında göz hevesi (örn. yapay gözyaşı merhemi) uygulayarak hayvanın gözlerini kurumaya karşı koruyun.
- Cerrahlar iyice bir bakteriyosidal scrub ile ellerini ovmak ve bir maske, steril eldiven ve temiz bir laboratuvar önlüğü giymek var.
5. Orta serebral arter oklüzyonu (MCAO) inme cerrahisi
NOT: Fare veya sıçan ın bir yarımkürede iskemik inme indüklemek için yapılan ameliyatlar, iç karotis artere (ICA) kan akışını tıkamak için bir sütür inmesi ile benzerdir (Şekil 4)17,18,19,22. Ancak, dikiş ekleme için seçilen arter sonraki kök hücre enjeksiyonu için gerekli mevcut çalışma alanına göre değişir. Sıçan iki ayrı izin vermek için dış karotis arter geniş alana sahiptir (ECA) segmentinde iki ayrı, sıralı ameliyatlar (inme ve NSC enjeksiyon), ama fare yok, alternatif bir yaklaşım gerektiren. İnmeye bağlı serebral kan akımı değişiklikleri, beyin enfarktüs boyutu ve nörolojik açıkları yazarların önceki raporlarında olduğu gibi bildirilmiştir17,18,19.
- İskemik inme indüklemek için, servikal bölgede orta hat kesisi ve sol ortak karotis arter (CCA), ECA ve ICA izolasyonu ile hem fare hem de sıçan ameliyatlarına başlayın(Şekil 4). CCA veya vagus sinirini esnetmeme, yerinden etmemeye veya sıkmamaya dikkat edin. Arter ve cerrahi basamak seçimi bundan sonra farklı olduğundan, fare ve sıçan üzerinde MCAO cerrahisi ayrı ayrı açıklanacaktır.
- Farede MCAO cerrahisi (Şekil 4A)
- CCA'nın altına üç örgülü 6-0 naylon dikiş yerleştirin(Şekil 4A, adım 1), ve proksimal dizeyi kullanarak damarı mümkün olduğunca çatallanmadan uzak tatmak için sıkı bir cerrahi düğüm yapın(Şekil 4A, adım 2). Dikiş uçlarını kırpın.
- CCA distal tarafında bir slipknot olun (dikkat: adım 6 çıkacak gibi aşırı sıkın) ve iki sıkılmış düğüm arasında bir gevşek slipknot(Şekil 4A, adım 2).
- CcA'daki proksimal düğüme mikrosiküllü(Şekil 4A, adım 3) yakın küçük bir kesi (~ 1/4 - 1/3) kesin ve ticari silikon kauçuk kaplı 7-0 katı naylon dikiş(Şekil 4A, adım 4) dikkatlice takın. Bu sütü, ica'dan gelen geri akışla kesiden kan sızıntısı ve silikon kauçuk kaplı naylon filamentin hareketini sağlamak için yeterince sıkılaştırarak orta dize ile sabitle,(Şekil 4A, adım 5) ve yine de sütürin cımbıztarafından hafif bir itme ile ECA'ya doğru ilerlemesine izin verin.
- Üst (distal) slipknot bırakın(Şekil 4A, adım 6) ve ucu 9 mm için çatallanma geçene kadar ICA içine naylon dikiş ilerlemek (bir referans olarak dikiş üzerinde gümüş marker kullanarak). Sütürgüvenli ve kan geri akışını önlemek için üst iki slipknot sıkın.
- Filament 1 saat sonra(Şekil 4A, adım 7) ve kanamayı önlemek için orta düğümü kullanarak CCA'yı litgate(Şekil 4A, ters sırada 5-7 adım, adım 8'de görüldüğü gibi kesin sonuçlar). Üst düğümü serbest bırak. Yarayı 4-0 cerrahi dikişle kapatın.
- Sıçanda MCAO cerrahisi (Şekil 4B)
- ECA'nın altına iki örgülü 6-0 naylon dikiş yerleştirin(Şekil 4B, adım 1) ve distal ucunda mümkün olduğunca sıkı bir düğüm yapın(Şekil 4B, adım 2).
- Damar klipslerini arteriyel kan akışını tıkamak için ICA ve CCA'ya yerleştirin(Şekil 4B, adım 3). Bir slipknot bir damar klipsi için alternatif olarak kullanılabilir.
- Mikroskalatör(Şekil 4B, adım 3-4) ile ECA üzerinde küçük bir kesi yapın, 6-0 naylon filament(Şekil 4B, adım 5) kaplanmış ticari silikon kauçuk takın ve ECA üzerinde bir slipknot ile düzgün bir şekilde sabit.
- ICA'daki damar klibini serbest bırakın, filamenti GÜMÜŞ marker (15 mm)çatallamayaulaşana kadar ICA'ya doğru ilerletin ve eca'daki2 düğümle sütü sabitleyin(Şekil 4B, adım 6).
- İskemi 1 saat sonra, bu filament çekin ve kanamayı önlemek için kesi ligate(Şekil 4B, adım 7), CCA damar klipsi çıkarın (adım 8 olarak nihai sonuç), ve 4-0 cerrahi sütür ile yara kapatın.
6. Kurtarma
- İnme ameliyatından sonra, hayvanları tamamen bilincini geri kazanana kadar ısıtma yastığına yerleştirin.
- Subkutan enjeksiyon ile analjezi sağlayın. Su ve gıda reklam libitum erişimi ile ev kafeslerine hayvanları geri dönün.
7. İntra-arteriyel enjeksiyon
- Tüm kateteri %70 etanol ile yıkayın ve kullanım anına kadar bir gece bekletin. Enjeksiyondan hemen önce, iğnenin Luer kilidini steril bir şırınga ile bağlayın ve kateter sisteminin tüm lümen tarafını 10 mL steril PBS ile yıkayın.
- NSC enjeksiyonu için zaman penceresi ve hazırlık
NOT: Diğer araştırma ekiplerinin deneyimlerine ve raporlarına dayanarak, NSC enjeksiyonunun zamanlaması hem deneklerin hem de eksojen NSC'lerin hayatta kalması için çok önemlidir. Pilot çalışmamızda NSC'lerin erken zaman noktalarında (reperfüzyondan sonraki ilk 6 saat içinde) enjeksiyonu mortaliteye yol açmıştır. Böylece, daha sonra enjeksiyon zaman noktalarını test ettik ve inme den sonra 2 d (48 h) ile 3 d (72 saat) arasındaki zaman penceresini belirledik ve nsc'lerin intraparenchymal dağılımının sağlanmasında etkilidir.- Şırınga pompası enjeksiyon hızını fareler için 20 μL/dk, sıçanlar için 50 μL/dk olarak ayarlayın. Enjeksiyonun aşırı hızı veya süresi, farelerin farelerden daha savunmasız olduğu sistemik hacim aşırı yüklenmesine neden olabilir.
- Kısacası, inme ameliyatından sonra 3 d, isoflurane ile hayvanları anestezik ve bir ısıtma yastığı üzerinde supine onları koymak.
- Servikal yarayı yeniden açın ve ECA, ICA ve CCA'yı tekrar ortaya çıkarTın(Şekil 5, adım 1). İnme ameliyatlarında olduğu gibi, enjeksiyon rotasını türlere göre belirleyin. Farede NSC enjeksiyonu için CCA ve sıçan23için ECA kullanın.
- Farede CCA ile intra-arteriyel enjeksiyon
- CCA altında iki 6-0 örgülü naylon dikiş yerleştirin. Bir önceki inme ameliyatından çatallanma ve alt düğümler arasında her biri ile gevşek bir slipknot oluşturun(Şekil 5, adım 2).
- Üst slipknot sıkın ve daha sonra alt düğüm üzerinde küçük bir kesi yapmak(Şekil 5, adım 3). Kesiden bir MRE010 kateteri takın(Şekil 5, adım 4) ve enjeksiyon akışını engellemeden orta düğümile sabitlein(Şekil 5, adım 5). Üst düğümü serbest ve kateter pozisyonunu ayarlarken kanın geri akışı kateterde görülmelidir.
- ECA'ya bir damar klipsi yerleştirin, 20 μL/dk'da bu kateterden 5 dakika boyunca şırınga pompası ile 1 x 106 GFP-NSC enjekte edin ve ardından aynı hızda 50-100 μL PBS ile floş çekin.
- Enjeksiyondan sonra CCA'yı kesinin üstündeki üst düğümle iniatın üzerine çekin ve MRE010 kateteri çekin(Şekil 5, adım 6). Sıkın ve orta düğüm ve üst düğüm kırpın. Damar klibini ECA'dan çıkarın. Şekil 5'teki son resme bakın , adım 7.
- Yarayı 4-0 cerrahi dikişle kapatın.
- Bir ısıtma yastığı ve deri altı analjezik enjeksiyon yeterli kurtarma sağladıktan sonra, ev kafesi için hayvanları geri dönün.
- Sıçanda ECA ile intra-arteriyel enjeksiyon
- ECA ve CCA'yı geçici olarak damar klipsleri ile tıka(Şekil 5, adım 2).
- ECA'nın proksimal tarafında küçük bir kesi yapın(Şekil 5, adım 3), MRE010 kateteri takın ve düğümle sabitlein(Şekil 5, adım 4).
- Her iki damar klipsini de çıkarın, motorlu şırınga pompası kullanarak 500 μL/dk'da 100 μL'lik PBS'ye 5x 106 NSC enjekte edin, ardından 50-100 μL PBS(Şekil 5, adım 5) ile aynı hızda bir floş çekin.
- Enjeksiyondan sonra CCA ve ECA'yı tekrar damar klipsleri ile tonuyla tonur ve enjeksiyon kateteri çekildikten sonra ikinci kesinin proksimal tarafında ECA'yı inklüzyon edin(Şekil 5, adım 6).
- İki damar klipsini çıkarın(Şekil 5, adım 7) ve yarayı 4-0 cerrahi dikişle kapatın.
- Bir ısıtma yastığı ve deri altı analjezik enjeksiyon yeterli kurtarma sağladıktan sonra, ev kafesi için hayvanları geri dönün.
- Histolojik çıktı
- İnjektörden sonra ötanazi ve intrakardiyak perfüzyon dan sonra nsc enjeksiyonu ve intrakardiyak perfüzyon ile 1 d (fare ve sıçan), 7 d (fare) ve 30 d (fare) ile iskemik inme alınan fare ve sıçanlardan beyin toplayın. Bu dört grubun her biri 5 NSC ve 5 araç enjekte hayvandan oluşuyordu.
- Bir gecede beyinleri düzeltin ve 3 d için% 30 sakaroz kriyokorun.
- Beyinleri OCT'ye yerleştirin, 40 μm kalınlığında dilimleyin ve glial fibrillary asidik protein (GFAP, astrositler), Tuj1 (olgun nöronlar) ve doublecortin (DCX, olgunlaşmamış nöronlar) dahil olmak üzere hücrespesifik belirteçlerle immünboyama sonrası NSC'lerin dağılımını inceleyin.
NOT: GFP ifade eden bir sıçan türünün olmaması nedeniyle, geçici floresan etiket olan DiI'yi, sadece nispeten kısa süreli gözlemsağlayan sıçan NSC'leri için kullandık. Bu nedenle, NSC dağılımı sıçanlarda inme sonrası sadece 1 d olarak incelendi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
GFP etiketli NSC'ler iskemik beyinde, çoğunlukla ipsilateral hemisferde, özellikle penumbrada ve yaralanma kenarı boyunca kolayca saptanmıştır(Şekil 6). Muayeneci görüntüleme ve analiz sırasında tek kör oldu.
Örneğin, enjeksiyondan sonra 1 d'de fare hipokampusu içinde NSC saptandı. NSC'lerin bir alt kümesi, bu erken zaman noktasında bile dentat girustaki olgunlaşmamış nöron belirteci DCX'in ortak ekspresyonu göstermiştir(Şekil 6A).
İnme sonrası 10 d'de (NSC enjeksiyonundan sonra 7 d), striatum ve kortekste yaralanma (havza alanı) kenarında en yüksek yoğunlukta ekzojen GFP-NSC'ler gözlendi(Şekil 6B). Bu 7 d enjeksiyondan sonra GFP-NSCs birçok da DCX ifade dikkat çekicidir (mavi daireler tarafından gösterilir), onların nöronal kaderi gösteren. Araç solüsyonu enjeksiyonu alan hayvanlarla karşılaştırıldığında, NSC enjeksiyonu ipsilateral yarımkürede DCX boyama (kırmızı) da artmıştır.
Enjeksiyondan sonra 30 d'de, NSC'ler hala yaralı kortekste tespit edildi ve bunların bir kısmı glial marker GFAP(Şekil 6C)veya olgun nöronal marker Tuj1(Şekil 6D)ekspresyonu gösterdi, eksojen NSC'lerin glial veya nöronal kadere ayırt olma ve yaralı beyinde 1 aya kadar hayatta kalma potansiyelini gösteren.
Şekil 1: Enjeksiyon kateterlerinin şematik tasarımları. Biz iki tasarım tanıtmak, Bileşik çözelti enjeksiyon için Tasarım 1 ve hücre enjeksiyonu için Tasarım 2. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: NSC enjeksiyonu ve cerrahi kancalar için kateter hazırlanması. (A) Kateter yapımı için malzemeler: MRE010, MRE025 ve MRE050 kateterler sırasıyla 3 cm, ~10-15 cm ve 3 cm uzunluklarda. (B) İğne uçlarını kesin ve donuk olana kadar parlatın. (C) Her segmenti bağlayın ve süper yapıştırıcı ile güvenli ve sonra geliştirme için epoksi hem iğne Luer kilitleri ve MRE050 segmenti gömmek. (D) 27 G iğne mili ve MRE025 kateter kullanarak cerrahi kanca yapın. Ölçek çubuğu: 5 mm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 3: GFP kültürü (+) sinirsel kök hücreler. (A) FITC kanalını kullanarak GFP (+) embriyoları floresan mikroskobu ile tanımlayın. (B) Nörosferoluşturana kadar kortikal NSC'leri izole edin ve kültürlendirin. Ölçek çubuğu: 100 μm. (C) Kök hücre marker paneli kullanarak nörosfer özelliklerini inceleyin. Ölçek çubuğu: 50 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Fare veya sıçanda adım adım orta serebral arter tıkanıklığı (MCAO) inme cerrahisinin şematik görüntüleri. Ayrıntılı cerrahi operasyon için videoya bakın. ICA, internal karotis arter; ECA, eksternal karotis arter; CCA, yaygın karotis arter. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: Fare veya sıçanda intra-arteriyel nöral kök hücre (NSC) enjeksiyonunun şematik görüntüleri. Ayrıntılı cerrahi operasyon için videoya bakın. ICA, internal karotis arter; ECA, eksternal karotis arter; CCA, yaygın karotis arter. Yeşil ok enjeksiyon sırasında akış yönünü gösterir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 6: İskemik beyinde nöral kök hücrelerin (NSC) dağılımı, hayatta kalması ve farklılaşması. (A) Hipokampal dentat girus içinde GFP (+) NSCs tespiti 1 d enjeksiyondan sonra. Kök hücreler floresan yeşil; doublecortin (DCX) immünboylama kırmızı ile gösterilmiştir. Beyaz ok, DCX ifadesine sahip bir GFP (+) NSC'yi gösterir. (B) GFP (+) hücrelerinin şematik haritası ve DCX etiketli hücreler iskemi-Reperfüzyon (I-R) sonrası şam kontrolleri (enjeksiyon yok) ve araç (I-R) veya NSC (I-R + NSC) enjekte edilmiş fareler. İskemik hakaretin topografyası, sırasıyla iskemik meydan okumaya ve nekrotik çekirdeğin tabi olduğu alanı daha açık ve koyu turuncunun temsil ettiği son şemada betimlenmiştir. Mavi şerit "havza" alanını gösterir. Gri dikdörtgenler,(C) ve (D)için görüntülerin çekildiği yerleri tasvir eder. (C,D) Eksojen NSC'ler doğumdan sonra glial kader (GFAP, C) veya nöronal kader (Tuj1, D) 30 d'ye ayırt edebilirler. Araç enjeksiyonu (C ve Daraç) alan inme hayvanlarında FITC (GFP) kanalında anlamlı bir sinyal gözlenmezken, NSC enjekte edilen farelerde, hayatta kalan GFP-NSC'ler GFAP (C) veya Tuj1 (D) boyama ile görselleştirildi ve colocalized edildi. Oklar 2 kanalın yerkaplaması gösterir. Ölçek çubuğu: 20 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Nörolojik hastalıklar için kök hücre tedavisi hala erken bir keşif aşamasındadır. Önemli bir sorun beyne SCs veya NSCs yeterli teslim için kurulmuş bir yöntem olmasıdır.
İntravenöz (IV), intraperitoneal (IP) veya intraparenkimal/intraserebral enjeksiyon sonrası beyinde ekzojen SCS/NSC saptamasına rağmen, her doğum yaklaşımının sakıncaları vardır. Beyin içinde saptanabilir popülasyon çok düşük periferik enjeksiyon ile olduğu tahmin edilmektedir (IV veya IP), enjekte veya aşılanmış hücrelerin sadece küçük bir kısmını temsil eden. İntraserebral enjeksiyon çok odak dağılımı verir, ve doğrudan beyin hasarı neden olabilir2,6,7,8,9,10,11,12,13. Bu nedenle, iskemik inme sonrası NSC doğumiçin alternatif bir yöntem olarak intra-arteriyel enjeksiyon fizibilite test etti. Bu yöntem, inme hakaretinden sonra ipsilateral serebral perfüzyon yoluyla NSC'ler sağlar. İnmeden sonra erken enjekte edilirse, eksojen NSC'ler bozulmuş kan-beyin bariyerini (BBB) geçerek beyin de geniş bir dağılım elde edebilirler. İntra-arteriyel enjeksiyonun bir avantajı, cns içinde ilk geçiş efektini kullanmasa da, eksojen NSC'lerin beyinde yerleşme potansiyelini en üst düzeye çıkarır, hücrelerin ilk kez akciğer ve karaciğer gibi filtreleme organlarının zengin mikrosirkülasyonundan geçtiği çevresel dağıtım yollarının aksine.
Burada açıklanan intra-arteriyel yaklaşım çok yönlüdür ve farklı doğum paradigmaları ve yaralanma veya hastalık modellerine uyum sağlayacak şekilde uyarlanabilir. Mevcut çalışmada sadece bir intra-arteriyel enjeksiyon yapılmasına rağmen, MRE025 kateter subkutan gömülü bir mikroport bağlanabilir, hangi aracılığıyla hayvanların tekrarlayan intra-arteriyel enjeksiyonlar alabilirsiniz12. Ayrıca, basit, tek lümen tasarımı ile, bu enjeksiyon yöntemi çözelti12,,23reaktiflerin teslimi için kullanılabilir. Birden fazla terapötik teslim gerekiyorsa, çift lümen tasarımı aynı anda veya sırayla ikinci bir ilaç veya bileşik ile bir başlangıç çözüm sunmak için kullanılabilir. Nörodejenerasyon veya travmatik beyin hasarı kemirgen modelleri için uygulamalar için, ilk inme cerrahisi için gerek yoktur, fare enjeksiyon kateter kurulumu için cerrahi ECA yapılabilir (sıçan için aynı protokol, uygun fareler için Adım 7.4 enjeksiyon hacmi ve oranı ayarlama), CCA ile serebral kan akımının potansiyel bozulmasını önlemek için.
Bu intra-arteriyel enjeksiyonun çeşitli dezavantajları ve olası yan sonuçları göz önünde bulundurulmalıdır. Hayvanlar anestezi veya cerrahi ile ilgili komplikasyonlar için potansiyel taşıyan ikinci bir ameliyat alırsınız. Ipsilateral CCA ile serebral kan akımı rahatsız, geçici de olsa (birkaç dakikadan az), CBF hafif depresyon başka bir geçici atak neden olabilir. Buna ek olarak, BBB bozukluğu veya açılması terapötik pencereyi sınırlayan intra-arteriyel NSC doğum için önemlidir. Pilot çalışmada, intra-arteriyel enjeksiyon sonrası naif beyinde neredeyse hiç GFP (+) NSC saptanmadı. Ancak, denek geçici olarak BBB açabilirsiniz ilaçlar tolere edebilir, yüksek osmolalite mannitol veya salin gibi, Bu daha sonraki zaman noktalarında NSC enjeksiyonu için BBB açılış geçici bir pencere oluşturmak için kullanılabilir. Ön çalışmalarda inme sonrası ilk 6 saat içinde intra-arteriyel enjeksiyonun tek başına inme ile gözlenenden daha yüksek mortalite ile sonuçlandığını bulduk. Bu ilk ameliyattan sonra iyileşme nispeten kısa bir süre sonra ikinci bir invaziv cerrahi ile ilgili olabilir. Alternatif olarak, iskemik hakaretten sonra, yaralı serebrovaskülatörü, kateterin getirilmesi, ek sıvı yüklemesi veya enjeksiyondan sonra ışık duvarına eklenmesi gibi ek uyaranlara yanıt olarak daha yüksek bir eğilime sahip olabilir. İnme sonrası NSC teslimatı ile ilgili bir diğer makul endişe, NSC'lerin mikrodamarları daha fazla tıkaveya rahatsız eden emboli oluşturabildiğidir. Öncekiraporlarile anlaşma 8,16,24, biz mikrovaskülüste GFP (+) emboli önemli kanıt bulamadık, biz perivasküler alanda GFP (+) NSCs bulmak rağmen (Virchow-Robin uzay) enjeksiyondan sonra ilk günlerinde. Enjeksiyon için zaman penceresini optimize ettikten sonra, mevcut çalışmada araç veya NSC enjeksiyonu alan inme grupları arasında komplikasyon veya mortalite oranı arasında fark yoktu. Bu nedenle, düzgün tasarlanmış intra-arteriyel NSC enjeksiyonnörolojik hastalıkları hedefleyen NSC tedavisinin güvenli ve verimli bir yöntemdir.
Başarılı NSC enjeksiyonu elde etmek ve hayvan sonuçlarını iyileştirmek için, inme cerrahisi veya NSC enjeksiyonu sırasında çeşitli yönleri dikkatle ele alınmalıdır. Korneanın korunması ve çekirdek sıcaklığının korunması gibi genel cerrahi destek ve bakım uygulanmalıdır. Burada bu özel cerrahi ve rehberlik bazı potansiyel komplikasyonlar ı en aza indirmek için tanıtmak.
Vagus sinirinde stres olabilir. Ameliyat sırasında vagus siniri gerilmemeli, ezilmemeli, ligated veya uyarılmamalıdır. Vagus sinirinin tesadüfi stimülasyonu bradikardi, kalp durması ve hatta ölüm gibi aritmiye neden olabilir.
Dikişin yanlış yerleştirilmesi veya sıklanması veya bir damar klibinin yanlış yerleştirilmesi veya kayması, CCA'nın proksimal ucundan (kardiyak çıkıştan) veya Willis Çemberi'nden distal uçtan arteriyel kanamaya neden olabilir. Her adımda, damar klipsi veya düğümleri kan akışını tıkamak için düzgün yerleştirilir emin olun. Kanama oluşursa, düğüm veya damar klipsleri doğru yerleşim geri deneyin. Görme alanı kan la bulanıksa, CCA'ya steril bir pamuk lu bezin ucunu koyun ve kan akışını durdurmak için basınçla tutun. Kanamadan hemoglobin arter üzerinde kesi kapatılmasını kolaylaştıracaktır. Kanama durduktan sonra, düğümü sıkın veya damar klibini doğru yere yerleştirin, görme alanındaki kanı temizleyin ve ameliyata devam edin.
Kateter takılmasından kaynaklanan yaralanma veya komplikasyonlar olabilir. MRE010 ucunu 45° açıyla kesin, böylece herhangi bir damar yaralanmasına neden olmadan arterdeki küçük kesiye kolayca girebilirsiniz. Nadir durumlarda, aşırı keskinleştirilmiş bir uç arter nüfuz edebilir veya bazal membran ve tunaica externa arasındaki boşluk girin. Bu yaralanmaları önlemek için, arter üzerinde uygun bir boyut kesi yapmak. Biz 1/4-1/3 arter çevresi bir boyut öneririz, hangi kateter ucu girişine izin verecek kadar büyük, ama kateter dışında sarmak için damar duvarında yeterli gücü korur. Çok büyük bir kesi kesi yerinde arter yırtılmasına yol açabilir. Kesiye girmek için MRE010 kateter ucunu yavaşça yönlendirin. Kateter ucunun girişini veya kateterin ilerlemesini zorlamayın. Gerekirse, keskin forseps kesi kenarını kaldırmak için kullanılabilir. Kateteri artere göre düşük açı ile ilerletin, böylece kateter ve arter neredeyse paraleldir.
Olası enjeksiyona bağlı komplikasyonlar da vardır. İntra-arteriyel enjeksiyondan kaynaklanan sık karşılaşılan komplikasyonlardan biri aşırı hacim yüklemesidir, bu da akut kardiyak aşırı yük ve pulmoner ödeme yol açabilir. Hızlı enjeksiyon hızları bu riskleri yükseltebilir ve damar duvarına zarar verebilir8. Bu nedenle hem oran hem de toplam hacim dikkatle kontrol edilmelidir. 5 dakika gibi kısa bir süre boyunca kullanıldığında fareler için 20 μL/dk'nın genellikle güvenli olduğunu tavsiye ediyoruz. Hacim aşırı belirtileri, hızlı, sığ nefes, nares pembe kabarcıklar, ya da disfori benzeri anormal hareket gibi belirtilirse, enjeksiyon durdurulmalı veya iptal edilmelidir, ve hayvanların kurtarmak için izin. Bir diğer olası komplikasyon da serebrovasküler sistemde NSC embolisi oluşumudur. Süspansiyon çözeltisi kalsiyum veya magnezyum içermemelidir, hangi hücre toplama teşvik etmek bilinmektedir. Emboli indükleme şansını azaltmak için, hücre kümelerinin yokluğunu doğrulamak için nsc'lerin tek hücreli süspansiyonları enjeksiyondan hemen önce mikroskop altında incelenmelidir. Hücre kümeleri varsa, tek hücresüspansiyonelde edilene kadar steril 1 mL pipet ile titre.
Bu çalışma, fare ler ve sıçanlar için intra-arteriyel doğum yaklaşımının fizibilitesini belirler ve iskemik inme bağlamında NSC'lerin bu intra-arteriyel enjeksiyonunun birçok önemli özelliğini ortaya koymaktadır. Beyin parankiminde hayatta kalan NSC'lerin nispeten fokal dağılımına göre tipik olarak intraserebral enjeksiyon1,,7,9,11,15,16ile bildirilmiştir, korteks, hipokampus ve striatum dahil olmak üzere ipsilateral hemisfer boyunca yaygın bir dağılım gözlemledik. Böylece, intra-arteriyel doğum sadece inme için değil, aynı zamanda birden fazla yaralanma türleri veya yaygın beyin hasarı içeren hastalıklar için uygundur. MCAO ayarında, en yüksek NSC konsantrasyonu yaralanma bölgesinin kenarı boyunca bulundu. Penumbra bölgesindeki eksojen NSC'lerin artan yoğunluğu, yeniden kurulan kan perfüzyonu ve BBB'nin açılmasından kaynaklanan teminat akışı ve NSC'lerin hasarlı bölgeye göçü yoluyla bu bölgeye yapılan teslimatın artmasından kaynaklanabilir. SCs IV teslim diffüz dağılımı neden olsa da, beyne ulaşan hücre sayısı toplam teslim küçük bir kısmını olduğu tahmin edilmektedir, kısmen periferik organlar tarafından filtrasyon nedeniyle8,13. Beyin metastazı üzerinde daha önce yapılan bir çalışmaya dayanarak12, intra-arteriyel enjekte luciferase etiketli D122 tümör hücreleri serebral vaskülatür yerleşmek ve periferik organlar yerine beyinde metastatik siteler geliştirmek için ilk geçiş etkisi yararlandı. Eksojen tümör hücrelerine bağlı serebral metastatik bölgeler, sağlam kafatası ve kafa derisi ile biyolüminesans sinyalini tespit etmek için iVIS görüntüleme sistemi kullanılarak enjeksiyondan 1 hafta sonra enjeksiyona bağlı olarak beyin ipsilateralinde saptandı. Buna karşılık, karaciğer, akciğer ve kas gibi periferik organlardan gelen lüminesans sinyaller (eksojen tümör hücreleri ile ilişkili tümör yükünü gösteren), intra-arteriyel enjeksiyondan 3-4 hafta sonraya kadar saptanmadı. Bu nedenle, benzer bir senaryoda, intra-arteriyel NSC doğum da büyük ölçüde periferik organlara göre beyne lokalizasyonu artırmak için serebral dolaşımda ilk geçiş etkisi yararlanacak bekliyoruz.
Doğrudan intraserebral enjeksiyon yaralı beyne hücrelerin çok sayıda teslim etmek için kullanılabilir rağmen, yaklaşım hücresel hasar veya kanama lokalize nöroinflamasyonu tetikleyen parankim iğne penetrasyonu nedeniyle sonuçları, potansiyel hayatta kalma ve yeni teslim hücrelerin entegrasyonu ödün14,15,16,25,26. NSC teslimat ı için intra-arteriyel yaklaşım bu lokalize beyin hasarı ve nöroinflamasyon önler avantajlı, ve NSCs uzun süreli sağkalım destekler3,8,9,14,24. Enjeksiyondan sonra 30 d'ye kadar olan noktalarda yaralı beyinde enjekte edilen GPF-NSC'lerin sağkalım ve farklılaşması gözlendi. Olgun nöronlar ve astrositler olarak farklılaşmış NSC'ler bulsak da, GFP-NSC'lerden üretilen çeşitli hücre tiplerinin göreceli dağılımını ve kronik yaralanma sonrası döneme kadar devam eden oranları belirlemek için ayrıntılı çalışmalar yapılması gerekmektedir. Daha da önemlisi, hayatta olup olmadığını, eksojen NSCs beyin ağı yeniden inşa etmek ve nörolojik fonksiyon değiştirmek için kurucu beyin hücreleri ile etkileşime olabilir hala belirsizdir ve araştırılmalıdır.
Birlikte ele alındığında, iskemik beyne NSCs teslim etmek için bir intra-arteriyel doğum yöntemi tanıtmak, iskemik hemisfer de uzun vadeli sağkalım gösteren ve nöronal ve glial hücre tipleri ne farklılaşma. İntra-arteriyel doğum yaklaşımı çok sayıda tür ve CNS yaralanma ve hastalık birden fazla model için uyarlanabilir ve diğer hücre tipleri veya tek veya birden fazla terapötik bileşikler veya biyolojik teslim için kullanılabilir, nörolojik toplum için geniş yarar sağlayan.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Hiçbiri.
Acknowledgments
Bu araştırma aşağıdakiler tarafından desteklenmiştir: LC için AHA Ödülü 14SDG20480186, Çin Tıbbı Shanxi Üniversitesi Konu yenilik ekibi 2019-QN07 BZ için, ve Kentucky Spinal Kord ve Kafa Yaralanması Araştırma Güven hibe 14-12A KES ve LC için.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 20 G needle | Becton & Dickinson | BD PrecisionGlide 305175 | preparation of injection catheter |
| 26 G needle | Becton & Dickinson | BD PrecisionGlide 305111 | preparation of injection catheter |
| 27 G needle | Becton & Dickinson | BD PrecisionGlide 305136 | preparation of injection catheter |
| 4-0 NFS-2 suture with needle | Henry Schein Animal Health | 56905 | surgery |
| 6-0 nylon suture | Teleflex/Braintree Scientific | 104-s | surgery |
| Accutase | STEMCELL Technologies | 7922 | cell detachment solution |
| blade | Bard-Parker | 10 | surgery |
| Buprenorphine-SR Lab | ZooPharm | Buprenorphine-SR Lab® | analgesia (0.6-1 mg/kg over 3 d) |
| Calcium/magnisum free PBS | VWR | 02-0119-0500 | NSC dissociation |
| DCX antibody | Millipore | AB2253 | immunostaining |
| GFAP antibody | Invitrogen | 180063 | immunostaining |
| Isoflurane | Henry Schein Animal Health | 50562-1 | surgery |
| MCAO filament for mouse | Doccol | 702223PK5Re | surgery |
| MCAO filament for rat | Doccol | 503334PK5Re | surgery |
| MRE010 catheter | Braintree Scientific | MRE010 | preparation of injection catheter |
| MRE025 catheter | Braintree Scientific | MRE025 | preparation of injection catheter |
| MRE050 catheter | Braintree Scientific | MRE050 | preparation of injection catheter |
| Nu-Tears Ointment | NuLife Pharmaceuticals | Nu-Tears Ointment | eye care during surgery |
| S&T Forceps - SuperGrip Tips JF-5TC Angled | Fine Science Tools | 00649-11 | surgery |
| S&T Forceps - SuperGrip Tips JF-5TC Straight | Fine Science Tools | 00632-11 | surgery |
| Superglue | Pacer Technology | 15187 | preparation of injection catheter |
| syringe pump | Kent Scientific | GenieTouch | surgery |
| Tuj1 antibody | Millipore | MAb1637 | immunostaining |
| two-component 5 minute epoxy | Devcon | 20445 | preparation of injection catheter |
| Vannas spring scissors | Fine Science Tools | 15000-08 | surgery |
| vascular clamps | Fine Science Tools | 00400-03 | surgery |
| Zeiss microscope | Zeiss | Axio Imager 2 | microscopy |
References
- Wang, Y. Stroke research in 2017: surgical progress and stem-cell advances. The Lancet. Neurology. 17, 2-3 (2018).
- Bliss, T., Guzman, R., Daadi, M., Steinberg, G. K. Cell transplantation therapy for stroke. Stroke. 38, 817-826 (2007).
- Boese, A. C., Le, Q. E., Pham, D., Hamblin, M. H., Lee, J. P. Neural stem cell therapy for subacute and chronic ischemic stroke. Stem Cell Research & Therapy. 9, 154 (2018).
- Kokaia, Z., Llorente, I. L., Carmichael, S. T. Customized Brain Cells for Stroke Patients Using Pluripotent Stem Cells. Stroke. 49, 1091-1098 (2018).
- Savitz, S. I. Are Stem Cells the Next Generation of Stroke Therapeutics. Stroke. 49, 1056-1057 (2018).
- Wechsler, L. R., Bates, D., Stroemer, P., Andrews-Zwilling, Y. S., Aizman, I. Cell Therapy for Chronic Stroke. Stroke. 49, 1066-1074 (2018).
- Muir, K. W. Clinical trial design for stem cell therapies in stroke: What have we learned. Neurochemistry International. 106, 108-113 (2017).
- Guzman, R., Janowski, M., Walczak, P. Intra-Arterial Delivery of Cell Therapies for Stroke. Stroke. 49, 1075-1082 (2018).
- Misra, V., Lal, A., El Khoury, R., Chen, P. R., Savitz, S. I. Intra-arterial delivery of cell therapies for stroke. Stem Cells and Development. 21, 1007-1015 (2012).
- Argibay, B., et al. Intraarterial route increases the risk of cerebral lesions after mesenchymal cell administration in animal model of ischemia. Scientific Reports. 7, 40758 (2017).
- Kelly, S., et al. Transplanted human fetal neural stem cells survive, migrate, and differentiate in ischemic rat cerebral cortex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 11839-11844 (2004).
- Chen, L., Swartz, K. R., Toborek, M. Vessel microport technique for applications in cerebrovascular research. Journal of Neuroscience Research. 87, 1718-1727 (2009).
- Fischer, U. M., et al. Pulmonary passage is a major obstacle for intravenous stem cell delivery: the pulmonary first-pass effect. Stem Cells and Development. 18, 683-692 (2009).
- Misra, V., Ritchie, M. M., Stone, L. L., Low, W. C., Janardhan, V. Stem cell therapy in ischemic stroke: role of IV and intra-arterial therapy. Neurology. 79, 207-212 (2012).
- Muir, K. W., Sinden, J., Miljan, E., Dunn, L. Intracranial delivery of stem cells. Translational Stroke Research. 2, 266-271 (2011).
- Boltze, J., et al. The Dark Side of the Force - Constraints and Complications of Cell Therapies for Stroke. Frontiers in Neurology. 6, 155 (2015).
- Huang, C., et al. Noninvasive noncontact speckle contrast diffuse correlation tomography of cerebral blood flow in rats. Neuroimage. 198, 160-169 (2019).
- Wong, J. K., et al. Attenuation of Cerebral Ischemic Injury in Smad1 Deficient Mice. PLoS One. 10, 0136967 (2015).
- Zhang, B., et al. Deficiency of telomerase activity aggravates the blood-brain barrier disruption and neuroinflammatory responses in a model of experimental stroke. Journal of Neuroscience Research. 88, 2859-2868 (2010).
- Walker, T. L., Yasuda, T., Adams, D. J., Bartlett, P. F. The doublecortin-expressing population in the developing and adult brain contains multipotential precursors in addition to neuronal-lineage cells. The Journal of Neuroscience. 27, 3734-3742 (2007).
- Progatzky, F., Dallman, M. J., Lo Celso, C. From seeing to believing: labelling strategies for in vivo cell-tracking experiments. Interface Focus. 3, 20130001 (2013).
- Bertrand, L., Dygert, L., Toborek, M. Induction of Ischemic Stroke and Ischemia-reperfusion in Mice Using the Middle Artery Occlusion Technique and Visualization of Infarct Area. Journal of Visualized Experiments. , (2017).
- Leda, A. R., Dygert, L., Bertrand, L., Toborek, M. Mouse Microsurgery Infusion Technique for Targeted Substance Delivery into the CNS via the Internal Carotid Artery. Journal of Visualized Experiments. , (2017).
- Chua, J. Y., et al. Intra-arterial injection of neural stem cells using a microneedle technique does not cause microembolic strokes. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 31, 1263-1271 (2011).
- Potts, M. B., Silvestrini, M. T., Lim, D. A. Devices for cell transplantation into the central nervous system: Design considerations and emerging technologies. Surgical Neurology International. 4, 22-30 (2013).
- Duma, C., et al. Human intracerebroventricular (ICV) injection of autologous, non-engineered, adipose-derived stromal vascular fraction (ADSVF) for neurodegenerative disorders: results of a 3-year phase 1 study of 113 injections in 31 patients. Molecular Biology Reports. 46, 5257-5272 (2019).
