Summary
En metode til levering af neurale stamceller, der kan tilpasses til injektion af opløsninger eller suspensioner, gennem den fælles kartepander arterie (mus) eller ekstern carotis arterie (rotte) efter iskæmisk slagtilfælde er rapporteret. Indsprøjtede celler er fordelt bredt i hele hjernen parenkym og kan påvises op til 30 d efter fødslen.
Abstract
Neurale stamceller (NSC) terapi er en ny innovativ behandling for slagtilfælde, traumatisk hjerneskade og neurodegenerative lidelser. Sammenlignet med intrakraniel levering er intraarterial administration af ikke-nationale rådgivende råd mindre invasiv og producerer en mere diffus fordeling af ikke-centralstoffer i hjernen parenkym. Yderligere, intra-arteriel levering tillader first-pass effekt i hjernens cirkulation, mindske risikoen for fældefangst af celler i perifere organer, såsom lever og milt, en komplikation forbundet med perifere injektioner. Her beskriver vi metoden, både i mus og rotter, til levering af nsc'er gennem den fælles kartepøly (mus) eller ekstern carotis arterie (rotte) til den ipsilaterale halvkugle efter et iskæmisk slagtilfælde. Ved hjælp af GFP-mærkede NSC'er illustrerer vi den udbredte fordeling, der opnås på hele gnavere ipsilateral halvkugle på 1 d, 1 uge og 4 uger efter postischemic levering, med en højere tæthed i eller i nærheden af iskæmisk skade site. Ud over langsigtet overlevelse, viser vi tegn på differentiering af GFP-mærkede celler på 4 uger. Den intraarterielle leveringsmetode, der er beskrevet her for ikke-nationale rådgivende råd, kan også anvendes til administration af terapeutiske forbindelser og har således bred anvendelighed til forskellige CNS-skades- og sygdomsmodeller på tværs af flere arter.
Introduction
Stængcelleterapi (SC) rummer et enormt potentiale som behandling for neurologiske sygdomme, herunder slagtilfælde, hovedtraume og demens1,,2,,3,,4,5,6. En effektiv metode til at levere eksogene SC'er til den syge hjerne er dog fortsat problematisk2,6,7,8,9,10,11,12,13. SC'er, der leveres via perifere leveringsruter, herunder intravenøs (IV) eller intraperitoneal (IP) injektion, er underlagt first-pass filtrering i mikrocirkulationen, især i lunge- og leveren, milten og muskel8,,9,13,14, stigende chancer for ophobning af celler i ikke-målområder. Den invasive intracerebral injektionsmetode resulterer i lokaliseret hjerneskade i hjernen og en meget begrænset fordeling af SC'er nær injektionsstedet2,,6,,8,,14,15,16. Vi har for nylig etableret en kateter-baseret intra-arteriel injektion metode til at levere udefrakommende neurale SCs (NSCs), som er beskrevet her anvendes i en gnaver model af fokal iskæmisk slagtilfælde. Vi inducere forbigående (1 h) iskæmi-reperfusion skade på den ene halvkugle ved hjælp af en silikone gummi belagt glødetråd til at okkludere venstre midterste cerebral arterie (MCA) i musen eller rotte17,18,19. I denne model har vi reproducerbart observeret ca 75-85% depression af cerebral blodgennemstrømning (CBF) i ipsilateral halvkugle med Laser Doppler eller Laser speckle imaging17,19, giver konsekvent neurologiske underskud17,18,19.
Af tidsbesparende formål er videoen indstillet til at spille med dobbelt så høj normal hastighed og rutinemæssige kirurgiske procedurer såsom hudforberedelse og sårlukning med sutur, og brugen og opsætningen af den motoriserede sprøjtepumpe præsenteres ikke. Metoden til intra-arteriel levering af NSCs er påvist i forbindelse med den midterste cerebrale arterie okklusion (MCAO) model af eksperimentelle slagtilfælde hos gnavere. Derfor inkluderer vi den forbigående iskæmisk slagtilfælde procedure for senere at vise, hvordan den anden operation, den intra-arteriel injektion, udføres ved hjælp af den tidligere kirurgiske sted på samme dyr. Gennemførligheden af intraarterial NSC-levering i gnavere træfningsmodeller påvises ved at vurdere distributionen og overlevelsen af eksogene NSC'er. Effekten af NSC-behandling til at dæmpe hjernens patologi og neurologisk dysfunktion vil blive rapporteret separat.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle procedurer om dyreemner blev godkendt af Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) fra University of Kentucky, og der blev gjort en passende indsats for at minimere stress eller smerter i forbindelse med kirurgi.
1. Forberedelse af injektionskateter og kirurgiske kroge
- Injektionskatetret konstrueres (figur 1). Indsamle nødvendige materialer, herunder: MRE010, MRE025, og MRE050 slanger, 20 G, 26 G og 27 G injektion nåle (Figur 2A), 600 grus sandpapir, superlim og to-komponent 5-minutters epoxy.
- Skær 20 G og 26 G nåle på 1 cm fra nålenavet og poler enden på sandpapir (Figur 2B). Nålene skylles med 10 ml dobbelt destilleret vand for at rense nåleboringen.
BEMÆRK: Der anvendes to forskellige design (figur 1). Design 1 har et enkelt stik og bruges til injektion af opløsninger eller suspensioner. Design 2 har 20 G og 26 G Luer-låsestik til injektion af celler (20 G nål) og skylning af det døde volumen (26 G nål) for at sikre, at hele mængden af NSC-holdige opløsning leveres.
- Skær 20 G og 26 G nåle på 1 cm fra nålenavet og poler enden på sandpapir (Figur 2B). Nålene skylles med 10 ml dobbelt destilleret vand for at rense nåleboringen.
- Design 1: Sæt et 3-4 cm langt MRE010 kateter ind i et 15 cm langt MRE025 kateter og fastgør med superlim.
- Tilslut den anden ende af MRE025 røret til et segment af MRE050 kateter, og fastgør med superlim. Sæt en sløvet 20 G nål ind i den resterende ende af MRE050 kateteret og fastgør med superlim (Figur 1).
- Yderligere styrke forbindelsen steder med epoxy lim. Dette kateterdesign er optimalt til injektion af reagenser (såsom kemiske opløsninger eller lægemiddelopløsninger eller andre biologiske løsninger såsom cytokiner).
- Design 2: Sæt et 3-4 cm langt MRE010 kateter ind i et 15 cm langt MRE025 kateter og fastgør med superlim.
- Tilslut den anden ende af MRE025 røret til et segment af MRE050 kateter, og fastgør med superlim. Sæt en sløvet 20 G nål ind i den resterende ende af MRE050 kateteret og fastgør med superlim.
- Sæt en sløvet 26 G nål ind i MRE050-røret nær spidsen af den første nål, efter injektionsstrømmens retning, og fastgør den med superlim (Figur 1 og Figur 2C). Forstærke begge nåle og segmentet af MRE050 rør med klar epoxy (Figur 2C). Dette design gør det muligt at sprøjte køretøjsopløsning gennem nål 2 (26 G) efter NSC-injektion gennem nål 1 (20 G) for at skylle det døde volumen i kateteret ind i hjernecirkulationen og opnå mere præcis kontrol af injektionsmængderne.
- Brug en 20 G nål til NSC injektion for at minimere skader på NSC'er, hvilket kan påvirke levedygtigheden negativt.
- Efter konstruktionen skylles katetrene med 10 ml dobbelt destilleret vand efterfulgt af 70% ethanol, og derefter lægges dem i blød i 70% ethanol natten over.
- Før operationen fjernes kateterne fra 70% ethanol og skylles med 10 ml steril PBS, og læg dem i en autoklaveret kirurgisk værktøjskasse til opbevaring og transport.
- Forberedelse af de kirurgiske kroge
- Skær en 1,5- 2 cm lang nåleskaft fra en 27 G nål, og poler begge ender på sandpapir, indtil den er kedelig. Brug derefter en lille hæmostatisk klemme til at bøje akslen i en krog i den ene ende og en ringform i den anden ende.
- Sæt et 10-15 cm langt MRE025 kateter gennem ringen og fastgør med klart kirurgisk tape (Figur 2D). Lav 2 flere kroge ved hjælp af samme metode.
- Sættetid alle kroge og katetersystemer i 70% ethanol indtil brug.
2. Forberedelse af dyr: Levering, bolig, miljøtilpasning
- Der blev anvendt C57BL/6-mus (10-12 uger, n=10/tid) og Wistar-rotter (10-12 uger, n=10) i dette studie.
- Hus dem i et miljøkontrolleret dyr vivarium med mad og vand ad libitum.
- Lad dem tilpasse sig miljøet mindst 1 uge før slagtilfælde kirurgi.
BEMÆRK: En mus og en rotte døde ved 1 d efter slagtilfælde kirurgi og en mus blev aflivet ved 3 d post-slagtilfælde før NSC injektion af humane årsager på grund af alvorlig lammelse.
3. Kultur af mus og rotte neurale stamceller (NSCs)
BEMÆRK: De nationale konkurrence- og østeuropæiske lande blev isoleret og dyrket efter en etableret protokol20.
- Musen
- Isoler wildtype (WT) og GFP-mærkede NSC'er fra E18 embryonale cortex fra timet-graviditet kvindelige C57BL/6 mus parret med GFP-positive mandlige mus (B6 ACTb-EGFP). For at identificere GFP(+) embryoner, observere de høstede embryoner på en fluorescens mikroskop ved hjælp af FITC kanal. GFP(+) embryoner giver grønt fluorescenssignal, mens WT-embryoner kun udviser svag autofluoridens (figur 3A).
- Rotte
- Isoler NSC'er fra subventrikulære zone (SVZ) af unge voksne WT rotter. Mærk dem med DiI lige før injektion efter producentens anvisninger21.
- Kultur mus eller rotte NSCs indtil de udvikler sig til neurosfærer, og passage dem, når diameteren af kuglen når omkring 100 μm (Figur 3B). Brug NSC'erne til injektion mellem passager 3 og 5.
- Kontroller deres stamcelleegenskaber ved hjælp af et embryonisk stamcellemarkørpanel (Figur 3C).
- På injektionsdagen skal NSC-kuglerne indsamles og adskilles med celleafløsningen, i calcium- og magnesiumfri PBS suspenderes til en koncentration på 107 celler/ml og anbringes på våd is indtil injektionen.
4. Kirurgisk forberedelse
- Før operationen markeres en prik på den kommercielle MCAO-sutur med en sølvmarkørpen på 9 mm (for mus) eller 15 mm (for rotter) fra spidsen for in-surgery reference af indsættelseslængde. Autoklave de kirurgiske værktøjer (saks, pincet) og instrumenter før hver operation, og varme sterilisere dem i en glasperle sterilisator mellem operationer.
- Fremkald anæstesi hos dyr med 5% isofluran via indånding og opretholde anæstesi med 1-2% isofluran. Evaluere dybden af anæstesi gennem observation af generelle betingelser (vejrtrækning mønster, whisker bevægelse, og spontan krop korrektion kropsholdning), hornhinde refleks og reaktion på tå knivspids.
- Læg dyr liggende på en varmepude, og forberede det kirurgiske sted på dyret ved klipning og skrubbe med betadin opløsning efterfulgt af 70% ethanol. Beskyt dyrets øjne mod tørring ved at påføre oftalmologisk salve (f.eks. kunstig tåresalve) under operationen.
- Har kirurger grundigt skrubbe deres hænder med en bakteriocidal krat og bære en maske, sterile handsker, og en ren laboratoriekittel.
5. Middle cerebral arterie okklusion (MCAO) slagtilfælde kirurgi
BEMÆRK: Operationer for at fremkalde iskæmisk slagtilfælde på den ene halvkugle af mus eller rotter ligner hinanden, fordi en sutur indføres i den indre kartappulsåre (ICA) for at okkludere blodgennemstrømningen (Figur 4)17,18,19,22. Den arterie, der vælges til suturindføring, varierer imidlertid afhængigt af den tilgængelige operationsplads, der kræves til den efterfølgende stamcelleinjektion. Rotten har rigelig plads i den eksterne carotis arterie (ECA) segment til at tillade to separate, sekventielle operationer (slagtilfælde og NSC injektion), men musen ikke, kræver en alternativ tilgang. Slagtilfælde-induceret cerebral blodgennemstrømning ændringer, hjernen infarkt størrelse og neurologiske underskud er blevet rapporteret som i forfatternes tidligere rapporter17,18,19.
- For at fremkalde iskæmisk slagtilfælde, begynde både mus og rotte operationer med en midterlinjen snit på livmoderhalsen område, og isolering af venstre fælles halspulsåren (CCA), ECA og ICA (Figur 4). Udvis forsigtighed for ikke at strække, fortrænge eller presse CCA eller vagus nerve. Da udvælgelsen af arterie og kirurgiske trin er forskellige derefter, MCAO kirurgi på musen og rotte vil blive beskrevet separat.
- MCAO kirurgi på mus (Figur 4A)
- Placer tre flettede 6-0 nylon suturer under CCA (Figur 4A, trin 1), og gøre en stram kirurgisk knude til at okkludere fartøjet så langt fra bifurcation som muligt ved hjælp af den proksimale streng (Figur 4A, trin 2). Trim ned suturen ender.
- Lav en slipknot på den distale side af CCA (forsigtig: ikke over-stramme, da det vil blive frigivet i trin 6) og en løs slipknot i mellem de to strammede knob (Figur 4A, trin 2).
- Skær et lille snit (~ 1/4 - 1/3 af omkredsen) tæt på den proksimale knude på CCA med mikroscissorer (Figur 4A, trin 3), og indsæt forsigtigt den kommercielle silikonegummi belagt 7-0 fast nylon sutur (Figur 4A, trin 4). Fastgør denne sutur med den midterste streng, stramning tilstrækkeligt (Figur 4A, trin 5) for at sikre ingen blodlækage fra snittet og ingen bevægelse af silikone gummibelagt nylon glødetråd ved tilbageløb fra ICA, mens der stadig tillader fremme af suturen mod ECA med en blid skub fra pincet.
- Slip den øvre (distale) slipknot (Figur 4A, trin 6), og fremfør nylons suturen ind i ICA, indtil spidsen passerer bifurcationen i 9 mm (ved hjælp af sølvmarkøren på suturen som reference). Stram de øverste to slipknots for at sikre suturen og forhindre blodtilbageløb.
- Træk glødetråden 1 h tilbage senere (Figur 4A, trin 7) og ligatiter CCA'en ved hjælp af den midterste knude for at forhindre blødning (figur 4A, trin 5-7 i omvendt rækkefølge, endelige resultater som set i trin 8). Slip den øverste knude. Luk såret med 4-0 kirurgisk sutur.
- MCAO-operation på rotter (figur 4B)
- Placer to flettede 6-0 nylon suturer under ECA (Figur 4B, trin 1), og lav en stram knude i den distale ende så vidt muligt (Figur 4B, trin 2).
- Karclips anbringes på ICA og CCA for at fastkleme arteriel blodgennemstrømning (figur 4B, trin 3). En slipknot kan bruges som alternativ til et fartøjsklip.
- Lav et lille snit på ECA med mikroscissorer (Figur 4B, trin 3-4), indsætte en kommerciel silikone gummi belagt 6-0 nylon glødetråd (Figur 4B, trin 5), og sikkert korrekt med en slipknot på Revisionsretten.
- Karclipsen på ICA'en åbnes, glødetråden føres ind i ICA, indtil sølvmarkøren (15 mm) når bifurcationen (figur 4B, trin 6), og fastgør derefter suturen med denFigure 4B2.
- Efter 1 time i iskæmi trækkes denne glødetråd tilbage, og snittet for at forhindre blødning undgå blødning (figur 4B, trin 7) fjernes karclipsen fra CCA (slutresultatet som i trin 8), og såret lukkes med 4-0 kirurgisk sutur.
6. Inddrivelse
- Efter slagtilfælde kirurgi, placere dyr på en varmepude, indtil de fuldt ud genvinde bevidstheden.
- Giv analgesi via subkutan injektion. Retur dyr til deres hjem bure med adgang til vand og mad ad libitum.
7. Intraarterial injektion
- Vask hele kateteret med 70% ethanol og lægges i blød natten over indtil brug. Lige før injektionen forbindes nålens Luer-lås med en steril sprøjte, og hele lumensiden af katetersystemet vaskes med 10 ml steril PBS.
- Tidsvindue og forberedelse til NSC-injektion
BEMÆRK: Baseret på erfaringer og rapporter fra andre forskerhold er timingen for NSC-injektion afgørende for overlevelsen af både forsøgspersoner og eksogene ikke-sc'er. I vores pilotundersøgelse førte injektion af ikke-nationale eksperter på tidspunkter tidligt (inden for de første 6 timer efter reperfusion) til højere dødelighed. Således testede vi senere injektionstidspunkter og bestemte tidsvinduet mellem 2 d (48 h) til 3 d (72 timer) efter slagtilfælde er sikkert og tåleligt for dyr, og er effektivt til at opnå intraparenkymal fordeling af NSC. Resultater præsenteret heri er fra dyr modtaget NSC injektion på 3 d efter skade.- Sprøjtepumpens indsprøjtningshastighed indstilles til 20 μL/min for mus og 50 μL/min for rotter. Overdreven hastighed eller varighed af injektionen kan resultere i systemisk overbelastning af volumen, som mus er mere sårbare end rotter.
- Kort sagt, på 3 d efter slagtilfælde kirurgi, bedødre dyrene med isoflurane og læg dem liggende på en varmepude.
- Åbn cervikal såret igen, og udsæt Revisionsretten, ICA og CCA igen (figur 5, trin 1). Som i slagtilfælde operationer, bestemme injektion rute baseret på arten. Brug CCA til NSC injektion i musen, og ECA for rotten23.
- Intra-arteriel injektion gennem CCA i mus
- Placer to 6-0 flettet nylon suturer under CCA. Opret en løs slipknot med hver af dem mellem bifurcation og lavere knob fra den tidligere slagtilfælde kirurgi (Figur 5, trin 2).
- Stram den øverste slipknot og derefter foretage et lille snit over den nederste knude (Figur 5, trin 3). Sæt et MRE010 kateter gennem snittet (Figur 5, trin 4), og fastgør det med den midterste knude uden at blokere injektionsstrømmen (figur 5, trin 5). Tilbageløb af blod skal være synlig i kateteret, når den øverste knude slippes, og kateterets position justeres.
- Anbring et karclips på ECA, indsprøjtning 1 x10 6 GFP-NSC'er gennem dette kateter ved 20 μL/min. i 5 minutter med en sprøjtepumpe efterfulgt af en skylning med 50-100 μL PBS med samme hastighed.
- Efter injektionen skal CCA'et over snittet med den øverste slipknud og MRE010-kateteret trækkes tilbage (figur 5, trin 6). Stram og trim den midterste knude og den øverste knude. Tag karclipsen ud af Revisionsretten. Se det endelige billede i figur 5, trin 7.
- Luk såret med 4-0 kirurgisk sutur.
- Når dyrene er blevet tilstrækkeligt til at komme sig på en varmepude og en subkutan smertestillende injektion, skal dyrene vende tilbage til deres hjemmebur.
- Intraarterial injektion gennem Revisionsretten hos rotter
- ECA og CCA skal midlertidigt fastgøres med fartøjsklip (Figur 5, trin 2).
- Lav et lille snit på den proksimale side af ECA(Figur 5, trin 3), indsæt MRE010 kateteret, og fastgør med en knude (Figur 5, trin 4).
- Fjern begge karclips, injicer 5 x10 6 NSC'er i 100 μL PBS ved 50 μL/min. i 2 min. efterfulgt af en skylning med 50-100 μL PBS(Figur 5, trin 5) ved samme hastighed ved hjælp af en motoriseret sprøjtepumpe.
- Efter injektionen skal CCA og ECA med karclips igen og ligatere Revisionsretten på den proksimale side af det andet snit efter tilbagetrækning af injektionskatetret (Figur 5, trin 6).
- Fjern de to karclips (Figur 5, trin 7), og luk såret med 4-0 kirurgisk sutur.
- Når dyrene er blevet tilstrækkeligt til at komme sig på en varmepude og en subkutan smertestillende injektion, skal dyrene vende tilbage til deres hjemmebur.
- Histologisk analyse
- Opsaml hjerner fra mus og rotter, der fik iskæmisk slagtilfælde efterfulgt af injektion af NSCs eller køretøjsopløsning efter eutanasi og intracardiac perfusion med 4% paraformaldehyd ved 1 d (mus og rotter), 7 d (mus) og 30 d (mus) efter injektion. Hver af disse fire grupper bestod af 5 NSC og 5 indsprøjtede dyr.
- Fix hjerner natten over og kryoprserve i 30% saccharose til 3 d.
- Integrer hjernen i OLT, skær ved 40 μm tykkelse, og undersøg fordelingen af NSCs efter immunstaining med cellespecifikke markører, herunder glialidbrillersyre protein (GFAP, astrocytter), Tuj1 (modne neuroner), og dobbeltkortin (DCX, umodne neuroner).
BEMÆRK: På grund af manglen på en rotte stamme, der udtrykker GFP, vi udnyttede DiI, en forbigående fluorescerende etiket, for rotte NSC'er, som kun tillader relativt kortsigtet observation. Derfor blev NSC-fordelingen først undersøgt ved 1 d efter slagtilfælde hos rotter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
GFP-mærket NSCs blev let opdaget i iskæmisk hjerne, for det meste i den ipsilaterale halvkugle, især i penumbra og langs skade fælgen (Figur 6). Eksaminatoren blev enkeltblind under billeddannelse og analyse.
For eksempel, på 1 d efter injektion, NSCs blev opdaget i musen hippocampus. En delmængde af NSCs viste co-ekspression af den umodne neuron markør DCX i dentate gyrus selv på dette tidlige tidspunkt (Figur 6A).
Ved 10 d efter slagtilfælde (7 d efter NSC injektion) blev der observeret eksogene GFP-NSC'er ved den højeste tæthedsgrad ved skadesranden (vandskel) i striatum og cortex (Figur 6B). Det er bemærkelsesværdigt, at ved 7 d efter injektion mange af de GFP-NSCs også udtrykt DCX (vist ved blå cirkler), hvilket indikerer deres neuronal skæbne. Sammenlignet med dyr, der fik injektion af køretøjsopløsning, øgede NSC-injektionen også DCX-farvning (rød) på ipsilateral halvkugle.
Ved 30 d efter injektion, NSCs blev stadig påvist i den sårede cortex, og en del af dem viste udtryk for gnile markør GFAP (Figur 6C) eller modne neuronal markør Tuj1 (Figur 6D), angiver potentialet i udefrakommende NSCs at differentiere i enten en glia eller neuronal skæbne, og overleve op til 1 måned i den skadede hjerne.
Figur 1: Skematisk design af injektionskatetre. Vi introducerer to designs, Design 1 til blandingsopløsningsinjektion og Design 2 til celleinjektion. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Forberedelse af kateter til NSC-injektion og kirurgiske kroge. (A) Materialer til kateterkonstruktion: MRE010, MRE025 og MRE050 katetre på henholdsvis 3 cm, ~10-15 cm og 3 cm længder. (B) Skær nålespidser og polere indtil kedelig. (C) Tilslut hvert segment og sikkert med superlim, og derefter integrere både nål Luer låse og MRE050 segment i epoxy for ekstraudstyr. (D) Gør kirurgisk krog ved hjælp af 27 G nål aksel og MRE025 kateter. Vægtstang: 5 mm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Kultur af GFP (+) neurale stamceller. (A) Identificer GFP-embryoner (+) med fluorescensmikroskop ved hjælp af FITC-kanalen. (B) Isoler og kultur kortikale NSCs indtil de danner neurosfærer. Vægtstang: 100 μm. (C) Undersøg neurosphereegenskaber ved hjælp af et stamcellemarkørpanel. Skalabar: 50 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Skematiske billeder af trin-for-trin midterste cerebral arterie okklusion (MCAO) slagtilfælde kirurgi på mus eller rotte. Se videoen for detaljeret kirurgisk indgreb. ICA, indre carotis arterie; Revisionsretten, ekstern carotis arterie; CCA, almindelig carotis arterie. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: Skematiske billeder af intra-arteriel neurale stamcelle (NSC) injektion i mus eller rotte. Se videoen for detaljeret kirurgisk indgreb. ICA, indre carotis arterie; Revisionsretten, ekstern carotis arterie; CCA, almindelig carotis arterie. Den grønne pil angiver flowretningen under injektionen. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6: Fordeling, overlevelse og differentiering af neurale stamceller (NSCs) i den iskæmiske hjerne. (A) Påvisning af GFP (+) NSC'er i hippocampal dentate gyrus ved 1 d efter injektion. Stamceller fluorescerer grøn; dobbeltcortin (DCX) immunstaining vist med rødt. Den hvide pil angiver en GFP-NSC (+) med DCX-udtryk. (B) Skematisk kort over GFP-celler (+) og DCX-mærkede celler ved 10 d efter Ichemia-Reperfusion (I-R) i skinkontroller (ingen injektion) og indsprøjtede køretøjer (I-R) eller NSC (I-R + NSC) injicerede mus. Topografien af den iskæmiske fornærmelse er afbildet i den sidste skematisk, hvor lysere og mørkere orange repræsenterer det område, der er genstand for iskæmisk udfordring og den nekrotiske kerne, hhv. Det blå bånd angiver området "vandskel". De grå rektangler viser de steder, hvor der blev taget billeder for (C) og (D). (C,D) Eksogene NSCs kan differentiere i en glial skæbne (GFAP, C) eller en neuronal skæbne (Tuj1, D) med 30 d efter levering. Der blev ikke observeret signifikante signaler i FITC-kanalen (GFP) i de stregdyr, der fik indsprøjtning af køretøjer (køretøj i C og D),mens overlevende GFP-NSC'er i NSC blev visualiseret og colocaliseret med GFAP (C) eller Tuj1 (D) farvning. Pile angiver overlejring af 2 kanaler. Skalabar: 20 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Stamcelleterapi for neurologiske sygdomme er stadig på et tidligt sonderende stadium. Et vigtigt problem er, at der ikke er nogen etableret metode til tilstrækkelig levering af SCS eller NSCs i hjernen.
Selvom der kan påvises eksogene SC'er/NSC'er i hjernen efter intravenøs (IV), intraperitoneal (IP) eller intraparenkymal/intracerebral injektion, har hver leveringsmetode ulemper. Den påviselige population i hjernen skønnes at være meget lav med perifer injektion (IV eller IP), der kun repræsenterer en lille brøkdel af de celler, der injiceres eller infunderes. Intracerebral injektion giver en meget fokal fordeling og kan direkte fremkalde hjerneskade2,6,7,8,9,10,11,12,13. Derfor testede vi gennemførligheden af intra-arteriel injektion som en alternativ metode til NSC levering efter iskæmisk slagtilfælde. Denne metode leverer NSCs gennem ipsilateral cerebral perfusion efter et slagtilfælde fornærmelse. Hvis injiceres tidligt efter slagtilfælde, eksogene NSCs kan krydse forstyrret blod - hjerne barrieren (BBB), opnå en bred fordeling i hele hjernen. En fordel ved intra-arteriel injektion er, at det udnytter en first-pass effekt inden for CNS, maksimere potentialet for udefrakommende NSCs at bosætte sig i hjernen, i modsætning til perifere leveringsveje, hvor cellerne først passerer gennem de rige mikrocirkulationen af filtreringsorganer såsom lunge og lever.
Den intra-arteriel tilgang, der er beskrevet her, er alsidig, og kan tilpasses til at rumme forskellige typer af levering paradigmer og skade eller sygdom modeller. Selv om der i den aktuelle undersøgelse kun udføres én intraarterial injektion, kan MRE025 kateteret forbindes til en mikroport, der er indlejret subkutanely, hvorigennem dyr kan modtage gentagne intraarteriale injektioner12. Med det enklere, enkelt lumendesign kan denne injektionsmetode desuden anvendes til levering af reagenser i opløsning12,23. Hvis levering af flere terapeutiske er påkrævet, den dobbelte lumen design kunne udnyttes til at levere en indledende løsning samtidig eller sekventielt med et andet lægemiddel eller sammensatte. Til anvendelser på gnavere modeller af neurodegeneration eller traumatisk hjerneskade, hvor der ikke er behov for den første slagtilfælde kirurgi, kirurgi til installation af injektion kateter i musen kan udføres på ECA (samme protokol som for rotte, passende justering af injektion volumen og sats i trin 7.4 for mus), for at undgå potentielle forstyrrelser af cerebral blodgennemstrømning gennem CCA.
Flere ulemper og potentielle negative konsekvenser af denne intraarterielle injektion bør overvejes. Dyr får en anden operation, som bærer potentiale for komplikationer i forbindelse med anæstesi eller kirurgi. Cerebral blodgennemstrømning gennem ipsilateral CCA forstyrres, omend forbigående (mindre end et par minutter), hvilket kan fremkalde en anden forbigående episode af mild depression af CBF. Derudover er BBB-forstyrrelse eller -åbning afgørende for intraarterial NSC-levering, hvilket begrænser det terapeutiske vindue. I pilotundersøgelsen blev der påvist næsten ingen GFP (+) NSC'er i naiv hjerne efter intraarterial injektion. Men hvis forsøgspersonen kan tåle medicin, der kan forbigående åbne BBB, såsom høj osmolalitet mannitol eller saltvand, dette kunne bruges til at skabe en forbigående vindue af BBB åbning for NSC injektion på senere tidspunkter. I indledende undersøgelser, Fandt vi, at intra-arteriel injektion inden for de første 6 timer efter slagtilfælde resulterede i højere dødelighed end observeret med slagtilfælde alene. Dette kan være relateret til en anden invasiv operation efter en relativt kort periode med genopretning efter den første operation. Alternativt, efter iskæmisk fornærmelse, den tilskadekomne cerebrovasculature kan have en højere tendens til at snøre som reaktion på eventuelle yderligere stimuli, såsom indførelse af kateteret, yderligere væske belastning, eller fastgørelse af udefrakommende NSCs til den lysende væg efter injektion. En anden rimelig bekymring med hensyn til NSC levering efter slagtilfælde er, at NSC'er kunne danne emboli at yderligere occlude eller forstyrre microvessels. Efter aftale med tidligere rapporter8,16,24, fandt vi ikke væsentlige beviser for GFP (+) emboli i mikrovaskulaturen, selv om vi fandt GFP (+) NSC'er i perivaskulærrummet (Virchow-Robin space) i de tidlige dage efter injektionen. Efter at vi optimerede tidsvinduet for injektion, var der ingen forskel i komplikation eller dødelighed mellem slagtilfælde grupper, der modtog køretøj eller NSC injektion i den aktuelle undersøgelse. Derfor, korrekt designet intra-arteriel NSC injektion er en sikker og effektiv metode til NSC behandling rettet mod neurologiske sygdomme.
For at opnå vellykket NSC injektion og forbedre dyrs resultater, flere aspekter bør håndteres med forsigtighed under slagtilfælde kirurgi eller NSC injektion. Generel kirurgisk støtte og pleje, såsom beskyttelse af hornhinden og vedligeholdelse af kernetemperaturen, bør praktiseres. Her introducerer vi nogle potentielle komplikationer af denne specifikke operation og vejledning for at minimere deres forekomst.
Der kan være stress på vagus nerve. Under operationen bør vagusnerven ikke strækkes, knuses, udredes eller stimuleres. Tilfældig stimulering af vagus nerve kan fremkalde arytmi såsom bradycardia, hjertestop, eller endda død.
Forkert placering eller stramning af sutur, eller fejlplacering eller glider af et fartøj klip kan resultere i arteriel blødning fra den proksimale ende af CCA (fra hjerte-output) eller distale ende gennem Circle of Willis. På hvert trin skal du sørge for, at karclipsen eller knuderne er placeret korrekt for at okkludere blodgennemstrømningen. Hvis der opstår blødning, skal du forsøge at genoprette den korrekte placering af knude eller karclips. Hvis synsfeltet er sløret med blod, sætte spidsen af en steril vatpind på CCA og hold med tryk for at stoppe blodgennemstrømningen. Hæmoglobin fra blødning vil lette lukning af snittet på arterien. Når blødningen stopper, stramme knude eller placere fartøjet klip på det korrekte sted, rense blodet i synsfeltet og fortsætte operationen.
Der kan være skade eller komplikationer fra kateter indsættelse. Trim MRE010-spidsen i en 45° vinkel, så den nemt kan trænge ind i det lille snit på arterien uden at fremkalde nogen karskade. I sjældne tilfælde kan en over-skærpet spids trænge ind i arterien eller komme ind i rummet mellem kælderen membran og tunica externa. For at undgå disse skader, foretage en ordentlig størrelse snit på arterien. Vi anbefaler en størrelse på 1/4-1/3 omkredsen af arterien, som er stor nok til at tillade indtrængning af kateterspids, men bevarer nok styrke i karvæggen til at vikle uden for kateteret. For stort et snit kan føre til rivning af arterien på snitstedet. Før forsigtigt MRE010 kateterspidsen for at komme ind i snittet. Tving ikke kateterets spids eller fremføring af kateteret. Hvis det er nødvendigt, kan skarpe pincet bruges til at løfte kanten af snittet. Foranfør kateteret med en lav vinkel i forhold til arterien, så kateteret og arterien er næsten parallelle.
Der er også potentielle injektionsrelaterede komplikationer. En almindelig komplikation fra intra-arteriel injektion er overdreven volumen belastning, hvilket kan føre til akut hjerteophobning og lungeødem. Hurtige indsprøjtningshastigheder kan forstærke disse risici og forårsage skader på karvæggen8. Således bør både sats og samlede volumen kontrolleres nøje. Vi anbefaler 20 μL/min som generelt sikkert for mus, når de anvendes over en kort periode, såsom 5 minutter. Hvis symptomer på volumen overbelastning er noteret, såsom hurtig, overfladisk ånde, lyserøde bobler fra nares, eller dysfori-lignende afvigende bevægelse, injektionen skal stoppes eller afbrydes, og dyrene lov til at komme sig. En anden mulig komplikation er dannelsen af NSC emboli i cerebrovaskulære system. Suspensionsopløsningen bør ikke indeholde calcium eller magnesium, som er kendt for at fremme cellesammenlægning. For at reducere risikoen for at fremkalde emboli bør enkeltcellesuspensioner af ikke-pc'er undersøges under mikroskop lige før injektion for at bekræfte, at der ikke findes celleklynger. Hvis der er celleklynger til stede, skal der titeres med en steril 1 ml pipet, indtil der opnås en enkelt cellesuspension.
Denne undersøgelse fastlægger gennemførligheden af den intra-arteriel levering tilgang til mus og rotter, og afslører flere vigtige træk ved denne intra-arteriel injektion af NSCs i forbindelse med iskæmisk slagtilfælde. I forhold til den relativt fokale fordeling af NSCs overlevende i hjernen parenkym typisk rapporteret med intra-cerebral injektion1,,7,9,11,,15,16, Vi observerede en diffus fordeling i hele den ipsilaterale halvkugle, herunder cortex, hippocampus og striatum., Således, intra-arteriel levering er velegnet ikke kun til slagtilfælde, men også til flere skade typer eller sygdomme, der involverer diffus hjerneskade. I indstillingen af MCAO blev den højeste koncentration af ikke-nationale konkurrencecentre fundet langs kanten af skadesstedet. Den øgede tæthed af eksogene ikke-snogene ikke-centralstoffer i penumbrazonen kan skyldes øget levering til denne region via collateral flow fra genetableret blodperfusion og åbning af BBB samt migration af ikke-nationale adresser mod det beskadigede område. Selv om IV levering af SCs kan resultere i en diffus fordeling, antallet af celler, der når hjernen skønnes at være en lille brøkdel af den samlede leveret, dels på grund af filtrering af perifere organer8,13. Baseret på en tidligere undersøgelse af hjernemetastase12,intra-arteriel injiceres luciferase-mærket D122 tumorceller benyttede sig af first-pass effekt til at slå sig ned i cerebral vaskulatur og udvikle metastatiske steder i hjernen i stedet for de perifere organer. Cerebral metastatiske steder på grund af udefrakommende tumorceller blev påvist i hjernen ipsilateral til injektion så tidligt som 1 uge efter injektion ved hjælp af en IVIS billeddannelse system til at opdage bioluminescerende signal gennem intakt kraniet og hovedbunden. I modsætning hertil, selvlysende signaler (angiver tumor byrde forbundet med de eksogene tumorceller) fra de perifere organer, såsom lever, lunge, og muskel, blev ikke opdaget indtil 3-4 uger efter intra-arteriel injektion. Derfor forventer vi, i et lignende scenario, intra-arteriel NSC levering vil også drage fordel af den første-pass effekt i cerebral cirkulation til i høj grad at øge lokalisering til hjernen i forhold til perifere organer.
Selv om direkte intracerebral injektion kan bruges til at levere et stort antal celler til den skadede hjerne, den tilgang resulterer i cellulære skader eller blødning på grund af nål penetration af parenkym, som udløser lokaliseret neuroinflammation, potentielt kompromittere overlevelse og integration af de nyligt leverede celler14,,15,,16,25,26. Den intra-arterielle tilgang til NSC levering er fordelagtig i, at det undgår denne lokaliserede hjerneskade og neuroinflammation, og understøtter langsigtet overlevelse af NSC3,,8,,9,14,24. Vi observerede overlevelse og differentiering af injicerede GPF-NSCs i den skadede hjerne på tidspunkter op til 30 d efter injektion. Selv om vi fandt NSCs, der havde differentieret i modne neuroner og astrocytter, detaljerede undersøgelser er nødvendige for at bestemme den relative fordeling af forskellige celletyper genereret fra GFP-NSCs og de proportioner, der overlever i den kroniske postinjury periode. Endnu vigtigere, om overlevende, udefrakommende NSCs kan interagere med konstituerende hjerneceller til at genopbygge cerebral netværk og ændre neurologiske funktion er stadig uklart og bør undersøges.
Samlet set introducerer vi en intra-arteriel leveringsmetode til at levere NSCs i den iskæmiske hjerne, der viser langsigtet overlevelse i den iskæmiske halvkugle og differentiering i neuronal og gliacelletyper. Den intra-arterielle levering tilgang kan tilpasses til mange arter og flere modeller af CNS skade og sygdom og kan bruges til levering af andre celletyper eller enkelt eller flere terapeutiske forbindelser eller biologics, der giver bred nytte for neurovidenskab samfund.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen.
Acknowledgments
Denne forskning blev støttet af følgende: AHA Award 14SDG20480186 for LC, Emne innovation team af Shanxi University of Chinese Medicine 2019-QN07 for BZ, og Kentucky Spinal Cord and Head Injury Research Trust grant 14-12A for KES og LC.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 20 G needle | Becton & Dickinson | BD PrecisionGlide 305175 | preparation of injection catheter |
| 26 G needle | Becton & Dickinson | BD PrecisionGlide 305111 | preparation of injection catheter |
| 27 G needle | Becton & Dickinson | BD PrecisionGlide 305136 | preparation of injection catheter |
| 4-0 NFS-2 suture with needle | Henry Schein Animal Health | 56905 | surgery |
| 6-0 nylon suture | Teleflex/Braintree Scientific | 104-s | surgery |
| Accutase | STEMCELL Technologies | 7922 | cell detachment solution |
| blade | Bard-Parker | 10 | surgery |
| Buprenorphine-SR Lab | ZooPharm | Buprenorphine-SR Lab® | analgesia (0.6-1 mg/kg over 3 d) |
| Calcium/magnisum free PBS | VWR | 02-0119-0500 | NSC dissociation |
| DCX antibody | Millipore | AB2253 | immunostaining |
| GFAP antibody | Invitrogen | 180063 | immunostaining |
| Isoflurane | Henry Schein Animal Health | 50562-1 | surgery |
| MCAO filament for mouse | Doccol | 702223PK5Re | surgery |
| MCAO filament for rat | Doccol | 503334PK5Re | surgery |
| MRE010 catheter | Braintree Scientific | MRE010 | preparation of injection catheter |
| MRE025 catheter | Braintree Scientific | MRE025 | preparation of injection catheter |
| MRE050 catheter | Braintree Scientific | MRE050 | preparation of injection catheter |
| Nu-Tears Ointment | NuLife Pharmaceuticals | Nu-Tears Ointment | eye care during surgery |
| S&T Forceps - SuperGrip Tips JF-5TC Angled | Fine Science Tools | 00649-11 | surgery |
| S&T Forceps - SuperGrip Tips JF-5TC Straight | Fine Science Tools | 00632-11 | surgery |
| Superglue | Pacer Technology | 15187 | preparation of injection catheter |
| syringe pump | Kent Scientific | GenieTouch | surgery |
| Tuj1 antibody | Millipore | MAb1637 | immunostaining |
| two-component 5 minute epoxy | Devcon | 20445 | preparation of injection catheter |
| Vannas spring scissors | Fine Science Tools | 15000-08 | surgery |
| vascular clamps | Fine Science Tools | 00400-03 | surgery |
| Zeiss microscope | Zeiss | Axio Imager 2 | microscopy |
References
- Wang, Y. Stroke research in 2017: surgical progress and stem-cell advances. The Lancet. Neurology. 17, 2-3 (2018).
- Bliss, T., Guzman, R., Daadi, M., Steinberg, G. K. Cell transplantation therapy for stroke. Stroke. 38, 817-826 (2007).
- Boese, A. C., Le, Q. E., Pham, D., Hamblin, M. H., Lee, J. P. Neural stem cell therapy for subacute and chronic ischemic stroke. Stem Cell Research & Therapy. 9, 154 (2018).
- Kokaia, Z., Llorente, I. L., Carmichael, S. T. Customized Brain Cells for Stroke Patients Using Pluripotent Stem Cells. Stroke. 49, 1091-1098 (2018).
- Savitz, S. I. Are Stem Cells the Next Generation of Stroke Therapeutics. Stroke. 49, 1056-1057 (2018).
- Wechsler, L. R., Bates, D., Stroemer, P., Andrews-Zwilling, Y. S., Aizman, I. Cell Therapy for Chronic Stroke. Stroke. 49, 1066-1074 (2018).
- Muir, K. W. Clinical trial design for stem cell therapies in stroke: What have we learned. Neurochemistry International. 106, 108-113 (2017).
- Guzman, R., Janowski, M., Walczak, P. Intra-Arterial Delivery of Cell Therapies for Stroke. Stroke. 49, 1075-1082 (2018).
- Misra, V., Lal, A., El Khoury, R., Chen, P. R., Savitz, S. I. Intra-arterial delivery of cell therapies for stroke. Stem Cells and Development. 21, 1007-1015 (2012).
- Argibay, B., et al. Intraarterial route increases the risk of cerebral lesions after mesenchymal cell administration in animal model of ischemia. Scientific Reports. 7, 40758 (2017).
- Kelly, S., et al. Transplanted human fetal neural stem cells survive, migrate, and differentiate in ischemic rat cerebral cortex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 11839-11844 (2004).
- Chen, L., Swartz, K. R., Toborek, M. Vessel microport technique for applications in cerebrovascular research. Journal of Neuroscience Research. 87, 1718-1727 (2009).
- Fischer, U. M., et al. Pulmonary passage is a major obstacle for intravenous stem cell delivery: the pulmonary first-pass effect. Stem Cells and Development. 18, 683-692 (2009).
- Misra, V., Ritchie, M. M., Stone, L. L., Low, W. C., Janardhan, V. Stem cell therapy in ischemic stroke: role of IV and intra-arterial therapy. Neurology. 79, 207-212 (2012).
- Muir, K. W., Sinden, J., Miljan, E., Dunn, L. Intracranial delivery of stem cells. Translational Stroke Research. 2, 266-271 (2011).
- Boltze, J., et al. The Dark Side of the Force - Constraints and Complications of Cell Therapies for Stroke. Frontiers in Neurology. 6, 155 (2015).
- Huang, C., et al. Noninvasive noncontact speckle contrast diffuse correlation tomography of cerebral blood flow in rats. Neuroimage. 198, 160-169 (2019).
- Wong, J. K., et al. Attenuation of Cerebral Ischemic Injury in Smad1 Deficient Mice. PLoS One. 10, 0136967 (2015).
- Zhang, B., et al. Deficiency of telomerase activity aggravates the blood-brain barrier disruption and neuroinflammatory responses in a model of experimental stroke. Journal of Neuroscience Research. 88, 2859-2868 (2010).
- Walker, T. L., Yasuda, T., Adams, D. J., Bartlett, P. F. The doublecortin-expressing population in the developing and adult brain contains multipotential precursors in addition to neuronal-lineage cells. The Journal of Neuroscience. 27, 3734-3742 (2007).
- Progatzky, F., Dallman, M. J., Lo Celso, C. From seeing to believing: labelling strategies for in vivo cell-tracking experiments. Interface Focus. 3, 20130001 (2013).
- Bertrand, L., Dygert, L., Toborek, M. Induction of Ischemic Stroke and Ischemia-reperfusion in Mice Using the Middle Artery Occlusion Technique and Visualization of Infarct Area. Journal of Visualized Experiments. , (2017).
- Leda, A. R., Dygert, L., Bertrand, L., Toborek, M. Mouse Microsurgery Infusion Technique for Targeted Substance Delivery into the CNS via the Internal Carotid Artery. Journal of Visualized Experiments. , (2017).
- Chua, J. Y., et al. Intra-arterial injection of neural stem cells using a microneedle technique does not cause microembolic strokes. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 31, 1263-1271 (2011).
- Potts, M. B., Silvestrini, M. T., Lim, D. A. Devices for cell transplantation into the central nervous system: Design considerations and emerging technologies. Surgical Neurology International. 4, 22-30 (2013).
- Duma, C., et al. Human intracerebroventricular (ICV) injection of autologous, non-engineered, adipose-derived stromal vascular fraction (ADSVF) for neurodegenerative disorders: results of a 3-year phase 1 study of 113 injections in 31 patients. Molecular Biology Reports. 46, 5257-5272 (2019).
