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Neuroscience

चूहा और माउस मस्तिष्क के लिए तंत्रिका स्टेम सेल की अंतर-धमनी वितरण: सेरेब्रल इस्केमिया के लिए आवेदन

Published: June 26, 2020 doi: 10.3791/61119
Automatic Translation
1, 2, 2, 2
1College of Public Health, Shaanxi University of Chinese Medicine, 2Spinal Cord and Brain Injury Research Center, Department of Physiology, University of Kentucky

Summary

इस्कीमिक स्ट्रोक की सूचना के बाद आम कैरोटिड धमनी (माउस) या बाहरी कैरोटिड धमनी (चूहा) के माध्यम से समाधान या निलंबन इंजेक्शन के लिए अनुकूलनीय तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं को वितरित करने के लिए एक विधि। इंजेक्शन कोशिकाओं को मोटे तौर पर मस्तिष्क परेन्चिमा भर में वितरित किया जाता है और प्रसव के बाद 30 डी तक का पता लगाया जा सकता है।

Abstract

तंत्रिका स्टेम सेल (एनएससी) थेरेपी स्ट्रोक, दर्दनाक मस्तिष्क की चोट और न्यूरोडीजेनेरेटिव विकारों के लिए एक उभरता हुआ अभिनव उपचार है। इंट्राक्रैनियल डिलीवरी की तुलना में, एनएससी का इंट्रा-धमनी प्रशासन कम आक्रामक है और मस्तिष्क परेन्चिमा के भीतर एनएससी का अधिक फैलाना वितरण पैदा करता है। इसके अलावा, इंट्रा-धमनी डिलीवरी मस्तिष्क परिसंचरण में पहले पास प्रभाव की अनुमति देती है, जिससे परिधीय अंगों में कोशिकाओं को फंसाने की क्षमता कम हो जाता है, जैसे कि यकृत और तिल्ली, परिधीय इंजेक्शन से जुड़ी जटिलता। यहां, हम चूहों और चूहों दोनों में, एनएससी के वितरण के लिए सामान्य कैरोटिड धमनी (माउस) या बाहरी कैरोटिड धमनी (चूहा) के माध्यम से इस्कीमिक स्ट्रोक के बाद इप्सिलाटेरल गोलार्द्ध में कार्यप्रणाली का विस्तार करते हैं। जीएफपी-लेबल वाले एनएससी का उपयोग करके, हम इस्कीमिक चोट साइट में या उसके पास उच्च घनत्व के साथ पोस्टिकेमिक डिलीवरी के बाद 1 डी, 1 सप्ताह और 4 सप्ताह में कृंतक इप्सिलाटेरल गोलार्द्ध में प्राप्त व्यापक वितरण को दर्शाते हैं। दीर्घकालिक अस्तित्व के अलावा, हम 4 सप्ताह में GFP-लेबल कोशिकाओं के भेदभाव के सबूत दिखाते हैं। एनएससी के लिए यहां वर्णित अंतर-धमनी वितरण दृष्टिकोण का उपयोग चिकित्सीय यौगिकों के प्रशासन के लिए भी किया जा सकता है, और इस प्रकार कई प्रजातियों में विभिन्न सीएनएस चोट और रोग मॉडलों के लिए व्यापक प्रयोज्यता है।

Introduction

स्टेम सेल (एससी) थेरेपी में न्यूरोलॉजिकल बीमारियों के उपचार के रूप में जबरदस्त क्षमता है, जिसमें स्ट्रोक, हेड ट्रॉमा और डिमेंशिया1,,2,,3,,4,5, 6शामिल हैं ।,,6 तथापि , रोगग्रस्त मस्तिष्क में एक्सोजेनस एससी पहुंचाने का एक कुशल तरीकासमस्याग्रस्त 2,6,6 , 7,8,9,10,11,12,,13.12 नसों में (IV) या इंट्रापेरिटोनियल (आईपी) इंजेक्शन सहित परिधीय वितरण मार्गों के माध्यम से वितरित एससी, माइक्रोसर्कुलेशन में पहले पास फ़िल्टरिंग के अधीन हैं, विशेष रूप से फेफड़े, यकृत, तिल्ली और मांसपेशियों में8,,9,13,,14,गैर-लक्षित क्षेत्रों में कोशिकाओं के संचय की संभावना बढ़ रही है।, आक्रामक इंट्रासेरेब्रल इंजेक्शन विधि के परिणामस्वरूप मस्तिष्क के ऊतकों को नुकसान होता है और इंजेक्शन,स्थल2, 6 , 8,14,,15,16केपास अनुसूचित जाति का बहुत प्रतिबंधित वितरणहोताहै ।615 हमने हाल ही में एक्सोजेनस न्यूरल एससी (एनएससी) देने के लिए एक कैथेटर-आधारित इंट्रा-धमनी इंजेक्शन विधि स्थापित की है, जिसे यहां फोकल इस्कीमिक स्ट्रोक के कृंतक मॉडल में लागू किया गया है। हम एक गोलार्द्ध में क्षणिक (1 घंटे) इस्केमिया-रिफ्यूजन चोट को प्रेरित करते हैं, जो एक सिलिकॉन रबर लेपित फिलामेंट का उपयोग करके माउस या चूहे17, 18, 19,18,19में बाएं मध्य मस्तिष्क धमनी (एमसीए) को ऑक्सीकरण करने के लिए प्रेरित करते हैं। इस मॉडल में हमने लेजर डॉप्लर या लेजर स्पेक्टल इमेजिंग17, 19के साथ इप्सिलाटरल गोलार्द्ध में सेरेब्रल ब्लड फ्लो (सीबीएफ) के लगभग75-85%अवसाद को पुन: देखा है, जो लगातार न्यूरोलॉजिकल घाटे17,,,18, 19,19को उत्पन्न करता है।

समय की बचत के प्रयोजनों के लिए, वीडियो दो बार सामान्य गति और नियमित शल्य चिकित्सा प्रक्रियाओं जैसे त्वचा की तैयारी और सीवन के साथ घाव बंद करने और मोटर चालित सिरिंज पंप के उपयोग और सेटअप प्रस्तुत नहीं कर रहे है पर खेलने के लिए सेट है । एनएससी के अंतर-धमनी वितरण की विधि को कृंतक में प्रायोगिक स्ट्रोक के मध्य मस्तिष्क धमनी ऑक्क्लुस (एमसीएओ) मॉडल के संदर्भ में प्रदर्शित किया जाता है। इसलिए, हम क्षणिक इस्कीमिक स्ट्रोक प्रक्रिया को शामिल करने के लिए बाद में प्रदर्शित करने के लिए कैसे दूसरी सर्जरी, अंतर धमनी इंजेक्शन, एक ही जानवर पर पिछले शल्य चिकित्सा साइट का उपयोग कर किया जाता है । कृंतक स्ट्रोक मॉडल में अंतर-धमनी एनएससी वितरण की व्यवहार्यता को एक्सोजेनस एनएससी के वितरण और अस्तित्व का आकलन करके प्रदर्शित किया जाता है। मस्तिष्क विकृति और तंत्रिका विज्ञान की शिथिलता को क्षीण करने के लिए एनएससी थेरेपी की प्रभावकारिता की अलग से रिपोर्ट की जाएगी ।

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Protocol

पशु विषयों पर सभी प्रक्रियाओं को केंटकी विश्वविद्यालय के संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) द्वारा अनुमोदित किया गया था, और सर्जरी से जुड़े तनाव या दर्द को कम करने के लिए उचित देखभाल की गई थी ।

1. इंजेक्शन कैथेटर और सर्जिकल हुक की तैयारी

  1. इंजेक्शन कैथेटर(चित्रा 1) कानिर्माण । सहित आवश्यक सामग्री इकट्ठा: MRE010, MRE025, और MRE050 टयूबिंग, 20 जी, 26 जी और 27 जी इंजेक्शन सुई(चित्रा 2A),६०० धैर्य सैंडपेपर, superglue और दो घटक 5 मिनट epoxy ।
    1. सुई हब से 1 सेमी पर 20 जी और 26 जी सुई काटें और सैंडपेपर(चित्रा 2B)पर अंत पॉलिश करें। सुई बोर को साफ करने के लिए 10 एमएल डबल डिस्टिल्ड पानी के साथ सुई फ्लश करें।
      नोट: दो अलग-अलग डिजाइन(चित्रा 1)का उपयोग किया जाता है। डिजाइन 1 में एक ही कनेक्टर है और इसका उपयोग समाधान या निलंबन के इंजेक्शन के लिए किया जाता है। डिजाइन 2 में कोशिकाओं के इंजेक्शन के लिए 20 जी और 26 जी लूयर लॉक कनेक्टर हैं (20 जी सुई) और एनएससी युक्त समाधान की पूरी मात्रा की डिलीवरी सुनिश्चित करने के लिए मृत मात्रा (26 जी सुई) का फ्लश।
  2. डिजाइन 1: 15 सेमी लंबाई MRE025 कैथेटर में 3-4 सेमी लंबाई MRE010 कैथेटर डालें और सुपरग्लू के साथ सुरक्षित करें।
    1. MRE025 ट्यूब के दूसरे छोर को MRE050 कैथेटर के एक खंड से कनेक्ट करें, और सुपरग्लू के साथ सुरक्षित करें। MRE050 कैथेटर के शेष अंत में एक सुस्त 20 जी सुई डालें और सुपरग्लू(चित्रा 1)के साथ सुरक्षित है ।
    2. इसके अलावा एपॉक्सी गोंद के साथ कनेक्शन साइटों को मजबूत। यह कैथेटर डिजाइन रिएजेंट्स (जैसे रासायनिक या दवा समाधान या साइटोकिन्स जैसे अन्य जीवविज्ञान) के इंजेक्शन के लिए इष्टतम है।
  3. डिजाइन 2: 15 सेमी लंबाई MRE025 कैथेटर में 3-4 सेमी लंबाई MRE010 कैथेटर डालें और सुपरग्लू के साथ सुरक्षित करें।
    1. MRE025 ट्यूब के दूसरे छोर को MRE050 कैथेटर के एक खंड से कनेक्ट करें, और सुपरग्लू के साथ सुरक्षित करें। MRE050 कैथेटर के शेष अंत में एक सुस्त 20 जी सुई डालें और सुपरग्लू के साथ सुरक्षित करें।
    2. इंजेक्शन प्रवाह की दिशा के बाद, पहली सुई की नोक के पास MRE050 ट्यूब में एक सुस्त 26 जी सुई डालें, और सुपरग्लू(चित्रा 1 और चित्रा 2C)के साथ सुरक्षित करें। दोनों सुइयों और स्पष्ट epoxy(चित्रा 2C)के साथ MRE050 ट्यूब के खंड को मजबूत । यह डिजाइन मस्तिष्क परिसंचरण में कैथेटर में मृत मात्रा फ्लश करने के लिए सुई 1 (20 जी) के माध्यम से एनएससी इंजेक्शन के बाद सुई 2 (26 जी) के माध्यम से वाहन समाधान के इंजेक्शन की अनुमति देता है, इंजेक्शन की मात्रा का अधिक सटीक नियंत्रण प्राप्त करने के लिए।
    3. एनएससी इंजेक्शन के लिए 20 जी सुई का उपयोग करें ताकि एनएससी को नुकसान को कम किया जा सके, जो व्यवहार्यता को प्रतिकूल रूप से प्रभावित कर सकता है।
  4. निर्माण के बाद, कैथेटर को डबल डिस्टिल्ड पानी के 10 एमएल के साथ फ्लश करें, इसके बाद 70% इथेनॉल, और फिर उन्हें रात भर 70% इथेनॉल में भिगो दें।
  5. सर्जरी से पहले, कैथेटर को 70% इथेनॉल से हटा दें और बाँझ पीबीएस के 10 एमएल के साथ फ्लश करें, और उन्हें भंडारण और परिवहन के लिए एक ऑटोक्लेव सर्जिकल टूल बॉक्स में रखें।
  6. सर्जिकल हुक की तैयारी
    1. एक 27 जी सुई से एक 1.5-2 सेमी लंबी सुई शाफ्ट काटें, और सुस्त जब तक सैंडपेपर पर दोनों सिरों पॉलिश । फिर शाफ्ट को एक छोर पर हुक में मोड़ने के लिए एक छोटे से हेमोस्टेटिक क्लैंप का उपयोग करें और दूसरे छोर पर एक अंगूठी-आकार।
    2. अंगूठी के माध्यम से एक 10-15 सेमी लंबा MRE025 कैथेटर डालें और स्पष्ट सर्जिकल टेप(चित्रा 2D)के साथ सुरक्षित । एक ही विधि का उपयोग कर 2 और हुक बनाओ।
    3. उपयोग तक सभी हुक और कैथेटर सिस्टम को 70% इथेनॉल में भिगो दें।

2. पशु तैयारी: वितरण, आवास, पर्यावरण अनुकूलन

  1. पुरुष और महिला C57BL/6 चूहों (10-12 सप्ताह, n = 10/time प्वाइंट) और Wistar चूहों (10-12 सप्ताह, n = 10) इस अध्ययन में इस्तेमाल किया गया ।
  2. उन्हें भोजन और पानी विज्ञापन लिबिटम के साथ पर्यावरण की दृष्टि से नियंत्रित पशु विवरियम में घर।
  3. उन्हें स्ट्रोक सर्जरी से कम से कम 1 सप्ताह पहले पर्यावरण के अनुकूल होने दें।
    नोट: एक माउस और एक चूहा स्ट्रोक सर्जरी के बाद 1 डी में मर गया और एक माउस गंभीर पक्षाघात की वजह से मानवीय कारणों के लिए एनएससी इंजेक्शन से पहले 3 डी के बाद स्ट्रोक पर इच्छामृत्यु थी ।

3. माउस और चूहे तंत्रिका स्टेम सेल (एनएससी) की संस्कृति

नोट: एनएससी को एक स्थापित प्रोटोकॉल20के बाद अलग और सुसंस्कृत किया गया था ।

  1. माउस
    1. समय पर गर्भावस्था महिला C57BL/6 चूहों GFP-सकारात्मक पुरुष चूहों (B6 ACTb-EGFP) के साथ संभोग से E18 भ्रूण प्रांतस्था से वाइल्डटाइप (डब्ल्यूटीई) और जीएफपी लेबल NSCs को अलग करें । जीएफपी (+) भ्रूण की पहचान करने के लिए, फिटसी चैनल का उपयोग करके फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप पर काटे गए भ्रूण का निरीक्षण करें। GFP (+) भ्रूण हरी फ्लोरेसेंस संकेत उपज जबकि WT भ्रूण केवल कमजोर ऑटो फ्लोरेसेंस(चित्रा 3A)दिखाते हैं ।
  2. चूहा
    1. युवा वयस्क डब्ल्यूटी चूहों के सबवेंट्रिकुलर जोन (एसवीजेड) से एनएससी को अलग करें। निर्माता के निर्देशों के बाद इंजेक्शन से ठीक पहले उन्हें डीआईआई के साथ लेबलकरें 21.
  3. संस्कृति माउस या चूहा एनएससी जब तक वे न्यूरोस्फीयर में विकसित नहीं होते हैं, और जब गोला का व्यास 100 माइक्रोन(चित्रा 3 B)के आसपास पहुंच जाता है तो उन्हें पारित कर दिया जाता है। 3 और 5 मार्ग के बीच इंजेक्शन के लिए एनएससी का उपयोग करें।
  4. एक भ्रूणस्टेम सेल मार्कर पैनल(चित्रा 3C)का उपयोग कर उनके स्टेम सेल गुणों को सत्यापित करें ।
  5. इंजेक्शन के दिन, एनएससी क्षेत्रों को इकट्ठा करें और सेल टुकड़ी समाधान के साथ अलग करें, कैल्शियम और मैग्नीशियम-मुक्त पीबीएस में 107 कोशिकाओं/एमएल की एकाग्रता के लिए निलंबित करें, और इंजेक्शन तक गीली बर्फ पर रखें।

4. सर्जिकल तैयारी

  1. सर्जरी से पहले, प्रविष्टि लंबाई के इन-सर्जरी संदर्भ के लिए टिप से 9 मिमी (माउस के लिए) या 15 मिमी (चूहे के लिए) पर चांदी मार्कर पेन के साथ वाणिज्यिक एमसीएओ सीवन पर एक डॉट चिह्नित करें। प्रत्येक सर्जरी से पहले सर्जिकल उपकरण (कैंची, संदंश) और उपकरणों को ऑटोक्लेव करें, और गर्मी उन्हें ऑपरेशन के बीच एक ग्लास मनका स्टरलाइजर में बंध्याकरण करे।
  2. साँस लेना के माध्यम से 5% आइसोफ्लुनान के साथ जानवरों में संज्ञाहरण प्रेरित करें और 1-2% आइसोफ्लाणे के साथ संज्ञाहरण बनाए रखें। सामान्य परिस्थितियों (श्वास पैटर्न, मूंछ आंदोलन, और सहज शरीर सुधार मुद्रा), कॉर्नियल पलटा और अंगुली चुटकी के लिए प्रतिक्रिया के अवलोकन के माध्यम से संज्ञाहरण की गहराई का मूल्यांकन करें।
  3. एक हीटिंग पैड पर पशु रीढ़ बिछाएं, और 70% इथेनॉल के बाद बीटाडीन समाधान के साथ क्लिपिंग और स्क्रबिंग करके जानवर पर सर्जिकल साइट तैयार करें। सर्जरी के दौरान नेत्र मरहम (जैसे, कृत्रिम आंसू मरहम) लगाकर जानवर की आंखों को सूखने से बचाएं।
  4. सर्जन अच्छी तरह से एक जीवाणु साफ़ के साथ अपने हाथों को साफ़ करें और एक मुखौटा, बाँझ दस्ताने, और एक साफ प्रयोगशाला कोट पहनते हैं ।

5. मध्य मस्तिष्क धमनी ऑक्क्लूज़न (एमसीएओ) स्ट्रोक सर्जरी

नोट: माउस या चूहे के एक गोलार्द्ध में इस्कीमिक स्ट्रोक को प्रेरित करने के लिए सर्जरी समान होती है कि एक सीवन को आंतरिक कैरोटिड धमनी (आईसीए) में रक्त प्रवाह(चित्रा 4) 17,,,19,1922,में पेश कियाजाताहै। हालांकि, सीवन प्रविष्टि के लिए चयनित धमनी बाद में स्टेम सेल इंजेक्शन के लिए आवश्यक उपलब्ध ऑपरेशन स्थान के आधार पर अलग है। चूहे में दो अलग- अलग, अनुक्रमिक सर्जरी (स्ट्रोक और एनएससी इंजेक्शन) की अनुमति देने के लिए बाहरी कैरोटिड धमनी (ईसीए) सेगमेंट में पर्याप्त जगह है, लेकिन माउस को वैकल्पिक दृष्टिकोण की आवश्यकता नहीं होती है। स्ट्रोक प्रेरित मस्तिष्क रक्त प्रवाह में परिवर्तन, मस्तिष्क इनफारेक्ट आकार और तंत्रिका संबंधी घाटे की रिपोर्ट लेखकों की पिछली रिपोर्ट17,18,,19के रूप में दी गई है ।,

  1. इस्कीमिक स्ट्रोक को प्रेरित करने के लिए, सर्वाइकल क्षेत्र पर मिडलाइन चीरा के साथ माउस और चूहे की सर्जरी दोनों शुरू करें, और बाएं आम कैरोटिड धमनी (सीसीए), ईसीए और आईसीए(चित्रा 4) केअलगाव। सीसीए या वेगस तंत्रिका को फैलाने, विस्थापित या निचोड़ने के लिए सावधानी बरतें। चूंकि इसके बाद धमनी और सर्जिकल स्टेप्स का चयन अलग-अलग होता है, इसलिए माउस और चूहे पर एमसीएओ सर्जरी अलग से बताई जाएगी।
  2. माउस पर MCAO सर्जरी(चित्रा 4A)
    1. सीसीए(चित्रा 4A,चरण 1) के तहत तीन लट 6-0 नायलॉन टांके रखें, और समीपस्थ स्ट्रिंग(चित्रा 4 ए,चरण 2) का उपयोग करके विभाजन से दूर के रूप में पोत को ऑक्सीलेड करने के लिए एक तंग सर्जिकल गाँठ बनाएं। सीवन समाप्त होता है नीचे ट्रिम।
    2. सीसीए के डिस्टल साइड में एक स्लिपनॉट बनाएं (सावधानी: अधिक कस न करें क्योंकि इसे चरण 6 में जारी किया जाएगा) और दो कसे हुए नॉट(चित्रा 4 ए,चरण 2) के बीच में एक ढीला स्लिपनॉट।
    3. माइक्रो कैंची(चित्रा 4A,चरण 3) के साथ सीसीए पर समीपस्थ गाँठ के करीब एक छोटा चीरा (~ 1/4 -1/3) काट लें, और ध्यान से वाणिज्यिक सिलिकॉन रबर लेपित 7-0 ठोस नायलॉन सीवन(चित्रा 4A, चरण 4)डालें। इस सीवन को मध्य स्ट्रिंग के साथ सुरक्षित करें, पर्याप्त रूप से कस(चित्रा 4A,चरण 5) चीरा से कोई रक्त रिसाव और आईसीए से बैकफ्लो द्वारा सिलिकॉन रबर लेपित नायलॉन फिलामेंट का कोई आंदोलन सुनिश्चित करने के लिए, जबकि अभी भी चिमटी द्वारा एक सौम्य धक्का के साथ ईसीए की ओर सीवन की उन्नति की अनुमति देता है।
    4. ऊपरी (डिस्टल) स्लिपनॉट(चित्रा 4A,चरण 6) जारी करें और नायलॉन सीवन को आईसीए में तब तक आगे बढ़ाएं जब तक कि इसकी टिप 9 मिमी (एक संदर्भ के रूप में सीवन पर चांदी मार्कर का उपयोग करके) के लिए विभाजन से गुजरती है। सीवन को सुरक्षित करने और रक्त बैकफ्लो को रोकने के लिए ऊपरी दो स्लिपनॉट को कस लें।
    5. फिलामेंट 1 घंटे बाद वापस लें(चित्रा 4A,चरण 7) और रक्तस्राव को रोकने के लिए मध्य गाँठ का उपयोग करके सीसीए को लिगेट करें(चित्रा 4A,रिवर्स क्रम में 5-7 कदम, अंतिम परिणाम के रूप में चरण 8 में देखा गया)। ऊपरी गाँठ छोड़ें। घाव को 4-0 सर्जिकल सीवन के साथ बंद करें।
  3. चूहे पर MCAO सर्जरी(चित्रा 4B)
    1. ईसीए(चित्रा 4B,चरण 1) के तहत दो लट 6-0 नायलॉन टांके रखें, और जहां तक संभव हो डिस्टल एंड पर एक टाइट गाँठ बनाएं(चित्रा 4B,चरण 2)।
    2. धमनी रक्त प्रवाह(चित्रा 4B,चरण 3) को कम करने के लिए आईसीए और सीसीए पर पोत क्लिप रखें। एक स्लिपनॉट का उपयोग पोत क्लिप के लिए वैकल्पिक के रूप में किया जा सकता है।
    3. माइक्रो कैंची(चित्रा 4B, चरण 3-4)के साथ ईसीए पर एक छोटा सा चीरा बनाएं, एक वाणिज्यिक सिलिकॉन रबर को लेपित 6-0 नायलॉन फिलामेंट(चित्रा 4B,चरण 5) डालें, और ईसीए पर स्लिपनॉट के साथ ठीक से सुरक्षित करें।
    4. आईसीए पर पोत क्लिप जारी करें, आईसीए में फिलामेंट को तब तक आगे बढ़ाएं जब तक कि सिल्वर मार्कर (15 मिमी) विभाजन(चित्रा 4B,चरण 6) तक न पहुंच जाए, और फिर ईसीए(चित्रा 4B,चरण 6) पर2 गाँठ के साथ सीवन को सुरक्षित करें।
    5. इस्केमिया के 1 घंटे के बाद, इस फिलामेंट को वापस लें और रक्तस्राव को रोकने के लिए चीरा लें(चित्रा 4B,चरण 7), सीसीए से पोत क्लिप को हटा दें (अंतिम परिणाम चरण 8 में), और घाव को 4-0 सर्जिकल सीवन के साथ बंद करें।

6. वसूली

  1. स्ट्रोक सर्जरी के बाद, जानवरों को एक हीटिंग पैड पर रखें जब तक कि वे पूरी तरह से होश में नहीं आ जाते।
  2. चमड़े के नीचे इंजेक्शन के माध्यम से एनाल्जेसिया प्रदान करें। पानी और खाद्य विज्ञापन libitum के लिए उपयोग के साथ अपने घर पिंजरों के लिए जानवरों को वापस ।

7. इंट्रा-धमनी इंजेक्शन

  1. पूरे कैथेटर को 70% इथेनॉल से धोएं और उपयोग तक रात भर भिगोएं। इंजेक्शन से ठीक पहले, सुई के लूयर लॉक को बाँझ सिरिंज से जोड़ें, और कैथेटर सिस्टम के पूरे ल्यूमेन पक्ष को बाँझ पीबीएस के 10 एमएल से धोएं।
  2. समय खिड़की और एनएससी इंजेक्शन के लिए तैयारी
    नोट: अन्य अनुसंधान टीमों के अनुभव और रिपोर्टों के आधार पर, एनएससी इंजेक्शन के लिए समय दोनों विषयों और बहिर्जात एनएससी के अस्तित्व के लिए महत्वपूर्ण है। हमारे प्रायोगिक अध्ययन में, शुरुआती समय बिंदुओं पर एनएससी के इंजेक्शन (रिफ्यूजन के बाद पहले 6 घंटे के भीतर) उच्च मृत्यु दर का कारण बनता था। इस प्रकार, हमने बाद में इंजेक्शन समय बिंदुओं का परीक्षण किया और स्ट्रोक के बाद 2 डी (48 एच) से 3 डी (72 घंटे) के बीच समय खिड़की निर्धारित की, जानवरों के लिए सुरक्षित और सहनीय है, और एनएससी के इंट्रापेरेन्चिमल वितरण को प्राप्त करने में कुशल है। यहां प्रस्तुत परिणाम चोट के बाद 3 डी में एनएससी इंजेक्शन प्राप्त जानवरों से हैं।
    1. चूहों के लिए 20 माइक्रोन/मिनट और चूहों के लिए ५० μL/min पर सिरिंज पंप इंजेक्शन दर निर्धारित करें । इंजेक्शन की अत्यधिक गति या अवधि के परिणामस्वरूप प्रणालीगत मात्रा अधिभार हो सकता है, जिसके लिए चूहे चूहों की तुलना में अधिक असुरक्षित हैं।
    2. संक्षेप में, स्ट्रोक सर्जरी के बाद 3 डी में, आइसोफ्लाणे के साथ जानवरों को एनेस्थेटाइज करें और उन्हें हीटिंग पैड पर रीपाइन रखें।
    3. गर्भाशय ग्रीवा के घाव को फिर से खोलें और ईसीए, आईसीए और सीसीए को फिर से बेनकाबकरें (चित्रा 5,चरण 1)। स्ट्रोक सर्जरी के रूप में, प्रजातियों के आधार पर इंजेक्शन मार्ग निर्धारित करें। माउस में एनएससी इंजेक्शन के लिए सीसीए का उपयोग करें, और चूहे23के लिए ईसीए।
  3. माउस में सीसीए के माध्यम से अंतर-धमनी इंजेक्शन
    1. सीसीए के तहत दो 6-0 लट नायलॉन टांके रखें। पिछले स्ट्रोक सर्जरी(चित्रा 5,चरण 2) से विभाजन और निचले समुद्री मील के बीच उनमें से प्रत्येक के साथ एक ढीली स्लिपनॉट बनाएं।
    2. ऊपरी स्लिपनॉट को कस लें और फिर निचले गाँठ(चित्रा 5,चरण 3) के ऊपर एक छोटा सा चीरा लगाएं। चीरा(चित्रा 5,चरण 4) के माध्यम से एक MRE010 कैथेटर डालें और इंजेक्शन प्रवाह(चित्रा 5, चरण 5)को अवरुद्ध किए बिना बीच की गाँठ के साथ सुरक्षित करें। ऊपरी गाँठ जारी करते समय और कैथेटर की स्थिति को समायोजित करते समय कैथेटर में रक्त का बैकफ्लो दिखाई देना चाहिए।
    3. ईसीए पर एक पोत क्लिप रखें, एक सिरिंज पंप के साथ 5 मिनट के लिए 20 μL/min पर इस कैथेटर के माध्यम से 1 x 106 GFP-NSCs इंजेक्ट करें, इसके बाद एक ही गति से पीबीएस के 50-100 माइक्रोन के साथ फ्लश करें ।
    4. इंजेक्शन के बाद, ऊपरी पर्ची गाँठ के साथ चीरा के ऊपर सीसीए ligate और MRE010 कैथेटर(चित्रा 5,चरण 6) वापस ले। मध्य गाँठ और ऊपरी गाँठ को कसकर ट्रिम करें। ईसीए से पोत क्लिप निकालें। चित्रा 5,चरण 7 में अंतिम छवि को देखें।
    5. घाव को 4-0 सर्जिकल सीवन के साथ बंद करें।
    6. एक हीटिंग पैड और चमड़े के नीचे एनाल्जेसिक इंजेक्शन पर पर्याप्त वसूली प्रदान करने के बाद, अपने घर पिंजरे में जानवरों को वापस।
  4. चूहे में ईसीए के माध्यम से अंतर-धमनी इंजेक्शन
    1. अस्थायी रूप से ईसीए और सीसीए को पोत क्लिप(चित्रा 5,चरण 2) के साथ occlude।
    2. ईसीए(चित्रा 5,चरण 3) के समीपस्थ पक्ष में एक छोटा सा चीरा लगाएं, MRE010 कैथेटर डालें, और एक गाँठ(चित्रा 5,चरण 4) के साथ सुरक्षित करें।
    3. दोनों पोत क्लिप निकालें, 2 मिनट के लिए 50 माइक्रोन/मिनट पर पीबीएस के 100 माइक्रोन में 5 x 106 एनएससी इंजेक्ट करें, इसके बाद एक मोटराइज्ड सिरिंज पंप का उपयोग करके एक ही गति से पीबीएस(चित्रा 5,चरण 5) के 50-100 माइक्रोन के साथ फ्लश करें।
    4. इंजेक्शन के बाद, सीसीए और ईसीए को पोत क्लिप के साथ फिर से ऑक्सीलेड करें और इंजेक्शन कैथेटर(चित्रा 5,चरण 6) की वापसी के बाद दूसरे चीरा के समीपस्थ पक्ष में ईसीए को लिगेट करें।
    5. दो पोत क्लिप(चित्रा 5,चरण 7) निकालें और 4-0 सर्जिकल सीवन के साथ घाव को बंद करें।
    6. एक हीटिंग पैड और चमड़े के नीचे एनाल्जेसिक इंजेक्शन पर पर्याप्त वसूली प्रदान करने के बाद, अपने घर पिंजरे में जानवरों को वापस।
  5. हिस्टोलॉजिकल परख
    1. इस्कीमिक स्ट्रोक प्राप्त करने वाले चूहों और चूहों से दिमाग ले लीजिए जिसके बाद इच्छामृत्यु के बाद एनएससी या वाहन समाधान के इंजेक्शन और इंट्राकार्डिएक परफ्यूजन के बाद 1 डी (माउस और चूहा), 7 डी (माउस) और 30 डी (माउस) में 4% पैराफॉर्मलडिहाइड के साथ इंजेक्शन के बाद। इन चार समूहों में से प्रत्येक में 5 एनएससी और 5 वाहन इंजेक्शन जानवर शामिल थे ।
    2. रात भर दिमाग को ठीक करें और 3 डी के लिए 30% सुक्रोज में क्रायोप्रिजर्व करें।
    3. अक्टूबर में दिमाग एम्बेड, 40 माइक्रोन मोटाई पर टुकड़ा, और ग्लियल फिब्रिलरी अम्लीय प्रोटीन (GFAP, एस्ट्रोसाइट्स), Tuj1 (परिपक्व न्यूरॉन्स), और डबलकॉर्टिन (DCX, अपरिपक्व न्यूरॉन्स) सहित सेल विशिष्ट मार्कर के साथ इम्यूनोस्टेटिंग के बाद एनएससी के वितरण की जांच करें।
      नोट: जीएफपी को व्यक्त करने वाले चूहे के तनाव की कमी के कारण, हमने चूहे एनएससी के लिए एक क्षणिक फ्लोरोसेंट लेबल डीआईआई का उपयोग किया, जो केवल अपेक्षाकृत अल्पकालिक अवलोकन की अनुमति देता है। इसलिए, एनएससी वितरण चूहों में स्ट्रोक के बाद केवल 1 डी पर जांच की गई थी।

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Representative Results

जीएफपी-लेबल वाले एनएससी को इस्कीमिक मस्तिष्क में आसानी से पता लगाया गया था, ज्यादातर इप्सिलाटेरल गोलार्द्ध में, विशेष रूप से पेनुम्ब्रा में और चोट रिम(चित्रा 6)के साथ। इमेजिंग और एनालिसिस के दौरान परीक्षक को सिंगल ब्लाइंड किया गया ।

उदाहरण के लिए, इंजेक्शन के बाद 1 डी में, माउस हिप्पोकैम्पस के भीतर एनएससी का पता चला। एनएससी के एक सबसेट ने इस शुरुआती समय बिंदु(चित्रा 6A)में भी डेंटेट जाइरस में अपरिपक्व न्यूरॉन मार्कर डीसीएक्स की सह-अभिव्यक्ति दिखाई।

स्ट्रोक के बाद 10 डी (एनएससी इंजेक्शन के बाद 7 डी) में, एक्सोजेनस जीएफपी-एनएससी को स्ट्राटम और कॉर्टेक्स(चित्रा 6B)में चोट के रिम (वाटरशेड एरिया) में उच्चतम घनत्व पर देखा गया। यह उल्लेखनीय है कि इंजेक्शन के बाद 7 डी द्वारा जीएफपी-एनएससी के कई ने डीसीएक्स (नीले घेरे द्वारा दिखाया गया) भी व्यक्त किया, जो उनके न्यूरोनल भाग्य का संकेत देता है। वाहन समाधान इंजेक्शन प्राप्त करने वाले जानवरों की तुलना में, एनएससी इंजेक्शन ने इप्सिलाटेरल गोलार्द्ध में डीसीएक्स स्टेनिंग (लाल) भी बढ़ाया।

इंजेक्शन के बाद 30 डी में, एनएससी अभी भी घायल प्रांतस्था में पता चला, और उनमें से एक हिस्से ने ग्लियल मार्कर GFAP(चित्रा 6C)या परिपक्व न्यूरोनल मार्कर Tuj1(चित्रा 6D)की अभिव्यक्ति दिखाई, जो एक्सोजेनस एनएससी की क्षमता को या तो एक ग्लियल या न्यूरोनल भाग्य में अंतर करने के लिए दर्शाता है, और घायल मस्तिष्क में 1 महीने तक जीवित रहता है।

Figure 1
चित्रा 1: इंजेक्शन कैथेटर के योजनाबद्ध डिजाइन। हम दो डिजाइन, यौगिक समाधान इंजेक्शन के लिए डिजाइन 1 और सेल इंजेक्शन के लिए डिजाइन 2 परिचय। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: एनएससी इंजेक्शन और सर्जिकल हुक के लिए कैथेटर की तैयारी। (A)कैथेटर निर्माण के लिए सामग्री: एमआरई010, एमआरई025 और एमआरई050 कैथेटर क्रमशः 3 सेमी, ~ 10-15 सेमी और 3 सेमी लंबाई में। (ख)सुई युक्तियों को काटें और सुस्त होने तक पॉलिश करें। (ग)प्रत्येक सेगमेंट को कनेक्ट करें और सुपरग्लू के साथ सुरक्षित करें, और फिर एन्हांसमेंट के लिए एपॉक्सी में सुई ल्यूर लॉक और एमआरई050 दोनों सेगमेंट को एम्बेड करें। (घ)27 जी सुई शाफ्ट और MRE025 कैथेटर का उपयोग कर सर्जिकल हुक बनाओ । स्केल बार: 5 मिमी. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: जीएफपी की संस्कृति (+) तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं। (क)एफटीसी चैनल का उपयोग करके फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप वाले जीएफपी (+) भ्रूणों की पहचान करें । (ख)आइसोइट और कल्चर कॉर्टिकल एनएससी जब तक वे न्यूरोस्फीयर नहीं बनाते । स्केल बार: 100 माइक्रोन(सी)स्टेम सेल मार्कर पैनल का उपयोग करके न्यूरोस्फीयर गुणों की जांच करें। स्केल बार: 50 माइक्रोन. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 4
चित्रा 4: माउस या चूहे पर कदम-दर-कदम मध्य सेरेब्रल धमनी ऑक्क्लुसेशन (एमसीएओओ) स्ट्रोक सर्जरी की योजनाबद्ध छवियां। विस्तृत शल्य चिकित्सा ऑपरेशन के लिए वीडियो को देखें। आईसीए, आंतरिक कैरोटिड धमनी; ईसीए, बाहरी कैरोटिड धमनी; सीसीए, आम कैरोटिड धमनी। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्रा 5: माउस या चूहे में इंट्रा-धमनी तंत्रिका स्टेम सेल (एनएससी) इंजेक्शन की योजनाबद्ध छवियां। विस्तृत शल्य चिकित्सा ऑपरेशन के लिए वीडियो को देखें। आईसीए, आंतरिक कैरोटिड धमनी; ईसीए, बाहरी कैरोटिड धमनी; सीसीए, आम कैरोटिड धमनी। हरे तीर इंजेक्शन के दौरान प्रवाह की दिशा इंगित करता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 6
चित्र 6: इस्कीमिक मस्तिष्क में तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं (एनएससी) का वितरण, अस्तित्व और भेदभाव। (ए)इंजेक्शन के बाद 1 डी पर हिप्पोकैम्पल डेंटेट जाइरस के भीतर जीएफपी (+) एनएससी का पता लगाना । स्टेम सेल फ्लोरोसे हरे; डबलकॉर्टिन (डीसीएक्स) इम्यूनोस्टेपिंग लाल रंग में दिखाया गया है। सफेद तीर डीसीएक्स अभिव्यक्ति के साथ एक जीएफपी (+) एनएससी इंगित करता है। (ख)जीएफपी (+) कोशिकाओं और डीसीएक्स के योजनाबद्ध मानचित्र ने नकली नियंत्रण (कोई इंजेक्शन नहीं) और वाहन (आई-आर) या एनएससी (आई-आर + एनएससी) में इस्केमिया-रिपरफ्यूजन (आई-आर) के बाद 10 डी पर कोशिकाओं को चिह्नित किया चूहों को इंजेक्शन दिया । इस्कीमिक अपमान की स्थलाकृति को अंतिम योजनाबद्ध में चित्रित किया गया है, जहां हल्का और गहरा नारंगी क्रमशः इस्कीमिक चुनौती और परिगलित कोर के अधीन क्षेत्र का प्रतिनिधित्व करता है। नीले रिबन "वाटरशेड" क्षेत्र को इंगित करता है। ग्रे आयत उन स्थानों को दर्शाते हैं जहां(सी)और(डी)के लिए छवियां ली गई थीं। (C,D) एक्सोजेनस एनएससी डिलीवरी के बाद 30 डी तक एक ग्लियल भाग्य (जीएफएपी, सी) या एक न्यूरोनल भाग्य (Tuj1, D) में अंतर कर सकता है। वाहन इंजेक्शन (सी और डीमें वाहन) प्राप्त करने वाले स्ट्रोक जानवरों में फिटसी (जीएफपी) चैनल में कोई महत्वपूर्ण संकेत नहीं देखे गए, जबकि एनएससी में चूहों को इंजेक्शन दिया गया, जीवित जीएफपी-एनएससी की कल्पना की गई और GFAP(C)या Tuj1(D)धुंधला के साथ colocalized । तीर 2 चैनलों के ओवरले का संकेत देते हैं। स्केल बार: 20 माइक्रोन करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

न्यूरोलॉजिकल रोगों के लिए स्टेम सेल थेरेपी अभी भी शुरुआती अन्वेषणात्मक चरण में है। एक प्रमुख मुद्दा यह है कि मस्तिष्क में अनुसूचित जाति या एनएससी के पर्याप्त वितरण के लिए कोई स्थापित विधि नहीं है ।

यद्यपि नसों में (IV), इंट्रापेरिटोनियल (आईपी) या इंट्रापेरेन्चिमल/इंट्रासेरेब्रल इंजेक्शन के बाद मस्तिष्क में एक्सजेनस एससी/एनएससी का पता लगाया जा सकता है, प्रत्येक डिलीवरी दृष्टिकोण में कमियां होती हैं । मस्तिष्क के भीतर पता लगाने योग्य आबादी परिधीय इंजेक्शन (चतुर्थ या आईपी) के साथ बहुत कम होने का अनुमान है, जो इंजेक्शन या संचार कोशिकाओं के केवल एक छोटे अंश का प्रतिनिधित्व करता है। इंट्रासेरेब्रल इंजेक्शन एक बहुत ही फोकल वितरण प्रदान करता है, और सीधे मस्तिष्क,की चोट2,6, 7,,8,9,,10,,11,,,12,,13को प्रेरित कर सकता है।,13 इसलिए, हमने इस्कीमिक स्ट्रोक के बाद एनएससी डिलीवरी के लिए एक वैकल्पिक विधि के रूप में इंट्रा-धमनी इंजेक्शन की व्यवहार्यता का परीक्षण किया। यह विधि स्ट्रोक के अपमान के बाद इप्सिलाटरल सेरेब्रल परफ्यूजन के माध्यम से एनएससी बचाती है। यदि स्ट्रोक के बाद जल्दी इंजेक्शन, बहिर्जात NSCs बाधित रक्त मस्तिष्क बाधा (BBB) को पार कर सकते हैं, मस्तिष्क भर में एक व्यापक वितरण प्राप्त करने । अंतर-धमनी इंजेक्शन के लिए एक लाभ यह है कि यह सीएनएस के भीतर पहले पास प्रभाव का उपयोग करता है, मस्तिष्क में बसने के लिए बहिर्जात एनएससी की क्षमता को अधिकतम करता है, परिधीय वितरण मार्गों के विपरीत जिसमें कोशिकाएं पहले फेफड़े और जिगर जैसे अंगों को फ़िल्टर करने के समृद्ध माइक्रोसर्कुलेशन से गुजरती हैं।

यहां वर्णित अंतर-धमनी दृष्टिकोण बहुमुखी है, और विभिन्न प्रकार के डिलीवरी प्रतिमान और चोट या रोग मॉडल को समायोजित करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। हालांकि वर्तमान अध्ययन में केवल एक इंट्रा-धमनी इंजेक्शन किया जाता है, MRE025 कैथेटर को एक माइक्रोपोर्ट से जोड़ा जा सकता है जो सब्ट्यूटेके रूप में एम्बेडेड है, जिसके माध्यम से जानवरों को दोहराव वाले अंतर-धमनी इंजेक्शन12प्राप्त हो सकते हैं। इसके अलावा, सरल, एकल ल्यूमेन डिजाइन के साथ, इस इंजेक्शन विधि का उपयोग समाधान12,,23में रिएजेंट्स के वितरण के लिए किया जा सकता है। यदि कई चिकित्सा विज्ञान की डिलीवरी की आवश्यकता है, तो दोहरी ल्यूमेन डिजाइन का उपयोग एक साथ प्रारंभिक समाधान देने के लिए या क्रमिक रूप से दूसरी दवा या यौगिक के साथ किया जा सकता है। न्यूरोडिजेनरेशन या दर्दनाक मस्तिष्क चोट के कृंतक मॉडल के लिए अनुप्रयोगों के लिए, जहां पहले स्ट्रोक सर्जरी की कोई आवश्यकता नहीं है, माउस में इंजेक्शन कैथेटर की स्थापना के लिए सर्जरी ईसीए पर की जा सकती है (चूहे के लिए एक ही प्रोटोकॉल, चूहों के लिए चरण 7.4 में इंजेक्शन की मात्रा और दर को उचित रूप से समायोजित करना), सीसीए के माध्यम से मस्तिष्क रक्त प्रवाह की संभावित अशांति से बचने के लिए।

इस इंट्रा-धमनी इंजेक्शन के कई नुकसान और संभावित प्रतिकूल परिणामों पर विचार किया जाना चाहिए। जानवरों को एक दूसरी सर्जरी प्राप्त होती है, जिसमें संज्ञाहरण या सर्जरी से संबंधित जटिलताओं की क्षमता होती है। ipsilateral सीसीए के माध्यम से मस्तिष्क रक्त प्रवाह परेशान है, हालांकि क्षणिक (कुछ मिनट से भी कम) है, जो CBF के हल्के अवसाद का एक और क्षणिक प्रकरण प्रेरित कर सकते हैं । इसके अलावा, बीबीबी अशांति या खोलने अंतर धमनी एनएससी वितरण के लिए महत्वपूर्ण है, जो चिकित्सकीय खिड़की को सीमित करता है । पायलट अध्ययन में, अंतर-धमनी इंजेक्शन के बाद भोले मस्तिष्क में लगभग कोई जीएफपी (+) एनएससी का पता नहीं चला। हालांकि, यदि विषय उन दवाओं को बर्दाश्त कर सकता है जो बीडीबी को क्षणिक रूप से खोल सकती हैं, जैसे कि उच्च ऑस्मोलिटी मैनिटोल या खारा, इसका उपयोग बाद के समय बिंदुओं पर एनएससी इंजेक्शन के लिए बीबीबी खोलने की क्षणिक खिड़की बनाने के लिए किया जा सकता है। प्रारंभिक अध्ययनों में, हमने पाया कि स्ट्रोक के बाद पहले 6 घंटे के भीतर इंट्रा-धमनी इंजेक्शन के परिणामस्वरूप अकेले स्ट्रोक के साथ मनाया जाने वाला उच्च मृत्यु दर हुई। यह पहली सर्जरी के बाद वसूली की अपेक्षाकृत कम अवधि के बाद एक दूसरी आक्रामक सर्जरी से संबंधित हो सकता है। वैकल्पिक रूप से, इस्कीमिक अपमान के बाद, घायल सेरेब्रोवैस्कुलेचर में किसी भी अतिरिक्त उत्तेजनाओं के जवाब में संकुचित होने की उच्च प्रवृत्ति हो सकती है, जैसे कैथेटर की शुरूआत, अतिरिक्त तरल पदार्थ लोड करना, या इंजेक्शन के बाद चमकदार दीवार पर एक्सजेनोसियस एनएससी का लगाव। स्ट्रोक के बाद एनएससी डिलीवरी के बारे में एक और उचित चिंता यह है कि एनएससी एम्बोली बना सकता है जो माइक्रोवेसेल्स को आगे बढ़ाता है या परेशान करता है। पिछलीरिपोर्टों 8,16,,24के साथ समझौते में, हमें माइक्रोवैस्कुलेचर में जीएफपी (+) एम्बोली के महत्वपूर्ण सबूत नहीं मिले, हालांकि हमने इंजेक्शन के बाद शुरुआती दिनों में पेरिवेंस्कुलर स्पेस (विरिक्व-रॉबिन स्पेस) में जीएफपी (+) एनएससी को पाया।, इंजेक्शन के लिए समय खिड़की को अनुकूलित करने के बाद, वर्तमान अध्ययन में वाहन या एनएससी इंजेक्शन प्राप्त करने वाले स्ट्रोक समूहों के बीच जटिलता या मृत्यु दर में कोई अंतर नहीं था। इसलिए, ठीक से डिजाइन किया गया अंतर-धमनी एनएससी इंजेक्शन न्यूरोलॉजिकल रोगों को लक्षित करने वाली एनएससी उपचार की एक सुरक्षित और कुशल विधि है।

सफल एनएससी इंजेक्शन प्राप्त करने और पशु परिणामों में सुधार करने के लिए, स्ट्रोक सर्जरी या एनएससी इंजेक्शन के दौरान सावधानी के साथ कई पहलुओं को संभाला जाना चाहिए। सामान्य सर्जिकल समर्थन और देखभाल, जैसे कॉर्निया की सुरक्षा और कोर तापमान के रखरखाव, अभ्यास किया जाना चाहिए। यहां हम उनकी घटना को कम करने के लिए इस विशिष्ट सर्जरी और मार्गदर्शन की कुछ संभावित जटिलताओं का परिचय देते हैं।

वैगस नर्व पर तनाव हो सकता है। सर्जरी के दौरान, वेगस तंत्रिका को बढ़ाया, कुचल, लिगा हुआ या उत्तेजित नहीं किया जाना चाहिए। वेगस तंत्रिका की आकस्मिक उत्तेजना अतालता जैसे कि ब्रैडकार्डिया, हृदय की गिरफ्तारी, या यहां तक कि मौत को प्रेरित कर सकती है।

अनुचित प्लेसमेंट या सीवन की सख्ती, या गलत स्थान या एक पोत क्लिप के फिसल सीसीए के समीपस्थ अंत से धमनी रक्तस्राव में परिणाम हो सकता है (हृदय उत्पादन से) या विलिस के सर्कल के माध्यम से डिस्टल अंत । प्रत्येक चरण में, यह सुनिश्चित करें कि रक्त प्रवाह को कम करने के लिए पोत क्लिप या समुद्री मील को ठीक से रखा जाता है। यदि रक्तस्राव होता है, तो गाँठ या पोत क्लिप की सही नियुक्ति को बहाल करने का प्रयास करें। यदि दृश्य क्षेत्र रक्त के साथ धुंधला है, सीसीए पर एक बाँझ कपास झाड़ू की नोक डाल दिया और रक्त प्रवाह को रोकने के लिए दबाव के साथ पकड़ो । रक्तस्राव से हीमोग्लोबिन धमनी पर चीरा बंद करने में सुविधा देगा। रक्तस्राव बंद होने के बाद, गाँठ को कस लें या पोत क्लिप को सही स्थान पर रखें, दृश्य क्षेत्र में रक्त को साफ करें और सर्जरी जारी रखें।

कैथेटर प्रविष्टि से चोट या जटिलताएं हो सकती हैं। MRE010 टिप को 45 डिग्री कोण पर ट्रिम करें, इसलिए यह किसी भी पोत की चोट को उत्प्रेरित किए बिना धमनी पर छोटे चीरा को आसानी से दर्ज कर सकता है। दुर्लभ मामलों में, एक ओवर-शार्प टिप धमनी में प्रवेश कर सकता है या तहखाने झिल्ली और ट्यूनिका एक्सर्टाना के बीच की जगह में प्रवेश कर सकता है। इन चोटों से बचने के लिए धमनी पर उचित आकार का चीरा लगा लें। हम 1/4-1/3 धमनी की परिधि के आकार की सलाह देते हैं, जो कैथेटर टिप के प्रवेश की अनुमति देने के लिए काफी बड़ा है, लेकिन कैथेटर के बाहर लपेटने के लिए पोत की दीवार में पर्याप्त ताकत बरकरार रखता है। बहुत बड़ा चीरा चीरा साइट पर धमनी के फाड़ करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं। चीरा दर्ज करने के लिए धीरे से MRE010 कैथेटर टिप गाइड। कैथेटर टिप या कैथेटर की उन्नति के प्रवेश के लिए मजबूर न करें। यदि आवश्यक हो, तो चीरा के किनारे उठाने के लिए तेज संदंश का उपयोग किया जा सकता है। धमनी के सापेक्ष कम कोण के साथ कैथेटर को आगे बढ़ाएं ताकि कैथेटर और धमनी लगभग समानांतर हो।

इंजेक्शन से संबंधित संभावित जटिलताएं भी हैं। इंट्रा-धमनी इंजेक्शन से एक आम जटिलता अत्यधिक मात्रा में लोड हो रही है, जो तीव्र हृदय अधिभार और फेफड़े के एडिमा का कारण बन सकती है। इंजेक्शन की तीव्र दरें इन जोखिमों को बढ़ा सकती हैं और पोत की दीवार8को नुकसान पहुंचा सकती हैं । इस प्रकार, दर और कुल मात्रा दोनों को सावधानीपूर्वक नियंत्रित किया जाना चाहिए। हम 20 μL/मिनट की सलाह के रूप में चूहों के लिए आम तौर पर सुरक्षित जब इस तरह के 5 मिनट के रूप में एक छोटी अवधि में इस्तेमाल किया । यदि वॉल्यूम अधिभार के लक्षणों को नोट किया जाता है, जैसे त्वरित, उथली सांस, नार्स से गुलाबी बुलबुले, या डिस्फोरिया जैसे गुमराह आंदोलन, इंजेक्शन को बंद या गर्भपात किया जाना चाहिए, और जानवरों को ठीक होने की अनुमति दी जानी चाहिए। एक और संभावित जटिलता सेरेब्रोवैस्कुलर सिस्टम में एनएससी एम्बोली का गठन है। सस्पेंशन सॉल्यूशन में कैल्शियम या मैग्नीशियम नहीं होना चाहिए, जो सेल एकत्रीकरण को बढ़ावा देने के लिए जाना जाता है। एम्बोली को प्रेरित करने की संभावना को कम करने के लिए, कोशिका समूहों की अनुपस्थिति की पुष्टि करने के लिए इंजेक्शन से ठीक पहले एनएससी के एकल कोशिका निलंबन की जांच माइक्रोस्कोप के तहत की जानी चाहिए। यदि सेल क्लस्टर मौजूद हैं, तो एकल सेल निलंबन प्राप्त होने तक बाँझ 1 एमएल पिपेट के साथ टिकेट करें।

यह अध्ययन चूहों और चूहों के लिए अंतर-धमनी वितरण दृष्टिकोण की व्यवहार्यता स्थापित करता है, और इस्कीमिक स्ट्रोक के संदर्भ में एनएससी के इस अंतर-धमनी इंजेक्शन की कई महत्वपूर्ण विशेषताओं का पता चलता है। मस्तिष्क परेंचिमा में जीवित एनएससी के अपेक्षाकृत फोकल वितरण की तुलना में आमतौर पर इंट्रा-सेरेब्रल इंजेक्शन1,,7,,9,11,15, 16के साथ रिपोर्ट कियाजाताहै, हमने कॉर्टेक्स, हिप्पोकैम्पस और स्ट्राटम सहित पूरे आईपीएसइलेटरल गोलार्द्ध में एक फैलाना वितरण देखा।,,, इस प्रकार, इंट्रा-धमनी डिलीवरी न केवल स्ट्रोक के लिए अनुकूल है, बल्कि कई चोट प्रकारों या बीमारियों के लिए भी अनुकूल है जिसमें मस्तिष्क क्षति को फैलाना शामिल है। एमसीएओ की सेटिंग में, एनएससी की उच्चतम एकाग्रता चोट स्थल के रिम के साथ पाई गई । पेनुम्ब्रा जोन में बहिर्जात एनएससी का बढ़ा घनत्व इस क्षेत्र में पुनर्स्थापित रक्त परफ्यूजन और बीबीबी के उद्घाटन के साथ-साथ क्षतिग्रस्त क्षेत्र की ओर एनएससी के प्रवास से संपाश्र्वक प्रवाह के माध्यम से इस क्षेत्र में बढ़ी हुई डिलीवरी के कारण हो सकता है । यद्यपि अनुसूचित जाति के चतुर्थ वितरण के परिणामस्वरूप एक फैलाना वितरण हो सकता है, मस्तिष्क तक पहुंचने वाली कोशिकाओं की संख्या परिधीय अंगों8,,13द्वारा निस्पंदन के कारण कुल वितरित का एक छोटा सा अंश होने का अनुमान है। मस्तिष्क मेटास्टेसिस12पर पिछले अध्ययन के आधार पर, इंट्रा-धमनी इंजेक्शन लूसिफ़ेरेस-लेबल D122 ट्यूमर कोशिकाओं ने सेरेब्रल वैक्यूलेचर में बसने और परिधीय अंगों के बजाय मस्तिष्क में मेटास्टैटिक साइटों को विकसित करने के लिए पहले पास प्रभाव का लाभ उठाया। एक्सोजेनस ट्यूमर कोशिकाओं के कारण मस्तिष्क में सेरेब्रल मेटास्टैटिक साइटों को मस्तिष्क में इंजेक्शन के रूप में 1 सप्ताह के बाद इंजेक्शन के रूप में पता लगाया गया था जो बरकरार खोपड़ी और खोपड़ी के माध्यम से बायोल्यूमिनेसेंट सिग्नल का पता लगाने के लिए आईवीआईएस इमेजिंग सिस्टम का उपयोग करके इंजेक्शन लगातार था। इसके विपरीत, लिवर, फेफड़े और मांसपेशियों जैसे परिधीय अंगों से ल्यूमिनेसेंट संकेतों (एक्सोजेनस ट्यूमर कोशिकाओं से जुड़े ट्यूमर के बोझ का संकेत) इंट्रा-धमनी इंजेक्शन के 3-4 सप्ताह बाद तक पता नहीं लगाया गया था। इसलिए, हम उम्मीद करते हैं कि इसी तरह के परिदृश्य में, इंट्रा-धमनी एनएससी डिलीवरी से सेरेब्रल सर्कुलेशन में पहले पास प्रभाव से भी लाभ होगा ताकि परिधीय अंगों की तुलना में मस्तिष्क में स्थानीयकरण में काफी वृद्धि हो सके ।

यद्यपि सीधे इंट्रासर्ज्रल इंजेक्शन का उपयोग बड़ी संख्या में कोशिकाओं को घायल मस्तिष्क तक पहुंचाने के लिए किया जा सकता है, लेकिन परेन्चिमा के सुई प्रवेश के कारण सेलुलर क्षति या नकसीर के कारण दृष्टिकोण का परिणाम होता है जो स्थानीयन्त न्यूरोइंफ्लेमेशन को ट्रिगर करता है, संभावित रूप से जीवित रहने और नए वितरित कोशिकाओं के एकीकरण से समझौता,करता है14,15,,16,,,25, 26।26 एनएससी डिलीवरी के लिए अंतर-धमनी दृष्टिकोण लाभप्रद है कि यह इस स्थानीयकृत मस्तिष्क क्षति और न्यूरोइंफ्लेमेशन से बचता है,,और एनएससी,3,8,9,14,24के दीर्घकालिक अस्तित्व का समर्थन करता है।,, हमने इंजेक्शन के बाद 30 डी तक के समय में घायल मस्तिष्क में इंजेक्शन जीपीएफ-एनएससी के अस्तित्व और भेदभाव को देखा। यद्यपि हमने पाया कि एनएससी ने परिपक्व न्यूरॉन्स और एस्ट्रोसाइट्स में अंतर किया था, जीएफपी-एनएससी से उत्पन्न विभिन्न सेल प्रकारों के सापेक्ष वितरण और पुरानी पोस्टिनिंजरी अवधि में जीवित रहने वाले अनुपात को निर्धारित करने के लिए विस्तृत अध्ययन की आवश्यकता है। इससे भी महत्वपूर्ण बात, चाहे जीवित, बहिर्जात NSCs मस्तिष्क नेटवर्क के पुनर्निर्माण और तंत्रिका संबंधी कार्य को बदलने के लिए संविलियन मस्तिष्क कोशिकाओं के साथ बातचीत कर सकते हैं अभी भी अस्पष्ट है और इसका पता लगाया जाना चाहिए।

एक साथ लिया, हम इस्कीमिक मस्तिष्क में एनएससी देने के लिए एक अंतर-धमनी वितरण विधि पेश करते हैं, जो इस्कीमिक गोलार्द्ध में दीर्घकालिक अस्तित्व का प्रदर्शन करता है और न्यूरोनल और ग्लियल सेल प्रकारों में भेदभाव करता है। अंतर धमनी वितरण दृष्टिकोण कई प्रजातियों और सीएनएस चोट और रोग के कई मॉडलों के लिए अनुकूलनीय है और अन्य सेल प्रकार या एकल या कई चिकित्सीय यौगिकों या जीवविज्ञान के वितरण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, तंत्रिका विज्ञान समुदाय के लिए व्यापक उपयोगिता प्रदान करते हैं।

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Disclosures

कोई नहीं.

Acknowledgments

इस शोध को निम्नलिखित द्वारा समर्थित किया गया था: एलसी के लिए अहा पुरस्कार 14SDG20480186, शांक्सी यूनिवर्सिटी ऑफ चाइनीज मेडिसिन 2019-QN07 की विषय नवाचार टीम बीजेड के लिए, और केंटकी स्पाइनल कॉर्ड और हेड इंजरी रिसर्च ट्रस्ट ग्रांट 14-12ए केएस और एलसी के लिए।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
20 G needle Becton & Dickinson BD PrecisionGlide 305175 preparation of injection catheter
26 G needle Becton & Dickinson BD PrecisionGlide 305111 preparation of injection catheter
27 G needle Becton & Dickinson BD PrecisionGlide 305136 preparation of injection catheter
4-0 NFS-2 suture with needle Henry Schein Animal Health 56905 surgery
6-0 nylon suture Teleflex/Braintree Scientific 104-s surgery
Accutase STEMCELL Technologies 7922 cell detachment solution
blade Bard-Parker 10 surgery
Buprenorphine-SR Lab ZooPharm Buprenorphine-SR Lab® analgesia (0.6-1 mg/kg over 3 d)
Calcium/magnisum free PBS VWR 02-0119-0500 NSC dissociation
DCX antibody Millipore AB2253 immunostaining
GFAP antibody Invitrogen 180063 immunostaining
Isoflurane Henry Schein Animal Health 50562-1 surgery
MCAO filament for mouse Doccol 702223PK5Re surgery
MCAO filament for rat Doccol 503334PK5Re surgery
MRE010 catheter Braintree Scientific MRE010 preparation of injection catheter
MRE025 catheter Braintree Scientific MRE025 preparation of injection catheter
MRE050 catheter Braintree Scientific MRE050 preparation of injection catheter
Nu-Tears Ointment NuLife Pharmaceuticals Nu-Tears Ointment eye care during surgery
S&T Forceps - SuperGrip Tips JF-5TC Angled Fine Science Tools 00649-11 surgery
S&T Forceps - SuperGrip Tips JF-5TC Straight Fine Science Tools 00632-11 surgery
Superglue Pacer Technology 15187 preparation of injection catheter
syringe pump Kent Scientific GenieTouch surgery
Tuj1 antibody Millipore MAb1637 immunostaining
two-component 5 minute epoxy Devcon 20445 preparation of injection catheter
Vannas spring scissors Fine Science Tools 15000-08 surgery
vascular clamps Fine Science Tools 00400-03 surgery
Zeiss microscope Zeiss Axio Imager 2 microscopy

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References

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Zhang, B., Joseph, B., Saatman, K.… More

Zhang, B., Joseph, B., Saatman, K. E., Chen, L. Intra-Arterial Delivery of Neural Stem Cells to the Rat and Mouse Brain: Application to Cerebral Ischemia. J. Vis. Exp. (160), e61119, doi:10.3791/61119 (2020).

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