Summary
Um método para fornecer células-tronco neurais, adaptáveis para soluções ou suspensões injetáveis, através da artéria carótida comum (mouse) ou artéria carótida externa (rato) após o derrame isquêmico ser relatado. As células injetadas são distribuídas amplamente por todo o parenchyma cerebral e podem ser detectadas até 30 d após o parto.
Abstract
A terapia com células-tronco neurais (NSC) é um tratamento inovador emergente para derrame, lesão cerebral traumática e distúrbios neurodegenerativos. Em comparação com a entrega intracraniana, a administração intra-arterial de NSCs é menos invasiva e produz uma distribuição mais difusa de NSCs dentro do parênquim cerebral. Além disso, a entrega intra-arterial permite o efeito de primeira passagem na circulação cerebral, diminuindo o potencial de captura de células em órgãos periféricos, como fígado e baço, uma complicação associada a injeções periféricas. Aqui, detalhamos a metodologia, tanto em camundongos quanto em ratos, para a entrega de NSCs através da artéria carótida comum (rato) ou artéria carótida externa (rato) para o hemisfério ipsilateral após um derrame isquêmico. Usando NSCs rotulados por GFP, ilustramos a distribuição generalizada alcançada em todo o hemisfério ipsilateral de roedores em 1 d, 1 semana e 4 semanas após a entrega pós-isquêmica, com maior densidade dentro ou perto do local de lesão isquêmica. Além da sobrevivência a longo prazo, mostramos evidências de diferenciação de células rotuladas por GFP em 4 semanas. A abordagem de entrega intra-arterial descrita aqui para NSCs também pode ser usada para administração de compostos terapêuticos, e, portanto, tem ampla aplicabilidade a variados modelos de lesões e doenças de CNS em várias espécies.
Introduction
A terapia com células-tronco (SC) tem um enorme potencial como tratamento para doenças neurológicas, incluindo acidente vascular cerebral, traumatismo craniano e demência1,,2,3,4,,5,6. No entanto, um método eficiente para fornecer SCs exógenos ao cérebro doente permanece problemático2,6,7,8,9,10,11,12,13. As SCs entregues através de rotas de entrega periféricas, incluindo injeção intravenosa (IV) ou intraperitoneal (IP), estão sujeitas à filtragem de primeira passagem na microcirculação, especialmente no pulmão, fígado, baço e músculo8,,9,,13,,14, aumentando as chances de acúmulo de células em áreas não-alvo. O método de injeção intracerebral invasivo resulta em danos localizados no tecido cerebral e uma distribuição muito restrita de SCs perto do local da injeção2,6,,8,,14,15,,16. Recentemente estabelecemos um método de injeção intra-arterial à base de cateter para fornecer SCs neurais exógenos (NSCs), que é descrito aqui aplicado em um modelo de roedor de derrame isquêmico focal. Induzimos lesão transitória (1 h) isquemia-reperfusão em um hemisfério usando um filamento revestido de borracha de silicone para ocluir a artéria cerebral média esquerda (MCA) no camundongo ou rato17,,18,,19. Neste modelo, observamos de forma reprodutiva aproximadamente 75-85% a depressão do fluxo sanguíneo cerebral (CBF) no hemisfério ipsilateral com Laser Doppler ou Laser speckle imaging17,19, gerando déficits neurológicos consistentes17,,18,,19.
Para fins de economia de tempo, o vídeo é definido para jogar em duas vezes a velocidade normal e procedimentos cirúrgicos de rotina, como preparação da pele e fechamento de feridas com sutura e o uso e configuração da bomba de seringa motorizada não são apresentados. O método de entrega intra-arterial de NSCs é demonstrado no contexto do modelo de oclusão da artéria cerebral média (MCAO) de derrame experimental em roedores. Por isso, incluímos o procedimento de derrame isquêmico transitório, a fim de demonstrar posteriormente como a segunda cirurgia, a injeção intra-arterial, é realizada utilizando o local cirúrgico anterior no mesmo animal. A viabilidade da entrega intra-arterial de NSC em modelos de curso de roedores é demonstrada pela avaliação da distribuição e sobrevivência de NSCs exógenos. A eficácia da terapia NSC para atenuar a patologia cerebral e disfunção neurológica será relatada separadamente.
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Protocol
Todos os procedimentos sobre os animais foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) da Universidade de Kentucky, e foram tomados cuidados adequados para minimizar o estresse ou a dor associados à cirurgia.
1. Preparação de cateter de injeção e ganchos cirúrgicos
- Construa o cateter de injeção(Figura 1). Reúna os materiais necessários, incluindo: MRE010, MRE025 e tubos MRE050, agulhas de injeção de 20 G, 26 G e 27 G(Figura 2A),600 lixa de grão, supercola e epóxi de 5 minutos de dois componentes.
- Corte agulhas de 20 G e 26 G a 1 cm do cubo da agulha e polir a extremidade na lixa(Figura 2B). Lave as agulhas com 10 mL de água dupla destilada para limpar o furo da agulha.
NOTA: São utilizados dois desenhos diferentes(Figura 1). O Design 1 tem um único conector e é usado para injeção de soluções ou suspensões. O Design 2 possui conectores de bloqueio Luer de 20 G e 26 G para injeção de células (agulha de 20 G) e descarga do volume morto (agulha de 26 G) para garantir a entrega do volume total da solução contendo NSC.
- Corte agulhas de 20 G e 26 G a 1 cm do cubo da agulha e polir a extremidade na lixa(Figura 2B). Lave as agulhas com 10 mL de água dupla destilada para limpar o furo da agulha.
- Design 1: Insira um cateter MRE010 de 3-4 cm de comprimento em um cateter MRE025 de 15 cm de comprimento e fixe com supercola.
- Conecte a outra extremidade do tubo MRE025 a um segmento de cateter MRE050 e fixe com supercola. Insira uma agulha de 20 G embotada na extremidade restante do cateter MRE050 e fixe com supercola(Figura 1).
- Reforçar ainda mais os locais de conexão com cola epóxi. Este projeto de cateter é ideal para a injeção de reagentes (como soluções químicas ou medicamentosas ou outros biológicos, como citocinas).
- Design 2: Insira um cateter MRE010 de 3-4 cm de comprimento em um cateter MRE025 de 15 cm de comprimento e fixe com supercola.
- Conecte a outra extremidade do tubo MRE025 a um segmento de cateter MRE050 e fixe com supercola. Insira uma agulha de 20 G embotada na extremidade restante do cateter MRE050 e fixe com supercola.
- Insira uma agulha de 26 G embotada no tubo MRE050 perto da ponta da primeira agulha, seguindo a direção do fluxo de injeção, e fixe com supercola(Figura 1 e Figura 2C). Reforce as agulhas e o segmento do tubo MRE050 com epóxi claro(Figura 2C). Este projeto permite a injeção de solução veicular através da agulha 2 (26 G) após a injeção de NSC através da agulha 1 (20 G) para liberar o volume morto no cateter para a circulação cerebral, alcançando um controle mais preciso dos volumes de injeção.
- Use uma agulha de 20 G para injeção de NSC, a fim de minimizar os danos aos NSCs, o que poderia afetar negativamente a viabilidade.
- Após a construção, lave os cateteres com 10 mL de água dupla destilada, seguido de 70% de etanol, e depois mergulhe-os em 70% de etanol durante a noite.
- Antes da cirurgia, retire os cateteres de 70% de etanol e lave com 10 mL de PBS estéril, e coloque-os em uma caixa de ferramentas cirúrgicas autoclavadas para armazenamento e transporte.
- Preparação dos ganchos cirúrgicos
- Corte um eixo de agulha de 1,5- 2 cm de comprimento de uma agulha de 27 G, e polir ambas as extremidades em lixa até ficar maçante. Em seguida, use um pequeno grampo hemostático para dobrar o eixo em um gancho em uma extremidade e uma forma de anel na outra extremidade.
- Insira um cateter MRE025 de 10-15 cm de comprimento através do anel e fixe com fita cirúrgica clara(Figura 2D). Faça mais 2 ganchos usando o mesmo método.
- Mergulhe todos os ganchos e sistemas de cateter em 70% de etanol até usar.
2. Preparação animal: Entrega, habitação, adaptação ambiental
- Foram utilizados neste estudo ratos C57BL/6 masculinos e femininos (10-12 semanas, n=10/ponto de tempo) e ratos Wistar (10-12 semanas, n=10).
- Abriga-os em um vivarium animal controlado ambientalmente com comida e água ad libitum.
- Permita que eles se adaptem ao ambiente pelo menos 1 semana antes da cirurgia de derrame.
NOTA: Um rato e um rato morreram em 1 d após a cirurgia de derrame e um rato foi eutanizado em 3 d pós-derrame antes da injeção de NSC por razões humanas por causa de paralisia grave.
3. Cultura de células-tronco neurais de camundongos e ratos (NSCs)
NOTA: Os NSCs foram isolados e cultivados seguindo um protocolo estabelecido20.
- Mouse
- Isolador os NSCs (WT) e os NSCs rotulados por GFP do córtex embrionário E18 de camundongos C57BL/6 fêmeas de gravidez cronometrada acasalados com camundongos machos GFP positivos (B6 ACTb-EGFP). Para identificar embriões GFP (+) observem os embriões colhidos em um microscópio de fluorescência usando o canal FITC. Os embriões GFP (+) produzem sinal de fluorescência verde, enquanto os embriões de TT mostram apenas auto-fluorescência fraca(Figura 3A).
- Rato
- Isolar os NSCs da zona subventricular (SVZ) de ratos WT adultos jovens. Rotule-os com DiI pouco antes da injeção seguindo as instruções do fabricante21.
- NSCs de camundongos ou ratos de cultura até que se desenvolvam em neurosferas, e os passem quando o diâmetro da esfera atingir cerca de 100 μm(Figura 3B). Use os NSCs para injeção entre as passagens 3 e 5.
- Verifique suas propriedades de células-tronco usando um painel de marcador de células-tronco embrionárias(Figura 3C).
- No dia da injeção, colete esferas de NSC e dissociar com a solução de descolamento celular, suspender em PBS livre de cálcio e magnésio para uma concentração de 107 células/mL, e colocar no gelo molhado até a injeção.
4. Preparação cirúrgica
- Antes da cirurgia, marque um ponto na sutura comercial de MCAO com uma caneta marcadora prateada a 9 mm (para mouse) ou 15 mm (para rato) da ponta para referência em cirurgia do comprimento da inserção. Autoclave as ferramentas cirúrgicas (tesouras, fórceps) e instrumentos antes de cada cirurgia, e o calor os esterilize em um esterilizador de contas de vidro entre as operações.
- Induzir anestesia em animais com 5% de isoflurane via inalação e manter anestesia com 1-2% de isoflurane. Avalie a profundidade da anestesia através da observação de condições gerais (padrão respiratório, movimento do bigode e postura espontânea de correção corporal), reflexo córnea e resposta ao aperto do dedo do dedo do dedo.
- Coloque o supino animal em uma almofada de aquecimento, e prepare o local cirúrgico no animal, cortando e esfregando com solução betadina seguido de 70% de etanol. Proteja os olhos do animal da secagem, aplicando pomada oftalmológica (por exemplo, pomada artificial) durante a cirurgia.
- Que os cirurgiões esfreguem completamente as mãos com um esfoliante bactericidal e usem uma máscara, luvas estéreis e um jaleco limpo.
5. Cirurgia de oclusão da artéria cerebral média (MCAO)
NOTA: As cirurgias para induzir derrame isquêmico em um hemisfério de camundongo ou rato são semelhantes na forma de introduzir uma sutura na artéria carótida interna (ICA) para ocluir o fluxo sanguíneo(Figura 4)17,,18,,19,22. No entanto, a artéria selecionada para a inserção da sutura difere com base no espaço de operação disponível necessário para a injeção subsequente de células-tronco. O rato tem amplo espaço no segmento de artéria carótida externa (ECA) para permitir duas cirurgias separadas e sequenciais (derrame e injeção de NSC), mas o rato não, exigindo uma abordagem alternativa. Alterações no fluxo sanguíneo cerebral induzidas por AVC, tamanho do infarto cerebral e déficits neurológicos foram relatadas como nos relatórios anteriores dos autores17,,18,,19.
- Para induzir o AVC isquêmico, inicie cirurgias de camundongos e ratos com incisão de linha média na área cervical e isolamento da artéria carótida comum esquerda (CCA), ECA e ICA (Figura 4). Tenha cuidado para não esticar, deslocar ou espremer o nervo CCA ou vagus. Uma vez que a seleção das etapas da artéria e cirúrgica são diferentes depois disso, a cirurgia de MCAO no camundongo e no rato será descrita separadamente.
- Cirurgia de MCAO no camundongo (Figura 4A)
- Coloque três suturas trançadas de nylon 6-0 sob a CCA (Figura 4A, passo 1), e faça um nó cirúrgico apertado para ocluir o vaso o mais longe possível da bifurcação usando a corda proximal(Figura 4A, passo 2). Apare as pontas da sutura.
- Faça um slipknot no lado distal da CCA (cuidado: não aperte demais, pois será liberado na etapa 6) e um slipknot solto entre os dois nós apertados(Figura 4A, passo 2).
- Corte uma pequena incisão (~ 1/4 - 1/3 da circunferência) perto do nó proximal na CCA com microscisores(Figura 4A, passo 3), e insira cuidadosamente a sutura de nylon sólida revestida de silicone comercial 7-0(Figura 4A, passo 4). Segure esta sutura com a corda média, apertando o suficiente(Figura 4A, passo 5) para garantir nenhum vazamento de sangue da incisão e nenhum movimento do filamento de nylon revestido de silicone pelo fluxo de fundo da ICA, ao mesmo tempo que permite o avanço da sutura em direção ao ECA com um leve empurrão pela pinça.
- Solte o slipknot superior (distal)(Figura 4A, passo 6) e avance a sutura de nylon no ICA até que sua ponta passe a bifurcação por 9 mm (usando o marcador de prata na sutura como referência). Aperte os dois deslizamentos superiores para fixar a sutura e evitar o fluxo sanguíneo.
- Retire o filamento 1 h depois(Figura 4A, passo 7) e ligate a CCA usando o nó médio para evitar sangramento(Figura 4A, passos 5-7 em ordem inversa, resultados finais como visto na etapa 8). Solte o nó superior. Feche a ferida com sutura cirúrgica 4-0.
- Cirurgia de MCAO em rato (Figura 4B)
- Coloque duas suturas trançadas de nylon 6-0 sob o ECA (Figura 4B, passo 1), e faça um nó apertado na extremidade distal na medida do possível(Figura 4B, passo 2).
- Coloque clipes de vaso no ICA e CCA para ocluir o fluxo sanguíneo arterial(Figura 4B, passo 3). Um slipknot pode ser usado como alternativa para um clipe de vaso.
- Faça uma pequena incisão no ECA com microscisores(Figura 4B, passos 3-4), insira um filamento comercial de borracha de silicone revestido 6-0 de nylon(Figura 4B, passo 5), e fixe corretamente com um slipknot no ECA.
- Solte o clipe do vaso no ICA, avance o filamento para dentro do ICA até que o marcador de prata (15 mm) atinja a bifurcação(Figura 4B, passo 6), edepois fixe a sutura com o 2º nó no ECA (Figura 4B, passo 6).
- Após 1h de isquemia, retire este filamento e liga a incisão para evitar sangramento (Figura 4B, passo 7), remova o clipe do vaso da CCA (resultado final como na etapa 8) e feche a ferida com sutura cirúrgica 4-0.
6. Recuperação
- Após a cirurgia de derrame, coloque os animais em uma almofada de aquecimento até que recuperem totalmente a consciência.
- Forneça analgesia através de injeção subcutânea. Devolva os animais para suas gaiolas de origem com acesso a água e comida ad libitum.
7. Injeção intra-arterial
- Lave o cateter inteiro com 70% de etanol e mergulhe durante a noite até usar. Logo antes da injeção, conecte a trava Luer da agulha com uma seringa estéril e lave todo o lado lúmen do sistema de cateter com 10 mL de PBS estéril.
- Janela de tempo e preparação para injeção de NSC
NOTA: Com base na experiência e relatórios de outras equipes de pesquisa, o tempo para injeção de NSC é crucial para a sobrevivência de ambos os sujeitos e NSCs exógenos. Em nosso estudo piloto, a injeção de NSCs em pontos de tempo inicial (dentro das primeiras 6h após a reperfusão) levou a uma maior mortalidade. Assim, testamos pontos de tempo de injeção posteriores e determinamos a janela de tempo entre 2 d (48 h) a 3 d (72 h) após o acidente vascular cerebral é seguro e tolerável para animais, e é eficiente em alcançar a distribuição intraparenquimal de NSCs. Os resultados aqui apresentados são de animais recebidos injeção de NSC em 3 d após lesão.- Coloque a taxa de injeção da bomba de seringa em 20 μL/min para ratos e 50 μL/min para ratos. A velocidade ou duração excessiva da injeção pode resultar em sobrecarga sistêmica de volume, para a qual os ratos são mais vulneráveis do que os ratos.
- Resumindo, em 3 d após a cirurgia de derrame, anestesiar os animais com isoflurano e colocá-los supino em uma almofada de aquecimento.
- Reabra a ferida cervical e exponha novamente o ECA, ICA e CCA(Figura 5, passo 1). Como nas cirurgias de derrame, determine a rota de injeção com base na espécie. Utilize a CCA para injeção de NSC no mouse, e o ECA para o rato23.
- Injeção intra-arterial através da CCA no mouse
- Coloque duas suturas de nylon trançadas 6-0 sob a CCA. Crie um slipknot solto com cada um deles entre a bifurcação e os nós inferiores da cirurgia anterior do derrame(Figura 5, passo 2).
- Aperte o slipknot superior e faça uma pequena incisão acima do nó inferior(Figura 5, passo 3). Insira um cateter MRE010 através da incisão(Figura 5, passo 4) e fixe com o nó médio sem bloquear o fluxo de injeção(Figura 5, passo 5). O fluxo de sangue deve ser visível no cateter ao liberar o nó superior e ajustar a posição do cateter.
- Coloque um clipe de vaso no ECA, injete 1 x 106 GFP-NSCs através deste cateter a 20 μL/min por 5 min com uma bomba de seringa, seguido por uma descarga com 50-100 μL de PBS na mesma velocidade.
- Após a injeção, liga a CCA acima da incisão com o nó de deslizamento superior e retire o cateter MRE010(Figura 5, passo 6). Aperte e corte o nó médio e o nó superior. Remova o clipe do vaso do TCE. Consulte a imagem final na Figura 5, passo 7.
- Feche a ferida com sutura cirúrgica 4-0.
- Depois de fornecer recuperação adequada em uma almofada de aquecimento e injeção analgésica subcutânea, devolva os animais para sua gaiola doméstica.
- Injeção intra-arterial através do ECA em rato
- Ocluir temporariamente o ECA e o CCA com clipes de vasos(Figura 5, etapa 2).
- Faça uma pequena incisão no lado proximal do ECA (Figura 5, passo 3), insira o cateter MRE010 e fixe com um nó (Figura 5, passo 4).
- Remova ambos os clipes do vaso, injete 5 x 106 NSCs em 100 μL de PBS a 50 μL/min por 2 min, seguido por uma descarga com 50-100 μL de PBS(Figura 5,passo 5) na mesma velocidade, usando uma bomba de seringa motorizada.
- Após a injeção, oclui novamente o CCA e o ECA com clipes de vaso e liga o ECA no lado proximal da segunda incisão após a retirada do cateter de injeção(Figura 5, etapa 6).
- Retire os dois clipes do vaso(Figura 5, passo 7) e feche a ferida com sutura cirúrgica 4-0.
- Depois de fornecer recuperação adequada em uma almofada de aquecimento e injeção analgésica subcutânea, devolva os animais para sua gaiola doméstica.
- Ensaio histológico
- Coletar cérebros de camundongos e ratos que receberam derrame isquêmico seguido de injeção de NSCs ou solução de veículo após eutanásia e perfusão intracardiac com 4% de paraformaldeído a 1 d (rato e rato), 7 d (rato) e 30 d (rato) após injeção. Cada um desses quatro grupos consistiu em 5 NSC e 5 animais injetados por veículos.
- Conserte cérebros durante a noite e criopreserve em 30% de sacarose por 3 d.
- Incorpore os cérebros em OCT, corte a 40 μm de espessura e examine a distribuição de NSCs após a imunostenção com marcadores específicos de células, incluindo proteína ácida fibrilar gliana (GFAP, astrócitos), Tuj1 (neurônios maduros) e doublecortin (DCX, neurônios imaturos).
NOTA: Devido à falta de uma cepa de rato que expressa GFP, utilizamos o DII, um rótulo fluorescente transitório, para NSCs de ratos, que permite apenas observação relativamente de curto prazo. Assim, a distribuição do NSC só foi examinada em 1 d após o derrame em ratos.
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Representative Results
Os NSCs rotulados por GFP foram prontamente detectados no cérebro isquêmico, principalmente no hemisfério ipsilateral, especialmente na penumbra e ao longo da borda da lesão(Figura 6). O examinador ficou cego durante a imagem e análise.
Por exemplo, a 1 d após a injeção, os NSCs foram detectados dentro do hipocampo do rato. Um subconjunto de NSCs mostrou co-expressão do marcador de neurônio imaturo DCX no giro dentado mesmo neste momento inicial(Figura 6A).
Em 10 d após o acidente vascular cerebral (7 d após a injeção de NSC), os GFP-NSCs exógenos foram observados na maior densidade na borda da lesão (área da bacia hidrográfica) no estriato e no córtex(Figura 6B). É notável que por 7 d após a injeção muitos dos GFP-NSCs também expressaram DCX (mostrado por círculos azuis), indicando seu destino neuronal. Em comparação com os animais que receberam injeção de solução veicular, a injeção de NSC também aumentou a coloração DCX (vermelha) no hemisfério ipsilateral.
Aos 30 d após a injeção, os NSCs ainda foram detectados no córtex ferido, e uma parte deles mostrou expressão do marcador gliano GFAP (Figura 6C) ou marcador neuronal maduro Tuj1(Figura 6D),indicando o potencial de NSCs exógenos para se diferenciar em um destino glitivo ou neuronal, e sobreviver até 1 mês no cérebro ferido.
Figura 1: Desenhos esquemáticos de cateteres de injeção. Introduzimos dois projetos, Design 1 para injeção de solução composta e Design 2 para injeção celular. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Preparação de cateter para injeção de NSC e de ganchos cirúrgicos. (A) Materiais para construção de cateter: MRE010, MRE025 e cateteres MRE050 a 3 cm, ~10-15 cm e 3 cm de comprimento, respectivamente. (B) Corte as pontas da agulha e polir até ficar maçante. (C) Conecte cada segmento e fixe com supercola e, em seguida, incorpore tanto as fechaduras da agulha Luer quanto o segmento MRE050 em epóxi para aprimoramento. (D) Faça gancho cirúrgico utilizando eixo de agulha de 27 G e cateter MRE025. Barra de escala: 5 mm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Cultura de células-tronco neurais GFP (+). (A) Identificar embriões GFP (+) com microscópio de fluorescência usando o canal FITC. (B) Isolar e cultivar NSCs cortical até formar neuroesferas. Barra de escala: 100 μm. (C) Examine as propriedades da neurosfera usando um painel marcador de células-tronco. Barra de escala: 50 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Imagens esquemáticas da cirurgia de oclusão da artéria cerebral média passo a passo (MCAO) em camundongo ou rato. Consulte o vídeo para uma operação cirúrgica detalhada. ICA, artéria carótida interna; ECA, artéria carótida externa; CCA, artéria carótida comum. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Imagens esquemáticas da injeção de células-tronco neurais intra-arterials (NSC) em camundongos ou ratos. Consulte o vídeo para uma operação cirúrgica detalhada. ICA, artéria carótida interna; ECA, artéria carótida externa; CCA, artéria carótida comum. A seta verde indica direção de fluxo durante a injeção. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6: Distribuição, sobrevivência e diferenciação de células-tronco neurais (NSCs) no cérebro isquêmico. (A) Detecção de NSCs GFP (+) dentro do giro dento denonato hipocampal a 1 d após a injeção. Células-tronco fluorescem verde; imunostaining doublecortin (DCX) mostrado em vermelho. A seta branca indica um NSC GFP (+) com expressão DCX. (B) Mapa esquemático das células GFP (+) e células rotuladas DCX a 10 d após Ischemia-Reperfusion (I-R) em controles falsos (sem injeção) e veículo (I-R) ou NSC (I-R + NSC) injetados em camundongos. A topografia do insulto isquêmico é retratada no último esquema, onde laranja mais clara e escura representam a área sujeita ao desafio isquêmico e ao núcleo necrosado, respectivamente. A fita azul indica a área "bacia hidrográfica". Os retângulos cinzentos retratam os locais onde as imagens para (C) e(D) foram tiradas. (C,D) NSCs exógenos podem se diferenciar em um destino gliano (GFAP, C) ou um destino neuronal (Tuj1, D) por 30 d após o parto. Não foram observados sinais significativos no canal FITC (GFP) nos animais de curso que receberam injeção de veículo (veículo em C e D),enquanto em camundongos injetados pelo NSC, os GFP-NSCs sobreviventes foram visualizados e colocados com coloração GFAP (C) ou Tuj1(D). As setas indicam sobreposição de 2 canais. Barra de escala: 20 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
A terapia com células-tronco para doenças neurológicas ainda está em estágio exploratório precoce. Uma questão importante é que não há um método estabelecido para a entrega suficiente de SCs ou NSCs no cérebro.
Embora SCs/NSCs exógenos possam ser detectados no cérebro após injeção intravenosa (IV), intraperitoneal (IP) ou intraparenquimal/intracerebral, cada abordagem de entrega tem desvantagens. Estima-se que a população detectável dentro do cérebro seja muito baixa com injeção periférica (IV ou IP), representando apenas uma pequena fração das células injetadas ou infundidas. A injeção intracerebral produz uma distribuição muito focal, podendo induzir diretamente lesão cerebral2,6,7,8,9,10,,11,12,13. Por isso, testamos a viabilidade da injeção intra-arterial como método alternativo para a entrega de NSC após o derrame isquêmico. Este método fornece NSCs através da perfusão cerebral ipsilateral após um insulto de derrame. Se injetados logo após o derrame, os NSCs exógenos podem atravessar a barreira hemoencefálica interrompida (BBB), alcançando uma ampla distribuição em todo o cérebro. Uma vantagem para a injeção intra-arterial é que ela utiliza um efeito de primeira passagem dentro do CNS, maximizando o potencial de NSCs exógenos se instalarem no cérebro, em contraste com as rotas de entrega periféricas nas quais as células passam pela primeira vez pela rica microcirculação de órgãos filtrantes como o pulmão e o fígado.
A abordagem intra-arterial descrita aqui é versátil, podendo ser adaptada para acomodar diferentes tipos de paradigmas de parto e modelos de lesões ou doenças. Embora no presente estudo seja realizada apenas uma injeção intra-arterial, o cateter MRE025 pode ser conectado a uma microporta que está incorporada subcutânea, através da qual os animais podem receber injeções intra-arterials repetitivas12. Além disso, com o design mais simples e único do lúmen, este método de injeção pode ser usado para a entrega de reagentes na solução12,23. Se a entrega de múltiplas terapêuticas for necessária, o design de lúmen duplo pode ser utilizado para fornecer uma solução inicial simultaneamente ou sequencialmente com uma segunda droga ou composto. Para aplicações a modelos de roedores de neurodegeneração ou lesão cerebral traumática, onde não há necessidade da primeira cirurgia de derrame, a cirurgia para instalação do cateter de injeção no camundongo pode ser realizada no ECA (mesmo protocolo que o de rato, ajustando adequadamente o volume de injeção e a taxa na Etapa 7.4 para camundongos), para evitar a possível perturbação do fluxo sanguíneo cerebral através do CCA.
Várias desvantagens e potenciais consequências adversas desta injeção intra-arterial devem ser consideradas. Os animais recebem uma segunda cirurgia, que carrega o potencial de complicações relacionadas à anestesia ou cirurgia. O fluxo sanguíneo cerebral através da CCA ipsilateral é perturbado, ainda que transitoriamente (menos de alguns minutos), o que pode induzir outro episódio transitório de depressão leve da CBF. Além disso, a perturbação ou abertura do BBB é fundamental para a entrega intra-arterial do NSC, o que limita a janela terapêutica. No estudo piloto, quase nenhum GFP (+) NSCs foi detectado no cérebro ingênuo após injeção intra-arterial. No entanto, se o sujeito pode tolerar medicamentos que podem abrir transitoriamente BBB, como manitol de alta osmolalidade ou soro fisiológico, isso pode ser usado para criar uma janela transitória de abertura do BBB para injeção de NSC em momentos posteriores. Em estudos preliminares, descobrimos que a injeção intra-arterial nas primeiras 6h após o AVC resultou em maior mortalidade do que o observado apenas com derrame. Isso pode estar relacionado a uma segunda cirurgia invasiva após um período relativamente curto de recuperação após a primeira cirurgia. Alternativamente, após o insulto isquêmico, a cerebrovasculatura ferida pode ter uma tendência maior de constrição em resposta a quaisquer estímulos adicionais, como a introdução do cateter, carregamento adicional de fluidos ou fixação de NSCs exógenos à parede luminal após a injeção. Outra preocupação razoável em relação à entrega do NSC após o acidente vascular cerebral é que os NSCs poderiam formar embolias que ocluem ou perturbam microvexes. De acordo com os relatórios anteriores8,16,24, não encontramos evidências significativas de GFP (+) emboli na microvasculatura, embora tenhamos encontrado NSCs GFP (+) no espaço perivascular (espaço Virchow-Robin) nos primeiros dias após a injeção. Depois de otimizarmos a janela de tempo para injeção, não houve diferença na complicação ou taxa de mortalidade entre os grupos de acidente vascular cerebral que receberam injeção de veículo ou NSC no presente estudo. Portanto, a injeção intra-arterial NSC devidamente projetada é um método seguro e eficiente de tratamento NSC voltado para doenças neurológicas.
Para alcançar a injeção de NSC bem sucedida e melhorar os resultados dos animais, vários aspectos devem ser tratados com cautela durante a cirurgia de derrame ou injeção de NSC. Deve-se praticar apoio cirúrgico geral e cuidados, como proteção da córnea e manutenção da temperatura do núcleo. Aqui introduzimos algumas complicações potenciais desta cirurgia específica e orientação para minimizar sua ocorrência.
Pode haver estresse no nervo vago. Durante a cirurgia, o nervo vago não deve ser esticado, esmagado, ligado ou estimulado. Estimulação incidental do nervo vago pode induzir arritmia como bradicardia, parada cardíaca ou até mesmo morte.
Colocação ou aperto inadequado de sutura, ou extravio ou deslizamento de um clipe de vaso pode resultar em sangramento arterial da extremidade proximal de CCA (de saída cardíaca) ou extremidade distal através do Círculo de Willis. A cada passo, certifique-se de que o clipe do vaso ou nós sejam colocados adequadamente para ocluir o fluxo sanguíneo. Se ocorrer sangramento, tente restaurar a colocação correta de clipes de nó ou vaso. Se o campo visual estiver borrado com sangue, coloque a ponta de um cotonete estéril na CCA e segure com pressão para parar o fluxo sanguíneo. A hemoglobina do sangramento facilitará o fechamento da incisão na artéria. Depois que o sangramento parar, aperte o nó ou coloque o clipe do vaso no local correto, limpe o sangue no campo visual e continue a cirurgia.
Pode haver lesões ou complicações da inserção do cateter. Corte a ponta MRE010 em um ângulo de 45°, para que possa entrar facilmente na pequena incisão na artéria, sem induzir qualquer ferimento no vaso. Em casos raros, uma ponta sobrefiada pode penetrar na artéria ou entrar no espaço entre a membrana do porão e a tunica externa. Para evitar esses ferimentos, faça uma incisão de tamanho adequado na artéria. Recomendamos um tamanho de 1/4-1/3 a circunferência da artéria, que é grande o suficiente para permitir a entrada da ponta do cateter, mas retém força suficiente na parede do vaso para envolvê-lo fora do cateter. Uma incisão muito grande pode levar ao rompimento da artéria no local da incisão. Guie suavemente a ponta do cateter MRE010 para entrar na incisão. Não force a entrada da ponta do cateter ou o avanço do cateter. Se necessário, fórceps afiados podem ser usados para levantar a borda da incisão. Avance o cateter com um ângulo baixo em relação à artéria para que o cateter e a artéria sejam quase paralelos.
Há também possíveis complicações relacionadas à injeção. Uma complicação comum da injeção intra-arterial é o carregamento excessivo de volume, que pode levar a sobrecarga cardíaca aguda e edema pulmonar. Taxas de injeção rápida podem amplificar esses riscos e causar danos à parede do vaso8. Assim, tanto a taxa quanto o volume total devem ser cuidadosamente controlados. Recomendamos 20 μL/min como geralmente seguros para ratos quando usados em um curto período, como 5 minutos. Se os sintomas de sobrecarga de volume forem observados, como respiração rápida, rasa, bolhas cor-de-rosa de nares ou movimento aberrante semelhante à disforia, a injeção deve ser interrompida ou abortada, e os animais podem se recuperar. Outra possível complicação é a formação de emboli NSC no sistema cerebrovascular. A solução de suspensão não deve conter cálcio ou magnésio, que são conhecidos por promover a agregação celular. Para reduzir as chances de induzir embolia, as suspensões de células únicas de NSCs devem ser examinadas sob microscópio pouco antes da injeção para confirmar a ausência de aglomerados celulares. Se os aglomerados de células estiverem presentes, titular com um tubo estéril de 1 mL até que a suspensão de célula única seja alcançada.
Este estudo estabelece a viabilidade da abordagem de entrega intra-arterial para camundongos e ratos, e revela várias características importantes dessa injeção intra-arterial de NSCs no contexto do derrame isquêmico. Em comparação com a distribuição relativamente focal de NSCs que sobrevivem no parênquim cerebral tipicamente relatado com injeção intra-cerebral1,7,9,11,15,16, observamos uma distribuição difusa em todo o hemisfério ipsilateral, incluindo o córtex, hipocampo e estriado. Assim, o parto intra-arterial é bem adequado não só ao AVC, mas também a múltiplos tipos de lesões ou doenças que envolvem danos cerebrais difusos. No cenário de MCAO, a maior concentração de NSCs foi encontrada ao longo da borda do local da lesão. O aumento da densidade de NSCs exógenos na região da penumbra pode ser devido ao aumento da entrega a esta região por meio do fluxo colateral da perfusão sanguínea restabelecida e abertura do BBB, bem como à migração de NSCs em direção à área danificada. Embora a entrega intravenosa das SCs possa resultar em uma distribuição difusa, estima-se que o número de células que chegam ao cérebro seja uma pequena fração do total entregue, em parte devido à filtragem por órgãos periféricos8,13. Com base em um estudo anterior sobre metástase cerebral12, células tumorais D122 injetadas intra-arterial injetadas na luciferase aproveitaram o efeito de primeira passagem para se estabelecer na vasculatura cerebral e desenvolver locais metastáticos no cérebro em vez dos órgãos periféricos. Locais metastáticos cerebrais devido a células tumorais exógenas foram detectados no cérebro ipsilateral para a injeção já em 1 semana após a injeção usando um sistema de imagem IVIS para detectar o sinal bioluminescente através do crânio e couro cabeludo intactos. Em contraste, sinais luminescentes (indicando a carga tumoral associada às células tumorais exógenas) dos órgãos periféricos, como fígado, pulmão e músculo, não foram detectados até 3-4 semanas após a injeção intra-arterial. Portanto, esperamos que, em um cenário semelhante, a entrega intra-arterial de NSC também se beneficie do efeito de primeira passagem na circulação cerebral para aumentar consideravelmente a localização para o cérebro em comparação com os órgãos periféricos.
Embora a injeção intracerebral direta possa ser usada para fornecer um grande número de células ao cérebro ferido, a abordagem resulta em danos celulares ou hemorragia devido à penetração da agulha do parenchyma que desencadeia a neuroinflamação localizada, potencialmente comprometendo a sobrevivência e integração das células recém-entregues14,,15,,16,,25,,26. A abordagem intra-arterial para o parto de NSC é vantajosa, pois evita esse dano cerebral localizado e a neuroinflamação, e suporta a sobrevivência a longo prazo dos NSCs3,,8,,9,,14,24. Observamos sobrevivência e diferenciação de GPF-NSCs injetados no cérebro ferido no momento em pontos de até 30 d após a injeção. Embora tenhamos encontrado NSCs que se diferenciaram em neurônios maduros e astrócitos, estudos detalhados são necessários para determinar a distribuição relativa de vários tipos de células geradas a partir de GFP-NSCs e as proporções que sobrevivem ao período crônico de lesão pós-lesão. Mais importante, se os NSCs exógenos sobreviventes podem interagir com células cerebrais constitutivas para reconstruir a rede cerebral e alterar a função neurológica ainda não está claro e deve ser explorado.
Juntos, introduzimos um método de entrega intra-arterial para fornecer NSCs no cérebro isquêmico, demonstrando sobrevivência a longo prazo no hemisfério isquêmico e diferenciação em tipos de células neuronais e gliais. A abordagem de entrega intra-arterial é adaptável para inúmeras espécies e múltiplos modelos de lesão e doenças do SNC e pode ser usada para a entrega de outros tipos de células ou compostos terapêuticos únicos ou múltiplos ou biológicos, fornecendo ampla utilidade para a comunidade neurociência.
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Disclosures
Nenhum.
Acknowledgments
Esta pesquisa foi apoiada pelo seguinte: Prêmio AHA 14SDG20480186 para LC, equipe de inovação de assuntos da Shanxi University of Chinese Medicine 2019-QN07 para BZ, e Kentucky Spinal Cord and Head Injury Research Trust bolsa 14-12A para KES e LC.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 20 G needle | Becton & Dickinson | BD PrecisionGlide 305175 | preparation of injection catheter |
| 26 G needle | Becton & Dickinson | BD PrecisionGlide 305111 | preparation of injection catheter |
| 27 G needle | Becton & Dickinson | BD PrecisionGlide 305136 | preparation of injection catheter |
| 4-0 NFS-2 suture with needle | Henry Schein Animal Health | 56905 | surgery |
| 6-0 nylon suture | Teleflex/Braintree Scientific | 104-s | surgery |
| Accutase | STEMCELL Technologies | 7922 | cell detachment solution |
| blade | Bard-Parker | 10 | surgery |
| Buprenorphine-SR Lab | ZooPharm | Buprenorphine-SR Lab® | analgesia (0.6-1 mg/kg over 3 d) |
| Calcium/magnisum free PBS | VWR | 02-0119-0500 | NSC dissociation |
| DCX antibody | Millipore | AB2253 | immunostaining |
| GFAP antibody | Invitrogen | 180063 | immunostaining |
| Isoflurane | Henry Schein Animal Health | 50562-1 | surgery |
| MCAO filament for mouse | Doccol | 702223PK5Re | surgery |
| MCAO filament for rat | Doccol | 503334PK5Re | surgery |
| MRE010 catheter | Braintree Scientific | MRE010 | preparation of injection catheter |
| MRE025 catheter | Braintree Scientific | MRE025 | preparation of injection catheter |
| MRE050 catheter | Braintree Scientific | MRE050 | preparation of injection catheter |
| Nu-Tears Ointment | NuLife Pharmaceuticals | Nu-Tears Ointment | eye care during surgery |
| S&T Forceps - SuperGrip Tips JF-5TC Angled | Fine Science Tools | 00649-11 | surgery |
| S&T Forceps - SuperGrip Tips JF-5TC Straight | Fine Science Tools | 00632-11 | surgery |
| Superglue | Pacer Technology | 15187 | preparation of injection catheter |
| syringe pump | Kent Scientific | GenieTouch | surgery |
| Tuj1 antibody | Millipore | MAb1637 | immunostaining |
| two-component 5 minute epoxy | Devcon | 20445 | preparation of injection catheter |
| Vannas spring scissors | Fine Science Tools | 15000-08 | surgery |
| vascular clamps | Fine Science Tools | 00400-03 | surgery |
| Zeiss microscope | Zeiss | Axio Imager 2 | microscopy |
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