Summary
هنا، يتم تقديم بروتوكول لاستخراج بصريا وفهرسة التوقيعات الفلورية الخلوية الفطرية (أي، autofluorescence الخلوية) من كل خلية حية الفردية الموزعة في الفضاء ثلاثي الأبعاد. هذه الطريقة مناسبة لدراسة التوقيع الفلوري الفطري للأنظمة البيولوجية المتنوعة بدقة خلية واحدة ، بما في ذلك خلايا من البكتيريا والفطريات والخمائر والنباتات والحيوانات.
Abstract
الموصوفة هنا هو انعكاس الكونفوكوكال بمساعدة المجهر خلية واحدة تحليل الفلورية الفطرية (CRIF)، وهي طريقة طفيفة التوغل لإعادة بناء التوقيع الفلوري الخلوية الفطرية من كل خلية حية فردية في السكان موزعة في مساحة ثلاثية الأبعاد (3D). التوقيع الفلوري الفطري للخلية هو مجموعة من إشارات الفلورسينس المنبعثة من الجزيئات الحيوية المختلفة داخل الخلية. أثبتت الدراسات السابقة أن توقيعات الفلورسينس الفطرية تعكس مختلف الخصائص الخلوية والاختلافات في الحالة الفسيولوجية وهي مصدر غني للمعلومات لتحديد خصائص الخلايا وتحديدها. وقد تم تحليل التوقيعات الفلورية الفطرية تقليديا على مستوى السكان، مما استلزم ثقافة التخفي، ولكن ليس على مستوى الخلية الواحدة. CRIF مناسبة بشكل خاص للدراسات التي تتطلب دقة ثلاثية الأبعاد و / أو استخراج انتقائي للإشارات الفلورية من الخلايا الفردية. ولأن التوقيع الفلوري هو خاصية فطرية للخلية، فإن CRIF مناسب أيضا للتنبؤ الخالي من العلامات بنوع و/أو الحالة الفسيولوجية للخلايا السليمة والخلايا المفردة. قد تكون هذه الطريقة أداة قوية لتحليل الخلايا المبسطة ، حيث يمكن تقييم النمط الظاهري لكل خلية واحدة في مجموعة غير متجانسة مباشرة من خلال توقيعها autofluorescence تحت المجهر دون وضع علامات على الخلية.
Introduction
تنبعث من الجزيئات الحيوية المتنوعة داخل الخلية 1 إشارات الفلورة الذاتية ، ويتكون التوقيع الفلوري الفطري للخلية من تجميع هذه الإشارات. يعكس هذا التألق المميز خصائص خلوية مختلفة وكذلك اختلافات في الحالة الفسيولوجية. تحليل الفلورسينس الفطرية هو الحد الأدنى من الغازية ويمكن أن تكمل التقليدية، والتحقيقات الميكروبيولوجية أكثر الغازية التي تترك مجموعة من الآثار من تعديل التمثيل الغذائي المعتدل لتدمير الخلايا كاملة. في حين أن التقنيات التقليدية مثل الحمض النووي أو استخراج محتوى الخلية2،3 ، الفلورسنت في التهجين الموقع4 ، وإدخال جينات المراسل الفلوري إلى الجينوم فعالة في تحديد نوع الخلية أو الحالة الفسيولوجية ، فإنها تتطلب عادة إما التلاعب بالخلايا أو وضع علامات غازية.
وقد أظهرت الدراسات التي أجريت على الفلورة الفطرية لمختلف المستعمرات الميكروبية الحية وسليمة، بما في ذلك تعليق الاستزراع الميكروبي السائب5،6، والحمأة النشطة7، وأنسجة الثدييات8،9، وخلايا الثدييات1،10، أن تحليل الفلورسنت الفطري يسهل التحليل الخالي من العلامات لأنواع الخلايا والحالة الفسيولوجية. وقد تم تقليديا تحليل التوقيعات الفلورية الفطرية على مستوى السكان وليس على مستوى الخلية الواحدة ، وبالتالي تتطلب ثقافة التخفي. في المقابل ، فإن تقنية تحليل التوهج البؤري confocal بمساعدة المجهر وحيدة الخلية innate fluorescence (CRIF) التقنية11 الموصوفة هنا تعيد بناء وفهرسة التوقيع الفلوري الخلوي الفطري لكل خلية ميكروبية حية فردية. وعلاوة على ذلك، يمكن ل CRIF أن تجمع بشكل منهجي التوقيع الفلوري الفطري لخلية ميكروبية واحدة داخل مجموعة يتم توزيعها في مساحة ثلاثية الأبعاد (ثلاثية الأبعاد).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. إعداد العينة
- ضع طوقا من السيليكون سمكه 1 مم مع آبار على شريحة زجاجية.
- ضع لوح أغروز سمكه 1 مم 0.8٪ (ث/v) في بئر طوقا السيليكون.
- تخفيف كثافة الخلية من ثقافة الخلية الميكروبية التعسفي إلى كثافة بصرية في 600 نانومتر (OD660) = 1.0.
- وضع 5 ميكرولتر aliquot من تعليق الخلية على لوح agarose.
- يغطى بلطف بغطاء زجاجي.
2. إعداد المجهر
ملاحظة: تقنية CRIF يجمع بين المجهر انعكاس confocal (CRM) والمنظار المجهري confocal متعدد القنوات. يعمل CRM كمصدر للمعلومات للمورفولوجيا الخلوية والتوطين المكاني ، وهو مستقل عن الفلورسينس الفطري الخلوي. يوفر التحليل المجهري البؤري متعدد القنوات المعلومات الطيفية للفلورة الفطرية الخلوية. في البروتوكول التالي، يشار إلى أي صورة تم الحصول عليها باستخدام المجهر الفلوري CONFOCAL مع CRM أو صورة المجهر البؤري متعدد القنوات، على التوالي.
- قم بتوصيل مجهر كونفوجكال مع قنوات طيفية مقفرة بأنبوب فوتوموليلييه (PMT) أو كاشف GaAsP.
ملاحظة: تتوفر هذه الاجهزة من عدة شركات مصنعة. - تجهيز المجهر مع فتحة رقمية عالية (NA) الهدف مع التكبير الكافي.
ملاحظة: يوصى ب 63x الهدف مع NA > 1.4 لتحليل الخلايا البكتيرية. - تجهيز المجهر مع مرآة نصف انعكاس (على سبيل المثال، NT 80/20) لاستيعاب إدارة علاقات العملاء، والتي تعتمد على التشتت الخلوي للضوء الحادث لتصور مورفولوجيا الخلية.
- للمنظار المجهري متعدد القنوات، قم بتجهيز المجهر بالمرايا الديكهروية. على سبيل المثال، استخدم MBS InVis405 أو MBS458 أو MBS488 أو MBS458/514 أو MBS488/543 أو MBS 488/543/633 مقسمات الحزمة ل 405 أو 458 أو 488 أو 514 أو 543 أو 633 نانومتر على التوالي.
- ضبط كثافة الإضاءة لكل الطول الموجي الإثارة باستخدام مقياس طاقة الليزر. الحفاظ على الناتج تحت المجهر ثابت من خلال أطوال موجية الإثارة (على سبيل المثال، استخدام 50 μW مع الهدف 63x).
3. الحصول على صورة
- تعيين حجم الثقب إلى 1 الاتحاد الافريقي باستخدام برنامج المجهر.
- تعيين الوقت يسكن بكسل (أي سرعة المسح) لكل الطول الموجي الإثارة.
ملاحظة: يمكن أن يؤدي وقت الشغل الطويل بشكل مفرط للبكسل إلى تلف الخلايا. تجنب وقتا طويلا للغاية للبكسل لتقليل التكميل الضوئي إلى الخلايا. بالنسبة للعينات البكتيرية، فإن الوقت الذي يسكن فيه البكسل <55.6 ميكروجرام/ميكرومتر2 (عندما يكون ناتج الإشعاع تحت المجهر ~ 17 μW/cm2) عادة ما يكون مناسبا لتجنب تثبيط النمو. قد تختلف هذه المعلمة اعتمادا على الكائنات الحية والإعدادات التجريبية. - تعيين دقة المسح الضوئي. بالنسبة للخلايا الصغيرة مثل البكتيريا، استخدم منطقة مسح تبلغ 1,024 × 1,024.
- تعيين نطاق Z-المسح الضوئي بحيث يتم تغطية المنطقة ذات الاهتمام.
ملاحظة: بالنسبة لعينات الخلايا البكتيرية والخميرة الموزعة على لوح الآغاروز، فإن نطاق المسح الضوئي Z الذي يبلغ ~ 15 ميكرومترا عادة ما يكون كافيا. - تعيين كاشف descanned لالتقاط نطاق الطول الموجي المرئي (على سبيل المثال، 416−691 نانومتر). استخدم نافذة طيفية من 8−10 نانومتر.
- الحصول على صور المجهر البؤري متعدد القنوات في تسلسل من أطول إلى أقصر أطوال موجية الإثارة لإنشاء Z-أكوام من الصور الفلورية.
- الحصول على صور CRM.
- حفظ الصور المكتسبة كملفات tiff 16 بت في دليل. اسم الملفات باستخدام اصطلاح التسمية XXXcYYzZZ.tif، حيث XXX هو الطول الموجي الإثارة، YY هو رقم قناة كاشف، ZZ هو رقم Z-شريحة، و "ج" و "ض" هي بادئات لرقم الكاشف ورقم Z-شريحة، على التوالي.
- على سبيل المثال، إذا تم التقاط صورة مجهرية متعددة القنوات مجهرية مع طول موجي مثير يبلغ 405 نانومتر، قناة كاشف 1 من صفيف الكاشف، وهي الشريحة الخامسة من المكدس Z، سمها "405c01z05.tif". بالنسبة لصور CRM، استخدم السلسلة "CRM" بدلا من XXX (على سبيل المثال، "CRMc01z05.tif").
ملاحظة: حدد ما إذا كان التقسيم ثلاثي الأبعاد أو ثلاثي الأبعاد هو الأكثر ملاءمة لبيانات الصورة. استخدم طريقة تجزئة 2D في الحالات التي تكون فيها الخلايا الصغيرة مقيدة بسطح 2D (على سبيل المثال ، السكان البكتيرية التي تلتزم بسطح زجاجي). استخدم طريقة التقسيم ثلاثي الأبعاد في الحالات التي يتم فيها توزيع مجموعة الخلايا في مساحة ثلاثية الأبعاد (مثل الأغشية الحيوية وعينات الأنسجة) أو تكون أحجام الخلايا أكبر من سمك الشريحة البصرية (على سبيل المثال، خلايا الخميرة وخلايا الثدييات). بالنسبة للتجزئة 2D الرجوع إلى القسم 4; للتجزئة ثلاثية الأبعاد، راجع القسم 5.
- على سبيل المثال، إذا تم التقاط صورة مجهرية متعددة القنوات مجهرية مع طول موجي مثير يبلغ 405 نانومتر، قناة كاشف 1 من صفيف الكاشف، وهي الشريحة الخامسة من المكدس Z، سمها "405c01z05.tif". بالنسبة لصور CRM، استخدم السلسلة "CRM" بدلا من XXX (على سبيل المثال، "CRMc01z05.tif").
4. تحليل الصور 2D
- تجهيز محطة عمل مع برامج تحليل الصور (على سبيل المثال، MATLAB).
- إجراء تجزئة الخلية وإعادة بناء توقيعات الفلورسينس الفطرية أحادية الخلية.
- افتح برنامج تحليل الصور.
- انقر نقرا مزدوجا فوق أحد البرامج النصية المتوفرة "Script2D.m" وفتحه.
- انتقل إلى علامة التبويب محرر ، ثم انقر فوق تشغيل. يجب أن تظهر نافذة تحديد مجلد.
- حدد الدليل الذي تم إنشاؤه في الخطوة 3.8، ثم انقر فوق فتح للمتابعة. سيظهر مربع حوار يطالب بإدخال معلمة التقسيم تلقائيا.
ملاحظة: لأغراض الاختبار حدد مجموعة البيانات المتوفرة ("Sample_2D"). يتم توفير مجموعة البيانات عينة كملف مضغوط وينبغي استخراج مقدما. - إدخال معلمات التقسيم: عتبة إعادة تنسيق الصورة (0−1) ل Binarization الصورة = 0.45، والعتبة العليا لمنطقة الخلية (بالبكسل) = 200، والعتبة السفلية لمنطقة الخلية (بالبكسل) = 10، وعدد أجهزة الكشف = 32. انقر فوق موافق للمتابعة.
ملاحظة: قد تتطلب هذه المعلمات ضبط حسب جودة الصورة. - يجب أن تظهر نافذة صورة جديدة تعرض صورة CRM. حدد منطقة خلفية عشوائية (أي منطقة حيث الخلايا غائبة) لاستخدامها في طرح الخلفية. رسم مستطيل داخل صورة CRM بواسطة الماوس السحب. انقر نقرا مزدوجا فوق المنطقة المحددة لتأكيد التحديد.
- البحث عن دليل جديد يسمى التوقيع في نفس الدليل المحدد في الخطوة 4.2.4.
ملاحظة: التعليمات البرمجية المتوفرة تلقائيا بإنشاء هذا الدليل. يخزن الدليل "Signature" التوقيع المضان الفطري لكل خلية ميكروبية ضمن مجموعة سكانية كملفات .png مرقمة بشكل متسلسل بعد بادئة شائعة "Signature".
تحليل الصور 5.3D
- تجهيز محطة عمل مع برنامج تحليل الصور (جدول المواد).
- إجراء تجزئة الخلية وإعادة بناء توقيعات الفلورسينس الفطرية أحادية الخلية.
- افتح برنامج تحليل الصور.
- انقر نقرا مزدوجا فوق ثم افتح البرنامج النصي المتوفر "Script3D.m".
- انتقل إلى علامة التبويب محرر ، ثم انقر فوق تشغيل. يجب أن تظهر نافذة تحديد مجلد.
- حدد الدليل الذي تم إنشاؤه في الخطوة 3.8، ثم انقر فوق فتح للمتابعة. سيظهر مربع حوار يطالب بإدخال معلمات التقسيم تلقائيا.
ملاحظة: لأغراض الاختبار حدد مجموعة البيانات المتوفرة ("Sample_3D"). يتم توفير مجموعة البيانات عينة كملف مضغوط وينبغي استخراج مقدما. - إدخال معلمات التقسيم: عتبة Binarization الصورة (0-1) ل binarization الصورة = 0.01، العتبة العليا لوحدة تخزين الخلية (بالبكسل) = 1000، الحد الأدنى لمنطقة الخلية (بالبكسل) = 20، X حجم بكسل [μm/pixel] = 0.26، Y حجم بكسل [μm/pixel] = 0.26، Z حجم بكسل [μm/pixel] = 0.42، وعدد أجهزة الكشف = 32. انقر فوق موافق للمتابعة; سيظهر مربع حوار يطالب بإدخال عدد الأطوال الموجية للإثارة.
ملاحظة: قد تتطلب هذه المعلمات ضبط حسب جودة الصورة. - إدخال عدد الأطوال الموجية المستخدمة لاكتساب الصورة (على سبيل المثال، إذا تم استخدام 405، 488، 561، 630، أدخل 4 في مربع الحوار). انقر فوق موافق.
- أدخل أطوال الموجة الإثارة في تسلسل من أقصر (أي، اسم مربع: الإثارة رقم 1) إلى أطول طول موجي في مربعات الحوار. انقر فوق موافق للمتابعة; يجب أن تظهر نافذة صورة جديدة تقدم صورة CRM.
- حدد منطقة الخلفية التعسفية (أي المنطقة التي تكون فيها الخلايا غائبة) لاستخدامها في طرح الخلفية. رسم مستطيل داخل صورة CRM بواسطة الماوس السحب. انقر نقرا مزدوجا فوق المنطقة المحددة لتأكيد التحديد.
- البحث عن الدليل المسمى التوقيع في الدليل المحدد في الخطوة 5.2.4.
ملاحظة: التعليمات البرمجية المتوفرة تلقائيا بإنشاء هذا الدليل. يخزن الدليل "Signature" التوقيع المضان الفطري لكل خلية ميكروبية واحدة داخل مجموعة سكانية كملفات .png مرقمة بشكل متسلسل بعد بادئة شائعة "Signature".
6. التحليل الإحصائي
ملاحظة: تنفيذ تقنيات الحد من الأبعاد (على سبيل المثال، تحليل المكون الرئيسي [PCA]) لتصور توزيع hyperspectrums من مجموعات الخلايا. ينفذ البرنامج النصي المقدم (PCA.py) PCA لمحتوى خلية اثنين (أي فئتين).
- تجهيز محطة عمل مع لغة البرمجة والمكتبات المصاحبة والوحدات (جدول المواد).
- إنشاء دليل فارغ في محرك الأقراص C (أو ما يعادلها) واسم الدليل "Parent_directory" (أي C:/ Parent_ الدليل).
- تخزين التوقيعات الفلورية (مثل ملفات .png التي تم إنشاؤها في الخطوة 4.2.7) لكل من مجموعتي الخلية في دليلين منفصلين.
ملاحظة: يجب أن يكون كلا الدلائل اثنين الموجودة في "Parent_directory".
جيم: /Parent_directory/
وضعية PUTIDAKT2440/
التوقيع01.png التوقيع02.png :وضعية PUTIDAKT2442/
التوقيع01.png
التوقيع02.png
: - تحميل PCA.py في "Parent_directory".
- افتح واجهة سطر الأوامر لمحطة العمل.
- اكتب "python C:/Parent_directory/PCA.py" في واجهة سطر الأوامر.
- حدد "Parent_directory" بعد عرض الرسالة "تحديد الدليل الهدف".
- في "C:/Parent_directory"، ابحث عن "PCA.png"، الذي يحتوي على مؤامرة PCA الناتجة.
وضعية PUTIDAKT2440/
التوقيع01.pngSubscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
يظهر الشكل 1A التوقيع النموذجي للفلورسينس أحادي الخلية لخلية بكتيرية مقدم كمؤامرة طيف تقليدية (أعلى) وكخريطة حرارية (وسط). ويبين الشكل 1B نتيجة تجزئة دقيقة للخلايا 2D فوق صورة CRM الأصلية لجمعية من بكتيريا التربة (Pseudomonas putida KT2440)12. يتم تقديم التوقيعات الفلورية الفطرية الناتجة للسكان كخريطة حرارية في الشكل 1D. لاحظ أن التباين داخل السكان كان طفيفا نسبيا بعد تجزئة الخلايا الناجحة. يظهر مثال على تجزئة الخلايا غير الدقيقة في الشكل 1C، الذي يتم فرضه على نفس مجموعة P. putida كما هو موضح في الشكل 1B. إن تأثير تجزئة الخلايا غير الدقيقة على التواقيع الفلورية الفطرية للسكان واضح بسهولة من العدد الكبير من القيم المتطرفة (الشكل 1E، المثلثات الحمراء). أدى تجزئة الخلايا غير دقيقة في كتلة أكثر مرونة بعد PCA مقارنة مع الكتلة الضيقة التي تم الحصول عليها بعد تجزئة الخلية دقيقة (الشكل 1F).
عادة، على الرغم من التباين داخل الأنواع، تشكل التوقيعات الفلورية الفطرية لأنواع الخلايا المختلفة مجموعات متميزة. ويعرض الشكل 2C نتيجة تحليلات PCA لزوج من السلالات المتقاربة تصنيفيا (سلالة P. putida KT2440 وسلالة KT244213). وعلى الرغم من التباين الطفيف الملاحظ داخل كل مجموعة سكانية منفصلة (الشكل 2 ألف، باء)، شكل كل مجموعة مجموعة متميزة على مؤامرة تحليل ال PCA (الشكل 2C).
الشكل 3A يظهر نتيجة دقيقة تجزئة الخلية 3D فرضها على صورة CRM الأصلي من السكان من الخميرة الناشئة Saccharomyces cerevisiae YM427114. ويبين الشكل 3B التواقيع الفلورية الفطرية الناتجة للسكان.
الشكل 1: دقة التقسيم والتباين الواضح داخل الأنواع. (أ) التوقيع الفلوري الفطري النموذجي أحادي الخلية لخلية بكتيرية (P. putida KT2440) ، كما قدم كمؤامرة الطيف (أعلى) وخريطة الحرارة (الوسط). يشار إلى الطول الموجي للانبعاثات كخريطة لون قوس قزح (أسفل). يشير محور Y لمؤامرة الطيف ولون الخريطة الحرارية إلى كثافة الفلورسينس النسبية. تشير الأرقام في الأسفل إلى الطول الموجي للإثارة. تمثيل مرئي للتعرف الدقيق (B) و (C) على منطقة الخلية بواسطة خوارزمية تحليل الصور. يشير التظليل الأزرق الفاتح إلى مناطق الخلايا المكتشفة لجمعية من بكتيريا التربة P. putida KT 2440. النقط ذات الترقيم الأحمر في اللوحة C هي أمثلة على الكشف الزائف ، حيث صنفت الخوارزمية المناطق غير الخلوية (أي ضوضاء الخلفية) كمناقط خلية بسبب إعدادات عتبة الثنائية غير المناسبة. أشرطة المقياس = 1 ميكرومتر في جميع أنحاء. ويصور اللوحان D وE التوقيعات الفلورية الفطرية لنفس السكان، التي تم إنشاؤها بتجزئة دقيقة وغير دقيقة للخلايا، على التوالي. يظهر كل عمود فرط خلية واحدة أعيد بناؤه يقدم كمصفوفة 1 × 192 ، حيث تشير خريطة اللون الأصفر إلى الأزرق إلى كثافة الفلورية النسبية. (و) تباين التوقيعات المفلورة الفطرية في التقسيمات الدقيقة (الزرقاء الفاتحة) وغير الدقيقة (الحمراء) التي تصور باستخدام PCA. تشير كل تسمية محور إلى رقم المكون ومساهمته التراكمية في تحليل PCA. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: التباين داخل الأنواع وبين التواقيع المفلورة الفطرية. توقيعات الفلورسينس الفطرية المقدمة كخرائط حرارية لسكان P. putida KT2440 (A) و P. putida KT2442 (B). (ج) إسقاط الزوجين الفطريين للتوقيع الفلوري المرئي باستخدام PCA، المقابل ل P. putida KT2440 (الأحمر، n = 288) وP. putida KT2442 (الأزرق، n = 373). X- و Y-محاور تمثل PC1 و PC2، على التوالي. يشير رقم المجموعة الداخلية إلى مركز كل مجموعة (1: P. putida KT2440، 2: P. putida KT2442). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: مثال للتجزئة ثلاثية الأبعاد واستخراج التوقيع المفلور الفطري. (أ) الإسقاط ثلاثي الأبعاد للمناطق المعترف بها كخلايا خميرة ناشئة S. cerevisiae YM4271. الأرقام الداخلية هي أرقام التعريف. (ب) خريطة حرارية لتوقيعات الفلورسينس الفطرية المستخرجة من المناطق ثلاثية الأبعاد. رقم المحور X يتوافق مع رقم التعريف. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
هناك نقطتان حاسمتان في هذه الطريقة التي تحتاج إلى متابعة عن كثب للحصول على نتائج قابلة للاستنساخ: 1) الحفاظ على إخراج طاقة الليزر تحت هدف المجهر متسقة من خلال أطوال الموجات والتجارب الإثارة، و 2) إجراء تجزئة دقيقة للخلايا.
النقطة الأولى مهمة بشكل خاص عند مقارنة التوقيع الفلوري الفطري بين التجارب المختلفة. تجنب ببساطة تطبيق نفس إعدادات "الإخراج في المائة" على أطوال الموجة المثيرة (أي استخدام مخرجات الطاقة بنسبة 5٪ لجميع خطوط الليزر 405 و 488 و 514 و 530 نانومتر) ، لأن الحد الأقصى لإخراج الطاقة يمكن أن يختلف إلى ترتيب الحجم بين خطوط الليزر. وبالإضافة إلى ذلك، فإن الهدف والبصريات الداخلية عادة ما يكون لها خصائص امتصاص بصري متفاوتة، والتي تحتاج أيضا إلى أن تكون مسؤولة. لهذه الأسباب ، في الواقع قياس الناتج تحت الهدف باستخدام الليزر السلطة متر (جدول المواد) ويوصى. أخذ هذا القياس كل التجارب القليلة، أو دوريا، ويوصى أيضا، لأن الناتج من خطوط الليزر يمكن أن تتحلل بشكل كبير على مدى بضع سنوات.
النقطة الثانية، تقسيم الخلايا دقيقة، يصبح مهما بشكل خاص في الحالات التي يكون فيها التباين داخل أو بين الأنواع مصدر قلق. يؤدي تقسيم الخلايا غير الدقيق (الشكل 1D) إلى نقاط بيانات أكثر تطرفا (الشكل 1E، المشار إليه بالمثلثات الحمراء) وتباين أكبر واضح داخل الأنواع. يجب تحديد معلمات التقسيم بعناية ، والتحقق من دقة تقسيم الخلية عن طريق تراكب نتائج التقسيم على صورة CRM الأصلية ، قبل الشروع في أي تحليل آخر أو نماذج التعلم الآلي التدريبي. إذا كنت تعمل مع صورة رديئة الجودة، فقد يلزم معالجة صور إضافية لتحقيق تجزئة دقيقة. يمكن استخدام إما "مرشح غاوسي" أو "مرشح وسيط" إزالة القطع الأثرية محبب، ومعالجة تصفية الثنائية عدادات أي خلفية مخططة.
مع ضعف جودة البصريات (على سبيل المثال ، هدف الصف غير confocal) أو عدم كفاية حساسية الكاشف ، قد يكون التعامل مع الكشف عن توقيعات الفلورسينس الفطرية الخافتة أمرا صعبا. لاحظ أنه باستخدام الإعداد الموصوف هنا وسابقا11 ، لم نواجه أي نوع من عينة الخلية التي كانت مضانها الفطرية باهتة جدا لإعادة بناء توقيع مضان فطري. على الرغم من أنه يمكن استخدام إنتاج انبعاثات أعلى للإثارة ووقت أطول للبكسل للحصول على إشارات انبعاث أقوى ، إلا أن هذا قد يسبب تلفا لعينات الخلية. الحل المحتمل للحالات التي يكون فيها الفلورسينس الفطري الخافت مشكلة هو تقليل كثافة إشارة الخلفية ، على سبيل المثال عن طريق تعليق الخلايا في الوسائط العازلة أو الاصطناعية بدلا من المرق. أنواع حاويات الخلايا، مثل الأطباق الزجاجية السفلية والأجهزة الدقيقة، متوافقة ومناسبة لهذه التقنية، على الرغم من استخدام لوح الآغاروز للاحتفاظ بالخلايا في موضعها هنا وفي دراسة سابقة15.
تقدم طريقة المجهر البؤري الدقة المكانية والتحليل في الموقع لتجمعات الخلايا الملتصقة والأغشية الحيوية وعينات الأنسجة. والمفاضلة المحتملة لهذه المنهجية هي الحد الأقصى من الإنتاجية مقارنة بمقياس التدفق الخلوي، على سبيل المثال. مجموعة كاملة من الاشعة confocal جمع بضع مئات إلى ألف التوقيعات الفلورية الفطرية مع مجموعة واحدة من الاشعة يمكن أن يستغرق ما يصل الى بضع دقائق. مقياس التدفق الخلوي أقل حساسية بسبب تصميمه البصري ولكن يمكن أن يحقق إنتاجية أكبر بعدة أوامر من الحجم.
إن تحديد مركب مسؤول عن ذروة محددة في توقيع فلوري فطري بدقة أمر صعب عادة ، نظرا لطبيعته المعقدة. ومع ذلك، فقد اقترح أن عددا من الجزيئات ذات الصلة بيولوجيا، مثل الفيتامينات (على سبيل المثال، فلافين أدينين دينوكليوتيد [FAD])، والكوزيميات (على سبيل المثال، النيكوتيناميد أدينين دينوكليوتيد [NADH])، وأصباغ ليبوفوسين يمكن أن تكون الفلوروفور الرئيسية في الخلايا 1،16. على سبيل المثال، لدى FAD حد أقصى للإثارة يتراوح بين 350-450 نانومتر وذروة انبعاث عند حوالي 525 نانومتر16. و يحتوي NADH المجاني على أقصى حد للإثارة و ذروة الانبعاثات عند 340 نانومتر و 460 نانومتر على التوالي ، على الرغم من أن أطياف الانبعاثات من NADH المقيدة بالبروتين تختلف 16،17،18. الدهون التي من المعروف أن المنتسبين مع الخلايا المجهدة أو القديمة لديها نطاق واسع من الإثارة (350-500 نانومتر) ونطاق الانبعاثات (450-600 نانومتر)16,18.
يوفر استخدام إدارة علاقات العملاء مصدرا مستقلا للمعلومات لتحديد معالم الخلية ، وبالتالي يوفر ميزة أخرى مهمة ل CRIF: الاستخراج الانتقائي لإشارات الفلورسينس من الخلايا الفردية الموزعة في مساحة ثلاثية الأبعاد. وهذا يمثل خطوة إلى الأمام من التحليل التقليدي للخصائص الفلورية للمستعمرة الميكروبية بأكملها أو تعليق الثقافة السائبة ، وهو مزيج متوسط من الإشارات من عدد كبير من الخلايا الملوثة بإشارات غير الخلية من المكونات المتوسطة ، والأيض المفرز ، والمصفوفات خارج الخلية. يسمح تحليل توقيعات الفلورسينس الفطرية أحادية الخلية بالتوصيف التنبؤي للحالة الفسيولوجية للخلايا السليمة ، مما يوفر حلا محتملا لحل التطور الزمني لتوزيع الخلية وحالتها الفسيولوجية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
وليس لدى صاحبي البلاغ ما يكشفان عنه.
Acknowledgments
وقد دعمت هذه الدراسة جزئيا بمنحة في المعونة للبحث العلمي من وزارة التعليم والثقافة والرياضة والتكنولوجيا في اليابان (18K04843) إلى Y. Yawata، وJST ERATO (JPMJER1502) إلى ن. نومورا.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose | Wako Chemicals | 312-01193 | |
| Beam splitters | Carl Zeiss, Nikon | MBSInVis405, MBS458, MBS488, MBS458/514, MBS488/543, or MBS 488/543/633 beam splitters (Carl Zeiss) | |
| Confocal microscope | Carl Zeiss, Nikon | Model LSM 880 (Carl Zeiss), Model A1R (Nikon) | |
| Cover slips | Matsunami Glass | C024601 | |
| Glass slides | Matsunami Glass | S011120 | |
| Half-reflection mirror | Carl Zeiss, Nikon | NT80/20 | |
| Laser power meter | Thorlabs | PM400 (power meter console) and S175C (sensor) | |
| LB Broth | Nacalai tesque | 20066-95 | For bacteria culture |
| Image analysis software | The MathWorks | MATLAB version 2019a or later, Image Processing Toolbox is needed | |
| Microscope objective | Carl Zeiss, Nikon | 440762-9904 | e.g. 63x plan Apochomat NA = 1.4 (Carl Zeiss) |
| Microscope software | Carl Zeiss, Nikon | ZEN (Carl Zeiss),NIS-elements (Nikon) | |
| PBS(-) | Wako Chemicals | 166-23555 | |
| Programming language | Python and libraries, modules (numpy, scikit-learn, scikit-image, os, glob, matplotlib, tkinter) are rquired to run the supplied PCA script. | ||
| Silicone gasket | ThermoFisher Scientific | P24744 | |
| Workstation | A high-performance workstation with discrete GPUs is recommended. | ||
| Yeast extract-peptone-dextrose (YPD) agar medium | Sigma-Aldrich | Y1500-250G | For yeast culture |
| YPD medium | Sigma-Aldrich | Y1375-250G |
References
- Monici, M. Cell and tissue autofluorescence research and diagnostic applications. Biotechnology Annual Review. 11, 227-256 (2005).
- Tang, J. Microbial metabolomics. Current Genomics. 12, 391-403 (2011).
- Woo, P. C., Lau, S. K., Teng, J. L., Tse, H., Yuen, K. Y. Then and now: use of 16S rDNA gene sequencing for bacterial identification and discovery of novel bacteria in clinical microbiology laboratories. Clinical Microbiology and Infection. 14, 908-934 (2008).
- Amman, R., Fuchs, B. M. Single-cell identification in microbial communities by improved fluorescence in situ hybridization techniques. Nature Reviews Microbiology. 6, 339-348 (2008).
- Giana, H. E., Silveira, L., Zângaro, R. A., Pacheco, M. T. T. Rapid identification of bacterial species by fluorescence spectroscopy and classification through principal components analysis. Journal of Fluorescence. 13 (6), 489-493 (2003).
- Leblanc, L., Dufour, E. Monitoring the identity of bacteria using their intrinsic fluorescence. FEMS Microbiology Letters. 211 (2), 147-153 (2002).
- Hou, X., Liu, S., Feng, Y. The autofluorescence characteristics of bacterial intracellular and extracellular substances during the operation of anammox reactor. Scientific Reports. 7, 39289 (2017).
- Ramanujam, N., et al. In vivo diagnosis of cervical intraepithelial neoplasia using 337-nm-excited laser-induced fluorescence. Proceeding National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (21), 10193-10197 (1994).
- Zhang, J. C., et al. Innate cellular fluorescence reflects alterations in cellular proliferation. Lasers in Surgery and Medicine. 20 (3), 319-331 (1997).
- Gosnell, M. E., et al. Quantitative non-invasive cell characterisation and discrimination based on multispectral autofluorescence features. Scientific Reports. 6, 23453 (2016).
- Yawata, Y., et al. Intra- and interspecies variability of single-cell innate fluorescence signature of microbial cell. Applied and Environmental Microbiology. 85, 00608-00619 (2019).
- Nelson, K. E., et al. Complete genome sequence and comparative analysis of the metabolically versatile Pseudomonas putida KT2440. Environmental Microbiology. 4 (12), 799-808 (2002).
- Bagdasarian, M., et al. Specific-purpose plasmid cloning vectors. II. Broad host range, high copy number, RSF1010-derived vectors, and a host-vector system for gene cloning in Pseudomonas. Gene. 16 (1-3), 237-247 (1981).
- Luo, Y., Vijaychander, S., Stile, J., Zhu, L. Cloning and analysis of DNA-binding proteins by yeast one-hybrid and one-two-hybrid systems. Biotechniques. 20 (4), 564-568 (1996).
- Yawata, Y., et al. Monitoring biofilm development in a microfluidic device using modified confocal reflection microscopy. Journal of Bioscience and Bioengineering. 110 (3), 377-380 (2010).
- Lakowicz, J. R. Principles of Fluorescence Spectroscopy. Third edition. , Springer. Germany. (2006).
- Blacker, T. S., Duchen, M. R. Investigating mitochondrial redox state using NADH and NADPH autofluorescence. Free Radical Biology & Medicine. 100, 53-65 (2016).
- Croce, A. C., Bottiroli, G. Autofluorescence spectroscopy and imaging: A tool for biomedical research and diagnosis. European Journal of Histochemistry. 58 (4), 2461 (2014).
