Summary
Her presenteres en protokoll for optisk utpakking og katalogisering av medfødte cellulære fluorescenssignaturer (dvs. cellulær autofluorescens) fra hver enkelt levende celle distribuert i et tredimensjonalt rom. Denne metoden er egnet for å studere den medfødte fluorescenssignaturen til forskjellige biologiske systemer med en encellet oppløsning, inkludert celler fra bakterier, sopp, gjær, planter og dyr.
Abstract
Beskrevet her er confocal reflection microscopy-assistert encellet medfødt fluorescensanalyse (CRIF), en minimalt invasiv metode for å rekonstruere den medfødte cellulære fluorescenssignaturen fra hver enkelt levende celle i en populasjon fordelt i et tredimensjonalt (3D) rom. Den medfødte fluorescenssignaturen til en celle er en samling fluorescenssignaler som slippes ut av ulike biomolekyler i cellen. Tidligere studier fastslått at medfødte fluorescenssignaturer gjenspeiler ulike cellulære egenskaper og forskjeller i fysiologisk status og er en rik kilde til informasjon for cellekarakterisering og identifikasjon. Medfødte fluorescenssignaturer har tradisjonelt blitt analysert på befolkningsnivå, noe som nødvendiggjør en klonær kultur, men ikke på encellet nivå. CRIF er spesielt egnet for studier som krever 3D-oppløsning og/eller selektiv utvinning av fluorescenssignaler fra enkeltceller. Fordi fluorescenssignaturen er en medfødt egenskap for en celle, er CRIF også egnet for tagfri prediksjon av typen og / eller fysiologisk status for intakte og enkeltceller. Denne metoden kan være et kraftig verktøy for strømlinjeformet celleanalyse, der fenotypen til hver enkelt celle i en heterogen populasjon kan vurderes direkte av sin autofluorescence signatur under et mikroskop uten cellemerking.
Introduction
Ulike biomolekyler i en celle1 avgir autofluorescenssignaler, og den medfødte fluorescenssignaturen til en celle består av montering av disse signalene. Denne signaturfluorescensen gjenspeiler ulike cellulære egenskaper og også forskjeller i fysiologisk status. Analyse av medfødt fluorescens er minimalt invasiv og kan utfylle tradisjonelle, mer invasive mikrobiologiske sonder som etterlater en rekke spor fra mild metabolsk modifikasjon til fullstendig celleødeleggelse. Mens tradisjonelle teknikker som DNA eller celleinnhold ekstraksjon2,3, fluorescerende in situ hybridisering4, og innføring av fluorescerende reporter gener til genomet er effektive i å bestemme celletype eller fysiologisk status, krever de vanligvis enten manipulering av cellene eller invasiv merking.
Studier av medfødt fluorescens av ulike levende og intakte mikrobielle kolonier, inkludert bulk mikrobielle kultur suspensjoner5,6, aktive slam7, pattedyr vev8,9, og pattedyr celler1,10, har vist at medfødt fluorescens analyse letter tag-fri analyse av celletyper og fysiologisk status. Medfødte fluorescenssignaturer har tradisjonelt blitt analysert på befolkningsnivå og ikke på encellet nivå, og krever dermed en klonærkultur. Derimot, den confokal reflection mikroskopi-assistert encellet innate fluorescence analyse (CRIF) teknikk11 beskrevet her rekonstruerer og kataloger den medfødte cellulær fluorescens signatur av hver enkelt levende mikrobiell celle. Videre kan CRIF systematisk samle den medfødte fluorescenssignaturen til en enkelt mikrobiell celle i en populasjon som er fordelt i et tredimensjonalt (3D) rom.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Utarbeidelse av prøven
- Plasser en 1 mm tykk silikonpakning med brønner på en glasssklie.
- Plasser en 1 mm tykk 0,8% (w / v) agarose plate i brønnen på silikonpakningen.
- Fortynn celletettheten til en vilkårlig mikrobiell cellekultur til en optisk tetthet ved 600 nm (OD660) = 1,0.
- Plasser en 5 μL aliquot celle suspensjon på agarose plate.
- Dekk forsiktig med en glassdekslerlip.
2. Oppsett av et mikroskop
MERK: CRIF-teknikken kombinerer kontrokal refleksjonsmikroskopi (CRM) og flerkanals kontrokal mikrospektroskopi. CRM fungerer som kilde til informasjon for cellulær morfologi og romlig lokalisering, som er uavhengig av cellulær medfødt fluorescens. Multikanals konfektmikrospektroskopi gir spektral informasjon om cellulær medfødt fluorescens. I følgende protokoll kalles ethvert bilde som er anskaffet med CRM eller konfokal fluorescensmikrospektroskopi, henholdsvis som et CRM-bilde eller et konfokalt mikrospektroskopibilde.
- Koble et konfokalt mikroskop med descanned spektralkanaler til et fotomultiplierrør (PMT) eller GaAsP-detektor.
MERK: Disse oppsettene er tilgjengelige fra flere produsenter. - Utstyr mikroskopet med et høyt numerisk blenderåpningsmål (NA) med tilstrekkelig forstørrelse.
MERK: Et 63x mål med NA > 1,4 anbefales for å analysere bakterieceller. - Utstyr mikroskopet med et halvt refleksjonsspeil (f.eks. NT 80/20) for å imøtekomme CRM, som er avhengig av cellulær spredning av hendelseslys for å visualisere cellemorfologi.
- For flerkanals kontrokal mikrospektroskopi, utstyr mikroskopet med dikroiske speil. Bruk for eksempel MBS InVis405, MBS458, MBS488, MBS458/514, MBS488/543 eller MBS 488/543/633 strålesplittere for henholdsvis 405, 458, 488, 514, 543 eller 633 nm eksitasjon.
- Juster belysningsintensiteten for hver eksitasjonsbølgelengde ved hjelp av en laserkraftmåler. Hold utgangen under mikroskopet konstant gjennom eksitasjonsbølgelengder (bruk for eksempel 50 μW med 63x-målet).
3. Bildeoppkjøp
- Sett pinhole-størrelsen til 1 AU ved hjelp av mikroskopprogramvaren.
- Still inn pikselens oppholdstid (dvs. skannehastighet) for hver eksitasjonsbølgelengde.
MERK: En for lang piksel oppholdstid kan skade celler. Unngå for lang piksel oppholdstid for å minimere fotodamage til cellene. For bakterieprøver er en pikselboetid <55,6 μs/μm2 (når bestrålingsutgangen under mikroskopet er ~ 17 μW / cm2) vanligvis egnet for å unngå veksthemming. Denne parameteren kan variere avhengig av organismer og eksperimentelle oppsett. - Angi skanneoppløsning. For små celler som bakterier, bruk et skanneområde på 1024 x 1024.
- Angi Z-skanneområdet slik at interesseområdet dekkes.
MERK: For bakterie- og gjærcelleprøver fordelt på en agaroseplate, er et Z-skanneområde på ~ 15 μm vanligvis tilstrekkelig. - Still inn descanned-detektoren for å fange opp det synlige bølgelengdeområdet (f.eks. 416−691 nm). Bruk et spektralvindu på 8−10 nm.
- Skaff deg flerkanals konfokale mikrospektroskopibilder i en sekvens fra lengste til korteste eksitasjonsbølgelengder for å lage Z-stabler av fluorescensbilder.
- Hent CRM-avbildninger.
- Lagre de anskaffede bildene som 16-biters TIFF-filer i en katalog. Navngi filene ved hjelp av navnekonvensjonen XXXcYYzZZ.tif, der XXX er eksitasjonsbølgelengden, YY er detektorkanalnummeret, ZZ er Z-stykkenummeret, og "c" og "z" er prefikser for henholdsvis detektornummeret og Z-stykkenummeret.
- Hvis for eksempel et flerkanals konfokalt mikrospektroskopibilde tas med en eksitasjonsbølgelengde på 405 nm, første detektorkanal i detektormatrisen og er den femte delen av Z-stabelen, må du kalle den "405c01z05.tif". For CRM-bilder bruker du strengen "CRM" i stedet for XXX (for eksempel "CRMc01z05.tif").
MERK: Bestem om 2D- eller 3D-segmentering passer best for bildedataene. Bruk en 2D-segmenteringsmetode i situasjoner der små celler er begrenset til et 2D-plan (f.eks. bakteriell populasjon som holder seg til en glassoverflate). Bruk 3D-segmenteringsmetoden i situasjoner der cellepopulasjonen fordeles i et tredimensjonalt rom (f.eks. biofilmer og vevsprøver) eller cellestørrelsene er større enn tykkelsen på den optiske skiven (f.eks. gjærceller, pattedyrceller). For 2D-segmentering se avsnitt 4; for 3D-segmentering, se avsnitt 5.
- Hvis for eksempel et flerkanals konfokalt mikrospektroskopibilde tas med en eksitasjonsbølgelengde på 405 nm, første detektorkanal i detektormatrisen og er den femte delen av Z-stabelen, må du kalle den "405c01z05.tif". For CRM-bilder bruker du strengen "CRM" i stedet for XXX (for eksempel "CRMc01z05.tif").
4. 2D-bildeanalyse
- Utstyr en arbeidsstasjon med bildeanalyseprogramvare (f.eks.
- Utfør cellesegmentering og rekonstruksjon av enkeltcellede medfødte fluorescenssignaturer.
- Åpne programvaren for bildeanalyse.
- Dobbeltklikk og åpne et av de medfølgende skriptene "Script2D.m".
- Gå til Redigering-fanen , og klikk deretter Kjør. Et mappevalgvindu skal vises.
- Velg katalogen som ble opprettet i trinn 3.8, og klikk deretter Åpne for å fortsette. En dialogboks der du blir bedt om å angi segmenteringsparameteren, vises automatisk.
MERK: For testformål velger du det angitte datasettet ("Sample_2D"). Eksempeldatasettet leveres som en komprimert fil og bør pakkes ut på forhånd. - Angi segmenteringsparameterne: Terskel for bildebinarisering (0−1) for bildebinarisering = 0,45, øvre terskelverdi for et celleområde (i piksler) = 200, nedre terskelverdi for et celleområde (i piksler) = 10 og antall detektorer = 32. Klikk OK for å fortsette.
MERK: Disse parameterne kan kreve justering avhengig av bildekvaliteten. - Et nytt bildevindu som presenterer et CRM-bilde, skal vises. Velg et vilkårlig bakgrunnsområde (dvs. område der celler er fraværende) som skal brukes til bakgrunnsdeltrekk. Tegn et rektangel i CRM-bildet ved å dra musen. Dobbeltklikk innenfor det merkede området for å bekrefte valget.
- Finn en ny mappe med navnet Signatur i samme mappe som ble valgt i trinn 4.2.4.
MERK: Den medfølgende koden oppretter automatisk denne katalogen. "Signatur" -katalogen lagrer den medfødte fluorescenssignaturen til hver mikrobielle celle i en populasjon som .png filer som er serienummert nummerert etter et felles prefiks "Signatur".
5.3D bildeanalyse
- Utstyr en arbeidsstasjon med bildeanalyseprogramvaren (Materialfortegnelser).
- Utfør cellesegmentering og rekonstruksjon av enkeltcellede medfødte fluorescenssignaturer.
- Åpne programvaren for bildeanalyse.
- Dobbeltklikk og åpne det medfølgende skriptet "Script3D.m".
- Gå til Redigering-fanen , og klikk deretter Kjør. Et mappevalgvindu skal vises.
- Velg katalogen som ble opprettet i trinn 3.8, og klikk deretter Åpne for å fortsette. En dialogboks der du blir bedt om å angi segmenteringsparameterne, vises automatisk.
MERK: For testformål velger du det angitte datasettet ("Sample_3D"). Eksempeldatasettet leveres som en komprimert fil og bør pakkes ut på forhånd. - Angi segmenteringsparameterne: Terskel for bildebinarisering (0–1) for bildebinarisering = 0,01, Øvre terskelverdi for et cellevolum (i piksler) = 1 000, nedre terskelverdi for et celleområde (i piksler) = 20, X Pikselstørrelse [μm/piksel] = 0,26, Y-pikselstørrelse [μm/piksel] = 0,26, Z-pikselstørrelse [μm/piksel] = 0,42 og Antall detektorer = 32. Klikk OK for å fortsette. Det vises en dialogboks der du blir bedt om å angi antall eksitasjonsbølgelengder.
MERK: Disse parameterne kan kreve justering avhengig av bildekvaliteten. - Skriv inn antall bølgelengder som brukes til bildeanskaffelse (hvis for eksempel 405, 488, 561, 630 brukes, skriver du inn 4 i dialogboksen). Klikk OK.
- Skriv inn eksitasjonsbølgelengdene i en sekvens fra korteste (dvs. boksnavn: Eksitasjon nr. 1) til lengste bølgelengde i dialogboksene. Klikk OK for å fortsette. Et nytt bildevindu som presenterer et CRM-bilde, skal dukke opp.
- Velg det vilkårlige bakgrunnsområdet (dvs. området der celler er fraværende) som skal brukes til bakgrunnsdeleksjon. Tegn et rektangel i CRM-bildet ved å dra musen. Dobbeltklikk innenfor det merkede området for å bekrefte valget.
- Finn mappen Signatur i katalogen som ble valgt i trinn 5.2.4.
MERK: Den medfølgende koden oppretter automatisk denne katalogen. "Signatur" -katalogen lagrer den medfødte fluorescenssignaturen til hver enkelt mikrobiell celle i en populasjon som .png filer som er serienummert nummerert etter et felles prefiks "Signatur".
6. Statistisk analyse
MERK: Utfør dimensjonale reduksjonsteknikker (f.eks. hovedkomponentanalyse [PCA]) for å visualisere fordelingen av hyperspektrum i cellepopulasjonene. Det angitte skriptet (PCA.py) utfører PCA for to cellepopulasjoner (dvs. to klasser).
- Utstyr en arbeidsstasjon med programmeringsspråket og tilhørende biblioteker og moduler (Materialfortegnelser).
- Opprett en tom mappe i C-stasjonen (eller tilsvarende) og gi mappen navnet "Parent_directory" (dvs. C:/ Parent_ katalog).
- Lagre fluorescenssignaturene (f.eks. de .png filene som ble generert i trinn 4.2.7) i hver av de to cellepopulasjonene i to separate kataloger.
MERK: De to katalogene skal begge være plassert i "Parent_directory".
C:/Parent_directory/
putidaKT2440/
Signatur01.png Signatur02.png :putidaKT2442/
Signatur01.png
Signatur02.png
: - Last ned PCA.py til "Parent_directory".
- Åpne kommandolinjegrensesnittet for arbeidsstasjonen.
- Skriv inn "python C:/Parent_directory/PCA.py" i kommandolinjegrensesnittet.
- Velg "Parent_directory" etter at meldingen 'Velg målkatalog' vises.
- I "C: / Parent_directory", finn "PCA.png", som inneholder en resulterende PCA-tomt.
putidaKT2440/
Signatur01.pngSubscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1A viser den typiske encellede fluorescenssignaturen til en bakteriell celle presentert som en tradisjonell spektrumplott (topp) og som et varmekart (midten). Figur 1B viser resultatet av en nøyaktig 2D-cellesegmentering lagt over det opprinnelige CRM-bildet av en populasjon av jordbakterier (Pseudomonas putida KT2440)12. De resulterende medfødte fluorescenssignaturene for befolkningen presenteres som et varmekart i figur 1D. Vær oppmerksom på at variasjonen i intrapopulasjonen var relativt liten etter vellykket cellesegmentering. Et eksempel på unøyaktig cellesegmentering vises i figur 1C, som legges over samme populasjon av P. putida som vist i figur 1B. Virkningen av unøyaktig cellesegmentering på befolkningens medfødte fluorescenssignaturer er lett synlig fra det betydelige antallet outliers (figur 1E, røde trekanter). Unøyaktig cellesegmentering resulterte i en løsere klynge etter PCA sammenlignet med den tette klyngen oppnådd etter nøyaktig cellesegmentering (figur 1F).
Vanligvis, til tross for intraspecies variasjon, medfødt fluorescens signaturer av forskjellige celletyper danner distinkte klynger. Figur 2C presenterer resultatet av PCA-analyser for et taksonomisk nært par stammer (P. putidastamme KT2440 og stamme KT244213). Til tross for den mindre variasjonen som ble observert i hver enkelt populasjon (figur 2A,B), dannet hver populasjon en distinkt klynge på PCA-analyseplottet (figur 2C).
Figur 3A viser resultatet av nøyaktig 3D-cellesegmentering lagt over det opprinnelige CRM-bildet av en populasjon av spirende gjær Saccharomyces cerevisiae YM427114. Figur 3B viser de resulterende medfødte fluorescenssignaturene for befolkningen.
Figur 1: Nøyaktighet av segmentering og tilsynelatende intraarter varierer. (A) Typisk enkeltcellet medfødt fluorescenssignatur av en bakteriecelle (P. putida KT2440), presentert som en spektrumplott (topp) og et varmekart (midten). Utslippsbølgelengden er angitt som et regnbuefargekart (bunn). Y-aksen til spektrumplottet og fargen på varmekartet indikerer begge de relative fluorescensintensitetene. Tallene i bunnen angir eksitasjonsbølgelengden. Visuell representasjon av nøyaktig (B) og unøyaktig (C) celleområdegjenkjenning av bildeanalysealgoritmen. Lyseblå skyggelegging indikerer celleregioner oppdaget for en populasjon av jordbakterie P. putida KT 2440. Blober med rød nummerering i panel C er eksempler på falsk deteksjon, der algoritmen klassifiserte ikke-celleområder (dvs. bakgrunnsstøy) som celleområder på grunn av upassende innstillinger for binariseringsterskel. Skalastenger = 1 μm gjennomgående. Panel D og E skildrer de medfødte fluorescenssignaturene for samme populasjon, generert med henholdsvis nøyaktig og unøyaktig cellesegmentering. Hver kolonne viser et rekonstruert hyperspektrum med én celle presentert som en matrise på 1 x 192, der det gul-til-blå fargekartet indikerer relativ fluorescensintensitet. (F) Variansen av medfødte fluorescenssignaturer i nøyaktige (lyseblå) og unøyaktige (røde) segmenteringer visualisert ved hjelp av PCA. Hver akseetikett angir komponentnummeret og det akkumulerte prosentbidraget til PCA-analysen. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Intra- og interspecies varierer medfødte fluorescenssignaturer. Medfødte fluorescenssignaturer presentert som varmekart for en populasjon av P. putida KT2440 (A) og P. putida KT2442 (B). (C) Projeksjon av de to medfødte fluorescenssignaturparene visualisert ved hjelp av PCA, tilsvarende P. putida KT2440 (rød, n = 288) og P. putida KT2442 (blå, n = 373). X- og Y-akser representerer henholdsvis PC1 og PC2. Innsettingsnummeret indikerer midten av hver klynge (1: P. putida KT2440, 2: P. putida KT2442). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Eksempel på 3D-segmentering og medfødt fluorescenssignaturutvinning. (A) 3D-projeksjon av regioner anerkjent som cellepopulasjoner av spirende gjær S. cerevisiae YM4271. Innsettende numre er identifikasjonsnumrene. (B) Varmekart over medfødte fluorescenssignaturer hentet fra 3D-regionene. X-aksenummeret tilsvarer identifikasjonsnummeret. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det er to kritiske punkter i denne metoden som må følges nøye for å oppnå reproduserbare resultater: 1) holde lasereffekten under mikroskopmålet konsistent gjennom eksitasjonsbølgelengder og eksperimenter, og 2) utføre nøyaktig cellesegmentering.
Det første punktet er spesielt viktig når man sammenligner den medfødte fluorescenssignaturen mellom forskjellige eksperimenter. Unngå bare å bruke de samme "prosentutgangsinnstillingene" på eksitasjonsbølgelengdene (dvs. ved å bruke 5% utgangseffekt for alle 405, 488, 514 og 530 nm laserlinjer), fordi maksimal effekt kan variere opp til en størrelsesorden mellom laserlinjer. I tillegg har målet og den interne optikken vanligvis ujevne optiske absorpsjonsegenskaper, som også må redegjøres for. Av disse grunnene anbefales det å faktisk måle utgangen under målet ved hjelp av en lasereffektmåler (Materialtabell). Å ta denne målingen med noen få eksperimenter, eller med jevne mellomrom, anbefales også, fordi utgangen fra laserlinjer kan forfalle betydelig over noen år.
Det andre punktet, nøyaktig cellesegmentering, blir spesielt viktig i situasjoner der intra- eller interspecies varierer er en bekymring. Unøyaktig cellesegmentering (figur 1D) resulterer i ytre datapunkter (figur 1E, indikert med røde trekanter) og større tilsynelatende intraartervariabilitet. Segmenteringsparametrene bør bestemmes nøye, kontrollere cellesegmenteringsnøyaktigheten ved å legge segmenteringsresultatene over det opprinnelige CRM-bildet, før du går videre til ytterligere analyse- eller opplærings maskinlæringsmodeller. Hvis du arbeider med et bilde av dårlig kvalitet, kan det være nødvendig med ekstra bildebehandling for å oppnå nøyaktig segmentering. Bruk av enten et Gaussian-filter eller et medianfilter kan fjerne kornete artefakter, og bilaterale filterbehandlingstellere har stripet bakgrunn.
Med dårlig kvalitetsoptikk (f.eks. et ikke-konfokalt mål) eller utilstrekkelig detektorfølsomhet, kan det være utfordrende å håndtere deteksjon av svake medfødte fluorescenssignaturer. Vær oppmerksom på at ved hjelp av oppsettet som er beskrevet her og tidligere11, møtte vi ikke noen form for celleprøve hvis medfødte fluorescens var for svak til å rekonstruere en medfødt fluorescenssignatur. Selv om høyere utslippseffekt for eksitasjon og lengre pikselboetid kan brukes til å oppnå sterkere utslippssignaler, kan dette føre til skade på celleprøvene. En potensiell løsning for tilfeller der svak medfødt fluorescens er et problem er å redusere bakgrunnssignalintensiteten, for eksempel ved å suspendere celler i buffer eller syntetiske medier i stedet for buljong. Typer cellebeholdere, som glassbunnsretter og mikrofluidiske enheter, er kompatible og passende for denne teknikken, selv om en agaroseplate ble brukt til å beholde celler i posisjon her og i en tidligere studie15.
Den konfiske mikroskopmetoden tilbyr romlig oppløsning og in situ-analyse for tilhengercellepopulasjoner, biofilmer og vevsprøver. En potensiell avveining av denne metoden er for eksempel maksimal gjennomstrømning sammenlignet med et strømningscytometer. Et komplett sett med konfokale skanninger som samler noen hundre til tusen medfødte fluorescenssignaturer med et enkelt sett med skanninger, kan ta opptil noen få minutter. Et strømningscytometer er mindre følsomt på grunn av sin optiske design, men kan potensielt oppnå en gjennomstrømning flere størrelsesordener større.
Å identifisere en forbindelse som er ansvarlig for en bestemt topp i en medfødt fluorescerende signatur er vanligvis utfordrende, på grunn av sin kompliserte natur. Det har imidlertid blitt antydet at en rekke biologisk relevante molekyler, som vitaminer (f.eks. flavin adenin dinucleotide [FAD]), koenzymer (f.eks. nikotinamid adenin dinucleotide [NADH]), og lipofuscinpigmenter kan være store fluoroforer i cellene1,16. For eksempel har FAD en eksitasjons maksimum mellom 350-450 nm og en utslippstopp på ca 525 nm16. Gratis NADH har en eksitasjons maksimums- og utslippstopp på henholdsvis 340 nm og 460 nm, selv om utslippsspektraet til proteinbundet NADH er forskjellig16,17,18. Lipopigments som er kjent for å assosiere med stressede eller alderen celler har et bredt eksitasjonsområde (350-500 nm) og utslippsområde (450-600 nm)16,18.
Bruken av CRM tilbyr en uavhengig informasjonskilde for å identifisere cellekonturer og gir derfor en annen betydelig fordel med CRIF: selektiv utvinning av fluorescenssignaler fra individuelle celler distribuert i et 3D-rom. Dette representerer et skritt fremover fra den tradisjonelle analysen av fluorescensegenskapene til en hel mikrobiell koloni eller en bulkkulturfjæring, som er en gjennomsnittlig blanding av signaler fra et stort antall celler forurenset med ikke-cellesignaler fra mellomstore komponenter, utskilte metabolitter og ekstracellulære matriser. En analyse av encellede medfødte fluorescenssignaturer tillater prediktiv karakterisering av den fysiologiske statusen til intakte celler, noe som gir en potensiell løsning for å løse temporal utvikling av en celles fordeling og fysiologisk tilstand.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Denne studien ble delvis støttet av et bistandsstipend for vitenskapelig forskning fra Departementet for utdanning, kultur, sport og teknologi i Japan (18K04843) til Y. Yawata, JST ERATO (JPMJER1502) til N. Nomura.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose | Wako Chemicals | 312-01193 | |
| Beam splitters | Carl Zeiss, Nikon | MBSInVis405, MBS458, MBS488, MBS458/514, MBS488/543, or MBS 488/543/633 beam splitters (Carl Zeiss) | |
| Confocal microscope | Carl Zeiss, Nikon | Model LSM 880 (Carl Zeiss), Model A1R (Nikon) | |
| Cover slips | Matsunami Glass | C024601 | |
| Glass slides | Matsunami Glass | S011120 | |
| Half-reflection mirror | Carl Zeiss, Nikon | NT80/20 | |
| Laser power meter | Thorlabs | PM400 (power meter console) and S175C (sensor) | |
| LB Broth | Nacalai tesque | 20066-95 | For bacteria culture |
| Image analysis software | The MathWorks | MATLAB version 2019a or later, Image Processing Toolbox is needed | |
| Microscope objective | Carl Zeiss, Nikon | 440762-9904 | e.g. 63x plan Apochomat NA = 1.4 (Carl Zeiss) |
| Microscope software | Carl Zeiss, Nikon | ZEN (Carl Zeiss),NIS-elements (Nikon) | |
| PBS(-) | Wako Chemicals | 166-23555 | |
| Programming language | Python and libraries, modules (numpy, scikit-learn, scikit-image, os, glob, matplotlib, tkinter) are rquired to run the supplied PCA script. | ||
| Silicone gasket | ThermoFisher Scientific | P24744 | |
| Workstation | A high-performance workstation with discrete GPUs is recommended. | ||
| Yeast extract-peptone-dextrose (YPD) agar medium | Sigma-Aldrich | Y1500-250G | For yeast culture |
| YPD medium | Sigma-Aldrich | Y1375-250G |
References
- Monici, M. Cell and tissue autofluorescence research and diagnostic applications. Biotechnology Annual Review. 11, 227-256 (2005).
- Tang, J. Microbial metabolomics. Current Genomics. 12, 391-403 (2011).
- Woo, P. C., Lau, S. K., Teng, J. L., Tse, H., Yuen, K. Y. Then and now: use of 16S rDNA gene sequencing for bacterial identification and discovery of novel bacteria in clinical microbiology laboratories. Clinical Microbiology and Infection. 14, 908-934 (2008).
- Amman, R., Fuchs, B. M. Single-cell identification in microbial communities by improved fluorescence in situ hybridization techniques. Nature Reviews Microbiology. 6, 339-348 (2008).
- Giana, H. E., Silveira, L., Zângaro, R. A., Pacheco, M. T. T. Rapid identification of bacterial species by fluorescence spectroscopy and classification through principal components analysis. Journal of Fluorescence. 13 (6), 489-493 (2003).
- Leblanc, L., Dufour, E. Monitoring the identity of bacteria using their intrinsic fluorescence. FEMS Microbiology Letters. 211 (2), 147-153 (2002).
- Hou, X., Liu, S., Feng, Y. The autofluorescence characteristics of bacterial intracellular and extracellular substances during the operation of anammox reactor. Scientific Reports. 7, 39289 (2017).
- Ramanujam, N., et al. In vivo diagnosis of cervical intraepithelial neoplasia using 337-nm-excited laser-induced fluorescence. Proceeding National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (21), 10193-10197 (1994).
- Zhang, J. C., et al. Innate cellular fluorescence reflects alterations in cellular proliferation. Lasers in Surgery and Medicine. 20 (3), 319-331 (1997).
- Gosnell, M. E., et al. Quantitative non-invasive cell characterisation and discrimination based on multispectral autofluorescence features. Scientific Reports. 6, 23453 (2016).
- Yawata, Y., et al. Intra- and interspecies variability of single-cell innate fluorescence signature of microbial cell. Applied and Environmental Microbiology. 85, 00608-00619 (2019).
- Nelson, K. E., et al. Complete genome sequence and comparative analysis of the metabolically versatile Pseudomonas putida KT2440. Environmental Microbiology. 4 (12), 799-808 (2002).
- Bagdasarian, M., et al. Specific-purpose plasmid cloning vectors. II. Broad host range, high copy number, RSF1010-derived vectors, and a host-vector system for gene cloning in Pseudomonas. Gene. 16 (1-3), 237-247 (1981).
- Luo, Y., Vijaychander, S., Stile, J., Zhu, L. Cloning and analysis of DNA-binding proteins by yeast one-hybrid and one-two-hybrid systems. Biotechniques. 20 (4), 564-568 (1996).
- Yawata, Y., et al. Monitoring biofilm development in a microfluidic device using modified confocal reflection microscopy. Journal of Bioscience and Bioengineering. 110 (3), 377-380 (2010).
- Lakowicz, J. R. Principles of Fluorescence Spectroscopy. Third edition. , Springer. Germany. (2006).
- Blacker, T. S., Duchen, M. R. Investigating mitochondrial redox state using NADH and NADPH autofluorescence. Free Radical Biology & Medicine. 100, 53-65 (2016).
- Croce, A. C., Bottiroli, G. Autofluorescence spectroscopy and imaging: A tool for biomedical research and diagnosis. European Journal of Histochemistry. 58 (4), 2461 (2014).
