Summary
Qui, viene presentato un protocollo per estrarre otticamente e catalogare le firme di fluorescenza cellulare innata (cioè l'autofluorescenza cellulare) da ogni singola cellula viva distribuita in uno spazio tridimensionale. Questo metodo è adatto per studiare la firma di fluorescenza innata di diversi sistemi biologici a una risoluzione unicellulare, comprese le cellule di batteri, funghi, lieviti, piante e animali.
Abstract
Qui è descritta l'analisi di fluorescenza innata a singola cellula assistita da microscopia a riflessione confocale (CRIF), un metodo minimamente invasivo per ricostruire la firma di fluorescenza cellulare innata da ogni singola cellula viva in una popolazione distribuita in uno spazio tridimensionale (3D). La firma di fluorescenza innata di una cellula è una raccolta di segnali di fluorescenza emessi da varie biomolecole all'interno della cellula. Studi precedenti hanno stabilito che le firme di fluorescenza innata riflettono varie proprietà cellulari e differenze nello stato fisiologico e sono una ricca fonte di informazioni per la caratterizzazione e l'identificazione cellulare. Le firme di fluorescenza innata sono state tradizionalmente analizzate a livello di popolazione, rendendo necessaria una coltura clonale, ma non a livello di singola cellula. Il CRIF è particolarmente indicato per studi che richiedono risoluzione 3D e/o estrazione selettiva di segnali di fluorescenza da singole cellule. Poiché la firma di fluorescenza è una proprietà innata di una cellula, il CRIF è adatto anche per la previsione senza tag del tipo e/o dello stato fisiologico di cellule intatte e singole. Questo metodo può essere un potente strumento per l'analisi cellulare semplificata, in cui il fenotipo di ogni singola cellula in una popolazione eterogenea può essere valutato direttamente dalla sua firma di autofluorescenza al microscopio senza marcatura cellulare.
Introduction
Diverse biomolecole all'interno di una cellula1 emettono segnali di autofluorescenza e la firma di fluorescenza innata di una cellula consiste nell'assemblaggio di questi segnali. Questa fluorescenza distintiva riflette varie proprietà cellulari e anche differenze nello stato fisiologico. L'analisi della fluorescenza innata è minimamente invasiva e può integrare le sonde microbiologiche tradizionali e più invasive che lasciano una serie di tracce dalla lieve modificazione metabolica alla completa distruzione cellulare. Mentre le tecniche tradizionali come l'estrazione del DNA o del contenuto cellulare2,3, l'ibridazione fluorescente in situ4 e l'introduzione di geni reporter fluorescenti nel genoma sono efficaci nel determinare il tipo di cellula o lo stato fisiologico, comunemente richiedono la manipolazione delle cellule o l'etichettatura invasiva.
Studi sulla fluorescenza innata di varie colonie microbiche vive e intatte, tra cui sospensioni di colture microbiche sfuse5,6, fanghi attivi7, tessuti di mammiferi8,9 e cellule di mammifero1,10, hanno dimostrato che l'analisi della fluorescenza innata facilita l'analisi senza tag dei tipi cellulari e dello stato fisiologico. Le firme di fluorescenza innata sono state tradizionalmente analizzate a livello di popolazione e non a livello di singola cellula, e quindi richiedono una coltura clonale. Al contrario, la tecnica di analisi della fluorescenza dell'innato a singola cellula assistita da microscopia a reflezione confocale11 qui descritta ricostruisce e cataloga la firma di fluorescenza cellulare innata di ogni singola cellula microbica viva. Inoltre, CRIF può raccogliere sistematicamente la firma di fluorescenza innata di una singola cellula microbica all'interno di una popolazione distribuita in uno spazio tridimensionale (3D).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Preparazione del campione
- Posizionare una guarnizione in silicone di 1 mm di spessore con pozzetti su una slitta di vetro.
- Posizionare una lastra di agarosio dello 0,8% (p/v) di spessore 1 mm nel pozzetto della guarnizione in silicone.
- Diluire la densità cellulare di una coltura cellulare microbica arbitraria a una densità ottica a 600 nm (OD660) = 1.0.
- Posizionare un'aliquota di 5 μL di sospensione cellulare sulla lastra di agarosio.
- Coprire delicatamente con una copertura di vetro.
2. Configurazione di un microscopio
NOTA: La tecnica CRIF combina microscopia a riflessione confocale (CRM) e microscopia confocale multicanale. Il CRM funge da fonte di informazioni per la morfologia cellulare e la localizzazione spaziale, che è indipendente dalla fluorescenza innata cellulare. La microspettroscopia confocale multicanale fornisce le informazioni spettrali della fluorescenza innata cellulare. Nel seguente protocollo, qualsiasi immagine acquisita con CRM o microspettroscopia a fluorescenza confocale viene definita rispettivamente immagine CRM o immagine di microspettroscopia confocale multicanale.
- Collegare un microscopio confocale con canali spettrali descanned a un tubo fotomoltiplicatore (PMT) o a un rivelatore GaAsP.
NOTA: queste configurazioni sono disponibili da diversi produttori. - Dotare il microscopio di un obiettivo ad alta apertura numerica (NA) con un ingrandimento adeguato.
NOTA: un obiettivo 63x con NA > 1.4 è raccomandato per l'analisi delle cellule batteriche. - Dotare il microscopio di uno specchio a semiriflesso (ad esempio, NT 80/20) per ospitare il CRM, che si basa sulla diffusione cellulare della luce incidente per visualizzare la morfologia cellulare.
- Per la microspettroscopia confocale multicanale, dotare il microscopio di specchi dicroici. Ad esempio, utilizzare MBS InVis405, MBS458, MBS488, MBS458/514, MBS488/543 o MBS 488/543/633 beam splitter per 405, 458, 488, 514, 543 o 633 nm di eccitazione, rispettivamente.
- Regolare l'intensità dell'illuminazione per ogni lunghezza d'onda di eccitazione utilizzando un misuratore di potenza laser. Mantenere costante l'output al microscopio attraverso lunghezze d'onda di eccitazione (ad esempio, utilizzare 50 μW con l'obiettivo 63x).
3. Acquisizione di immagini
- Impostare la dimensione del foro stenopeico su 1 UA utilizzando il software del microscopio.
- Impostare il tempo di permanenza dei pixel (ad esempio, la velocità di scansione) per ogni lunghezza d'onda di eccitazione.
NOTA: un tempo di permanenza in pixel eccessivamente lungo può danneggiare le celle. Evitare un tempo di permanenza dei pixel eccessivamente lungo per ridurre al minimo il fotodanno alle celle. Per i campioni batterici, un tempo di permanenza in pixel <55,6 μs/μm2 (quando l'uscita di irraggiamento al microscopio è ~ 17 μW/cm2) è solitamente adatto per evitare l'inibizione della crescita. Questo parametro può variare a seconda degli organismi e delle configurazioni sperimentali. - Impostare la risoluzione di scansione. Per le piccole cellule come i batteri, utilizzare un'area di scansione di 1.024 x 1.024.
- Impostare l'intervallo di scansione Z in modo che la regione di interesse sia coperta.
NOTA: per i campioni di cellule batteriche e di lievito distribuiti su una lastra di agarosio, di solito è sufficiente un intervallo di scansione Z di ~ 15 μm. - Impostare il rivelatore descanned per catturare l'intervallo di lunghezze d'onda visibili (ad esempio, 416-691 nm). Utilizzare una finestra spettrale di 8−10 nm.
- Acquisisci immagini di microspettroscopia confocale multicanale in una sequenza dalle lunghezze d'onda di eccitazione più lunghe a quelle più corte per creare pile Z di immagini a fluorescenza.
- Acquisisci immagini CRM.
- Salvare le immagini acquisite come file tiff a 16 bit in una directory. Denominare i file utilizzando la convenzione di denominazione XXXcYYzZZ.tif, dove XXX è la lunghezza d'onda di eccitazione, YY è il numero del canale del rivelatore, ZZ è il numero Z-slice e "c" e "z" sono prefissi per il numero del rivelatore e il numero Z-slice, rispettivamente.
- Ad esempio, se un'immagine di microspettroscopia confocale multicanale viene scattata con una lunghezza d'onda di eccitazione di 405 nm, 1 ° canale del rivelatore dell'array di rivelatori, ed è la quinta fetta dello stack Z, denominarla "405c01z05.tif". Per le immagini CRM, utilizzare la stringa "CRM" al posto di XXX (ad esempio, "CRMc01z05.tif").
NOTA: decidere se la segmentazione 2D o 3D è più adatta per i dati dell'immagine. Utilizzare un metodo di segmentazione 2D in situazioni in cui le piccole cellule sono vincolate a un piano 2D (ad esempio, la popolazione batterica che aderisce a una superficie di vetro). Utilizzare il metodo di segmentazione 3D in situazioni in cui la popolazione cellulare è distribuita in uno spazio tridimensionale (ad esempio, biofilm e campioni di tessuto) o le dimensioni delle cellule sono maggiori dello spessore della fetta ottica (ad esempio, cellule di lievito, cellule di mammifero). Per la segmentazione 2D fare riferimento alla sezione 4; per la segmentazione 3D, fare riferimento alla sezione 5.
- Ad esempio, se un'immagine di microspettroscopia confocale multicanale viene scattata con una lunghezza d'onda di eccitazione di 405 nm, 1 ° canale del rivelatore dell'array di rivelatori, ed è la quinta fetta dello stack Z, denominarla "405c01z05.tif". Per le immagini CRM, utilizzare la stringa "CRM" al posto di XXX (ad esempio, "CRMc01z05.tif").
4. Analisi delle immagini 2D
- Dotare una workstation di un software di analisi delle immagini (ad esempio, MATLAB).
- Eseguire la segmentazione cellulare e la ricostruzione delle firme di fluorescenza innata a singola cellula.
- Aprire il software di analisi delle immagini.
- Fare doppio clic e aprire uno degli script forniti "Script2D.m".
- Vai alla scheda Editor , quindi fai clic su Esegui. Dovrebbe apparire una finestra di selezione della cartella.
- Selezionare la directory creata nel passaggio 3.8, quindi fare clic su Apri per procedere. Verrà visualizzata automaticamente una finestra di dialogo che richiede l'input del parametro di segmentazione.
NOTA: a scopo di test, selezionare il set di dati fornito ("Sample_2D"). Il set di dati di esempio viene fornito come file compresso e deve essere estratto in anticipo. - Immettere i parametri di segmentazione: Soglia di binarizzazione dell'immagine (0−1) per la binarizzazione dell'immagine = 0,45, Soglia superiore per una regione di cella (in pixel) = 200, Soglia inferiore per una regione di cella (in pixel) = 10 e Il numero di rilevatori = 32. Fare clic su OK per procedere.
NOTA: questi parametri potrebbero richiedere una regolazione in base alla qualità dell'immagine. - Dovrebbe apparire una nuova finestra di immagine che presenta un'immagine CRM. Selezionare un'area di sfondo arbitraria (ad esempio, un'area in cui le celle sono assenti) da utilizzare per la sottrazione dello sfondo. Disegna un rettangolo all'interno dell'immagine CRM trascinando il mouse. Fare doppio clic all'interno dell'area selezionata per confermare la selezione.
- Trovare una nuova directory denominata Firma nella stessa directory selezionata nel passaggio 4.2.4.
NOTA: il codice fornito crea automaticamente questa directory. La directory "Firma" memorizza la firma di fluorescenza innata di ogni cellula microbica all'interno di una popolazione come file .png numerati in serie dopo un prefisso comune "Firma".
5.3D analisi delle immagini
- Dotare una postazione di lavoro del software di analisi delle immagini (Table of Materials).
- Eseguire la segmentazione cellulare e la ricostruzione delle firme di fluorescenza innata a singola cellula.
- Aprire il software di analisi delle immagini.
- Fare doppio clic e aprire lo script fornito "Script3D.m".
- Vai alla scheda Editor , quindi fai clic su Esegui. Dovrebbe apparire una finestra di selezione della cartella.
- Selezionare la directory creata nel passaggio 3.8, quindi fare clic su Apri per procedere. Apparirà automaticamente una finestra di dialogo che richiede l'input dei parametri di segmentazione.
NOTA: a scopo di test, selezionare il set di dati fornito ("Sample_3D"). Il set di dati di esempio viene fornito come file compresso e deve essere estratto in anticipo. - Immettere i parametri di segmentazione: Soglia di binarizzazione dell'immagine (0-1) per la binarizzazione dell'immagine = 0,01, Soglia superiore per un volume di cella (in pixel) = 1.000, Soglia inferiore per una regione di cella (in pixel) = 20, Dimensione pixel X [μm/pixel] = 0,26, Dimensione pixel Y [μm/pixel] = 0,26, Dimensione pixel Z [μm/pixel] = 0,42 e Numero di rilevatori = 32. Fare clic su OK per procedere; verrà visualizzata una finestra di dialogo che richiede l'input per il numero di lunghezze d'onda di eccitazione.
NOTA: questi parametri potrebbero richiedere una regolazione in base alla qualità dell'immagine. - Immettere il numero di lunghezze d'onda utilizzate per l'acquisizione delle immagini (ad esempio, se vengono utilizzati 405, 488, 561, 630, immettere 4 nella finestra di dialogo). Fare clic su OK.
- Immettere le lunghezze d'onda di eccitazione in una sequenza dalla più corta (ad esempio, nome della casella: Eccitazione n. 1) alla lunghezza d'onda più lunga nelle finestre di dialogo. Fare clic su OK per procedere; dovrebbe apparire una nuova finestra di immagine che presenta un'immagine CRM.
- Selezionare l'area di sfondo arbitraria (ad esempio, l'area in cui le celle sono assenti) da utilizzare per la sottrazione dello sfondo. Disegna un rettangolo all'interno dell'immagine CRM trascinando il mouse. Fare doppio clic all'interno dell'area selezionata per confermare la selezione.
- Individuare la directory denominata Firma nella directory selezionata nel passaggio 5.2.4.
NOTA: il codice fornito crea automaticamente questa directory. La directory "Firma" memorizza la firma di fluorescenza innata di ogni singola cellula microbica all'interno di una popolazione come file .png numerati in serie dopo un prefisso comune "Firma".
6. Analisi statistica
NOTA: Eseguire tecniche di riduzione dimensionale (ad esempio, analisi dei componenti principali [PCA]) per visualizzare la distribuzione degli iperspettri delle popolazioni cellulari. Lo script fornito (PCA.py) esegue PCA per due popolazioni di cellule (cioè due classi).
- Dotare una postazione di lavoro del linguaggio di programmazione e delle librerie e dei moduli di accompagnamento (Tabella dei materiali).
- Creare una directory vuota nell'unità C (o equivalente) e denominare la directory "Parent_directory" (ad esempio, C:/ Parent_).
- Memorizzare le firme di fluorescenza (ad esempio, i file di .png generati nel passaggio 4.2.7) di ciascuna delle due popolazioni cellulari in due directory separate.
NOTA: le due directory devono trovarsi entrambe nella "Parent_directory".
C:/Parent_directory/
putidaKT2440/
Firma01.png Firma02.png :putidaKT2442/
Firma01.png
Firma02.png
: - Scarica PCA.py nel "Parent_directory".
- Aprire l'interfaccia della riga di comando della workstation.
- Digita "python C:/Parent_directory/PCA.py" nell'interfaccia della riga di comando.
- Seleziona "Parent_directory" dopo aver visualizzato il messaggio "Seleziona directory di destinazione".
- Nel "C:/Parent_directory", trova "PCA.png", che contiene un grafico PCA risultante.
putidaKT2440/
Firma01.pngSubscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
La Figura 1A mostra la tipica firma di fluorescenza a singola cellula di una cellula batterica presentata come un grafico dello spettro tradizionale (in alto) e come una mappa di calore (al centro). La Figura 1B mostra il risultato di un'accurata segmentazione cellulare 2D sovrapposta all'immagine CRM originale di una popolazione di batteri del suolo (Pseudomonas putida KT2440)12. Le firme di fluorescenza innata risultanti per la popolazione sono presentate come una mappa di calore nella Figura 1D. Si noti che la variabilità intrapopolazione è stata relativamente minore dopo il successo della segmentazione cellulare. Un esempio di segmentazione cellulare imprecisa è mostrato nella Figura 1C, che è sovrapposta alla stessa popolazione di P. putida come mostrato nella Figura 1B. L'impatto di una segmentazione cellulare imprecisa sulle firme di fluorescenza innata della popolazione è facilmente evidente dal considerevole numero di valori anomali (Figura 1E, triangoli rossi). Una segmentazione cellulare imprecisa ha portato a un cluster più libero dopo PCA rispetto al cluster stretto ottenuto a seguito di un'accurata segmentazione cellulare (Figura 1F).
Tipicamente, nonostante la variabilità intraspecie, le firme di fluorescenza innata di diversi tipi di cellule formano cluster distinti. La Figura 2C presenta il risultato delle analisi PCA per una coppia di ceppi tassonomicamente vicini (ceppo P. putida KT2440 e ceppo KT244213). Nonostante la minore variabilità osservata all'interno di ciascuna popolazione separata (Figura 2A,B), ogni popolazione ha formato un cluster distinto sul grafico di analisi PCA (Figura 2C).
La Figura 3A mostra il risultato di un'accurata segmentazione cellulare 3D sovrapposta all'immagine CRM originale di una popolazione di lievito in erba Saccharomyces cerevisiae YM427114. La Figura 3B mostra le firme di fluorescenza innata risultanti per la popolazione.
Figura 1: Accuratezza della segmentazione e apparente variabilità intraspecie. (A) Tipica firma di fluorescenza innata monocellulare di una cellula batterica (P. putida KT2440), presentata come un grafico dello spettro (in alto) e una mappa di calore (al centro). La lunghezza d'onda di emissione è indicata come mappa a colori arcobaleno (in basso). L'asse Y del grafico dello spettro e il colore della mappa di calore indicano entrambi le intensità di fluorescenza relative. I numeri in basso indicano la lunghezza d'onda di eccitazione. Rappresentazione visiva del riconoscimento accurato (B) e impreciso (C) della regione cellulare da parte dell'algoritmo di analisi delle immagini. L'ombreggiatura blu chiaro indica le regioni cellulari rilevate per una popolazione di batterio del suolo P. putida KT 2440. I BLOB con numerazione rossa nel pannello C sono esempi di falso rilevamento, in cui l'algoritmo ha classificato le regioni non cellulari (cioè il rumore di fondo) come regioni di cella a causa di impostazioni di soglia di binarizzazione inappropriate. Barre della scala = 1 μm in tutto. I pannelli D ed E raffigurano le firme di fluorescenza innata per la stessa popolazione, generate rispettivamente con una segmentazione cellulare accurata e imprecisa. Ogni colonna mostra un iperspettro a singola cellula ricostruito presentato come una matrice 1 x 192, dove la mappa dei colori da giallo a blu indica l'intensità relativa della fluorescenza. (F) La varianza delle firme di fluorescenza innate in segmentazioni accurate (azzurro) e imprecise (rosse) visualizzate utilizzando PCA. Ogni etichetta dell'asse indica il numero del componente e il suo contributo percentuale cumulativo all'analisi PCA. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Variabilità intra- e interspecie delle firme di fluorescenza innata. Firme di fluorescenza innata presentate come mappe di calore per una popolazione di P. putida KT2440 (A) e P. putida KT2442 (B). (C) Proiezione delle due coppie di firme di fluorescenza innata visualizzate utilizzando PCA, corrispondenti a P. putida KT2440 (rosso, n = 288) e P. putida KT2442 (blu, n = 373). Gli assi X e Y rappresentano rispettivamente PC1 e PC2. Il numero di inserto indica il centro di ogni cluster (1: P. putida KT2440, 2: P. putida KT2442). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Esempio di segmentazione 3D ed estrazione della firma a fluorescenza innata. (A) Proiezione 3D di regioni riconosciute come popolazioni cellulari di lievito in erba S. cerevisiae YM4271. I numeri inseriti sono i numeri di identificazione. (B) Mappa termica delle firme di fluorescenza innata estratte dalle regioni 3D. Il numero dell'asse X corrisponde al numero di identificazione. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ci sono due punti critici in questo metodo che devono essere seguiti da vicino per ottenere risultati riproducibili: 1) mantenere coerente la potenza del laser sotto l'obiettivo del microscopio attraverso lunghezze d'onda di eccitazione ed esperimenti e 2) eseguire un'accurata segmentazione cellulare.
Il primo punto è particolarmente importante quando si confronta la firma di fluorescenza innata tra diversi esperimenti. Evita di applicare semplicemente le stesse impostazioni di "uscita percentuale" alle lunghezze d'onda di eccitazione (ad esempio, utilizzando il 5% di potenza in uscita per tutte le linee laser 405, 488, 514 e 530 nm), perché la potenza massima in uscita può differire fino a un ordine di grandezza tra le linee laser. Inoltre, l'obiettivo e l'ottica interna di solito hanno caratteristiche di assorbimento ottico non uniformi, che devono anche essere prese in considerazione. Per questi motivi, si consiglia di misurare effettivamente l'uscita sotto l'obiettivo utilizzando un misuratore di potenza laser (Tabella dei materiali). Si consiglia inoltre di effettuare questa misurazione ogni pochi esperimenti, o periodicamente, perché l'output dalle linee laser può decadere significativamente in pochi anni.
Il secondo punto, l'accurata segmentazione cellulare, diventa particolarmente importante in situazioni in cui la variabilità intra o interspecie è una preoccupazione. Una segmentazione cellulare imprecisa (Figura 1D) si traduce in punti di dati anomali (Figura 1E, indicati da triangoli rossi) e una maggiore variabilità apparente intraspecie. I parametri di segmentazione devono essere determinati con attenzione, controllando l'accuratezza della segmentazione cellulare sovrapponendo i risultati della segmentazione sull'immagine CRM originale, prima di procedere a qualsiasi ulteriore analisi o addestramento dei modelli di apprendimento automatico. Se si lavora con un'immagine di scarsa qualità, potrebbe essere necessaria un'ulteriore elaborazione delle immagini per ottenere una segmentazione accurata. L'utilizzo di un "filtro gaussiano" o di un "filtro mediano" può rimuovere artefatti granulosi e l'elaborazione bilaterale del filtro contrasta qualsiasi sfondo a strisce.
Con un'ottica di scarsa qualità (ad esempio, un obiettivo di grado non confocale) o una sensibilità del rivelatore insufficiente, affrontare il rilevamento di deboli firme di fluorescenza innata potrebbe essere difficile. Si noti che utilizzando la configurazione descritta qui e in precedenza11, non abbiamo riscontrato alcun tipo di campione cellulare la cui fluorescenza innata era troppo debole per ricostruire una firma di fluorescenza innata. Sebbene sia possibile utilizzare una maggiore emissione per l'eccitazione e un tempo di permanenza dei pixel più lungo per ottenere segnali di emissione più forti, ciò può causare danni ai campioni cellulari. Una potenziale soluzione per i casi in cui la debole fluorescenza innata è un problema è ridurre l'intensità del segnale di fondo, ad esempio sospendendo le cellule in tampone o mezzi sintetici invece di brodo. I tipi di contenitori cellulari, come i piatti con fondo di vetro e i dispositivi microfluidici, sono compatibili e appropriati per questa tecnica, sebbene una lastra di agarosio sia stata utilizzata per mantenere le cellule in posizione qui e in uno studio precedente15.
Il metodo del microscopio confocale offre risoluzione spaziale e analisi in situ per popolazioni cellulari aderenti, biofilm e campioni di tessuto. Un potenziale compromesso di questa metodologia è il massimo throughput rispetto a un citometro a flusso, per esempio. Un set completo di scansioni confocali che raccolgono da poche centinaia a mille firme di fluorescenza innata con un singolo set di scansioni può richiedere fino a pochi minuti. Un citometro a flusso è meno sensibile a causa del suo design ottico, ma può potenzialmente raggiungere un throughput di diversi ordini di grandezza maggiore.
Identificare rigorosamente un composto responsabile di un picco specifico in una firma fluorescente innata è in genere impegnativo, a causa della sua natura complicata. Tuttavia, è stato suggerito che un certo numero di molecole biologicamente rilevanti, come le vitamine (ad esempio, flavina adenina dinucleotide [FAD]), coenzimi (ad esempio, nicotinamide adenina dinucleotide [NADH]) e pigmenti di lipofuscina potrebbero essere i principali fluorofori nelle cellule1,16. Ad esempio, FAD ha un massimo di eccitazione compreso tra 350-450 nm e un picco di emissione a circa 525 nm16. Il NADH libero ha un massimo di eccitazione e un picco di emissione a 340 nm e 460 nm, rispettivamente, sebbene gli spettri di emissione del NADH legato alle proteine differiscano16,17,18. I lipogeni che sono noti per associarsi a cellule stressate o invecchiate hanno un ampio intervallo di eccitazione (350-500 nm) e un intervallo di emissione (450-600 nm)16,18.
L'uso del CRM offre una fonte indipendente di informazioni per identificare i contorni cellulari e quindi fornisce un altro vantaggio significativo del CRIF: l'estrazione selettiva dei segnali di fluorescenza da singole cellule distribuite in uno spazio 3D. Ciò rappresenta un passo avanti rispetto all'analisi tradizionale delle caratteristiche di fluorescenza di un'intera colonia microbica o di una sospensione di coltura di massa, che è una miscela media di segnali provenienti da un vasto numero di cellule contaminate da segnali non cellulari provenienti da componenti medi, metaboliti secreti e matrici extracellulari. Un'analisi delle firme di fluorescenza innata monocellulare consente la caratterizzazione predittiva dello stato fisiologico delle cellule intatte, fornendo una potenziale soluzione per risolvere lo sviluppo temporale della distribuzione e dello stato fisiologico di una cellula.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Questo studio è stato sostenuto in parte da una sovvenzione per la ricerca scientifica dal Ministero dell'Istruzione, della Cultura, dello Sport e della Tecnologia del Giappone (18K04843) a Y. Yawata, dal JST ERATO (JPMJER1502) a N. Nomura.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose | Wako Chemicals | 312-01193 | |
| Beam splitters | Carl Zeiss, Nikon | MBSInVis405, MBS458, MBS488, MBS458/514, MBS488/543, or MBS 488/543/633 beam splitters (Carl Zeiss) | |
| Confocal microscope | Carl Zeiss, Nikon | Model LSM 880 (Carl Zeiss), Model A1R (Nikon) | |
| Cover slips | Matsunami Glass | C024601 | |
| Glass slides | Matsunami Glass | S011120 | |
| Half-reflection mirror | Carl Zeiss, Nikon | NT80/20 | |
| Laser power meter | Thorlabs | PM400 (power meter console) and S175C (sensor) | |
| LB Broth | Nacalai tesque | 20066-95 | For bacteria culture |
| Image analysis software | The MathWorks | MATLAB version 2019a or later, Image Processing Toolbox is needed | |
| Microscope objective | Carl Zeiss, Nikon | 440762-9904 | e.g. 63x plan Apochomat NA = 1.4 (Carl Zeiss) |
| Microscope software | Carl Zeiss, Nikon | ZEN (Carl Zeiss),NIS-elements (Nikon) | |
| PBS(-) | Wako Chemicals | 166-23555 | |
| Programming language | Python and libraries, modules (numpy, scikit-learn, scikit-image, os, glob, matplotlib, tkinter) are rquired to run the supplied PCA script. | ||
| Silicone gasket | ThermoFisher Scientific | P24744 | |
| Workstation | A high-performance workstation with discrete GPUs is recommended. | ||
| Yeast extract-peptone-dextrose (YPD) agar medium | Sigma-Aldrich | Y1500-250G | For yeast culture |
| YPD medium | Sigma-Aldrich | Y1375-250G |
References
- Monici, M. Cell and tissue autofluorescence research and diagnostic applications. Biotechnology Annual Review. 11, 227-256 (2005).
- Tang, J. Microbial metabolomics. Current Genomics. 12, 391-403 (2011).
- Woo, P. C., Lau, S. K., Teng, J. L., Tse, H., Yuen, K. Y. Then and now: use of 16S rDNA gene sequencing for bacterial identification and discovery of novel bacteria in clinical microbiology laboratories. Clinical Microbiology and Infection. 14, 908-934 (2008).
- Amman, R., Fuchs, B. M. Single-cell identification in microbial communities by improved fluorescence in situ hybridization techniques. Nature Reviews Microbiology. 6, 339-348 (2008).
- Giana, H. E., Silveira, L., Zângaro, R. A., Pacheco, M. T. T. Rapid identification of bacterial species by fluorescence spectroscopy and classification through principal components analysis. Journal of Fluorescence. 13 (6), 489-493 (2003).
- Leblanc, L., Dufour, E. Monitoring the identity of bacteria using their intrinsic fluorescence. FEMS Microbiology Letters. 211 (2), 147-153 (2002).
- Hou, X., Liu, S., Feng, Y. The autofluorescence characteristics of bacterial intracellular and extracellular substances during the operation of anammox reactor. Scientific Reports. 7, 39289 (2017).
- Ramanujam, N., et al. In vivo diagnosis of cervical intraepithelial neoplasia using 337-nm-excited laser-induced fluorescence. Proceeding National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (21), 10193-10197 (1994).
- Zhang, J. C., et al. Innate cellular fluorescence reflects alterations in cellular proliferation. Lasers in Surgery and Medicine. 20 (3), 319-331 (1997).
- Gosnell, M. E., et al. Quantitative non-invasive cell characterisation and discrimination based on multispectral autofluorescence features. Scientific Reports. 6, 23453 (2016).
- Yawata, Y., et al. Intra- and interspecies variability of single-cell innate fluorescence signature of microbial cell. Applied and Environmental Microbiology. 85, 00608-00619 (2019).
- Nelson, K. E., et al. Complete genome sequence and comparative analysis of the metabolically versatile Pseudomonas putida KT2440. Environmental Microbiology. 4 (12), 799-808 (2002).
- Bagdasarian, M., et al. Specific-purpose plasmid cloning vectors. II. Broad host range, high copy number, RSF1010-derived vectors, and a host-vector system for gene cloning in Pseudomonas. Gene. 16 (1-3), 237-247 (1981).
- Luo, Y., Vijaychander, S., Stile, J., Zhu, L. Cloning and analysis of DNA-binding proteins by yeast one-hybrid and one-two-hybrid systems. Biotechniques. 20 (4), 564-568 (1996).
- Yawata, Y., et al. Monitoring biofilm development in a microfluidic device using modified confocal reflection microscopy. Journal of Bioscience and Bioengineering. 110 (3), 377-380 (2010).
- Lakowicz, J. R. Principles of Fluorescence Spectroscopy. Third edition. , Springer. Germany. (2006).
- Blacker, T. S., Duchen, M. R. Investigating mitochondrial redox state using NADH and NADPH autofluorescence. Free Radical Biology & Medicine. 100, 53-65 (2016).
- Croce, A. C., Bottiroli, G. Autofluorescence spectroscopy and imaging: A tool for biomedical research and diagnosis. European Journal of Histochemistry. 58 (4), 2461 (2014).
