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Biology

通过共聚焦显微镜重建单细胞先天荧光特征

Published: May 27, 2020 doi: 10.3791/61120
* These authors contributed equally

Summary

在这里,提出了一种方案,用于光学提取和编目来自分布在三维空间中的每个个体活细胞的先天细胞荧光特征(即细胞自发荧光)。该方法适用于以单细胞分辨率研究各种生物系统的先天荧光特征,包括来自细菌,真菌,酵母,植物和动物的细胞。

Abstract

这里描述的是共聚焦反射显微镜辅助的单细胞先天荧光分析(CRIF),这是一种微创方法,用于重建分布在三维(3D)空间中的群体中每个个体活细胞的先天细胞荧光特征。细胞的先天荧光特征是由细胞内各种生物分子发出的荧光信号的集合。先前的研究表明,先天荧光特征反映了各种细胞特性和生理状态的差异,是细胞表征和鉴定的丰富信息来源。传统上,先天荧光特征是在群体水平上进行分析的,需要克隆培养,但不是在单细胞水平上。CRIF特别适用于需要3D分辨率和/或选择性提取单个细胞荧光信号的研究。由于荧光特征是细胞的先天特性,CRIF也适用于完整和单个细胞的类型和/或生理状态的无标记预测。这种方法可能是简化细胞分析的强大工具,其中异质性群体中每个单个细胞的表型可以在显微镜下通过其自发荧光特征直接评估,而无需细胞标记。

Introduction

cell1内的各种生物分子发出自发荧光信号,细胞的先天荧光特征由这些信号的组装组成。这种特征性荧光反映了各种细胞特性以及生理状态的差异。先天荧光的分析是微创的,可以补充传统的,更具侵入性的微生物探针,这些探针会留下从轻度代谢修饰到完全细胞破坏的一系列痕迹。虽然DNA或细胞含量提取23,荧光原位杂交4以及将荧光报告基因引入基因组等传统技术可有效确定细胞类型或生理状态,但它们通常需要对细胞进行操作或侵入性标记。

对各种活的和完整的微生物菌落的先天荧光的研究表明,包括散装微生物培养悬浮液56,活性污泥7,哺乳动物组织89和哺乳动物细胞110,先天荧光分析有助于对细胞类型和生理状态进行无标记分析。传统上,先天荧光特征是在群体水平上而不是在单细胞水平上进行分析的,因此需要克隆培养。相比之下,此处描述的食性反射显微镜辅助单细胞无光泽分析(CRIF)技术11重建并编目了每个活微生物细胞的先天细胞荧光特征。此外,CRIF可以系统地整理分布在三维(3D)空间中的群体中单个微生物细胞的先天荧光特征。

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Protocol

1. 样品的制备

  1. 将带有孔的1毫米厚硅胶垫圈放在载玻片上。
  2. 将1毫米厚的0.8%(w / v)琼脂糖板坯放在硅胶垫圈的孔中。
  3. 将任意微生物细胞培养物的细胞密度稀释至600nm(OD660)= 1.0的光密度。
  4. 将5μL等分试样的细胞悬浮液放在琼脂糖板上。
  5. 用玻璃盖板轻轻盖住。

2. 显微镜的设置

注意:CRIF技术结合了共聚焦反射显微镜(CRM)和多通道共聚焦显微光谱。CRM是细胞形态学和空间定位的信息来源,其独立于细胞先天荧光。多通道共聚焦显微光谱提供细胞先天荧光的光谱信息。在下面的协议中,使用CRM或共聚焦荧光显微光谱学获取的任何图像分别称为CRM图像或多通道共聚焦显微光谱图像。

  1. 将具有去扫描光谱通道的共聚焦显微镜连接到光电倍增管(PMT)或GaAsP检测器。
    注:这些设置可从多家制造商处获得。
  2. 为显微镜配备具有足够放大倍率的高数值孔径(NA)物镜。
    注意:建议使用 NA > 1.4 的 63x 物镜来分析细菌细胞。
  3. 为显微镜配备半反射镜(例如NT 80/20)以适应CRM,CRM依靠入射光的细胞散射来可视化细胞形态。
  4. 对于多通道共聚焦显微光谱,请为显微镜配备二向色镜。例如,将 MBS InVis405、MBS458、MBS488、MBS458/514、MBS488/543 或 MBS 488/543/633 分束器分别用于 405、458、488、514、543 或 633 nm 激发。
  5. 使用激光功率计调整每个激发波长的照明强度。通过激发波长保持显微镜下的输出恒定(例如,使用63x物镜使用50μW)。

3. 图像采集

  1. 使用显微镜软件将针孔尺寸设置为1 AU。
  2. 设置每个激发波长的像素停留时间(即扫描速度)。
    注意:过长的像素停留时间会损坏细胞。避免过长的像素停留时间,以最大限度地减少对细胞的光损伤。对于细菌样品,像素停留时间<55.6 μs/μm2 (当显微镜下的辐照度输出为~17 μW/cm2时)通常适合于避免生长抑制。该参数可能因生物体和实验装置而异。
  3. 设置扫描分辨率。对于细菌等小细胞,请使用 1,024 x 1,024 的扫描区域。
  4. 设置 Z 轴扫描范围,以便覆盖感兴趣的区域。
    注意:对于分布在琼脂糖板上的细菌和酵母细胞样品,Z扫描范围通常为〜15μm就足够了。
  5. 设置去扫描探测器以捕获可见光波长范围(例如,416−691 nm)。使用8−10 nm的光谱窗口。
  6. 以从最长到最短激发波长的顺序获取多通道共聚焦显微光谱图像,以创建荧光图像的Z层。
  7. 获取 CRM 映像。
  8. 将采集的图像作为 16 位 tiff 文件保存到目录中。使用命名约定 XXXcYYzZZ.tif 命名文件其中 XXX 是激发波长,YY 是探测器通道数,ZZ 是 Z 切片数,"c"和"z"分别是探测器编号和 Z 切片编号的前缀。
    1. 例如,如果使用激发波长为405nm的多通道共聚焦显微光谱图像,探测器阵列的第 1个探测器通道拍摄,并且是Z-stack的第 5个切片,请将其命名为"405c01z05.tif"。对于 CRM 图像,请使用字符串"CRM"代替 XXX(例如,"CRMc01z05.tif")。
      注: 确定 2D 分割还是 3D 分割最适合图像数据。在小细胞被限制在2D平面(例如,粘附在玻璃表面上的细菌群)的情况下,使用2D分割方法。在细胞群分布在三维空间中(例如,生物膜和组织样品)或细胞大小大于光学切片厚度(例如,酵母细胞,哺乳动物细胞)的情况下,使用3D分割方法。对于2D分割,请参阅第4节;有关 3D 分割,请参阅第 5 节。

4. 二维图像分析

  1. 为工作站配备图像分析软件(例如 MATLAB)。
  2. 对单细胞先天荧光特征进行细胞分割和重建。
    1. 打开图像分析软件。
    2. 双击并打开提供的脚本之一"Script2D.m"。
    3. 转到 编辑器 选项卡,然后单击 运行。应出现一个文件夹选择窗口。
    4. 选择在步骤 3.8 中创建的目录,然后单击" 打开 "继续。将自动出现一个对话框,提示输入分割参数。
      注意:出于测试目的,请选择提供的数据集("Sample_2D")。示例数据集以压缩文件的形式提供,应提前提取。
    5. 输入分割参数: 图像二值化的图像二值化阈值 (0−1) = 0.45单元区域阈值上限(以像素为单位) = 200单元区域阈值下限(以像素为单位) = 10 检测器数量 = 32。单击 "确定" 继续。
      注:这些参数可能需要根据图像质量进行调整。
    6. 应出现一个显示 CRM 图像的新图像窗口。选择任意背景区域(即单元格不存在的区域)以用于背景减法。通过拖动鼠标在 CRM 图像中绘制一个矩形。在所选区域内双击以确认选择。
    7. 在步骤 4.2.4 中选择的同一目录中查找名为 Signature 的新目录。
      注意:提供的代码会自动创建此目录。"Signature"目录将群体中每个微生物细胞的先天荧光特征存储为.png文件,这些文件在通用前缀"Signature"之后按顺序编号。

5.3D 图像分析

  1. 为工作站配备图像分析软件(材料表)。
  2. 对单细胞先天荧光特征进行细胞分割和重建。
    1. 打开图像分析软件。
    2. 双击并打开提供的脚本"Script3D.m"。
    3. 转到 编辑器 选项卡,然后单击 运行。应出现一个文件夹选择窗口。
    4. 选择在步骤 3.8 中创建的目录,然后单击" 打开 "继续。将自动出现一个对话框,提示输入分割参数。
      注意:出于测试目的,请选择提供的数据集("Sample_3D")。示例数据集以压缩文件的形式提供,应提前提取。
    5. 输入分割参数: 图像二值化的图像二值化阈值 (0–1) = 0.01像元体积阈值(以像素为单位) = 1,000像元区域下限阈值(以像素为单位) = 20X 像素大小 [μm/像素] = 0.26Y 像素大小 [μm/像素] = 0.26Z 像素大小 [μm/像素] = 0.42 检测器数量 = 32。点击 确定 继续;将出现一个对话框,提示输入激发波长的数量。
      注:这些参数可能需要根据图像质量进行调整。
    6. 输入用于图像采集的波长数(例如,如果使用405、488、561、630,则在对话框中输入 4 )。单击" 确定"
    7. 在对话框中按从最短波长(即框名称: 激发 1 号)到最长波长的顺序输入激发波长。点击 确定 继续;应该会弹出一个显示CRM图像的新图像窗口。
    8. 选择要用于背景减法的任意背景区域(即单元格不存在的区域)。通过拖动鼠标在 CRM 图像中绘制一个矩形。在所选区域内双击以确认选择。
    9. 在步骤 5.2.4 中选择的目录中找到名为 Signature 的目录。
      注意:提供的代码会自动创建此目录。"Signature"目录将群体中每个单个微生物细胞的先天荧光特征存储为.png文件,这些文件在通用前缀"Signature"之后按顺序编号。

6. 统计分析

注意:执行降维技术(例如,主成分分析[PCA])以可视化细胞群高光谱的分布。提供的脚本(PCA.py)为两个细胞群(即两个类)执行PCA。

  1. 为工作站配备编程语言以及随附的库和模块(材料表)。
  2. 在C驱动器(或等效驱动器)中创建一个空目录,并将该目录命名为"Parent_directory"(即C:/Parent_目录)。
  3. 将两个细胞群中每个细胞群的荧光特征(例如,在步骤4.2.7中生成的.png文件)存储到两个单独的目录中。
    注意:这两个目录应都位于"Parent_directory"中。

    C:/Parent_directory/
    image 12普蒂达KT2440/
    image 13 image 9签名01.png
    image 14 image 10签名02.png
    image 4 image 11:
    image 5普蒂达KT2442/
     image 6签名01.png
     image 7签名02.png
     image 8:
  4. 将 PCA.py 下载到"Parent_directory"中。
  5. 打开工作站的命令行界面。
  6. 在命令行界面中键入"python C:/Parent_directory/PCA.py"。
  7. 在显示消息"选择目标目录"后选择"Parent_directory"。
  8. 在"C:/Parent_directory"中,找到"PCA.png",其中包含生成的 PCA 图。

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Representative Results

图1A显示了细菌细胞的典型单细胞荧光特征,以传统光谱图(顶部)和热图(中间)的形式呈现。图1B显示了叠加在土壤细菌群的原始CRM图像上的精确2D细胞分割的结果(假单胞菌KT2440)12。由此产生的群体先天荧光特征在图1D中以热图的形式呈现。请注意,在成功进行细胞分割后,种群内的变异性相对较小。不准确的细胞分割示例如图1C所示,其叠加到如图1B所示的相同P. putida群体上。不准确的细胞分割对群体先天荧光特征的影响从大量异常值中显而易见(图1E,红色三角形)。与精确细胞分割后获得的紧密簇相比,不准确的细胞分割导致PCA后更松散的簇(图1F)。

通常,尽管种内存在变异性,但不同细胞类型的先天荧光特征形成不同的簇。图2C显示了分类学上接近的菌株对(P. putida菌株KT2440和菌株KT244213)的PCA分析结果。尽管在每个单独的总体中观察到微小的变异性(图2AB),但每个总体在PCA分析图上形成了一个不同的聚类(图2C)。

图3A显示了叠加在酿酒酵母YM427114芽酵母群的原始CRM图像上的精确3D细胞分割的结果。图3B显示了由此产生的群体的先天荧光特征。

Figure 1
图1:分割的准确性和明显的种内变异性。A)细菌细胞的典型单细胞先天荧光特征(P. putida KT2440),以光谱图(顶部)和热图(中间)表示。发射波长表示为彩虹色图(底部)。光谱图的Y轴和热图的颜色都表示相对荧光强度。底部的数字表示激发波长。通过图像分析算法识别准确(B)和不准确(C)细胞区域的可视化表示。浅蓝色阴影表示为土壤细菌 P. putida KT 2440 群体检测到的细胞区域。面板 C 中带有红色编号的 Blob 是错误检测的示例,其中算法由于不适当的二值化阈值设置而将非像元区域(即背景噪声)分类为像元区域。比例尺 = 1 μm。图DE描绘了同一群体的先天荧光特征,分别通过准确和不准确的细胞分割生成每列显示重建的单细胞高光谱,呈现为1 x 192基质,其中黄色至蓝色的色图表示相对荧光强度。(F)使用PCA可视化的准确(浅蓝色)和不准确(红色)分割中先天荧光特征的方差。每个轴标签表示组件编号及其对 PCA 分析的累积百分比贡献。请点击此处查看此图的放大版本。

Figure 2
图2:先天荧光特征的种内和种间变异性。先天荧光特征以P. putida KT2440(A)和P. putida KT2442(B)种群的热图表示。(C)使用PCA可视化的两个先天荧光特征对的投影,对应于P. putida KT2440(红色,n = 288)和P. putida KT2442(蓝色,n = 373)。X 轴和 Y 轴分别代表 PC1 和 PC2。插图号表示每个簇的中心(1:P. putida KT2440,2:P. putida KT2442)。请点击此处查看此图的放大版本。

Figure 3
图3:3D分割和先天荧光特征提取的示例。 A)对被识别为酿酒母萌芽酵母YM4271细胞群的区域进行3D投影。插页码是标识号。(B)从3D区域提取的先天荧光特征的热图。X 轴编号对应于标识号。请点击此处查看此图的放大版本。

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Discussion

该方法中有两个关键点需要密切关注以获得可重复的结果:1)通过激发波长和实验保持显微镜物镜下的激光功率输出一致,以及2)执行准确的细胞分割。

在比较不同实验之间的先天荧光特征时,第一点尤其重要。避免简单地将相同的"百分比输出"设置应用于激发波长(即,对所有405、488、514和530 nm激光线使用5%功率输出),因为激光线之间的最大功率输出差异可达一个数量级。此外,物镜和内部光学通常具有不均匀的光学吸收特性,这也需要考虑在内。出于这些原因,建议使用激光功率计(材料表)实际测量物镜下的输出。还建议每隔几次实验或定期进行这种测量,因为激光线的输出会在几年内显着衰减。

第二点,准确的细胞分割,在关注种内或种间变异性的情况下变得尤为重要。不准确的细胞分割(图1D)导致异常值数据点(图1E,由红色三角形表示)和更大的明显种内变异性。在进行任何进一步的分析或训练机器学习模型之前,应仔细确定分割参数,通过将分割结果叠加到原始CRM图像上来检查像元分割的准确性。如果处理质量较差的图像,则可能需要额外的图像处理才能实现准确的分割。使用"高斯滤光片"或"中值滤光片"可以去除颗粒状伪影,并且双边滤镜处理可以抵消任何条纹背景。

对于质量较差的光学元件(例如,非共聚焦级物镜)或检测器灵敏度不足,处理微弱先天荧光特征的检测可能具有挑战性。请注意,使用此处和之前描述的设置11,我们没有遇到任何类型的细胞样品,其先天荧光太微弱而无法重建先天荧光特征。虽然更高的激励发射输出和更长的像素停留时间可用于获得更强的发射信号,但这可能会对电池样品造成损坏。对于微弱的先天荧光是一个问题,一种潜在的解决方案是降低背景信号强度,例如通过将细胞悬浮在缓冲液或合成培养基而不是肉汤中。细胞容器的类型,如玻璃底培养皿和微流体装置,与该技术相容且适用,尽管琼脂糖板用于将细胞保留在这里和先前的研究中15

共聚焦显微镜方法为贴壁细胞群、生物膜和组织样品提供空间分辨率和原位分析。例如,这种方法的一个潜在权衡是与流式细胞仪相比的最大通量。一组完整的共聚焦扫描通过一组扫描收集几百到一千个先天荧光特征可能需要几分钟的时间。流式细胞仪由于其光学设计而灵敏度较低,但可以潜在地实现高出几个数量级的通量。

由于其复杂性,严格鉴定负责先天荧光特征中特定峰的化合物通常具有挑战性。然而,已经提出许多生物学相关分子,如维生素(例如,黄素腺嘌呤二核苷酸[FAD]),辅酶(例如,烟酰胺腺嘌呤二核苷酸[NADH])和脂褐素色素可能是细胞中的主要荧光团116。例如,FAD的激发最大值在350-450 nm之间,发射峰值约为525 nm16。游离NADH的激发最大值和发射峰分别为340 nm和460 nm,尽管蛋白质结合的NADH的发射光谱不同161718。已知与受压或老化细胞相关的脂质色素具有广泛的激发范围(350-500nm)和发射范围(450-600nm)1618

CRM的使用提供了一个独立的信息来源来识别细胞轮廓,因此提供了CRIF的另一个显着优势:从分布在3D空间中的单个细胞中选择性提取荧光信号。这代表了对整个微生物菌落或体培养悬浮液的荧光特性的传统分析向前迈出的一步,后者是来自大量细胞的信号的平均混合物,这些信号被来自培养基成分,分泌的代谢物和细胞外基质的非细胞信号污染。 对单细胞先天荧光特征的分析可以预测完整细胞的生理状态,为解决细胞分布和生理状态的时间发展提供潜在的解决方案。

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Disclosures

作者没有什么可透露的。

Acknowledgments

这项研究得到了日本文部科学省(18K04843)向Y. Yawata,JST ERATO(JPMJER1502)到N. Nomura的科学研究资助的部分支持。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agarose Wako Chemicals 312-01193
Beam splitters Carl Zeiss, Nikon MBSInVis405, MBS458, MBS488, MBS458/514, MBS488/543, or MBS 488/543/633 beam splitters (Carl Zeiss)
Confocal microscope Carl Zeiss, Nikon Model LSM 880 (Carl Zeiss), Model A1R (Nikon)
Cover slips Matsunami Glass C024601
Glass slides Matsunami Glass S011120
Half-reflection mirror Carl Zeiss, Nikon NT80/20
Laser power meter Thorlabs PM400 (power meter console) and S175C (sensor)
LB Broth Nacalai tesque 20066-95 For bacteria culture
Image analysis software The MathWorks MATLAB version 2019a or later, Image Processing Toolbox is needed
Microscope objective Carl Zeiss, Nikon 440762-9904 e.g. 63x plan Apochomat NA = 1.4 (Carl Zeiss)
Microscope software Carl Zeiss, Nikon ZEN (Carl Zeiss),NIS-elements (Nikon)
PBS(-) Wako Chemicals 166-23555
Programming language Python and libraries, modules (numpy, scikit-learn, scikit-image, os, glob, matplotlib, tkinter) are rquired to run the supplied PCA script.
Silicone gasket ThermoFisher Scientific P24744
Workstation A high-performance workstation with discrete GPUs is recommended.
Yeast extract-peptone-dextrose (YPD) agar medium Sigma-Aldrich Y1500-250G For yeast culture
YPD medium Sigma-Aldrich Y1375-250G

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References

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Tags

生物学,第159期,共聚焦显微镜,光谱学,自发荧光,单细胞分析,先天荧光,共聚焦反射显微镜,共聚焦显微光谱,微生物学,无标签分析,微创分析
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Hirayama, T., Takabe, K., Kiyokawa,More

Hirayama, T., Takabe, K., Kiyokawa, T., Nomura, N., Yawata, Y. Reconstruction of Single-Cell Innate Fluorescence Signatures by Confocal Microscopy. J. Vis. Exp. (159), e61120, doi:10.3791/61120 (2020).

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