Summary
Aqui, é apresentado um protocolo para extração óptica e catalogação de assinaturas de fluorescência celular inata (ou seja, autofluorescência celular) de cada célula viva individual distribuída em um espaço tridimensional. Este método é adequado para estudar a assinatura de fluorescência inata de diversos sistemas biológicos em uma resolução unicelular, incluindo células de bactérias, fungos, leveduras, plantas e animais.
Abstract
Descrito aqui é a análise de fluorescência unicelular assistida por microscopia de reflexão confocal (CRIF), um método minimamente invasivo para reconstruir a assinatura de fluorescência celular inata de cada célula viva individual em uma população distribuída em um espaço tridimensional (3D). A assinatura de fluorescência inata de uma célula é uma coleção de sinais de fluorescência emitidos por várias biomoléculas dentro da célula. Estudos anteriores estabeleceram que as assinaturas de fluorescência inata refletem várias propriedades celulares e diferenças no estado fisiológico e são uma rica fonte de informação para caracterização e identificação celular. As assinaturas de fluorescência inata têm sido tradicionalmente analisadas no nível populacional, necessitando de uma cultura clonal, mas não no nível de célula única. O CRIF é particularmente adequado para estudos que requerem resolução 3D e/ou extração seletiva de sinais de fluorescência de células individuais. Como a assinatura de fluorescência é uma propriedade inata de uma célula, o CRIF também é adequado para a previsão livre de tags do tipo e/ou status fisiológico de células intactas e únicas. Este método pode ser uma ferramenta poderosa para análise celular simplificada, onde o fenótipo de cada célula em uma população heterogênea pode ser diretamente avaliado por sua assinatura de autofluorescência sob um microscópio sem marcação celular.
Introduction
Diversas biomoléculas dentro de uma célula1 emitem sinais de autofluorescência, e a assinatura de fluorescência inata de uma célula consiste na montagem desses sinais. Essa fluorescência de assinatura reflete várias propriedades celulares e também diferenças no estado fisiológico. A análise da fluorescência inata é minimamente invasiva e pode complementar sondas microbiológicas tradicionais e mais invasivas que deixam uma gama de vestígios desde modificações metabólicas leves até destruição celular completa. Enquanto técnicas tradicionais como extração de DNA ou conteúdo celular2,3, hibridização fluorescente in situ4, e a introdução de genes repórteres fluorescentes ao genoma são eficazes na determinação do tipo celular ou status fisiológico, eles geralmente requerem manipulação das células ou marcação invasiva.
Estudos da fluorescência inata de várias colônias microbianas vivas e intactas, incluindo suspensões de cultura microbiana a granel5,6, lodo ativo7, tecidos mamíferos8,9 e células mamíferas1,10, mostraram que a análise de fluorescência inata facilita a análise livre de etiquetas de tipos celulares e status fisiológico. As assinaturas de fluorescência inata têm sido tradicionalmente analisadas no nível populacional e não no nível de célula única, e, portanto, necessitam de uma cultura clonal. Em contraste, a técnica de análise de fluorescência unicelular assistida por microscopia confocal (CRIF) descrita aqui reconstrói e cataloga a assinatura de fluorescência celular inata de cada célula microbiana viva individual. Além disso, o CRIF pode sistematicamente reunir a assinatura de fluorescência inata de uma única célula microbiana dentro de uma população que é distribuída em um espaço tridimensional (3D).
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Protocol
1. Preparação da amostra
- Coloque uma junta de silicone de 1 mm de espessura com poços em uma lâmina de vidro.
- Coloque uma laje de 1 mm de espessura de 0,8% (w/v) no poço da junta de silicone.
- Diluir a densidade celular de uma cultura celular microbiana arbitrária para uma densidade óptica a 600 nm (OD660) = 1,0.
- Coloque uma alíquota de 5 μL de suspensão celular na laje agarose.
- Cubra delicadamente com uma mancha de vidro.
2. Configuração de um microscópio
NOTA: A técnica CRIF combina microscopia de reflexão conocal (CRM) e microspectroscopia confocal multicanal. O CRM serve como fonte de informação para morfologia celular e localização espacial, que é independente da fluorescência inata celular. A microespectroscopia confocal multicanal fornece as informações espectrais da fluorescência inata celular. No protocolo a seguir, qualquer imagem adquirida com crm ou microspectroscopia de fluorescência conocal é referida como uma imagem DE CRM ou imagem microspectroscópcional multicanal, respectivamente.
- Conecte um microscópio confocal com canais espectrais descanned a um tubo fotomultiplier (PMT) ou detector GaAsP.
NOTA: Estas configurações estão disponíveis em vários fabricantes. - Equipar o microscópio com um objetivo de alta abertura numérica (NA) com ampliação adequada.
NOTA: Recomenda-se um objetivo de 63x com na > 1,4 para análise de células bacterianas. - Equipar o microscópio com um espelho de meio reflexo (por exemplo, NT 80/20) para acomodar o CRM, que conta com a dispersão celular da luz incidente para visualizar a morfologia celular.
- Para microespectroscopia confocrática multicanal, equipar o microscópio com espelhos dicroicos. Por exemplo, use os divisores de feixe MBS InVis405, MBS458, MBS458/514, MBS488/543 ou MBS 488/543/633 para 405, 458, 488, 514, 543 ou 633 nm de excitação, respectivamente.
- Ajuste a intensidade de iluminação para cada comprimento de onda de excitação usando um medidor de alimentação laser. Mantenha a saída sob o microscópio constante através de comprimentos de onda de excitação (por exemplo, use 50 μW com o objetivo de 63x).
3. Aquisição de imagens
- Ajuste o tamanho do pinhole para 1 UA usando o software de microscópio.
- Defina o tempo de habitante do pixel (ou seja, velocidade de varredura) para cada comprimento de onda de excitação.
NOTA: Um tempo de sono de pixels excessivamente longo pode danificar as células. Evite o tempo de consumo excessivamente longo de pixels para minimizar a fotodamagem para as células. Para amostras bacterianas, um tempo de moradia de pixel < 55,6 μs/μm2 (quando a saída de irradiação sob o microscópio é ~17 μW/cm2) é geralmente adequado para evitar a inibição do crescimento. Este parâmetro pode variar dependendo dos organismos e configurações experimentais. - Defina a resolução de digitalização. Para células pequenas, como bactérias, use uma área de varredura de 1.024 x 1.024.
- Defina a faixa de varredura Z para que a região de interesse seja coberta.
NOTA: Para amostras de células bacterianas e leveduras distribuídas em uma laje de agarose, uma faixa de varredura Z de ~15 μm é geralmente suficiente. - Defina o detector descaned para capturar a faixa de comprimento de onda visível (por exemplo, 416-691 nm). Use uma janela espectral de 8-10 nm.
- Adquira imagens de microspectroscopia confocrática multicanal em uma sequência de comprimentos de onda de excitação mais longos e mais curtos para criar pilhas de Z de imagens de fluorescência.
- Adquira imagens de CRM.
- Salve as imagens adquiridas como arquivos de tiff de 16 bits em um diretório. Nomeie os arquivos usando a convenção de nomeação XXXcYYzZZ.tif, onde XXX é o comprimento de onda de excitação, YY é o número do canal do detector, ZZ é o número de fatia Z e "c" e "z" são prefixos para o número do detector e o número da fatia Z, respectivamente.
- Por exemplo, se uma imagem de microespectroscopia confocal multicanal for tirada com um comprimento de onda de excitação de 405 nm, 1º canal detector da matriz do detector, e for a 5ª fatia da pilha Z, nomeie-a como "405c01z05.tif". Para imagens de CRM, use a string "CRM" no lugar de XXX (por exemplo, "CRMc01z05.tif").
NOTA: Decida se a segmentação 2D ou 3D é mais adequada para os dados de imagem. Use um método de segmentação 2D em situações em que pequenas células são restritas a um plano 2D (por exemplo, população bacteriana aderindo a uma superfície de vidro). Use o método de segmentação 3D em situações em que a população celular é distribuída em um espaço tridimensional (por exemplo, biofilmes e amostras de tecido) ou os tamanhos celulares são maiores que a espessura da fatia óptica (por exemplo, células de levedura, células de mamíferos). Para segmentação 2D consulte a seção 4; para segmentação 3D, consulte a seção 5.
- Por exemplo, se uma imagem de microespectroscopia confocal multicanal for tirada com um comprimento de onda de excitação de 405 nm, 1º canal detector da matriz do detector, e for a 5ª fatia da pilha Z, nomeie-a como "405c01z05.tif". Para imagens de CRM, use a string "CRM" no lugar de XXX (por exemplo, "CRMc01z05.tif").
4. Análise de imagem 2D
- Equipar uma estação de trabalho com software de análise de imagem (por exemplo, MATLAB).
- Realizar segmentação celular e reconstrução de assinaturas de fluorescência inata de células únicas.
- Abra o software de análise de imagens.
- Clique duas vezes e abra um dos scripts fornecidos "Script2D.m".
- Vá para a guia Editor e clique em Executar. Uma janela de seleção de pastas deve aparecer.
- Selecione o diretório criado na etapa 3.8 e clique em Abrir para prosseguir. Uma caixa de diálogo que solicita a entrada do parâmetro de segmentação aparecerá automaticamente.
NOTA: Para fins de teste selecione o conjunto de dados fornecido ("Sample_2D"). O conjunto de dados da amostra é fornecido como um arquivo comprimido e deve ser extraído com antecedência. - Insira os parâmetros de segmentação: Limiar de binarização de imagem (0−1) para binarização de imagem = 0,45, Limiar Superior para Uma Região celular (em pixels) = 200, Limiar Inferior para uma Região celular (em pixels) = 10, e O Número de Detectores = 32. Clique em OK para prosseguir.
NOTA: Esses parâmetros podem exigir ajuste dependendo da qualidade da imagem. - Uma nova janela de imagem apresentando uma imagem de CRM deve aparecer. Selecione uma região de fundo arbitrária (ou seja, área onde as células estão ausentes) para usar para subtração de fundo. Desenhe um retângulo dentro da imagem CRM por arrastar o mouse. Clique duas vezes na região selecionada para confirmar a seleção.
- Encontre um novo diretório chamado Signature no mesmo diretório selecionado na etapa 4.2.4.
NOTA: O código fornecido cria automaticamente este diretório. O diretório "Signature" armazena a assinatura de fluorescência inata de cada célula microbiana dentro de uma população, à medida que .png arquivos que são numerados em série após um prefixo comum "Signature".
Análise de imagem .3D 5
- Equipar uma estação de trabalho com o software de análise de imagens (Tabela de Materiais).
- Realizar segmentação celular e reconstrução de assinaturas de fluorescência inata de células únicas.
- Abra o software de análise de imagens.
- Clique duas vezes e abra o script fornecido "Script3D.m".
- Vá para a guia Editor e clique em Executar. Uma janela de seleção de pastas deve aparecer.
- Selecione o diretório criado na etapa 3.8 e clique em Abrir para prosseguir. Uma caixa de diálogo que solicita a entrada dos parâmetros de segmentação aparecerá automaticamente.
NOTA: Para fins de teste, selecione o conjunto de dados fornecido ("Sample_3D"). O conjunto de dados da amostra é fornecido como um arquivo comprimido e deve ser extraído com antecedência. - Insira os parâmetros de segmentação: Limiar de binarização de imagem (0-1) para binarização de imagem = 0,01, Limiar superior para um volume de célula (em pixels) = 1.000, Limiar inferior para uma região celular (em pixels) = 20, X Tamanho do Pixel [μm/pixel] = 0,26, Y Pixel Size [μm/pixel] = 0,26, tamanho do pixel Z [μm/pixel] = 0,42, e O Número de Detectores = 32. Clique em OK para prosseguir; uma caixa de diálogo que solicita a entrada para o número de comprimentos de onda de excitação aparecerá.
NOTA: Esses parâmetros podem exigir ajuste dependendo da qualidade da imagem. - Insira o número de comprimentos de onda utilizados para aquisição de imagens (por exemplo, se 405, 488, 561, 630 forem utilizados, digite 4 na caixa de diálogo). Clique ok.
- Digite os comprimentos de onda de excitação em uma sequência do mais curto (ou seja, nome da caixa: Excitação nº 1) ao comprimento de onda mais longo nas caixas de diálogo. Clique em OK para prosseguir; uma nova janela de imagem que apresenta uma imagem de CRM deve aparecer.
- Selecione a região de fundo arbitrária (ou seja, área onde as células estão ausentes) para ser usada para subtração de fundo. Desenhe um retângulo dentro da imagem CRM por arrastar o mouse. Clique duas vezes na região selecionada para confirmar a seleção.
- Encontre o diretório chamado Assinatura no diretório selecionado na etapa 5.2.4.
NOTA: O código fornecido cria automaticamente este diretório. O diretório "Signature" armazena a assinatura de fluorescência inata de cada célula microbiana dentro de uma população como .png arquivos que são numerados em série após um prefixo comum "Signature".
6. Análise estatística
NOTA: Realizar técnicas de redução dimensional (por exemplo, análise de componentes principais [PCA]) para visualizar a distribuição de hiperespectrums das populações celulares. O script fornecido (PCA.py) executa PCA para duas populações celulares (ou seja, duas classes).
- Equipar uma estação de trabalho com a linguagem de programação e bibliotecas e módulos de acompanhamento (Tabela de Materiais).
- Crie um diretório vazio na unidade C (ou equivalente) e nomeie o diretório "Parent_directory" (ou seja, C:/ Parent_ diretório).
- Armazene as assinaturas de fluorescência (por exemplo, os arquivos .png gerados na etapa 4.2.7) de cada uma das duas populações celulares em dois diretórios separados.
NOTA: Os dois diretórios devem estar localizados no "Parent_directory".
C:/Parent_directory/
putidaKT2440/
Assinatura01.png Assinatura02.png :putidaKT2442/
Assinatura01.png
Assinatura02.png
: - Baixe PCA.py no "Parent_directory".
- Abra a interface da linha de comando da estação de trabalho.
- Digite "python C:/Parent_directory/PCA.py" na interface da linha de comando.
- Selecione o "Parent_directory" após a exibição da mensagem 'Selecionar diretório de destino'.
- No "C:/Parent_directory", encontre "PCA.png", que contém um enredo PCA resultante.
putidaKT2440/
Assinatura01.pngSubscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
A Figura 1A mostra a assinatura típica de fluorescência unicelular de uma célula bacteriana apresentada como uma trama de espectro tradicional (superior) e como um mapa de calor (meio). A Figura 1B mostra o resultado de uma segmentação de células 2D precisa sobreposta à imagem original de CRM de uma população de bactérias do solo (Pseudomonas putida KT2440)12. As assinaturas de fluorescência inata resultantes para a população são apresentadas como um mapa de calor na Figura 1D. Observe que a variabilidade da intrapopulação foi relativamente pequena após a segmentação celular bem sucedida. Um exemplo de segmentação celular imprecisa é mostrado na Figura 1C, que é sobreposta à mesma população de P. putida como mostrado na Figura 1B. O impacto da segmentação celular imprecisa nas assinaturas de fluorescência inata da população é facilmente aparente a partir do número considerável de outliers (Figura 1E, triângulos vermelhos). A segmentação celular imprecisa resultou em um cluster mais frouxo após o PCA em comparação com o cluster apertado obtido após a segmentação celular precisa (Figura 1F).
Normalmente, apesar da variabilidade das intraespécies, assinaturas de fluorescência inata de diferentes tipos de células formam aglomerados distintos. A Figura 2C apresenta o resultado das análises de PCA para um par de cepas taxonomicamente próximas (P. putida strain KT2440 e strain KT244213). Apesar da pequena variabilidade observada dentro de cada população separada (Figura 2A,B), cada população formou um aglomerado distinto no gráfico de análise do PCA (Figura 2C).
A Figura 3A mostra o resultado da segmentação de células 3D precisa sobreposta à imagem original do CRM de uma população de leveduras brotantes Saccharomyces cerevisiae YM427114. A Figura 3B mostra as assinaturas de fluorescência inata resultantes para a população.
Figura 1: Precisão da segmentação e variabilidade de intraespécies aparentes. (A) Assinatura típica de fluorescência inata de células únicas de uma célula bacteriana (P. putida KT2440), apresentada como um gráfico de espectro (superior) e um mapa de calor (meio). O comprimento de onda de emissão é indicado como um mapa de cor arco-íris (inferior). O eixo Y da trama de espectro e a cor do mapa de calor indicam as intensidades relativas de fluorescência. Os números na parte inferior indicam o comprimento de onda de excitação. Representação visual de reconhecimento preciso (B) e de região celular (C) impreciso pelo algoritmo de análise de imagem. Sombreamento azul claro indica regiões celulares detectadas para uma população de bactérias do solo P. putida KT 2440. Bolhas com numeração vermelha no painel C são exemplos de detecção falsa, onde o algoritmo classificou regiões não-celulares (ou seja, ruído de fundo) como regiões celulares devido a configurações inadequadas do limiar de binarização. Barras de escala = 1 μm ao longo de todo. Os painéis D e E retratam as assinaturas de fluorescência inata para a mesma população, geradas com segmentação celular precisa e imprecisa, respectivamente. Cada coluna mostra um hiperespectrum de célula única reconstruído apresentado como uma matriz 1 x 192, onde o mapa de cor amarelo-azul indica intensidade relativa de fluorescência. (F) A variância de assinaturas de fluorescência inata em segmentações precisas (azul claro) e imprecisas (vermelhas) visualizadas utilizando PCA. Cada rótulo de eixo denota o número do componente e sua contribuição percentual cumulativa para a análise do PCA. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Variabilidade intra e interespécie de assinaturas de fluorescência inata. Assinaturas de fluorescência inata apresentadas como mapas de calor para uma população de P. putida KT2440 (A) e P. putida KT2442 (B). (C) Projeção dos dois pares de assinatura de fluorescência inata visualizados usando PCA, correspondente a P. putida KT2440 (vermelho, n = 288) e P. putida KT2442 (azul, n = 373). X e Y-axes representam PC1 e PC2, respectivamente. O número de entrada indica o centro de cada cluster (1: P. putida KT2440, 2: P. putida KT2442). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Exemplo de segmentação 3D e extração de assinatura de fluorescência inata. (A) Projeção 3D de regiões reconhecidas como populações celulares de levedura s. cerevisiae YM4271. Os números inset são os números de identificação. (B) Mapa de calor de assinaturas de fluorescência inata extraídas das regiões 3D. O número do eixo X corresponde ao número de identificação. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Existem dois pontos críticos neste método que precisam ser acompanhados de perto para obter resultados reprodutíveis: 1) manter a saída de energia laser sob o objetivo do microscópio consistente através de comprimentos de onda e experimentos de excitação, e 2) realizar segmentação celular precisa.
O primeiro ponto é particularmente importante quando se compara a assinatura de fluorescência inata entre diferentes experimentos. Evite simplesmente aplicar as mesmas configurações de "saída percentual" nos comprimentos de onda de excitação (ou seja, usando 5% de potência para todas as linhas laser de 405, 488, 514 e 530 nm), pois a potência máxima pode diferir até uma ordem de magnitude entre as linhas de laser. Além disso, o objetivo e a óptica interna geralmente possuem características de absorção óptica irregulares, que também precisam ser contabilizadas. Por essas razões, recomenda-se, na verdade, medir a saída sob o objetivo usando um medidor de potência laser (Tabela de Materiais). Tomar esta medida a cada poucos experimentos, ou periodicamente, também é recomendado, porque a saída de linhas laser pode decair significativamente ao longo de alguns anos.
O segundo ponto, a segmentação celular precisa, torna-se particularmente importante em situações em que a variabilidade intra ou interespécie é uma preocupação. A segmentação celular imprecisa (Figura 1D) resulta em pontos de dados outlier (Figura 1E, indicado por triângulos vermelhos) e maior variabilidade de intraespécies aparentes. Os parâmetros de segmentação devem ser determinados com cuidado, verificando a precisão da segmentação celular sobrepondo os resultados de segmentação na imagem original do CRM, antes de prosseguir para qualquer análise adicional ou modelos de aprendizado de máquina de treinamento. Se trabalhar com uma imagem de má qualidade, um processamento adicional de imagem pode ser necessário para obter uma segmentação precisa. O uso de um 'filtro gaussiano' ou "filtro mediano" pode remover artefatos granulados e o processamento bilateral de filtros contra-ataca qualquer fundo listrado.
Com óptica de má qualidade (por exemplo, um objetivo de grau não confocal) ou sensibilidade insuficiente do detector, lidar com a detecção de assinaturas de fluorescência inata fraca pode ser um desafio. Note que usando a configuração descrita aqui e anteriormente11, não encontramos nenhum tipo de amostra celular cuja fluorescência inata era muito fraca para reconstruir uma assinatura de fluorescência inata. Embora uma maior saída de emissão para excitação e maior tempo de moradia de pixels possam ser usados para obter sinais de emissão mais fortes, isso pode causar danos às amostras de células. Uma solução potencial para casos em que fluorescência inata fraca é um problema é reduzir a intensidade do sinal de fundo, por exemplo, suspendendo células em buffer ou mídia sintética em vez de caldo. Tipos de recipientes celulares, como pratos de fundo de vidro e dispositivos microfluidos, são compatíveis e apropriados para esta técnica, embora uma laje de agarose tenha sido usada para reter células em posição aqui e em um estudo anterior15.
O método de microscópio confocal oferece resolução espacial e análise in situ para populações de células aderentes, biofilmes e amostras de tecido. Uma possível troca dessa metodologia é o rendimento máximo comparado a um citómetro de fluxo, por exemplo. Um conjunto completo de varreduras confocal coletando algumas centenas a mil assinaturas de fluorescência inata com um único conjunto de varreduras pode levar até alguns minutos. Um citómetro de fluxo é menos sensível devido ao seu design óptico, mas pode potencialmente alcançar um throughput várias ordens de magnitude maior.
Identificar rigorosamente um composto responsável por um pico específico em uma assinatura fluorescente inata é tipicamente desafiador, devido à sua natureza complicada. No entanto, tem sido sugerido que uma série de moléculas biologicamente relevantes, como vitaminas (por exemplo, dinucleotídeo de adenina de flavin [FAD]), coenzimas (por exemplo, nicotinamida adenina dinucleotídeo [NADH]), e pigmentos lipofuscina podem ser fluoroforos principais nas células1,16. Por exemplo, a FAD tem um máximo de excitação entre 350-450 nm e um pico de emissão de aproximadamente 525 nm16. O NADH livre tem um pico máximo de excitação e emissão de 340 nm e 460 nm, respectivamente, embora o espectro de emissões de NADH ligado à proteína difere16,17,18. Lipopigments que são conhecidos por associar-se a células estressadas ou envelhecidas têm uma ampla faixa de excitação (350-500 nm) e faixa de emissão (450-600 nm)16,18.
O uso do CRM oferece uma fonte independente de informações para identificar contornos celulares e, portanto, fornece outra vantagem significativa do CRIF: a extração seletiva de sinais de fluorescência de células individuais distribuídas em um espaço 3D. Isso representa um avanço da análise tradicional das características da fluorescência de toda uma colônia microbiana ou uma suspensão de cultura a granel, que é uma mistura média de sinais de um grande número de células contaminadas com sinais não celulares de componentes médios, metabólitos secretados e matrizes extracelulares. Uma análise de assinaturas de fluorescência inata de células únicas permite a caracterização preditiva do estado fisiológico das células intactas, fornecendo uma solução potencial para resolver o desenvolvimento temporal da distribuição de uma célula e do estado fisiológico.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Este estudo foi apoiado em parte por uma subvenção em auxílio para pesquisas científicas do Ministério da Educação, Cultura, Esportes e Tecnologia do Japão (18K04843) para Y. Yawata, o JST ERATO (JPMJER1502) para N. Nomura.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose | Wako Chemicals | 312-01193 | |
| Beam splitters | Carl Zeiss, Nikon | MBSInVis405, MBS458, MBS488, MBS458/514, MBS488/543, or MBS 488/543/633 beam splitters (Carl Zeiss) | |
| Confocal microscope | Carl Zeiss, Nikon | Model LSM 880 (Carl Zeiss), Model A1R (Nikon) | |
| Cover slips | Matsunami Glass | C024601 | |
| Glass slides | Matsunami Glass | S011120 | |
| Half-reflection mirror | Carl Zeiss, Nikon | NT80/20 | |
| Laser power meter | Thorlabs | PM400 (power meter console) and S175C (sensor) | |
| LB Broth | Nacalai tesque | 20066-95 | For bacteria culture |
| Image analysis software | The MathWorks | MATLAB version 2019a or later, Image Processing Toolbox is needed | |
| Microscope objective | Carl Zeiss, Nikon | 440762-9904 | e.g. 63x plan Apochomat NA = 1.4 (Carl Zeiss) |
| Microscope software | Carl Zeiss, Nikon | ZEN (Carl Zeiss),NIS-elements (Nikon) | |
| PBS(-) | Wako Chemicals | 166-23555 | |
| Programming language | Python and libraries, modules (numpy, scikit-learn, scikit-image, os, glob, matplotlib, tkinter) are rquired to run the supplied PCA script. | ||
| Silicone gasket | ThermoFisher Scientific | P24744 | |
| Workstation | A high-performance workstation with discrete GPUs is recommended. | ||
| Yeast extract-peptone-dextrose (YPD) agar medium | Sigma-Aldrich | Y1500-250G | For yeast culture |
| YPD medium | Sigma-Aldrich | Y1375-250G |
References
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