Summary
Здесь представлен протокол для оптического извлечения и каталогизации врожденных клеточных флуоресцентных сигнатур (т.е. клеточной автофлуоресценции) от каждой отдельной живой клетки, распределенной в трехмерном пространстве. Этот метод подходит для изучения врожденной флуоресцентной сигнатуры различных биологических систем с одноклеточным разрешением, включая клетки бактерий, грибов, дрожжей, растений и животных.
Abstract
Здесь описан конфокальный отражательный микроскопический анализ одноклеточной врожденной флуоресценции (CRIF), минимально инвазивный метод реконструкции врожденной клеточной флуоресцентной сигнатуры от каждой отдельной живой клетки в популяции, распределенной в трехмерном (3D) пространстве. Врожденная флуоресцентная сигнатура клетки представляет собой набор флуоресцентных сигналов, излучаемых различными биомолекулами внутри клетки. Предыдущие исследования установили, что врожденные флуоресцентные сигнатуры отражают различные клеточные свойства и различия в физиологическом статусе и являются богатым источником информации для характеристики и идентификации клеток. Врожденные флуоресцентные сигнатуры традиционно анализируются на популяционном уровне, что требует клональной культуры, но не на уровне одной клетки. CRIF особенно подходит для исследований, которые требуют 3D-разрешения и / или селективного извлечения флуоресцентных сигналов из отдельных клеток. Поскольку флуоресцентная сигнатура является врожденным свойством клетки, CRIF также подходит для безметочного прогнозирования типа и/или физиологического статуса интактных и одиночных клеток. Этот метод может быть мощным инструментом для упрощенного анализа клеток, где фенотип каждой отдельной клетки в гетерогенной популяции может быть непосредственно оценен по ее автофлуоресцентной сигнатуре под микроскопом без маркировки клеток.
Introduction
Разнообразные биомолекулы внутри ячейки1 излучают автофлуоресцентные сигналы, и врожденная флуоресцентная сигнатура клетки состоит из сборки этих сигналов. Эта сигнатурная флуоресценция отражает различные клеточные свойства, а также различия в физиологическом статусе. Анализ врожденной флуоресценции является минимально инвазивным и может дополнять традиционные, более инвазивные микробиологические зонды, которые оставляют ряд следов от легкой метаболической модификации до полного разрушения клеток. Хотя традиционные методы, такие как извлечение ДНК или содержимого клеток2,3, флуоресцентная гибридизация in situ4 и введение флуоресцентных репортерных генов в геном, эффективны в определении типа клеток или физиологического статуса, они обычно требуют либо манипуляций с клетками, либо инвазивной маркировки.
Исследования врожденной флуоресценции различных живых и интактных микробных колоний, включая объемные суспензии микробных культур5,6, активные ила7, ткани млекопитающих8,9 и клетки млекопитающих1,10, показали, что анализ врожденной флуоресценции облегчает анализ типов клеток и физиологического статуса без меток. Врожденные флуоресцентные сигнатуры традиционно анализируются на уровне популяции, а не на уровне одной клетки, и, таким образом, требуют клональной культуры. В отличие от этого, метод анализа одноклеточной флюоресценции (CRIF) с помощью конфокальной рифлекционной микроскопии11, описанный здесь, реконструирует и каталогизирует врожденную клеточную флуоресцентную сигнатуру каждой отдельной живой микробной клетки. Кроме того, CRIF может систематически сопоставлять врожденную флуоресцентную сигнатуру одной микробной клетки в популяции, которая распределена в трехмерном (3D) пространстве.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Подготовка образца
- Поместите силиконовую прокладку толщиной 1 мм с лунками на стеклянную горку.
- Поместите в лунку силиконовой прокладки агарозовую плиту толщиной 1 мм толщиной 0,8% (мас./об.).
- Разбавьте плотность клеток произвольной культуры микробных клеток до оптической плотности при 600 нм (OD660) = 1,0.
- Поместите 5 мкл аликвоты клеточной суспензии на агарозную плиту.
- Аккуратно накройте стеклянной крышкой.
2. Настройка микроскопа
ПРИМЕЧАНИЕ: Метод CRIF сочетает в себе конфокальную отражательную микроскопию (CRM) и многоканальную конфокальную микроспектроскопию. CRM служит источником информации для клеточной морфологии и пространственной локализации, которая не зависит от клеточной врожденной флуоресценции. Многоканальная конфокальная микроспектроскопия обеспечивает спектральную информацию клеточной врожденной флуоресценции. В следующем протоколе любое изображение, полученное с помощью CRM или конфокальной флуоресцентной микроспектроскопии, называется изображением CRM или многоканальным конфокальным микроспектроскопическим изображением соответственно.
- Подключите конфокальный микроскоп с десканированными спектральными каналами к фотоумножительной трубке (PMT) или детектору GaAsP.
ПРИМЕЧАНИЕ: Эти настройки доступны от нескольких производителей. - Оснастите микроскоп объективом с высокой числовой апертурой (NA) с адекватным увеличением.
ПРИМЕЧАНИЕ: Объектив 63x с NA > 1.4 рекомендуется для анализа бактериальных клеток. - Оснастите микроскоп зеркалом полуотражения (например, NT 80/20) для размещения CRM, который полагается на клеточный рассеяние падающего света для визуализации морфологии клеток.
- Для многоканальной конфокальной микроспектроскопии оснастите микроскоп дихроичными зеркалами. Например, используйте разветвители луча MBS InVis405, MBS458, MBS488, MBS458/514, MBS488/543 или MBS 488/543/633 для возбуждения 405, 458, 488, 514, 543 или 633 нм соответственно.
- Отрегулируйте интенсивность освещения для каждой длины волны возбуждения с помощью лазерного измерителя мощности. Держите выход под микроскопом постоянным через длины волн возбуждения (например, используйте 50 мкВт с объективом 63x).
3. Получение изображений
- Установите размер точечного отверстия на 1 а.е. с помощью программного обеспечения микроскопа.
- Установите время выдержки пикселя (т.е. скорость сканирования) для каждой длины волны возбуждения.
ПРИМЕЧАНИЕ: Чрезмерно длительное время выдержки пикселя может повредить клетки. Избегайте чрезмерно длительного времени выдержки пикселя, чтобы свести к минимуму фотоповреждения в ячейках. Для бактериальных образцов время выдержки пикселя <55,6 мкс/мкм2 (когда выход излучения под микроскопом составляет ~17 мкВт/см2) обычно подходит для предотвращения ингибирования роста. Этот параметр может варьироваться в зависимости от организмов и экспериментальных установок. - Установите разрешение сканирования. Для небольших клеток, таких как бактерии, используйте область сканирования 1024 x 1024.
- Установите диапазон Z-сканирования таким образом, чтобы была охвачена интересующая область.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для образцов бактериальных и дрожжевых клеток, распределенных на агарозной плите, обычно достаточно диапазона Z-сканирования ~ 15 мкм. - Установите десканированный детектор для захвата видимого диапазона длин волн (например, 416−691 нм). Используйте спектральное окно 8−10 нм.
- Получение многоканальных конфокальных микроспектроскопических изображений в последовательности от самых длинных до кратчайших длин волн возбуждения для создания Z-стеков флуоресцентных изображений.
- Получение образов CRM.
- Сохраните полученные изображения в виде 16-битных файлов tiff в каталог. Назовите файлы, используя соглашение об именовании XXXcYYzZZ.tif, где XXX - длина волны возбуждения, YY - номер канала детектора, ZZ - номер Z-среза, а "c" и "z" - префиксы для номера детектора и номера Z-среза соответственно.
- Например, если многоканальное конфокальное микроспектроскопическое изображение получено с длиной волны возбуждения 405 нм, 1-м детекторным каналом детекторной решетки, и является 5-м срезом Z-стека, назовите его «405c01z05.tif». Для изображений CRM используйте строку "CRM" вместо XXX (например, "CRMc01z05.tif").
ПРИМЕЧАНИЕ: Решите, является ли 2D или 3D сегментация наиболее подходящей для данных изображения. Используйте метод 2D-сегментации в ситуациях, когда маленькие клетки ограничены 2D-плоскостью (например, бактериальная популяция, придерживающаяся стеклянной поверхности). Используйте метод 3D-сегментации в ситуациях, когда клеточная популяция распределена в трехмерном пространстве (например, биопленки и образцы тканей) или размеры клеток больше толщины оптического среза (например, дрожжевые клетки, клетки млекопитающих). Для 2D-сегментации обратитесь к разделу 4; Для 3D-сегментации обратитесь к разделу 5.
- Например, если многоканальное конфокальное микроспектроскопическое изображение получено с длиной волны возбуждения 405 нм, 1-м детекторным каналом детекторной решетки, и является 5-м срезом Z-стека, назовите его «405c01z05.tif». Для изображений CRM используйте строку "CRM" вместо XXX (например, "CRMc01z05.tif").
4. 2D анализ изображений
- Оснастите рабочую станцию программным обеспечением для анализа изображений (например, MATLAB).
- Выполнение клеточной сегментации и реконструкции одноклеточных врожденных флуоресцентных сигнатур.
- Откройте программное обеспечение для анализа изображений.
- Дважды щелкните и откройте один из предоставленных скриптов "Script2D.m".
- Перейдите на вкладку Редактор и нажмите кнопку Выполнить. Должно появиться окно выбора папки.
- Выберите каталог, созданный на шаге 3.8, затем нажмите кнопку Открыть , чтобы продолжить. Автоматически появится диалоговое окно с запросом на ввод параметра сегментации.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для целей тестирования выберите предоставленный набор данных («Sample_2D»). Образец набора данных предоставляется в виде сжатого файла и должен быть извлечен заранее. - Введите параметры сегментации: Порог бинаризации изображения (0−1) для бинаризации изображения = 0,45, Верхний порог для области ячейки (в пикселях) = 200, Нижний порог для области ячейки (в пикселях) = 10 и Количество детекторов = 32. Нажмите кнопку ОК , чтобы продолжить.
ПРИМЕЧАНИЕ: Эти параметры могут потребовать настройки в зависимости от качества изображения. - Должно появиться новое окно изображения, представляющее изображение CRM. Выберите произвольную фоновую область (т. е. область, где ячейки отсутствуют), чтобы использовать ее для вычитания фона. Нарисуйте прямоугольник в изображении CRM путем перетаскивания мыши. Дважды щелкните в выбранном регионе, чтобы подтвердить выбор.
- Найдите новый каталог с именем Signature в том же каталоге, который был выбран на шаге 4.2.4.
ПРИМЕЧАНИЕ: Предоставленный код автоматически создает этот каталог. Каталог «Подпись» хранит врожденную флуоресцентную сигнатуру каждой микробной клетки в популяции в виде .png файлов, которые последовательно нумеруются после общего префикса «Подпись».
5.3D анализ изображений
- Оснастить рабочую станцию программным обеспечением для анализа изображений (Таблица материалов).
- Выполнение клеточной сегментации и реконструкции одноклеточных врожденных флуоресцентных сигнатур.
- Откройте программное обеспечение для анализа изображений.
- Дважды щелкните и откройте предоставленный скрипт "Script3D.m".
- Перейдите на вкладку Редактор и нажмите кнопку Выполнить. Должно появиться окно выбора папки.
- Выберите каталог, созданный на шаге 3.8, затем нажмите кнопку Открыть , чтобы продолжить. Автоматически появится диалоговое окно с запросом на ввод параметров сегментации.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для целей тестирования выберите предоставленный набор данных («Sample_3D»). Образец набора данных предоставляется в виде сжатого файла и должен быть извлечен заранее. - Введите параметры сегментации: Порог бинаризации изображения (0–1) для бинаризации изображения = 0,01, Верхний порог для объема ячейки (в пикселях) = 1000, Нижний порог для области ячейки (в пикселях) = 20, X Размер пикселя [мкм/пиксель] = 0,26, Размер пикселя Y [мкм/пиксель] = 0,26, Размер пикселя Z [мкм/пиксель] = 0,42 и Количество детекторов = 32. Нажмите кнопку ОК , чтобы продолжить; появится диалоговое окно, запрашивающее ввод количества длин волн возбуждения.
ПРИМЕЧАНИЕ: Эти параметры могут потребовать настройки в зависимости от качества изображения. - Введите количество длин волн, используемых для получения изображения (например, если используются 405, 488, 561, 630, введите 4 в диалоговом окне). Нажмите кнопку ОК.
- Введите длины волн возбуждения в последовательности от самой короткой (т.е. название поля: Возбуждение No 1) до самой длинной длины волны в диалоговые окна. Нажмите кнопку ОК , чтобы продолжить; должно появиться новое окно изображения, в котором представлено изображение CRM.
- Выберите произвольную фоновую область (т. е. область, в которой отсутствуют ячейки), которая будет использоваться для вычитания фона. Нарисуйте прямоугольник в изображении CRM путем перетаскивания мыши. Дважды щелкните в выбранном регионе, чтобы подтвердить выбор.
- Найдите каталог с именем Signature в каталоге, выбранном на шаге 5.2.4.
ПРИМЕЧАНИЕ: Предоставленный код автоматически создает этот каталог. Каталог «Подпись» хранит врожденную флуоресцентную сигнатуру каждой отдельной микробной клетки в популяции в виде .png файлов, которые последовательно нумеруются после общего префикса «Подпись».
6. Статистический анализ
ПРИМЕЧАНИЕ: Выполнение методов уменьшения размеров (например, анализ главных компонентов [PCA]) для визуализации распределения гиперспектрумов клеточных популяций. Предоставленный сценарий (PCA.py) выполняет PCA для двух клеточных популяций (т.е. двух классов).
- Оснастить рабочую станцию языком программирования и сопутствующими библиотеками и модулями (Таблица материалов).
- Создайте пустой каталог на диске C (или эквивалентном) и назовите каталог "Parent_directory" (т.е. C:/ Parent_ каталог).
- Храните флуоресцентные сигнатуры (например, файлы .png, сгенерированные на шаге 4.2.7) каждой из двух популяций клеток в двух отдельных каталогах.
ПРИМЕЧАНИЕ: Оба каталога должны быть расположены в "Parent_directory".
C:/Parent_directory/
putidaKT2440/
Подпись01.png Подпись02.png :putidaKT2442/
Подпись01.png
Подпись02.png
: - Скачайте PCA.py в "Parent_directory".
- Откройте интерфейс командной строки рабочей станции.
- Введите "python C:/Parent_directory/PCA.py" в интерфейсе командной строки.
- Выберите «Parent_directory» после отображения сообщения «Выбрать целевой каталог».
- В поле "C:/Parent_directory" найдите "PCA.png", который содержит результирующий график PCA.
putidaKT2440/
Подпись01.pngSubscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
На рисунке 1А показана типичная одноклетовая флуоресцентная сигнатура бактериальной клетки, представленная в виде традиционного участка спектра (вверху) и в виде тепловой карты (посередине). На рисунке 1B показан результат точной сегментации 2D-клеток, наложенных на исходное изображение CRM популяции почвенных бактерий (Pseudomonas putida KT2440)12. Результирующие врожденные флуоресцентные сигнатуры для популяции представлены в виде тепловой карты на рисунке 1D. Обратите внимание, что вариабельность интрапопуляции была относительно незначительной после успешной сегментации клеток. Пример неточной сегментации клеток показан на рисунке 1C, который накладывается на ту же популяцию P. putida , как показано на рисунке 1B. Влияние неточной сегментации клеток на врожденные флуоресцентные сигнатуры популяции легко проявляется из значительного числа выбросов (рисунок 1E, красные треугольники). Неточная сегментация клеток привела к более свободному кластеру после PCA по сравнению с плотным кластером, полученным после точной сегментации клеток (рисунок 1F).
Как правило, несмотря на внутривидовую изменчивость, врожденные флуоресцентные сигнатуры различных типов клеток образуют отдельные кластеры. На рисунке 2C представлен результат анализа PCA для таксономически близкой пары штаммов (штамм P. putida KT2440 и штамм KT244213). Несмотря на незначительную изменчивость, наблюдаемую в каждой отдельной популяции (рисунок 2A, B), каждая популяция сформировала отдельный кластер на графике анализа PCA (рисунок 2C).
На рисунке 3A показан результат точной 3D-сегментации клеток, наложенной на исходное изображение CRM популяции почкирующихся дрожжей Saccharomyces cerevisiae YM427114. На рисунке 3B показаны результирующие врожденные флуоресцентные сигнатуры для популяции.
Рисунок 1: Точность сегментации и кажущаяся внутривидовая изменчивость. (А) Типичная одноклеточная врожденная флуоресцентная сигнатура бактериальной клетки (P. putida KT2440), представленная в виде спектрального графика (вверху) и тепловой карты (посередине). Длина волны излучения обозначена в виде радужной цветовой карты (внизу). Ось Y на графике спектра и цвет тепловой карты указывают на относительную интенсивность флуоресценции. Цифры внизу указывают на длину волны возбуждения. Визуальное представление точного (B) и неточного (C) распознавания областей клеток алгоритмом анализа изображений. Светло-голубое затенение указывает на области клеток, обнаруженные для популяции почвенной бактерии P. putida KT 2440. Большие двоичные объекты с красной нумерацией на панели C являются примерами ложного обнаружения, где алгоритм классифицировал неячеистые области (т. Е. Фоновый шум) как области ячеек из-за неподходящих настроек порога бинаризации. Шкала стержней = 1 мкм по всей длине. Панели D и E изображают врожденные флуоресцентные сигнатуры для одной и той же популяции, генерируемые с точной и неточной сегментацией клеток, соответственно. Каждый столбец показывает реконструированный одноклеточный гиперспектр, представленный в виде матрицы 1 x 192, где желто-синяя цветовая карта указывает относительную интенсивность флуоресценции. (F) Дисперсия врожденных флуоресцентных сигнатур в точных (светло-голубых) и неточных (красный) сегментах, визуализированных с использованием PCA. Каждая метка оси обозначает номер компонента и его совокупный процентный вклад в анализ PCA. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Внутривидовая и межвидовая изменчивость врожденных флуоресцентных сигнатур. Сигнатуры врожденной флуоресценции представлены в виде тепловых карт для популяции P. putida KT2440 (A) и P. putida KT2442 (B). (C) Проекция двух врожденных пар флуоресцентных сигнатур, визуализированных с использованием PCA, соответствующих P. putida KT2440 (красный, n = 288) и P. putida KT2442 (синий, n = 373). Оси X и Y представляют PC1 и PC2 соответственно. Номер вставки указывает на центр каждого кластера (1: P. putida KT2440, 2: P. putida KT2442). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Пример 3D-сегментации и извлечения сигнатуры врожденной флуоресценции. (A) 3D-проекция областей, признанных клеточными популяциями почковых дрожжей S. cerevisiae YM4271. Номера-вставки являются идентификационными номерами. (B) Тепловая карта врожденных флуоресцентных сигнатур, извлеченных из 3D-областей. Номер по оси X соответствует идентификационному номеру. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В этом методе есть две критические точки, которые необходимо внимательно соблюдать для получения воспроизводимых результатов: 1) поддерживать постоянную выходную мощность лазера под микроскопом с помощью длин волн возбуждения и экспериментов и 2) выполнять точную сегментацию клеток.
Первый момент особенно важен при сравнении врожденной флуоресцентной сигнатуры среди различных экспериментов. Избегайте простого применения одних и тех же настроек «процентной выходной мощности» к длинам волн возбуждения (т. Е. Использование выходной мощности 5% для всех лазерных линий 405, 488, 514 и 530 нм), потому что максимальная выходная мощность может отличаться до порядка величины среди лазерных линий. Кроме того, объектив и внутренняя оптика обычно имеют неравномерные оптические характеристики поглощения, которые также необходимо учитывать. По этим причинам рекомендуется фактически измерять выход под объектив с помощью лазерного измерителя мощности (Таблица материалов). Также рекомендуется проводить это измерение каждые несколько экспериментов или периодически, потому что выход из лазерных линий может значительно уменьшаться в течение нескольких лет.
Второй момент, точная сегментация клеток, становится особенно важным в ситуациях, когда внутривидовая или межвидовая изменчивость вызывает беспокойство. Неточная сегментация клеток (рисунок 1D) приводит к выбросу точек данных (рисунок 1E, обозначен красными треугольниками) и большей кажущейся внутривидовой изменчивости. Параметры сегментации должны быть тщательно определены, проверяя точность сегментации клеток, накладывая результаты сегментации на исходное изображение CRM, прежде чем переходить к любому дальнейшему анализу или обучению моделей машинного обучения. При работе с изображением низкого качества может потребоваться дополнительная обработка изображения для достижения точной сегментации. Использование «гауссовского фильтра» или «срединного фильтра» может удалить зернистые артефакты, а двусторонний фильтр обрабатывает любой полосатый фон.
При низком качестве оптики (например, объектив неконфокального класса) или недостаточной чувствительности детектора работа с обнаружением слабых врожденных флуоресцентных сигнатур может быть сложной задачей. Обратите внимание, что используя установку, описанную здесь и ранее11, мы не столкнулись с каким-либо типом образца клеток, чья врожденная флуоресценция была слишком слабой, чтобы реконструировать врожденную флуоресцентную сигнатуру. Хотя более высокий выход излучения для возбуждения и более длительное время выдержки пикселей могут быть использованы для получения более сильных сигналов излучения, это может привести к повреждению образцов клеток. Потенциальным решением для случаев, когда слабая врожденная флуоресценция является проблемой, является снижение интенсивности фонового сигнала, например, путем приостановки клеток в буферных или синтетических средах вместо бульона. Типы контейнеров для клеток, такие как стеклянные нижние тарелки и микрофлюидные устройства, совместимы и подходят для этого метода, хотя агарозная плита использовалась для удержания клеток в положении здесь и в предыдущем исследовании15.
Метод конфокального микроскопа предлагает пространственное разрешение и анализ in situ для адгезивных клеточных популяций, биопленок и образцов тканей. Потенциальным компромиссом этой методологии является максимальная пропускная способность по сравнению, например, с проточным цитометром. Полный набор конфокальных сканирований, собирающих от нескольких сотен до тысячи врожденных флуоресцентных сигнатур с помощью одного набора сканирований, может занять до нескольких минут. Проточный цитометр менее чувствителен из-за своей оптической конструкции, но потенциально может достичь пропускной способности на несколько порядков больше.
Строго идентифицировать соединение, которое отвечает за определенный пик во врожденной флуоресцентной сигнатуре, как правило, сложно из-за его сложной природы. Однако было высказано предположение, что ряд биологически значимых молекул, таких как витамины (например, флавинадениндинуклеотид [FAD]), коферменты (например, никотинамидадениндинуклеотид [NADH]) и пигменты липофусцина могут быть основными флуорофорами в клетках1,16. Например, FAD имеет максимум возбуждения между 350–450 нм и пик излучения примерно 525 нм16. Свободный NADH имеет максимум возбуждения и пик излучения при 340 нм и 460 нм соответственно, хотя спектры излучения связанных с белком NADH различаются16,17,18. Липопигменты, которые, как известно, ассоциируются со стрессовыми или стареющими клетками, имеют широкий диапазон возбуждения (350-500 нм) и диапазон излучения (450-600 нм) 16,18.
Использование CRM предлагает независимый источник информации для идентификации контуров клеток и, следовательно, обеспечивает еще одно существенное преимущество CRIF: селективное извлечение флуоресцентных сигналов из отдельных клеток, распределенных в 3D-пространстве. Это представляет собой шаг вперед по сравнению с традиционным анализом флуоресцентных характеристик целой микробной колонии или суспензии объемной культуры, которая представляет собой усредненную смесь сигналов от огромного числа клеток, загрязненных неклеточными сигналами от компонентов среды, секретируемых метаболитов и внеклеточных матриксов. Анализ одноклеточных врожденных флуоресцентных сигнатур позволяет прогнозировать характеристику физиологического статуса интактных клеток, обеспечивая потенциальное решение для разрешения временного развития распределения и физиологического состояния клетки.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Это исследование было частично поддержано грантом на научные исследования от Министерства образования, культуры, спорта и технологий Японии (18K04843) Ю. Явате, JST ERATO (JPMJER1502) до Н. Номуры.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose | Wako Chemicals | 312-01193 | |
| Beam splitters | Carl Zeiss, Nikon | MBSInVis405, MBS458, MBS488, MBS458/514, MBS488/543, or MBS 488/543/633 beam splitters (Carl Zeiss) | |
| Confocal microscope | Carl Zeiss, Nikon | Model LSM 880 (Carl Zeiss), Model A1R (Nikon) | |
| Cover slips | Matsunami Glass | C024601 | |
| Glass slides | Matsunami Glass | S011120 | |
| Half-reflection mirror | Carl Zeiss, Nikon | NT80/20 | |
| Laser power meter | Thorlabs | PM400 (power meter console) and S175C (sensor) | |
| LB Broth | Nacalai tesque | 20066-95 | For bacteria culture |
| Image analysis software | The MathWorks | MATLAB version 2019a or later, Image Processing Toolbox is needed | |
| Microscope objective | Carl Zeiss, Nikon | 440762-9904 | e.g. 63x plan Apochomat NA = 1.4 (Carl Zeiss) |
| Microscope software | Carl Zeiss, Nikon | ZEN (Carl Zeiss),NIS-elements (Nikon) | |
| PBS(-) | Wako Chemicals | 166-23555 | |
| Programming language | Python and libraries, modules (numpy, scikit-learn, scikit-image, os, glob, matplotlib, tkinter) are rquired to run the supplied PCA script. | ||
| Silicone gasket | ThermoFisher Scientific | P24744 | |
| Workstation | A high-performance workstation with discrete GPUs is recommended. | ||
| Yeast extract-peptone-dextrose (YPD) agar medium | Sigma-Aldrich | Y1500-250G | For yeast culture |
| YPD medium | Sigma-Aldrich | Y1375-250G |
References
- Monici, M. Cell and tissue autofluorescence research and diagnostic applications. Biotechnology Annual Review. 11, 227-256 (2005).
- Tang, J. Microbial metabolomics. Current Genomics. 12, 391-403 (2011).
- Woo, P. C., Lau, S. K., Teng, J. L., Tse, H., Yuen, K. Y. Then and now: use of 16S rDNA gene sequencing for bacterial identification and discovery of novel bacteria in clinical microbiology laboratories. Clinical Microbiology and Infection. 14, 908-934 (2008).
- Amman, R., Fuchs, B. M. Single-cell identification in microbial communities by improved fluorescence in situ hybridization techniques. Nature Reviews Microbiology. 6, 339-348 (2008).
- Giana, H. E., Silveira, L., Zângaro, R. A., Pacheco, M. T. T. Rapid identification of bacterial species by fluorescence spectroscopy and classification through principal components analysis. Journal of Fluorescence. 13 (6), 489-493 (2003).
- Leblanc, L., Dufour, E. Monitoring the identity of bacteria using their intrinsic fluorescence. FEMS Microbiology Letters. 211 (2), 147-153 (2002).
- Hou, X., Liu, S., Feng, Y. The autofluorescence characteristics of bacterial intracellular and extracellular substances during the operation of anammox reactor. Scientific Reports. 7, 39289 (2017).
- Ramanujam, N., et al. In vivo diagnosis of cervical intraepithelial neoplasia using 337-nm-excited laser-induced fluorescence. Proceeding National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (21), 10193-10197 (1994).
- Zhang, J. C., et al. Innate cellular fluorescence reflects alterations in cellular proliferation. Lasers in Surgery and Medicine. 20 (3), 319-331 (1997).
- Gosnell, M. E., et al. Quantitative non-invasive cell characterisation and discrimination based on multispectral autofluorescence features. Scientific Reports. 6, 23453 (2016).
- Yawata, Y., et al. Intra- and interspecies variability of single-cell innate fluorescence signature of microbial cell. Applied and Environmental Microbiology. 85, 00608-00619 (2019).
- Nelson, K. E., et al. Complete genome sequence and comparative analysis of the metabolically versatile Pseudomonas putida KT2440. Environmental Microbiology. 4 (12), 799-808 (2002).
- Bagdasarian, M., et al. Specific-purpose plasmid cloning vectors. II. Broad host range, high copy number, RSF1010-derived vectors, and a host-vector system for gene cloning in Pseudomonas. Gene. 16 (1-3), 237-247 (1981).
- Luo, Y., Vijaychander, S., Stile, J., Zhu, L. Cloning and analysis of DNA-binding proteins by yeast one-hybrid and one-two-hybrid systems. Biotechniques. 20 (4), 564-568 (1996).
- Yawata, Y., et al. Monitoring biofilm development in a microfluidic device using modified confocal reflection microscopy. Journal of Bioscience and Bioengineering. 110 (3), 377-380 (2010).
- Lakowicz, J. R. Principles of Fluorescence Spectroscopy. Third edition. , Springer. Germany. (2006).
- Blacker, T. S., Duchen, M. R. Investigating mitochondrial redox state using NADH and NADPH autofluorescence. Free Radical Biology & Medicine. 100, 53-65 (2016).
- Croce, A. C., Bottiroli, G. Autofluorescence spectroscopy and imaging: A tool for biomedical research and diagnosis. European Journal of Histochemistry. 58 (4), 2461 (2014).
