Summary
Här presenteras ett protokoll för optiskt extraherande och katalogisering av medfödda cellulära fluorescenssignaturer (dvs. cellulär autofluorescens) från varje enskild levande cell som distribueras i ett tredimensionellt utrymme. Denna metod är lämplig för att studera den medfödda fluorescenssignaturen hos olika biologiska system vid en encellig upplösning, inklusive celler från bakterier, svampar, jäst, växter och djur.
Abstract
Beskrivs här är confocal reflektion mikroskopi-assisterad encells medfödda fluorescens analys (CRIF), en minimalt invasiv metod för rekonstruera medfödda cellulära fluorescens signatur från varje enskild levande cell i en population distribueras i ett tredimensionellt (3D) utrymme. Cellens medfödda fluorescenssignatur är en samling fluorescenssignaler som avges av olika biomolekyler i cellen. Tidigare studier visat att medfödda fluorescenssignaturer återspeglar olika cellulära egenskaper och skillnader i fysiologisk status och är en rik informationskälla för cellkarakterisering och identifiering. Medfödda fluorescenssignaturer har traditionellt analyserats på befolkningsnivå, vilket kräver en klonkultur, men inte på encellsnivå. CRIF är särskilt lämplig för studier som kräver 3D-upplösning och/eller selektiv extraktion av fluorescenssignaler från enskilda celler. Eftersom fluorescenssignaturen är en medfödd egenskap hos en cell är CRIF också lämplig för taggfri förutsägelse av typen och/eller fysiologisk status för intakta och enskilda celler. Denna metod kan vara ett kraftfullt verktyg för strömlinjeformad cellanalys, där fenotypen för varje enskild cell i en heterogen population kan bedömas direkt genom dess autofluorescenssignatur under ett mikroskop utan cellmärkning.
Introduction
Olika biomolekyler inom en cell1 avger autofluorescenssignaler, och den medfödda fluorescenssignaturen i en cell består av monteringen av dessa signaler. Denna signaturfluorescens återspeglar olika cellulära egenskaper och även skillnader i fysiologisk status. Analys av medfödd fluorescens är minimalt invasiv och kan komplettera traditionella, mer invasiva mikrobiologiska sonder som lämnar en rad spår från mild metabolisk modifiering till fullständig cellförstörelse. Medan traditionella tekniker som DNA eller cellinnehåll extraktion2,3, fluorescerande in situ hybridisering4 och införandet av fluorescerande reportergener till genomet är effektiva för att bestämma celltyp eller fysiologisk status, kräver de ofta antingen manipulering av cellerna eller invasiv taggning.
Studier av medfödd fluorescens av olika levande och intakta mikrobiella kolonier, inklusive mikrobiella odlingsupphängningar i bulk5,6, aktivt slam7, däggdjursvävnader8,9 och däggdjursceller1,10, har visat att medfödd fluorescensanalys underlättar taggfri analys av celltyper och fysiologisk status. Medfödda fluorescenssignaturer har traditionellt analyserats på befolkningsnivå och inte på encellsnivå, och kräver därmed en klonkultur. Däremot rekonstruerar och katalogiserar den confocal reflection mikroskopi-assisterade encelliga innate fluorescence analys (CRIF) teknik11 beskrivs här medfödda cellulära fluorescens signatur av varje enskild levande mikrobiell cell. Dessutom kan CRIF systematiskt sortera den medfödda fluorescenssignaturen hos en enda mikrobiell cell inom en population som distribueras i ett tredimensionellt (3D) utrymme.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Beredning av provet
- Placera en 1 mm tjock silikonpackning med brunnar på en glasrutschbana.
- Placera en 1 mm tjock 0,8% (w/v) agaroseplatta i silikonpackningens brunn.
- Späd celltätheten hos en godtycklig mikrobiell cellkultur till en optisk densitet vid 600 nm (OD660) = 1,0.
- Placera en 5 μL alikvot cellfjädring på agarosplattan.
- Täck försiktigt med ett omslagsslip i glas.
2. Installation av ett mikroskop
OBS: CRIF-tekniken kombinerar konfokal reflektionsmikroskopi (CRM) och flerkanalig konfokal mikrospektroskopi. CRM fungerar som informationskälla för cellulär morfologi och rumslig lokalisering, som är oberoende av cellulär medfödd fluorescens. Multichannel confocal mikrospektroskopi ger spektral information om cellulär medfödd fluorescens. I följande protokoll kallas varje bild som förvärvats med CRM eller konfokal fluorescensmikroskopi en CRM-bild respektive en flerkanalig konfokal mikrospektroskopibild.
- Anslut ett konfokalt mikroskop med avskannade spektralkanaler till ett fotomultiplierrör (PMT) eller GaAsP-detektor.
DESSA inställningar är tillgängliga från flera tillverkare. - Utrusta mikroskopet med ett NA-mål (High Numerical Aperture) med tillräcklig förstoring.
OBS: Ett 63x-mål med NA > 1,4 rekommenderas för att analysera bakterieceller. - Utrusta mikroskopet med en halvreflektionsspegel (t.ex. NT 80/20) för att rymma CRM, som förlitar sig på den cellulära spridningen av infallande ljus för att visualisera cellmorfologi.
- För flerkanalig konfokal mikrospektroskopi, utrusta mikroskopet med dichroiska speglar. Använd till exempel MBS InVis405, MBS458, MBS488, MBS458/514, MBS488/543 eller MBS 488/543/633 beam splitters för 405, 458, 488, 514, 543 respektive 633 nm excitation.
- Justera belysningsintensiteten för varje excitationsvåglängd med hjälp av en lasereffektmätare. Håll utgången under mikroskopet konstant genom excitationsvåglängder (använd t.ex. 50 μW med 63x-målet).
3. Bildförvärv
- Ställ in pinhole-storleken på 1 AU med hjälp av mikroskopprogramvaran.
- Ställ in pixelns uppehållstid (dvs. skanningshastighet) för varje excitationsvåglängd.
OBS: En alltför lång pixel uppehållstid kan skada celler. Undvik alltför lång pixel uppehållstid för att minimera fotodamage till cellerna. För bakterieprover är en pixel uppehållstid <55,6 μs/μm2 (när strålningsutgången under mikroskopet är ~17 μW/cm2) vanligtvis lämplig för att undvika tillväxthämning. Denna parameter kan variera beroende på organismer och experimentella inställningar. - Ställ in skanningsupplösningen. För små celler som bakterier, använd ett skanningsområde på 1 024 x 1 024.
- Ställ in Z-skanningsintervallet så att intresseområdet täcks.
OBS: För bakterie- och jästcellsprover fördelade på en agaroseplatta är ett Z-skanningsområde på ~15 μm vanligtvis tillräckligt. - Ställ in den avskannade detektorn för att fånga det synliga våglängdsområdet (t.ex. 416−691 nm). Använd ett spektralfönster på 8−10 nm.
- Skaffa flerkanaliga konfokala mikrospektroskopibilder i en sekvens från längsta till kortaste excitationsvåglängder för att skapa Z-staplar av fluorescensbilder.
- Hämta CRM-bilder.
- Spara de förvärvade avbildningarna som 16-bitars tiff-filer i en katalog. Namnge filerna med namngivningskonventionen XXXcYYzZZ.tif, där XXX är excitationsvåglängden, YY är detektorkanalnumret, ZZ är Z-segmentnumret och "c" och "z" är prefix för detektornumret respektive Z-segmentnumret.
- Om till exempel en flerkanalig konfokal mikrospektroskopibild tas med en excitationsvåglängd på 405 nm, 1: a detektorkanalen för detektormatrisen och är den femte delen av Z-stacken, namnge den "405c01z05.tif". För CRM-bilder använder du strängen "CRM" i stället för XXX (t.ex. "CRMc01z05.tif").
OBS: Bestäm om 2D- eller 3D-segmentering är mest lämplig för bilddata. Använd en 2D-segmenteringsmetod i situationer där små celler är begränsade till ett 2D-plan (t.ex. bakteriepopulation som håller sig till en glasyta). Använd 3D-segmenteringsmetoden i situationer där cellpopulationen fördelas i ett tredimensionellt utrymme (t.ex. biofilmer och vävnadsprover) eller cellstorlekarna är större än tjockleken på den optiska skivan (t.ex. jästceller, däggdjursceller). För 2D-segmentering hänvisas till avsnitt 4; för 3D-segmentering, se avsnitt 5.
- Om till exempel en flerkanalig konfokal mikrospektroskopibild tas med en excitationsvåglängd på 405 nm, 1: a detektorkanalen för detektormatrisen och är den femte delen av Z-stacken, namnge den "405c01z05.tif". För CRM-bilder använder du strängen "CRM" i stället för XXX (t.ex. "CRMc01z05.tif").
4. 2D-bildanalys
- Utrusta en arbetsstation med bildanalysprogramvara (t.ex. MATLAB).
- Utför cellsegmentering och rekonstruktion av encelliga medfödda fluorescenssignaturer.
- Öppna bildanalysprogramvaran.
- Dubbelklicka och öppna ett av de medföljande skripten "Script2D.m".
- Gå till fliken Redigerare och klicka sedan på Kör. Ett mappmarkeringsfönster ska visas.
- Markera katalogen som skapades i steg 3.8 och klicka sedan på Öppna för att fortsätta. En dialogruta som uppmanar till indata från segmenteringsparametern visas automatiskt.
Obs: För teständamål väljer du den angivna datauppsättningen ("Sample_2D"). Exempel data uppsättningen tillhandahålls som en komprimerad fil och bör extraheras i förväg. - Ange segmenteringsparametrarna: Tröskelvärde för bildkartisering (0−1) för Bild binarization = 0,45, Övre tröskelvärde för en cellregion (i pixlar) = 200, lägre tröskelvärde för en cellregion (i pixlar) = 10 och Antalet detektorer = 32. Klicka på OK för att fortsätta.
OBS: Dessa parametrar kan kräva justering beroende på bildkvaliteten. - Ett nytt bildfönster med en CRM-bild ska visas. Markera ett godtyckligt bakgrundsområde (dvs. område där celler saknas) som ska användas för bakgrunds subtraktion. Rita en rektangel i CRM-bilden med musen dra. Dubbelklicka i det markerade området för att bekräfta markeringen.
- Hitta en ny katalog med namnet Signatur i samma katalog som valdes i steg 4.2.4.
Den angivna koden skapar automatiskt den här katalogen. Katalogen "Signatur" lagrar den medfödda fluorescenssignaturen för varje mikrobiell cell i en population som .png filer som är serienumrerade efter ett gemensamt prefix "Signatur".
5.3D bildanalys
- Utrusta en arbetsstation med bildanalysprogramvaran (Table of Materials).
- Utför cellsegmentering och rekonstruktion av encelliga medfödda fluorescenssignaturer.
- Öppna bildanalysprogramvaran.
- Dubbelklicka och öppna det medföljande skriptet "Script3D.m".
- Gå till fliken Redigerare och klicka sedan på Kör. Ett mappmarkeringsfönster ska visas.
- Markera katalogen som skapades i steg 3.8 och klicka sedan på Öppna för att fortsätta. En dialogruta som uppmanar till indata från segmenteringsparametrarna visas automatiskt.
Obs: För teständamål väljer du den angivna datauppsättningen ("Sample_3D"). Exempel data uppsättningen tillhandahålls som en komprimerad fil och bör extraheras i förväg. - Mata in segmenteringsparametrarna: Tröskelvärde för bildkardarisering (0–1) för bildkartisering = 0,01, övre tröskelvärde för en cellvolym (i pixlar) = 1 000, lägre tröskelvärde för en cellregion (i pixlar) = 20, X Pixelstorlek [μm/pixel] = 0,26, Y PixelStorlek [μm/pixel] = 0,26, Z pixelstorlek [μm/pixel] = 0,26, Y PixelStorlek [μm/pixel] = 0,26, Z pixelstorlek [μm/pixel] = 0,26, Y Pixelstorlek [μm/pixel] = 0,26, 0,26, Y PixelStorlek [μm/pixel] = 0,26, Z pixelstorlek [μm/pixel] = 0,26, Y Pixelstorlek [μm/pixel] = 0,26, 0,26, 0,26, Y PixelStorlek [μm/pixel] = 0,26, Y PixelStorlek [μm/pixel] = 0,26, Z-pixelstorlek [μm/pixel] = 0,26, Y PixelStorlek [μm/pixel] = 0,26, Y PixelStorlek [μm/pixel] = 0,26, Y PixelStorlek [μm/pixel] = 0,26, Y PixelStorlek [μm/pixel] = 0,26, 0,26, Y Klicka på OK för att fortsätta; En dialogruta som uppmanar indata för antalet excitationsvåglängder visas.
OBS: Dessa parametrar kan kräva justering beroende på bildkvaliteten. - Ange antalet våglängder som används för bildförvärv (t.ex. om 405, 488, 561, 630 används, ange 4 i dialogrutan). Klicka på OK.
- Ange excitationsvåglängderna i en sekvens från kortaste (dvs. rutanamn: Excitation nr 1) till längst våglängd i dialogrutorna. Klicka på OK för att fortsätta; Ett nytt bildfönster som visar en CRM-bild ska dyka upp.
- Markera det godtyckliga bakgrundsområde (dvs. område där celler saknas) som ska användas för bakgrunds subtraktion. Rita en rektangel i CRM-bilden med musen dra. Dubbelklicka i det markerade området för att bekräfta markeringen.
- Leta reda på katalogen Med namnet Signatur i katalogen som valdes i steg 5.2.4.
Den angivna koden skapar automatiskt den här katalogen. Katalogen "Signatur" lagrar den medfödda fluorescenssignaturen för varje enskild mikrobiell cell i en population när .png filer som är serienumrerade efter ett gemensamt prefix "Signatur".
6. Statistisk analys
OBS: Utför dimensionsreduktionstekniker (t.ex. huvudkomponentanalys [PCA]) för att visualisera fördelningen av hyperspektra i cellpopulationerna. Det angivna skriptet (PCA.py) kör PCA för två cellpopulationer (dvs. två klasser).
- Utrusta en arbetsstation med programmeringsspråket och medföljande bibliotek och moduler (Tabell över material).
- Skapa en tom katalog i C-enheten (eller motsvarande) och namnge katalogen "Parent_directory" (dvs. C:/ Parent_ katalog).
- Lagra fluorescenssignaturerna (t.ex. .png filer som genereras i steg 4.2.7) av var och en av de två cellpopulationerna i två separata kataloger.
OBS: De två katalogerna bör båda finnas i "Parent_directory".
C:/Parent_directory/
putidaKT2440/
Signatur01.png Underskrift02.png :putidaKT2442/
Signatur01.png
Underskrift02.png
: - Ladda ner PCA.py till "Parent_directory".
- Öppna kommandoradsgränssnittet på arbetsstationen.
- Skriv "python C:/Parent_directory/PCA.py" i kommandoradsgränssnittet.
- Välj "Parent_directory" när meddelandet "Välj målkatalog" visas.
- I "C:/Parent_directory" hittar du "PCA.png", som innehåller en resulterande PCA-plot.
putidaKT2440/
Signatur01.pngSubscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1A visar den typiska encelliga fluorescenssignaturen för en bakteriecell som presenteras som ett traditionellt spektrumdiagram (överst) och som en värmekarta (mitten). Figur 1B visar resultatet av en exakt 2D-cellsegmentering ovanpå den ursprungliga CRM-bilden av en population av jordbakterier (Pseudomonas putida KT2440)12. De resulterande medfödda fluorescenssignaturerna för befolkningen presenteras som en värmekarta i figur 1D. Observera att intrapopulation variabilitet var relativt liten efter framgångsrika cell segmentering. Ett exempel på felaktig cellsegmentering visas i figur 1C, som läggs ovanpå samma population av P. putida som visas i figur 1B. Effekten av felaktig cellsegmentering på populationens medfödda fluorescenssignaturer framgår tydligt av det stora antalet avvikande värden (figur 1E, röda trianglar). Felaktig cellsegmentering resulterade i ett lösare kluster efter PCA jämfört med det snäva kluster som erhållits efter korrekt cellsegmentering (figur 1F).
Vanligtvis, trots intraspecies variabilitet, bildar medfödda fluorescenssignaturer av olika celltyper distinkta kluster. Figur 2C presenterar resultatet av PCA-analyser för ett taxonomiskt nära par stammar (P. putida stam KT2440 och stam KT244213). Trots den mindre variation som observerats inom varje enskild population (figur 2A, B) bildade varje population ett distinkt kluster på PCA-analysdiagrammet (figur 2C).
Figur 3A visar resultatet av korrekt 3D-cellsegmentering ovanpå den ursprungliga CRM-bilden av en population av spirande jäst Saccharomyces cerevisiae YM427114. Figur 3B visar de resulterande medfödda fluorescenssignaturerna för befolkningen.
Figur 1: Noggrannhet av segmentering och synbar intraspecies variabilitet. (A) Typisk encellig medfödd fluorescenssignatur av en bakteriecell (P. putida KT2440), presenterad som ett spektrumdiagram (överst) och en värmekarta (mitten). Emissionsvåglängden anges som en regnbågsfärgkarta (nederkant). Y-axeln i spektrumdiagrammet och värmekartans färg indikerar båda de relativa fluorescensintensiteterna. Siffrorna längst ner anger excitationsvåglängden. Visuell representation av korrekt (B) och felaktig (C) cellregionigenkänning av bildanalysalgoritmen. Ljusblå skuggning indikerar cellregioner som upptäckts för en population av jordbakteri P. putida KT 2440. Blobbar med röd numrering på panel C är exempel på falsk identifiering, där algoritmen klassificerade icke-cellområden (dvs. bakgrundsbrus) som cellregioner på grund av olämpliga tröskelvärden för binarisering. Skalstänger = 1 μm i hela. Panelerna D och E visar de medfödda fluorescenssignaturerna för samma population, genererade med korrekt respektive felaktig cellsegmentering. Varje kolumn visar en rekonstruerad encellig hyperspektral som presenteras som en matris på 1 x 192, där den gul-till-blå färgkartan indikerar relativ fluorescensintensitet. (F) Variansen av medfödda fluorescenssignaturer i exakta (ljusblå) och felaktiga (röda) segmenteringar visualiserade med hjälp av PCA. Varje axeletikett anger komponentnumret och dess kumulativa procentuella bidrag till PCA-analysen. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 2: Variabiliteten mellan medfödda fluorescenssignaturer inom och mellanarter. Medfödda fluorescenssignaturer presenteras som värmekartor för en population av P. putida KT2440 (A) och P. putida KT2442 (B). C) Projektion av de två medfödda fluorescensparen som visualiseras med PCA, motsvarande P. putida KT2440 (röd, n = 288) och P. putida KT2442 (blå, n = 373). X- respektive Y-axlar representerar PC1 respektive PC2. Det infällda numret anger mitten av varje kluster (1: P. putida KT2440, 2: P. putida KT2442). Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 3: Exempel på 3D-segmentering och medfödd fluorescenssignaturutvinning. (A) 3D-projektion av regioner som erkänts som cellpopulationer av spirande jäst S. cerevisiae YM4271. De infällda numren är identifikationsnumren. B) Värmekarta över medfödda fluorescenssignaturer som extraherats från 3D-regionerna. X-axelnumret motsvarar identifieringsnumret. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det finns två kritiska punkter i denna metod som måste följas noga för att uppnå reproducerbara resultat: 1) hålla lasereffekten under mikroskopmålet konsekvent genom excitationsvåglängder och experiment, och 2) utföra korrekt cellsegmentering.
Den första punkten är särskilt viktig när man jämför den medfödda fluorescenssignaturen mellan olika experiment. Undvik att helt enkelt använda samma "procentutgång" på excitationsvåglängderna (dvs. med 5 % uteffekt för alla laserlinjer på 405, 488, 514 och 530 nm), eftersom den maximala uteffekten kan skilja sig upp till en storleksordning mellan laserlinjer. Dessutom har målet och den interna optiken vanligtvis ojämna optiska absorptionsegenskaper, som också måste beaktas. Av dessa skäl rekommenderas faktiskt mätning av utgången under målet med hjälp av en lasereffektmätare (Table of Materials). Att ta denna mätning med några experiment, eller periodiskt, rekommenderas också, eftersom utgången från laserlinjer kan förfalla avsevärt under några år.
Den andra punkten, korrekt cellsegmentering, blir särskilt viktig i situationer där variabilitet inom eller mellanarter är ett problem. Felaktig cellsegmentering (figur 1D) resulterar i avvikande datapunkter (figur 1E, indikerat av röda trianglar) och större uppenbar intraspeciesvariation. Segmenteringsparametrarna bör bestämmas noggrant och kontrollera cellens segmenteringsnoggrannhet genom att lägga över segmenteringsresultaten på den ursprungliga CRM-bilden innan du fortsätter till ytterligare analys- eller utbildnings maskininlärningsmodeller. Om du arbetar med en bild av dålig kvalitet kan ytterligare bildbehandling krävas för att uppnå korrekt segmentering. Om du använder antingen ett "Gaussian-filter" eller "medianfilter" kan korniga artefakter tas bort, och bilateral filterbearbetning räknar med alla randiga bakgrunder.
Med optik av dålig kvalitet (t.ex. ett icke-konfokalt kvalitetsmål) eller otillräcklig detektorkänslighet kan det vara svårt att hantera detektion av svaga medfödda fluorescenssignaturer. Observera att med hjälp av inställningen som beskrivs här och tidigare11 stötte vi inte på någon typ av cellprov vars medfödda fluorescens var för svag för att rekonstruera en medfödd fluorescenssignatur. Även om högre utsläppsutgång för excitation och längre pixel uppehållstid kan användas för att erhålla starkare utsläppssignaler, kan detta orsaka skador på cellproverna. En möjlig lösning för fall där svag medfödd fluorescens är ett problem är att minska bakgrundssignalintensiteten, till exempel genom att suspendera celler i buffert eller syntetiska medier istället för buljong. Typer av cellbehållare, såsom glasbottenfat och mikrofluidiska enheter, är kompatibla och lämpliga för denna teknik, även om en agaroseplatta användes för att behålla celler på plats här och i en tidigare studie15.
Den konfokala mikroskopmetoden erbjuder rumslig upplösning och in situ-analys för vidhäftande cellpopulationer, biofilmer och vävnadsprover. En potentiell kompromiss av denna metod är det maximala genomströmningen jämfört med en flödescytometer, till exempel. En komplett uppsättning konfokala skanningar som samlar in några hundra till tusen medfödda fluorescenssignaturer med en enda uppsättning skanningar kan ta upp till några minuter. En flödescytometer är mindre känslig på grund av sin optiska design men kan potentiellt uppnå ett genomströmningsflöde av flera storleksordningar större.
Att noggrant identifiera en förening som är ansvarig för en specifik topp i en medfödd fluorescerande signatur är vanligtvis utmanande, på grund av dess komplicerade natur. Det har dock föreslagits att ett antal biologiskt relevanta molekyler, såsom vitaminer (t.ex. flavin adenin dinucleotide [FAD]), coenzymes (t.ex. nikotinamid adenin dinucleotide [NADH]) och lipofuscin pigment kan vara stora fluoroforer i celler1,16. FAD har till exempel ett excitations maximum mellan 350–450 nm och en utsläppstopp på cirka 525 nm16. Fri NADH har en excitation maximal och utsläppstopp på 340 nm respektive 460 nm, även om utsläppsspektrat för proteinbunden NADH skiljer sig16,17,18. Lipopigments som är kända för att associera med stressade eller åldrade celler har ett brett excitationsområde (350–500 nm) och utsläppsområde (450–600 nm)16,18.
Användningen av CRM erbjuder en oberoende informationskälla för att identifiera cellkonturer och ger därför en annan betydande fördel med CRIF: selektiv extraktion av fluorescenssignaler från enskilda celler fördelade i ett 3D-utrymme. Detta utgör ett steg framåt från den traditionella analysen av fluorescensegenskaperna hos en hel mikrobiell koloni eller en bulkkultur suspension, som är en genomsnittlig blandning av signaler från ett stort antal celler förorenade med icke-cellsignaler från medelstora komponenter, utsöndrade metaboliter och extracellulära matriser. En analys av encelliga medfödda fluorescenssignaturer möjliggör prediktiv karakterisering av den fysiologiska statusen hos intakta celler, vilket ger en potentiell lösning för att lösa temporal utveckling av en cells fördelning och fysiologiska tillstånd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Denna studie stöddes delvis av ett bidrag till vetenskaplig forskning från Japans ministerium för utbildning, kultur, sport och teknik (18K04843) till Y. Yawata, JST ERATO (JPMJER1502) till N. Nomura.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose | Wako Chemicals | 312-01193 | |
| Beam splitters | Carl Zeiss, Nikon | MBSInVis405, MBS458, MBS488, MBS458/514, MBS488/543, or MBS 488/543/633 beam splitters (Carl Zeiss) | |
| Confocal microscope | Carl Zeiss, Nikon | Model LSM 880 (Carl Zeiss), Model A1R (Nikon) | |
| Cover slips | Matsunami Glass | C024601 | |
| Glass slides | Matsunami Glass | S011120 | |
| Half-reflection mirror | Carl Zeiss, Nikon | NT80/20 | |
| Laser power meter | Thorlabs | PM400 (power meter console) and S175C (sensor) | |
| LB Broth | Nacalai tesque | 20066-95 | For bacteria culture |
| Image analysis software | The MathWorks | MATLAB version 2019a or later, Image Processing Toolbox is needed | |
| Microscope objective | Carl Zeiss, Nikon | 440762-9904 | e.g. 63x plan Apochomat NA = 1.4 (Carl Zeiss) |
| Microscope software | Carl Zeiss, Nikon | ZEN (Carl Zeiss),NIS-elements (Nikon) | |
| PBS(-) | Wako Chemicals | 166-23555 | |
| Programming language | Python and libraries, modules (numpy, scikit-learn, scikit-image, os, glob, matplotlib, tkinter) are rquired to run the supplied PCA script. | ||
| Silicone gasket | ThermoFisher Scientific | P24744 | |
| Workstation | A high-performance workstation with discrete GPUs is recommended. | ||
| Yeast extract-peptone-dextrose (YPD) agar medium | Sigma-Aldrich | Y1500-250G | For yeast culture |
| YPD medium | Sigma-Aldrich | Y1375-250G |
References
- Monici, M. Cell and tissue autofluorescence research and diagnostic applications. Biotechnology Annual Review. 11, 227-256 (2005).
- Tang, J. Microbial metabolomics. Current Genomics. 12, 391-403 (2011).
- Woo, P. C., Lau, S. K., Teng, J. L., Tse, H., Yuen, K. Y. Then and now: use of 16S rDNA gene sequencing for bacterial identification and discovery of novel bacteria in clinical microbiology laboratories. Clinical Microbiology and Infection. 14, 908-934 (2008).
- Amman, R., Fuchs, B. M. Single-cell identification in microbial communities by improved fluorescence in situ hybridization techniques. Nature Reviews Microbiology. 6, 339-348 (2008).
- Giana, H. E., Silveira, L., Zângaro, R. A., Pacheco, M. T. T. Rapid identification of bacterial species by fluorescence spectroscopy and classification through principal components analysis. Journal of Fluorescence. 13 (6), 489-493 (2003).
- Leblanc, L., Dufour, E. Monitoring the identity of bacteria using their intrinsic fluorescence. FEMS Microbiology Letters. 211 (2), 147-153 (2002).
- Hou, X., Liu, S., Feng, Y. The autofluorescence characteristics of bacterial intracellular and extracellular substances during the operation of anammox reactor. Scientific Reports. 7, 39289 (2017).
- Ramanujam, N., et al. In vivo diagnosis of cervical intraepithelial neoplasia using 337-nm-excited laser-induced fluorescence. Proceeding National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (21), 10193-10197 (1994).
- Zhang, J. C., et al. Innate cellular fluorescence reflects alterations in cellular proliferation. Lasers in Surgery and Medicine. 20 (3), 319-331 (1997).
- Gosnell, M. E., et al. Quantitative non-invasive cell characterisation and discrimination based on multispectral autofluorescence features. Scientific Reports. 6, 23453 (2016).
- Yawata, Y., et al. Intra- and interspecies variability of single-cell innate fluorescence signature of microbial cell. Applied and Environmental Microbiology. 85, 00608-00619 (2019).
- Nelson, K. E., et al. Complete genome sequence and comparative analysis of the metabolically versatile Pseudomonas putida KT2440. Environmental Microbiology. 4 (12), 799-808 (2002).
- Bagdasarian, M., et al. Specific-purpose plasmid cloning vectors. II. Broad host range, high copy number, RSF1010-derived vectors, and a host-vector system for gene cloning in Pseudomonas. Gene. 16 (1-3), 237-247 (1981).
- Luo, Y., Vijaychander, S., Stile, J., Zhu, L. Cloning and analysis of DNA-binding proteins by yeast one-hybrid and one-two-hybrid systems. Biotechniques. 20 (4), 564-568 (1996).
- Yawata, Y., et al. Monitoring biofilm development in a microfluidic device using modified confocal reflection microscopy. Journal of Bioscience and Bioengineering. 110 (3), 377-380 (2010).
- Lakowicz, J. R. Principles of Fluorescence Spectroscopy. Third edition. , Springer. Germany. (2006).
- Blacker, T. S., Duchen, M. R. Investigating mitochondrial redox state using NADH and NADPH autofluorescence. Free Radical Biology & Medicine. 100, 53-65 (2016).
- Croce, A. C., Bottiroli, G. Autofluorescence spectroscopy and imaging: A tool for biomedical research and diagnosis. European Journal of Histochemistry. 58 (4), 2461 (2014).
