Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Chemistry

Оценка окислительного стресса в биологических образцах с использованием анализа химически активных веществ тиобарбитуровой кислоты

Published: May 12, 2020 doi: 10.3791/61122

Summary

Целью анализа реакционноспособных веществ тиобарбитуровой кислоты является оценка окислительного стресса в биологических образцах путем измерения производства продуктов перекисного окисления липидов, в первую очередь малониальдегида, с использованием спектрофотометрии видимой длины волны при 532 нм. Описанный здесь способ может быть применен к сыворотке крови человека, клеточным лизатам и липопротеинам низкой плотности.

Abstract

Несмотря на свою ограниченную аналитическую специфичность и прочность, анализ реакционноспособных веществ тиобарбитуровой кислоты (TBARS) широко используется в качестве общей метрики перекисного окисления липидов в биологических жидкостях. Он часто считается хорошим показателем уровня окислительного стресса в биологическом образце при условии, что образец был правильно обработан и сохранен. Анализ включает реакцию продуктов перекисного окисления липидов, в первую очередь малондиальдегида (MDA), с тиобарбитуровой кислотой (TBA), что приводит к образованию аддуктов MDA-TBA2, называемых TBARS. TBARS дает красно-розовый цвет, который можно измерить спектрофотометрически при 532 нм. Анализ TBARS проводится в кислых условиях (рН = 4) и при 95 °C. Чистый MDA нестабилен, но эти условия позволяют высвобождать MDA из MDA bis (диметилацетал), который используется в качестве аналитического стандарта в этом методе. Анализ TBARS является простым методом, который может быть завершен примерно за 2 часа. Подготовка пробирных реагентов подробно описана здесь. Экономные исследователи могут использовать эти реагенты для нескольких экспериментов по низкой цене, а не покупать дорогой набор для анализа TBARS, который позволяет строить только одну стандартную кривую (и, следовательно, может быть использован только для одного эксперимента). Применимость этого анализа TBARS показана в сыворотке крови человека, липопротеинах низкой плотности и клеточных лизатах. Анализ является последовательным и воспроизводимым, и могут быть достигнуты пределы обнаружения 1,1 мкМ. Приведены рекомендации по использованию и интерпретации спектрофотометрического анализа TBARS.

Introduction

Перекисное окисление липидов - это процесс, в котором свободные радикалы, такие как активные формы кислорода и активные формы азота, атакуют двойные связи углерод-углерод в липидах, процесс, который включает в себя абстрагирование водорода из углерода и вставку молекулы кислорода. Этот процесс приводит к смешиванию сложных продуктов, включая липидные пероксиловые радикалы и гидропероксиды в качестве первичных продуктов, а также малониальдегид (MDA) и 4-гидроксиноненал в качестве преобладающих вторичных продуктов1.

MDA широко используется в биомедицинских исследованиях в качестве маркера перекисного окисления липидов из-за его легкой реакции с тиобарбитуровой кислотой (TBA). Реакция приводит к образованию MDA-TBA2, сопряжения, которое поглощается в видимом спектре при 532 нм и производит красно-розовый цвет2. Другие молекулы, полученные в результате перекисного окисления липидов, помимо MDA, также могут реагировать с TBA и поглощать свет при 532 нм, способствуя общему сигналу поглощения, который измеряется. Аналогичным образом, MDA может реагировать с большинством других основных классов биомолекул, потенциально ограничивая его доступность для реакции с TBA3,4. Таким образом, этот традиционный анализ просто считается измеряющим «реакционноспособные вещества тиобарбитуровой кислоты» или TBARS5.

При правильном применении и интерпретации анализ TBARS обычно считается хорошим показателем общего уровня окислительного стресса в биологическом образце6. К сожалению, как задокументировано Хоубнасабджафари и другими, анализ TBARS часто проводится и интерпретируется таким образом, чтобы облегчить сомнительные выводы3,4,7,8,9,10,11. Причины этого коренятся главным образом в преаналитических переменных, связанных с выборкой, и отсутствии прочности анализа, что запрещает, казалось бы, незначительные изменения в протоколе анализа без существенных изменений в результатах анализа1,7,12,13.

Преаналитические переменные, связанные с обработкой и хранением биообразцев (например, плазма крови, временно хранящаяся при -20 °C)14,15, могут оказать существенное влияние на результаты анализа TBARS16,17; Настолько, что результаты анализа TBARS не следует сравнивать в разных лабораториях, если это не оправдано явными межлабораторными аналитическими данными валидации. Эта рекомендация сродни тому, как обычно используются и интерпретируются западные пятна. Сравнение плотностей полос справедливо для внутри-блоттинговых и, возможно, внутрилабораторных исследований, но сравнение плотностей полос между лабораториями обычно считается некорректной практикой.

Некоторые исследователи предположили, что MDA, измеренный с помощью анализа TBARS, просто не соответствует аналитическим или клиническим критериям, требуемым для приемлемого биомаркера3,9,10,18,19. Действительно, если бы анализ не был разработан более 50 лет назад, он, вероятно, не получил бы широкого использования и молчаливой приемлемости, которые он имеет сегодня. Хотя существуют и другие анализы с большей аналитической чувствительностью, специфичностью и прочностью, используемые для определения окислительного стресса, анализ TBARS, основанный на поглощении при 532 нм, остается одним из наиболее часто используемых анализов для определения перекисного окисления липидов20 и, следовательно, оценки окислительного стресса.

Анализ TBARS можно найти только в виде дорогостоящего набора (более 400 долларов США), в котором инструкция не дает подробной информации о большинстве концентраций используемых реагентов. Кроме того, предоставленные реагенты могут быть использованы только для одного эксперимента, потому что только одна колориметрическая стандартная кривая может быть сделана на комплект. Это может быть проблематично для исследователей, которые намерены определить уровни окисления в нескольких образцах в разные моменты времени, потому что одна и та же стандартная кривая не может использоваться несколько раз. Следовательно, для нескольких экспериментов необходимо приобрести несколько наборов. В настоящее время, если не приобретен дорогостоящий комплект, нет подробного протокола, доступного для выполнения анализа TBARS. Некоторые исследователи в прошлом расплывчато описывали, как выполнять анализ TBARS21,22, но ни полностью подробный протокол, ни всеобъемлющее видео о том, как проводить анализ TBARS без дорогостоящего комплекта, не доступны в литературе.

Здесь мы сообщаем о подробной, аналитически проверенной методологии для целей о том, как выполнить анализ TBARS простым, воспроизводимым и недорогим способом. Изменения в перекисном окислении липидов сыворотки крови человека, лизатов HepG2 и липопротеинов низкой плотности при лечении ионами Cu(II) демонстрируются в качестве иллюстративных применений для анализа TBARS. Результаты показывают, что этот анализ TBARS является последовательным и воспроизводимым на ежедневной основе.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Образцы сыворотки крови человека были получены от добровольцев по согласию с одобрения IRB и в соответствии с принципами, изложенными в Хельсинкской декларации. Образцы кодировались и деидентифицировались перед передачей в аналитическую лабораторию.

1. Пробоподготовка

  1. Лизаты клеток HepG2
    1. Посейте около 10 х 106 клеток HepG2 на колбу в 16 колбах T75 с 14 мл среды EMEM, дополненной 10% фетальной бычьей сывороткой (FBS), и выращивайте клетки в течение 2 дней.
    2. Подготовьте буфер RIPA: в пробирке объемом 50 мл добавьте 1,5 мл 5 M NaCl, 2,5 мл 1 M Tris-HCl (pH = 7), 500 мкл реагента NP-40, затем доведите конечный объем до 50 мл с водой DI.
    3. Приготовьте буфер лизиса: аликвот 20 мл буфера RIPA в пробирку объемом 50 мл и добавьте 200 мкл 100-кратного раствора ингибитора протеазы для ингибирования деградации белка и липидов. Хранить при температуре 4 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Буфер лизиса совместим с реагентами TBARS и не препятствует абсорбции при 532 нм. Если планируется использовать другой буфер лизиса или добавлять дополнительные ингредиенты в буфер лизиса, необходимо провести предварительные валидационные исследования, чтобы убедиться, что компоненты буфера лизиса совместимы с анализом TBARS.
    4. Удалите носитель, содержащий 10% FBS, и промыть клетки 2x 5 мл холодного, стерильного 1x PBS.
    5. Добавьте 1 мл лизисного буфера в колбы T75, содержащие клетки, и инкубируйте их в течение 10 минут при комнатной температуре (RT) с постоянным закручиванием, чтобы обеспечить хорошое распределение буфера.
    6. Соберите лизаты в соответствующим образом маркированные полипропиленовые трубки объемом 2 мл и инкубируйте на льду в течение 10 минут.
    7. Раскрутите лизаты при 5000 х г в течение 10 мин на RT для сбора клеточного мусора и аспирируют супернатанты в одну трубку объемом 15 мл.
    8. Концентрируйте супернатант лизата клеток в четыре раза, используя скорость вакуума при 50 °C и 3 мбар, и превращайте аликвоты по 94 мкл каждая в полипропиленовые трубки с защелкивающейся крышкой 2 мл. Храните образцы при -80 °C до тех пор, пока они не будут использованы для окисления in vitro и/или анализа TBARS.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы избежать концентрации супернатанта лизата клеток, клетки также могут быть отделены с использованием 3 мл 1x трипсина, нейтрализованы 6 мл среды и промыты 2x 5 мл холодного PBS. Затем гранулы клеток могут быть восстановлены в 250 мкл лизисного буфера, и затем могут быть выполнены этапы 1.1.6 и 1.1.7.
    9. Приготовьте 35 мМ раствора CuCl2 в уксусной кислоте (рН = 4).
      1. Приготовьте раствор уксусной кислоты (рН = 4): Разбавьте 1 мкл ледниковой уксусной кислоты в 100 мл воды DI (рН должен быть примерно 4, но подтвердите это рН-метром). Добавьте больше воды или уксусной кислоты, чтобы отрегулировать рН до 4.
      2. Весите около 0,1936 г хлорида меди II и растворите в 10 мл раствора уксусной кислоты (рН = 4), чтобы получить запас CuCl2 объемом 144 мМ. Aliquot 490 мкл из этого раствора и добавляют к 1,510 мкл уксусной кислоты (рН = 4), чтобы получить 35 мМ раствора CuCl2 .
    10. Aliquot 6 мкл из 35 мМ раствора CuCl2 и добавляют его к шести образцам, содержащим 94 мкл лизата клеток, чтобы получить конечную концентрацию CuCl2 около 2 мМ. Добавьте 6 мкл раствора уксусной кислоты (рН = 4), который не имеет CuCl2 , к шести образцам, содержащим 94 мкл клеточных лизатов, для использования в качестве контроля. Конечный объем лизата клеток должен составлять 100 мкл, что и будет использоваться для анализа TBARS.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Внесение 35 мМ раствора CuCl2 в уксусную кислоту (рН = 4) необходимо для предотвращения осаждения гидроксида меди.
    11. Инкубируйте образцы в печи при 37 °C в течение 24 ч и выполняйте анализ TBARS на каждом образце, содержащем конечный объем 100 мкл.
    12. Повторите шаги 1.1.9 и 1.1.11 2x в отдельные дни, чтобы проверить воспроизводимость анализа TBARS для лизатов клеток HepG2.
  2. Липопротеины низкой плотности
    ПРИМЕЧАНИЕ: Как правило, предварительно очищенные липопротеины низкой плотности (ЛПНП) содержат некоторое количество ЭДТА. Образцы ЛПНП, используемые здесь, содержат 0,01% ЭДТА. ЭДТА может ингибировать in vitro Cu(II)-опосредованное окисление ЛПНП. Следовательно, может потребоваться удалить ЭДТА из образцов ЛПНП до экспериментов или анализа. Шаги 1.2.1–1.2.5 описывают этот процесс.
    ВНИМАНИЕ: Гидроксид натрия является коррозионным и вызывает раздражение кожи и глаз. Используйте надлежащие средства индивидуальной защиты.
    1. Aliquot 24 мкл из запаса ЛПНП 5,51 мг/мл (концентрация белка, определяемая модифицированным методом Лоури с использованием BSA в качестве стандарта) в соответствующим образом маркированные полипропиленовые трубки с защелкивающейся крышкой 1 мл. Сделайте столько аликвот, сколько необходимо, и храните при 4 °C до использования в окислительном и/или TBARS анализе.
    2. Приготовьте буфер HEPES 10 мМ в 0,15 М NaCl, скорректированный на рН = 7 с шариками NaOH: растворите 4,39 г NaCl в 0,49 л воды, затем добавьте 1,19 г HEPES. Хорошо растворить с помощью перемешивания. Добавьте шарики гидроксида натрия до тех пор, пока рН не достигнет 7. Разбавить водой до 0,5 л. Хранить буфер при 4 °C и использовать в течение 3 месяцев.
    3. Добавьте 476 мкл буфера HEPES 10 мМ в 0,15 М NaCl (рН = 7) к аликвотированным образцам ЛПНП, чтобы довести конечный объем до 500 мкл. Добавьте разбавленный образец ЛПНП к центробежному спиновому фильтрующему устройству объемом 0,5 мл с отсечкой молекулярной массы 100 К.
    4. Спиновые образцы при 14 000 х г в течение 10 мин при RT, оставляя конечный объем ретентата около 30 мкл. Восстановите образцы в 480 мкл буфера HEPES 10 мМ в 0,15 М NaCl (pH = 7) и снова вращайтесь при 14 000 х г в течение 10 мин при RT. Выполните этот шаг 2x в общей сложности четыре спин-прохождения.
    5. Поместите фильтрующее устройство вверх ногами в новую полипропиленовую трубку с защелкивающейся крышкой 2 мл и центрифугу при 1000 х г в течение 2 минут для сбора образца ЛПНП (конечный объем = около 30 мкл).
    6. Образец Aliquot помещается в соответствующим образом маркированную пробирку объемом 1 мл и добавляет 20 мкл воды к каждому образцу для достижения конечного объема 50 мкл.
    7. Приготовление 200 мкМ раствора CuCl2 в уксусной кислоте (рН = 4)
      1. Приготовить раствор уксусной кислоты (рН = 4): см. этап 1.1.9.1.
      2. Приготовьте 144 мМ раствора CuCl2 (см. этап 1.1.9.2), затем аликвот 5,5 мкл из запаса CuCl2 144 мМ и растворите в конечном объеме 4 мл уксусной кислоты (рН = 4), чтобы получить раствор 200 мкМ.
    8. Aliquot 2,7 мкл из 200 мкМ раствора CuCl2 и добавляют его к шести образцам, содержащим 50 мкл ЛПНП, для достижения конечной концентрации CuCl2 ~10 мкМ. Добавьте 2,7 мкл из раствора уксусной кислоты (рН = 4), который не содержит CuCl2 , к шести образцам, содержащим 50 мкл ЛПНП, которые будут использоваться для контроля.
    9. Инкубировать образцы ЛПНП в течение 2 ч в духовке при 37 °C. Через 2 ч доведите конечный объем до 100 мкл для каждого образца с буфером HEPES 10 мМ в 0,15 М NaCl (pH = 7). Немедленно выполните анализ TBARS.
    10. Повторите шаги 1.2.3–1.2.9 2x в два разных дня, чтобы проверить воспроизводимость анализа TBARS.
  3. Сыворотка крови человека
    1. Из образца сыворотки крови человека сделайте аликвоты по 94 мкл каждая в полипропиленовые трубки с защелкивающейся крышкой 2 мл и храните образцы при -80 °C.
    2. Приготовьте 35 мМ раствора CuCl2 в уксусной кислоте (рН = 4): см. шаг 1.1.9.
    3. Aliquot 6 мкл из исходного раствора CuCl2 и добавьте его к шести образцам, содержащим 94 мкл сыворотки человека, чтобы получить окончательную концентрацию CuCl2 около 2 мМ. Добавьте 6 мкл раствора уксусной кислоты (рН = 4), который не имеет CuCl2 , к шести образцам, содержащим 94 мкл сыворотки крови человека, для использования в качестве контроля.
    4. Инкубировать образцы сыворотки крови человека в течение 24 ч в печи при 37 °C и определять уровни окисления с помощью анализа TBARS (раздел 4).
    5. Повторите шаги 1.3.2–1.3.4 2x в течение двух отдельных дней, чтобы определить воспроизводимость анализа TBARS.

2. Подготовка реагентов

ВНИМАНИЕ: Тиобарбитуровая кислота вызывает раздражение кожи и глаз и, возможно, вредна при вдыхании или поглощении кожи. Уксусная кислота может повредить внутренние органы при вдыхании. Приготовьте все растворы кислоты в вытяжке.

  1. Приготовление 8,1% (мас./об.) раствора додецилсульфата натрия (SDS)
    1. Весите 32,4 г SDS и растворяйте в 350 мл воды DI в стакане. Используйте магнитный перемешиватель, чтобы мягко растворить SDS и избежать образования пузырьков. Доведите конечный объем до 400 мл с водой DI и храните раствор SDS в RT.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь готовят избыточный 8,1% раствор SDS; однако для 96 образцов требуется только около 20 мл 8,1% раствора SDS. Подготовьте этот раствор в соответствии с количеством анализируемых образцов.
  2. Получение буфера ацетата натрия 3,5 М (рН = 4)
    1. Разбавьте 100 мл ледниковой уксусной кислоты в 350 мл воды DI в стакане. Используйте магнитный перемешивание, чтобы аккуратно растворить его.
    2. Приготовьте раствор NaOH 6,5 М, используя шарики гидроксида натрия в воде. Растворите 13 г шариков NaOH в 40 мл воды DI и доведите до конечного объема 50 мл водой DI.
    3. Медленно добавляйте около 46 мл раствора NaOH 6,5 М к раствору уксусной кислоты во время смешивания с перемешивающим стержнем (это должно повысить рН до 4, но подтвердить, медленно добавляя раствор NaOH при измерении с помощью рН-метра).
    4. Доведите конечный объем до 500 мл с водой DI и храните буфер ацетата натрия в RT.
  3. Приготовление 0,8% водного раствора тиобарбитуровой кислоты (с поправкой на рН = 4)
    ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе подготовка тиобарбитуровой кислоты оптимизирована для больших объемов, так как будет проанализировано большое количество образцов (108 образцов, не включая стандарты). Подготовьте этот раствор в зависимости от количества образцов, запланированных к анализу.
    1. Приготовьте раствор гидроксида натрия 5 М, используя шарики гидроксида натрия и воду: растворите 4 г шариков гидроксида натрия в конечном объеме 20 мл воды. Хранить в пластиковом контейнере. Этот раствор должен быть свежеприготовленным для каждой партии.
    2. Весите 4 г тиобарбитуровой кислоты и добавьте 450 мл воды DI. Используйте магнитный перемешивание, чтобы аккуратно растворить его.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Это решение в конечном итоге будет доведено до общего объема 500 мл.
    3. Растворяя тиобарбитуровую кислоту перемешиванием, добавляют (медленно и по каплям) около 3 мл раствора 5 M NaOH с шагом 100 мкл. После добавления раствора NaOH частицы тиобарбитуровой кислоты начнут растворяться.
    4. Если частицы тиобарбитуровой кислоты все еще не полностью растворились, добавьте больше раствора 5 M NaOH с шагом 100 мкл до тех пор, пока все частицы тиобарбитуровой кислоты не будут полностью растворены. Для этого конкретного объема раствора добавляют в общей сложности 4 мл раствора 5 M NaOH, чтобы полностью растворить частицы тиобарбитуровой кислоты.
      ПРИМЕЧАНИЕ: При этой концентрации тиобарбитуровая кислота не будет полностью растворяться, если рН не составляет почти 4.
    5. Прекратите добавлять NaOH после того, как вся тиобарбитуровая кислота полностью растворится. Избегайте превышения рН 4. Конечный рН можно проверить, взяв 1 мкл из перемешиваемого раствора тиобарбитуровой кислоты и поместив его на рН-бумагу.
    6. Доведите конечный объем до 500 мл с водой DI и храните водный 0,8% раствор тиобарбитуровой кислоты в RT.

3. Маландиальдегид бис (диметилацеталь) стандартная пробоподготовка

ПРИМЕЧАНИЕ: Малондиальдегид (MDA) нестабилен и коммерчески недоступен. Тем не менее, существуют различные химические формы MDA, которые коммерчески доступны, такие как соль тетрабутиламмония MDA, MDA бис (диметилацеталь) и MDA бис (диэтилацетал). Из этих трех химических форм здесь используется MDA бис (диметилацеталь), потому что в большинстве исследований используется этот же стандарт21,22. Если вы решите использовать две другие химические формы MDA, следует провести предварительную проверку их пригодности.

  1. Приготовьте 550 мкМ раствора MDA бис (диметилацетал) путем разбавления 92 мкл чистого MDA-биса (диметилацетала) в 1 л воды DI. Используйте магнитный перемешивание, чтобы тщательно перемешать раствор в течение 10 минут. Хранить раствор при температуре 4 °C и использовать в течение 1 месяца.
  2. Приготовьте 200 мкМ MDA бис (диметилацеталь), разбавив 726 мкл из 550 мкМ MDA бис (диметилацеталь) в 1274 мкл воды DI. Этот 200 мкМ раствор МДА бис (диметилацеталь) следует готовить свежим каждый раз, когда проводится анализ TBARS.
  3. Стандартная кривая подготовки: возьмите восемь полипропиленовых трубок с защелкивающейся крышкой 2 мл и нанесите на них маркировку буквами от А до Н. Добавьте MDA-бис (диметилацетал) из запаса 200 мкМ и разбавьте в воде, как описано в таблице 1.
  4. Возьмите восемь стеклянных трубок (13 мм х 100 мм) и нанесите на них маркировку A–H, затем добавьте 100 мкл стандарта к соответствующим трубкам. Выполните шесть реплик для пустого стандарта (образец А) для расчета пределов обнаружения анализа TBARS.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол может быть приостановлен здесь не более чем на 1 ч.

4. Анализ TBARS

ПРИМЕЧАНИЕ: После того, как анализ TBARS запущен, он должен быть завершен без остановки.

  1. Возьмите столько стеклянных трубок, сколько необходимо для количества образцов, подлежащих анализу, и пометьте их названиями образцов. Затем добавьте 100 мкл каждого подготовленного образца (как описано выше) в каждую стеклянную трубку.
  2. Добавьте 200 мкл 8,1% SDS к каждому образцу и стандарту и осторожно покрутите стеклянную трубку круговыми движениями, чтобы перемешать образец.
  3. Добавьте 1,5 мл буфера ацетата натрия 3,5 М (рН = 4) к каждому образцу и стандарту.
  4. Добавьте 1,5 мл водного 0,8% раствора тиобарбитуровой кислоты (рН = 4) к каждому образцу и стандарту.
  5. Доведите конечный объем до 4 мл для каждого образца и стандарта, добавив 700 мкл воды DI.
  6. Плотно закрывают каждую стеклянную трубку и инкубируют в нагревательном блоке, установленном на 95 °C в течение 1 ч. Накройте стеклянные трубки алюминиевой фольгой, чтобы предотвратить конденсацию в верхней части трубок.
  7. Снимите стеклянные трубки с нагревательного блока и высиживайте на льду в течение 30 минут.
  8. Образцы и стандарты центрифуги при 1500 х г в течение 10 мин при 4 °C. После центрифугирования храните стеклянные трубки, содержащие образцы и стандарты, на RT.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Сохранение образцов на льду или при температуре 4°C приведет к выпадению в осадок всего образца или стандарта.
  9. Сразу после центрифугирования аликвотируют 150 мкл супернатанта из каждой трубки и помещают в отдельную лунку из 96 луночной пластины.
  10. Удалите пузырьки из каждой скважины с помощью наконечника пипетки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Наличие пузырьков приведет к непоследовательным показаниям абсорбции, что приведет к высокой неточности анализа.
  11. Считывание поглощений при 532 нм. Вычтите среднее показание поглощения пустых образцов из всех других показаний поглощения.
  12. Создайте стандартную кривую, построив показания поглощения с пустым вычитанием при 532 нм по сравнению с известной концентрацией каждого стандарта. Подгонка точек данных с помощью линейной регрессии. Рассчитайте неизвестные концентрации образцов с помощью уравнения линейной линии регрессии, полученной из стандартной кривой.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

В кислых условиях (рН = 4) и при 95 °C малониальдегид (MDA) бис (диметилацеталь) дает MDA23. MDA и тесно связанные с ним химические конгенеры реагируют с двумя молекулами тиобарбитуровой кислоты (TBA) с образованием соединений, называемых реакционноспособными веществами тиобарбитуровой кислоты (TBARS), которые придают красно-розовый цвет и имеют поглощение λmax при 532 нм (Рисунок 1, Рисунок 2). Используя MDA bis (диметилацеталь) в качестве стандарта, были сгенерированы стандартные кривые (рисунок 3, таблица 1) для определения пределов обнаружения и чувствительности анализа и уровней окисления в трех различных биологических образцах. В общей сложности было проведено девять анализов TBARS для определения уровней окисления в трех разных образцах в разные дни. Таким образом, было сгенерировано в общей сложности девять стандартных кривых, как показано на рисунке 3. Процедура наименьших квадратов24 использовалась для определения стандартных отклонений наклона и y-перехвата, которые составляли 8,67 х 10-6 и 5,66 х 10-4 соответственно.

Пределы обнаружения анализа TBARS определяли в соответствии со стандартными аналитическими процедурами25 путем измерения поглощений пустых образцов (шесть экспериментальных реплик с двумя техническими репликами на экспериментальную реплику) в течение трех разных дней. Минимальный различимый аналитический сигнал (Sm) определяли суммированием среднего значения пустого сигнала (S̄bl) плюс кратное k стандартного отклонения заготовки (ksbl), где k = 3. То есть Sm = S̄bl+ ksbl. Используя Sm и наклон стандартной кривой (m), предел обнаружения (cm) был рассчитан как cm = (Sm - S̄bl)/m. Полученные данные по пустым образцам за три разных дня показывают, что минимальная концентрация вещества TBARS, необходимая для подачи обнаруживаемого сигнала непоглощающего шума, составляет 1,1 мкМ (таблица 2). Чувствительность анализа TBARS составляет около 0,00160 единиц поглощения/мкМ, что является способностью анализа различать различия в концентрации анализируемого вещества (таблица 2).

Чтобы проиллюстрировать применимость анализа TBARS в обнаружении изменений перекисного окисления липидов в различных биологических матрицах, CuCl2 использовался для индуцирования окисления in vitro сыворотки крови человека, лизатов клеток HepG2 и липопротеинов низкой плотности. Эти биологические образцы, используемые здесь, являются прототипами биологических матриц. Например, основываясь на результатах, представленных здесь для лизатов клеток HepG2, разумно ожидать, что этот анализ будет работать с другими типами лизата клеток; однако для этой цели его необходимо будет провести аналитическую проверку. Кроме того, из трех биологических матриц, используемых здесь, некоторые типы образцов обычно демонстрируют низкие эндогенные концентрации TBARS. Например, TBARS для лизатов клеток HepG2, которые не обрабатывались CuCl2 , были чуть выше предела обнаружения анализа (около 2 мкМ; Рисунок 4). Как и следовало ожидать при наличии низкого отношения сигнал/шум, стандартное отклонение и коэффициент вариации для данного конкретного образца являются относительно высокими (таблица 3). Однако по мере увеличения сигнала в результате опосредованного Cu(II) окисления коэффициент вариации становится ниже. В целом, по мере увеличения абсорбции сверх предела обнаружения, воспроизводимость анализа улучшается (таблица 3).

Для целей этого протокола не было никакого желания использовать антиоксиданты для маскировки in vitro Cu(II)-опосредованного окисления биологических образцов. Коммерчески приготовленные липопротеины низкой плотности (ЛПНП) могут содержать 0,01% ЭДТА. ЭДТА предотвращает Cu(II)-опосредованное окисление ЛПНП, но не обязательно другие реакции окисления, опосредованные металлами26,27. Анализ TBARS проводился на образцах ЛПНП, содержащих ЭДТА, и уровни TBARS не изменялись между образцами ЛПНП, обработанными Cu(II), и необработанными образцами ЛПНП (рисунок 5A). Однако после того, как ЭДТА удаляли спиновой фильтрацией (см. этап 1.2.3–1.2.5), ЛПНП подвергался Cu(II)-опосредованному окислению, обнаруженному анализом TBARS (рисунок 5B).

Нормальный диапазон продуктов перекисного окисления липидов в сыворотке крови человека от здоровых доноров, выраженный в терминах MDA, составляет от 1,80 до 3,94 мкМ28. Чтобы проиллюстрировать динамический диапазон анализа TBARS в сыворотке крови человека, к образцам добавляли концентрацию ионов 2 мМ Cu(II) с последующей инкубацией в течение 24 ч при 37 °C. Это привело к увеличению TBARS в 6–7 раз (рисунок 6).

Figure 1
Рисунок 1: Схема анализа реакционноспособных веществ тиобарбитуровой кислоты.
Сто микролитров образца или стандарта добавляют в стеклянную трубку размером 13 мм х 100 мм с последующим добавлением реагентов химически активных веществ тиобарбитуровой кислоты (TBARS). После инкубации при 95 °C в течение 1 ч образцы и стандарты инкубируют во льду в течение 30 мин, затем центрифугируют при 1 500 х г в течение 10 мин при 4°С. Сто пятьдесят микролитров образца или стандартного супернатанта загружаются на пластину 96 скважин, а поглощение измеряется при 532 нм. Неизвестная концентрация образца рассчитывается с использованием уравнения стандартной кривой. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 2
Рисунок 2: Реакция реакционноспособных веществ архетипа тиобарбитуровой кислоты.
Малондальдиальдегид бис (диметилацеталь) дает малондиальдегид под катализируемым кислотой гидролизом1. Высвобождаемый малондиальдегид (MDA) затем реагирует с двумя молекулами 2-тиобарбитуровой кислоты (TBA) (pH = 4 и 95 °C) с образованием аддуктов MDA-TBA2, которые дают красно-розовый цвет и могут быть измерены спектрофотометрически при 532 нм. Поскольку другие молекулы, помимо MDA, которые получены из окисленных липидов, также могут реагировать с TBA, измерение поглощения при 532 нм просто называется измерением активных веществ тиобарбитуровой кислоты или TBARS. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 3
Рисунок 3: Малондиальдегидные бис(диметилацеталь) колориметрические стандартные кривые.
На рисунке показаны девять стандартных кривых, созданных в разные дни. Некоторые точки перекрываются и не могут быть отличимы друг от друга. Малонциальдегид бис (диметилацеталь) обогащен калибраторными образцами при 0, 2,5, 5, 10, 20, 40, 80 и 160 мкМ (как показано в таблице 1; n = 1 на точку концентрации в день). Поглощение измерялось при 532 нм, при этом среднее поглощение пустых образцов вычиталось из всех измерений в этой партии, включая неизвестные. Каждый день уравнение, генерируемое линейной регрессией наименьших квадратов, использовалось для определения TBARS в биологических образцах. Для всех девяти стандартных кривых вместе взятых стандартное отклонение наклона составляло 8,67 х 10-6, а стандартное отклонение Y-перехвата составляло 5,66 х 10-4. Стандартные отклонения наклона и y-перехвата были рассчитаны с использованием процедуры наименьших квадратов24. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 4
Рисунок 4: Окисление в лизатах HepG2, обнаруженное TBARS.
Шесть образцов лизата клеток HepG2 инкубировали с 2 мМ CuCl2 [лизат клеток HepG2 + 2 мМ Cu(II)] и шесть образцов инкубировали в растворе без CuCl2 (лизат клеток HepG2) в течение 24 ч при 37 °C. После инкубации анализ TBARS был выполнен на 12 образцах. Эта процедура повторялась 2 раза в течение трех разных дней. Полосы ошибок представляют SD. Звездочка указывает на статистически значимые различия между контрольными и Cu(II)-обработанными лизатами (p < 0,001). Статистическая значимость была определена с помощью теста Манна Уитни U в GraphPad. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 5
Рисунок 5: Окисление липопротеинов низкой плотности, обнаруженное TBARS.
(A) Анализ TBARS, проведенный в образцах ЛПНП, содержащих 0,01% ЭДТА. Шесть образцов ЛПНП инкубировали с 10 мкМ CuCl2 [ЛПНП + 10 мкМ Cu(II)], а шесть образцов инкубировали с контрольным раствором без добавления CuCl2 (нативный ЛПНП) в течение 2 ч при 37 °C. Затем на 12 образцах был проведен анализ TBARS. "ns" не представляет статистической значимости. (B) ЛПНП был отфильтрован спином с использованием центробежного устройства спинового фильтра для удаления ЭДТА. Затем инкубацию с добавлением Cu(II) и без него снова выполняли, как описано для (A). Анализ TBARS был выполнен сразу после этого. Эту же процедуру повторяли 2 раза в общей сложности 3 дня. Полосы погрешностей представляют собой SD. Звездочка указывает на статистически значимые различия между контрольными и Обработанными Cu(II) образцами ЛПНП (p < 0,001). Статистическая значимость была определена с помощью теста Манна Уитни U в GraphPad. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 6
Рисунок 6: Перекисное окисление липидов в образцах сыворотки крови человека, обнаруженных TBARS.
Шесть образцов сыворотки крови человека инкубировали с 2 мМ CuCl2 [сыворотка + 2 мМ Cu(II)], а шесть образцов инкубировали с раствором, в котором не было добавлено CuCl2 (нормальная сыворотка) в течение 24 ч при 37 °C. После инкубации анализ TBARS был выполнен на 12 образцах. Эта процедура повторялась в течение двух дополнительных дней. Полосы погрешностей представляют SD. Звездочка указывает на статистически значимые различия между контрольными и Обработанными Cu(II) образцами сыворотки (p < 0,001). Статистическая значимость была определена с помощью теста Манна Уитни U в GraphPad. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Стеклянная трубка 200 мкМ MDA бис (диметилацеталь) (мкл) Вода (мкл) Конечная концентрация MDA-бис (диметилацеталь) (мкМ)
Аа 0 1000 0
B 12.5 987.5 2.5
C 25 975 5
D 50 950 10
E 100 900 20
F 200 800 40
G 400 600 80
H 800 200 160

Таблица 1: Маландиальдегид бис(диметилацеталь) стандартный пробоподготовка. Из свежеприготовленного 200 мкМ малониальдегида бис (диметилацеталь) аликвотируют предложенные объемы для достижения конечной концентрации для стандартной кривой. Рекомендуется выполнять не менее шести реплик пустого образца (А) в день для определения пределов обнаружения метода.

День Абсорбанса Сблб Smc Чувствительность (единицы поглощения/мкМ)d cm (мкМ)e
1 (n = 6) 0.0412 0.000612 0.0430 0.00160 1.14
2 (n = 6) 0.0415 0.000632 0.0433 0.00160 1.18
3 (n = 6) 0.0413 0.000605 0.0431 0.00160 1.13
Все три дня (n = 18) 0.0413 0.000589 0.0431 0.00160 1.10
a Поглощение заготовок образцов в течение трех разных дней с 6 репликами в день.
bSbl = стандартное отклонение поглощения заготовленных образцов.
cSm = Минимальный различимый аналитический сигнал, который определялся суммированием среднего значения пустого сигнала (S̄bl) плюс кратное k стандартного отклонения заготовки (ksbl), где k = 3. То есть; Sm = S̄bl + ksbl.
г Чувствительность анализа TBARS, который является наклоном стандартной кривой.
ecm = Пределы обнаружения, которые были рассчитаны как cm = (Sm - S̄bl)⁄m, где m = наклон стандартной кривой.

Таблица 2: Пределы обнаружения анализа TBARS.

Липопротеины низкой плотности Сыворотка для человека HepG2 Клеточный лизат
День % резюме День % резюме День % резюме
1 (n = 6) 5.6 1 (n = 6) 7.9 1 (n = 6) 12.6
2 (n = 6) 5.4 2 (n = 6) 7.2 2 (n = 6) 15.8
3 (n = 6) 3.9 3 (n = 6) 7.0 3 (n = 6) 17.7
Все три дня (n = 18)a 7.4 Все три дня (n = 18) 9.8 Все три дня (n = 18) 15.5б
С 10 мкМ CuCl2 С 2 мМ CuCl2 С 2 мМ CuCl2
1 (n = 6) 4.5 1 (n = 6) 6.0 1 (n = 6) 5.8
2 (n = 6) 6.5 2 (n = 6) 4.3 2 (n = 6) 6.0
3 (n = 6) 6.7 3 (n = 6) 6.2 3 (n = 6) 8.0
Все три дня (n = 18) 6.1 Все три дня (n = 18) 5.6 Все три дня (n = 18) 7.3
a Междневная точность была рассчитана путем объединения данных за все три дня.
б Точность была ограничена из-за результатов, близких к анализу LOD.

Таблица 3: Аналитическая воспроизводимость ТБАРС в трех различных биологических образцах.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Несмотря на свои ограничения1,3,4,7,8,9,10,12,13,14,15,19 и недостаточную пригодность для сравнения между лабораториями, анализ TBARS является одним из старейших29,30 но наиболее широко используются анализы для измерения окислительного стресса в биологических образцах. Анализ TBARS является простым методом, который занимает всего около 2 часов, после того, как все необходимые реагенты были подготовлены. Здесь мы подробно описали, как этот анализ, включая стандартную кривую, может быть выполнен много раз экономичным способом (около 3,50 долларов США за 96 образцов), без необходимости покупать дорогой комплект для каждой партии образцов.

Все этапы анализа имеют решающее значение, но есть некоторые шаги, которые требуют дополнительного внимания. Например, рН тиобарбитуровой кислоты не должен быть выше 4. Следует принять меры предосторожности при добавлении раствора гидроксида натрия к тиобарбитуровой кислоте и избегать получения рН более 4. Для возникновения реакции между MDA и TBA требуется кислая среда, а стандарт MDA высвобождается из MDA bis (диметилацетал) путем катализируемого кислотой гидролиза. Следовательно, высокий рН может привести к непредсказуемым и сильно изменчивым результатам31.

Кроме того, хотя это может быть очевидно для некоторых читателей, также важно удалить любые пузырьки в пластине 96 лунки перед измерением поглощения. Наличие пузырьков даст высокие значения поглощения и различия между репликациями, что приведет к высокому проценту CV. Кроме того, после инкубации 1 ч при 95 °C образцы не следует инкубировать дольше 30 минут на льду, поскольку это приведет к осаждению всего образца, и сбор супернатанта без осадков будет трудно осуществить. Примечательно, что после начала анализа TBARS нет хороших остановочных пунктов. Он должен быть завершен после инициирования. Наконец, есть много возможных методологических вариаций, которые могут быть применены к этому анализу. Общий протокол, описанный здесь, может быть дополнительно адаптирован (и проверен) для конкретных применений, включая те, в которых требуется добавление радикальных поглотителей или других типов антиоксидантов перед анализом.

Хотя анализ TBARS популярен, важно понимать, что он не является молекулярно специфическим анализом. Многочисленные химически активные карбонилсодержащие органические молекулы, в том числе полученные из окисленных биомолекул, отличных от липидов, могут вступать в реакцию с ТБА и, таким образом, подсчитываются как TBARS1,32,33,34. Кроме того, пределы обнаружения анализа TBARS на основе поглощения не становятся намного лучше, чем около 1,1 мкМ, как определено этим методом. Однако пределы обнаружения могут быть улучшены с помощью других методов обнаружения. Например, спектрофторометрия с возбуждением при 520 нм и излучением при 550 нм обеспечивает более высокую чувствительность и лучшие пределы обнаружения, как ранее предлагали Jo и Ahn35. Методы, основанные на масс-спектрометрии, могут значительно улучшить как специфичность, так и пределы обнаружения. Например, для обнаружения пентафторбензилового производного MDA в образцах сыворотки и мочи человека в образцах сыворотки и мочи человека использовался метод GC-MS/MS с электронно-захватным методом отрицательной ионной химической ионизации (ECNICI) с пределами обнаружения 2 x 10-18 моль MDA на колонке36. Здесь хроматографическое разделение в сочетании с тандемной масс-спектрометрией также значительно улучшает молекулярную специфичность анализа.

Тем не менее, как и в случае с другими измерениями окислительных процессов в биологических образцах37,38, преаналитическая обработка образцов имеет решающее значение для результатов измерений TBARS. Например, хранение плазмы крови при -20 °C приводит к медленному, но резкому увеличению концентраций MDA39,40. Таким образом, следует предположить, что воздействие биологических образцов на размороженные или даже частично размороженные условия в течение чего-либо, кроме минимального периода времени, вызывает артефактное повышение уровня TBARS. Это означает, что даже умеренной изменчивости в преаналитической обработке и хранении биообразцов, которые следует сравнивать с помощью анализа TBARS, следует избегать.

Учитывая эти предостережения, связанные с преаналитической изменчивостью, а также ограниченной чувствительностью и специфичностью, рекомендуется, чтобы анализ TBARS на основе поглощения использовался только для внутрилабораторной общей оценки или экспериментов по определению диапазона. Эти приложения включают исследования, в которых относительные уровни TBARS напрямую сравниваются между одной или несколькими группами биологически сходных образцов, которые обрабатываются или хранятся вместе и разделяются только одной переменной, которая полностью контролируется исследователями.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы не имеют конкурирующих финансовых интересов или других конфликтов интересов для раскрытия.

Acknowledgments

Исследование, представленное здесь, было частично поддержано Национальным институтом рака Национальных институтов здравоохранения под номером премии. R33 CA217702 и программа «Инициатива по максимальному развитию студентов» (IMSD). Содержание является исключительной ответственностью авторов и не обязательно представляет официальную точку зрения Национальных институтов здравоохранения.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1x Sterile PBS pH 7.4 1 L VWR, PA 101642--262 cell lysis reagent
50 mL self-standing centrifuge tube Corning, NY CLS430897 General material
96 well plate, Non-Treated, clear, with lid, Non-sterile Thermo Fisher Scientific, MA 280895 To measure absorbance
Amicon Ultra-0.5 100 kD centrifugal spin filter device Fisher Scientific, NH UFC510024 LDL purification
Caps for glass tubes Thermo Fisher Scientific, MA 14-930-15D for TBARS assay
Copper II Chloride SIGMA, MO 222011-250G to induce oxidation
Culture tubes, Disposable, with Screw-Cap Finish, Borosilicate Glass (13 x 100 mm) VWR, PA 53283-800 for TBARS assay
Eagle's Minimum Essential Medium (EMEM) ATCC, VA HB-8065 HepG2 cell media
Eppendorf Safe-Lock Tubes, 1.5 mL eppendorf, NY 22363204 General material
Eppendorf Safe-Lock Tubes, 2.0 mL Genesee Sceitific, CA 22363352 General material
Fetal Bovine Serum US Source Omega Scientific, CA FB-11 for cell culture
Glacial Acetic Acid SIGMA, MO 27225-1L-R TBARS Reagent
Halt Protease Inhibitor Cocktail (100x) Thermo Scientific, MA 87786 cell lysis reagent
HEPES SIGMA, MO H3375-250G LDL solvent
HepG2 Cells ATCC, VA HB-8065 Biological matrix prototype
Hydrocloric acid (HCl) Fisher Scientific, NH A144-212 cell lysis reagent
Legend Micro 17 Centrifuge Thermo Scientific, MA 75002431 General material
Low Density Lipoprotein, Human Plasma Athens Research & Technology, GA 12-16-120412 Biological matrix prototype
Magnetic Stir Bars, Octagon 6-Assortment VWR, PA 58948-025 General material
Malondialdehyde bis (dimethyl acetal) SIGMA, MO 8207560250 TBARS Standard
Multiskan Go Microplate Spectrophotometer Fisher Scientific, NH 51119200 To measure absorbance
NP-40 EMD Millipore Corp, MA 492016-100ML cell lysis reagent
Sodium Chloride SIGMA, MO S7653-1KG cell lysis reagent
Sodium dodecyl sulfate (SDS) SIGMA, MO 436143-100G TBARS Reagent
Sodium hydroxide SIGMA, MO 367176-2.5KG TBARS Reagent
SpeedVac Concentrator Thermo Scientific, MA SC250EXP For concentrating cell lysates
T-75 Flask, Tissue Culture Treated, 250 mL, w/filter cap USA Scientific, FL 658175 cell culture
Thiobarbituric Acid SIGMA, MO T5500-100G TBARS Reagent
TRIS base Fluka, GA 93362 cell lysis reagent
Trypsin (1x) VWR, PA 16777-166 To detach HepG2 cells

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Tsikas, D. Assessment of lipid peroxidation by measuring malondialdehyde (MDA) and relatives in biological samples: Analytical and biological challenges. Analytical Biochemistry. 524, 13-30 (2017).
  2. Ohkawa, H., Ohishi, N., Yagi, K. Reaction of linoleic acid hydroperoxide with thiobarbituric acid. Journal of Lipid Research. 19 (8), 1053-1057 (1978).
  3. Khoubnasabjafari, M., Soleymani, J., Jouyban, A. Avoid Using Spectrophotometric Determination of Malondialdehyde as a Biomarker of Oxidative Stress. Biomarkers in Medicine. 12 (6), 551-554 (2018).
  4. Morales, M., Munné-Bosch, S. Malondialdehyde: Facts and artifacts. Plant Physiology. 180 (3), 1246-1250 (2019).
  5. Devasagayam, T. P. A., Boloor, K. K., Ramasarma, T. Methods for estimating lipid peroxidation: An analysis of merits and demerits. Indian Journal of Biochemistry and Biophysics. 40 (5), 300-308 (2003).
  6. Dasgupta, A., Klein, K. Methods for Measuring Oxidative Stress in the Laboratory. Antioxidants in Food, Vitamins and Supplements. , 19-40 (2014).
  7. Wade, C. R., van Rij, A. M. Plasma malondialdehyde, lipid peroxides, and the thiobarbituric acid reaction. Clinical Chemistry. 35 (2), 336-336 (1989).
  8. Khoubnasabjafari, M., Ansarin, K., Jouyban, A. Reliability of malondialdehyde as a biomarker of oxidative stress in psychological disorders. BioImpacts. 5 (3), 123-127 (2015).
  9. Khoubnasabjafari, M., Ansarin, K., Jouyban, A. Comments Concerning "Comparison of Airway and Systemic Malondialdehyde Levels for Assessment of Oxidative Stress in Cystic Fibrosis". Lung. 193 (5), 867-868 (2015).
  10. Khoubnasabjafari, M., Ansarin, K., Vaez-Gharamaleki, J., Jouyban, A. Comments on "Salivary 8-hydroxy-2-deoxyguanosine, malondialdehyde, vitamin C, and vitamin E in oral pre-cancer and cancer: diagnostic value and free radical mechanism of action". Clinical Oral Investigations. 20 (2), 395-396 (2016).
  11. Khoubnasabjafari, M., Ansarin, K., Jouyban, A. Comments on "An Investigation into the Serum Thioredoxin Superoxide Dismutase, Malondialdehyde, and Advanced Oxidation Protein Products in Patients with Breast Cancer". Annals of Surgical Oncology. 24, 573-576 (2017).
  12. Azizi, S., et al. Effects of analytical procedures on the repeatability of malondialdehyde determinations in biological samples. Pharmaceutical Sciences. 23 (3), 193-197 (2017).
  13. Azizi, S., et al. A possible reason for the low reproducibility of malondialdehyde determinations in biological samples. Bioanalysis. 8 (21), 2179-2181 (2016).
  14. Wasowicz, W., Neve, J., Peretz, A. Optimized steps in fluorometric determination of thiobarbituric acid- reactive substances in serum: Importance of extraction pH and influence of sample preservation and storage. Clinical Chemistry. 39 (12), 2522-2526 (1993).
  15. Jentzsch, A. M., Bachmann, H., Fürst, P., Biesalski, H. K. Improved analysis of malondialdehyde in human body fluids. Free Radical Biology and Medicine. 20 (2), 251-256 (1996).
  16. Buege, J. A., Aust, S. D. Microsomal lipid peroxidation. Methods in Enzymology. 52, 302-310 (1978).
  17. Gutteridge, J. M. C. Free-Radical Damage to Lipids, Amino-Acids, Carbohydrates and Nucleic-Acids Determined by Thiobarbituric Acid Reactivity. International Journal of Biochemistry. 14 (7), 649-653 (1982).
  18. Khoubnasabjafari, M., Ansarin, K., Jouyban, A. Salivary malondialdehyde as an oxidative stress biomarker in oral and systemic diseases. J Dent Res Dent Clin Dent Prospects. 10 (2), 71-74 (2016).
  19. Halliwell, B., Whiteman, M. Measuring reactive species and oxidative damage in vivo and in cell culture: How should you do it and what do the results mean. British Journal of Pharmacology. 142 (2), 231-255 (2004).
  20. Lee, R., et al. Evaluating oxidative stress in human cardiovascular disease: methodological aspects and considerations. Current medicinal chemistry. 19 (16), 2504-2520 (2012).
  21. Morel, D. W., Hessler, J. R., Chisolm, G. M. Low density lipoprotein cytotoxicity induced by free radical peroxidation of lipid. Journal of Lipid Research. 24 (8), 1070-1076 (1983).
  22. Guzmán-Chozas, M., Vicario-Romero, I. M., Guillén-Sans, R. 2-thiobarbituric acid test for lipid oxidation in food: Synthesis and spectroscopic study of 2-thiobarbituric acid-malonaldehyde adduct. Journal of the American Oil Chemists Society. 75 (12), 1711-1715 (1998).
  23. Shibata, T., et al. Identification of a lipid peroxidation product as a potential trigger of the p53 pathway. Journal of Biological Chemistry. 28 (2), 1196-1204 (2006).
  24. Skoog, D. A., West, D. M., Holler, F. J., Crouch, S. R. Sampling, standardization, and calibration. Fundamentals of Analytical Chemistry. 9th ed. , Cengage - Brooks/Cole. Belmont, CA. Ch. 7 153-196 (2014).
  25. Skoog, D. A., Holler, F. J., Crouch, S. R. Introduction. Principles of Instrumental Analysis. 6th ed. , Cengage - Brooks/Cole. Belmont, CA. Ch. 1 1-24 (2007).
  26. Seibig, S., Van Eldik, R. Kinetics of [FeII(edta)] Oxidation by Molecular Oxygen Revisited. New Evidence for a Multistep Mechanism. Inorganic Chemistry. 36 (18), 4115-4120 (1997).
  27. Jeffs, J. W., et al. Delta-S-Cys-Albumin: A Lab Test that Quantifies Cumulative Exposure of Archived Human Blood Plasma and Serum Samples to Thawed Conditions. Molecular & Cellular Proteomics. 18 (10), 2121-2137 (2019).
  28. Yagi, K. Simple Assay for the Level of Total Lipid Peroxides in Serum or Plasma. Free Radical and Antioxidant Protocols. Methods in Molecular Biology. Armstrong, D. , Humana Press. Totowa, NJ. 101-106 (1998).
  29. Bernheim, F., Bernheim, M. L. C., Wilbur, K. M. The reaction between thiobarbituric acid and the oxidation products of certain lipides. Journal of Biological Chemistry. 174 (1), 257-264 (1948).
  30. Wilbur, K. M., Bernheim, F., Shapiro, O. W. The thiobarbituric acid reagent as a test for the oxidation of unsaturated fatty acids by various agents. Archives of Biochemistry. 24 (2), 305-313 (1949).
  31. Kwon, T. W., Watts, B. M. Determination of malonaldehyde by ultraviolet spectrophotometry. Journal of Food Science. 28 (6), 627-630 (1963).
  32. Esterbauer, H., Schaur, F. J., Zollner, H. Chemistry and biochemistry of 4-hydroxynonenal, malonaldehyde and related aldehydes. Free Radical Biology & Medicine. 11 (1), 81-128 (1991).
  33. Dalle-Donne, I., Rossi, R., Colombo, R., Giustarini, D., Milzani, A. Biomarkers of oxidative damage in human disease. Clinical Chemistry. 52 (4), 601-623 (2006).
  34. Jentzsch, A. M., Bachmann, H., Fürst, P., Biesalski, H. K. Improved analysis of malondialdehyde in human body fluids. Free Radical Biology and Medicine. 20 (2), 251-256 (1996).
  35. Jo, C., Ahn, D. U. Fluorometric Analysis of 2-Thiobarbituric Acid Reactive Substances in Turkey. Poultry Science. 77 (3), 475-480 (1998).
  36. Tsikas, D., et al. Development, validation and biomedical applications of stable-isotope dilution GC-MS and GC-MS/MS techniques for circulating malondialdehyde (MDA) after pentafluorobenzyl bromide derivatization: MDA as a biomarker of oxidative stress and its relation to 15(S)-8-iso-prostaglandin F2α and nitric oxide (NO). Journal of Chromatography. B, Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 1019, 95-111 (2016).
  37. Barden, A. E., Mas, E., Croft, K. D., Phillips, M., Mori, T. A. Minimizing artifactual elevation of lipid peroxidation products (F 2-isoprostanes) in plasma during collection and storage. Analytical Biochemistry. 449 (1), 129-131 (2014).
  38. Jeffs, J. W., Ferdosi, S., Yassine, H. N., Borges, C. R. Ex vivo instability of glycated albumin: A role for autoxidative glycation. Archives of Biochemistry and Biophysics. 629, 36-42 (2017).
  39. Lee, D. M. Malondialdehyde in Stored Plasma. Biochemical and Biophysical Research Communications. 95 (4), 1663-1672 (1980).
  40. Tsikas, D., et al. Simultaneous GC-MS/MS measurement of malondialdehyde and 4-hydroxy-2-nonenal in human plasma: Effects of long-term L-arginine administration. Analytical Biochemistry. 524, 31-44 (2017).

Tags

Химия выпуск 159 реакционноспособные вещества тиобарбитуровой кислоты TBARS окисление перекисное окисление липидов малондиальдегид MDA тиобарбитуровая кислота TBA окислительный стресс
Оценка окислительного стресса в биологических образцах с использованием анализа химически активных веществ тиобарбитуровой кислоты
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Aguilar Diaz De Leon, J., Borges, C. More

Aguilar Diaz De Leon, J., Borges, C. R. Evaluation of Oxidative Stress in Biological Samples Using the Thiobarbituric Acid Reactive Substances Assay. J. Vis. Exp. (159), e61122, doi:10.3791/61122 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter