Summary
Målet med analysen af reaktive stoffer af thiobarbitursyre er at vurdere oxidativ stress i biologiske prøver ved at måle produktionen af lipidperoxideringsprodukter, primært malondialdehyd, ved hjælp af synlig bølgelængdespektrofotometri ved 532 nm. Den metode, der er beskrevet her, kan anvendes på humane serum, cellelyater og lipoproteiner med lav densitet.
Abstract
På trods af sin begrænsede analytiske specificitet og robusthed er analysen af thiobarbiturinsyreaktive stoffer (TBARS) blevet meget anvendt som en generisk måling af lipidperoxidation i biologiske væsker. Det betragtes ofte som en god indikator for niveauet af oxidativ stress i en biologisk prøve, forudsat at prøven er blevet håndteret og opbevaret korrekt. Analysen indebærer reaktion af lipidperoxidation produkter, primært malondialdehyd (MDA), med thiobarbituric syre (TBA), hvilket fører til dannelsen af MDA-TBA2 adducts kaldet TBARS. TBARS giver en rød-pink farve, der kan måles spektrotometrisk ved 532 nm. TBARS-analysen udføres under sure forhold (pH = 4) og ved 95 °C. Ren MDA er ustabil, men disse betingelser tillader frigivelse af MDA fra MDA bis(dimethyl acetal), som bruges som analytisk standard i denne metode. TBARS-analysen er en enkel metode, der kan afsluttes på ca. 2 timer. Fremstilling af assay reagenser er beskrevet i detaljer her. Budget-bevidste forskere kan bruge disse reagenser til flere eksperimenter til en lav pris i stedet for at købe en dyr TBARS assay kit, der kun tillader opførelse af en enkelt standard kurve (og dermed kun kan bruges til ét eksperiment). Anvendeligheden af denne TBARS assay er vist i human serum, lav densitet lipoproteiner, og celle lysater. Analysen er konsistent og reproducerbar, og grænserne for påvisning af 1,1 μM kan nås. Der gives anbefalinger til anvendelse og fortolkning af den spektrofotometriske TBARS-analyse.
Introduction
Lipidperoxidation er en proces, hvor frie radikaler, såsom reaktive iltarter og reaktive nitrogenarter, angriber kulstof-carbon dobbeltbindinger i lipider, en proces, der involverer indvinding af en brint fra et kulstof og indsættelse af et iltmolekyle. Denne proces fører til en blanding af komplekse produkter, herunder lipid peroxyl radikaler, og hydroperoxider som de primære produkter, samt malondialdehyd (MDA) og 4-hydroxynonenal som fremherskende sekundære produkter1.
MDA har været meget udbredt i biomedicinsk forskning som en markør for lipidperoxidation på grund af sin letkøbte reaktion med thiobarbituric syre (TBA). Reaktionen fører til dannelsen af MDA-TBA2, en konjugat, der absorberer i det synlige spektrum ved 532 nm og producerer en rød-pink farve2. Andre molekyler afledt af lipidperoxidation udover MDA kan også reagere med TBA og absorbere lys ved 532 nm, hvilket bidrager til det samlede absorptionssignal, der måles. Tilsvarende kan MDA reagere med de fleste andre større klasser af biomolekyler, hvilket potentielt begrænser dets tilgængelighed til reaktion med TBA3,4. Som sådan, denne traditionelle analyse er simpelthen anses for at måle "thiobarbituric syre reaktive stoffer" eller TBARS5.
Når TBARS-analysen anvendes og fortolkes korrekt, betragtes den generelt som en god indikator for de samlede niveauer af oxidativ stress i en biologisk prøve6. Desværre, som dokumenteret af Khoubnasabjafari og andre, TBARS assay er ofte gennemført og fortolket på måder, der letter tvivlsomme konklusioner3,4,7,8,9,10,11. Årsagerne til dette er primært forankret i prøve-relaterede præ-analytiske variabler og en mangel på assay robusthed, der forbyder tilsyneladende mindre variationer i assay protokol uden væsentlige ændringer i analysen resultater1,7,12,13.
Præanalytiske variabler i forbindelse med biospecimenhåndtering og -lagring (f.eks. blodplasma, der holdes midlertidigt ved -20 °C)14,15, kan have stor indvirkning på TBARS-analyseresultaterne16,17; så meget, at TBARS-analyseresultater ikke bør sammenlignes på tværs af forskellige laboratorier, medmindre det er berettiget af eksplicitte interlaboratoriske analytiske valideringsdata. Denne anbefaling er beslægtet med, hvordan vestlige blots er almindeligt anvendt og fortolket. Sammenligninger af båndtætheder gælder for undersøgelser inden for blot og måske inden for laboratoriet, men sammenligning af båndtætheder mellem laboratorier betragtes generelt som en ugyldig praksis.
Nogle forskere har foreslået, at MDA målt ved TBARS assay simpelthen ikke opfylder de analytiske eller kliniske kriterier, der kræves af en acceptabel biomarkør3,9,10,18,19. Faktisk, hvis analysen ikke var blevet udviklet over 50 år siden, ville det sandsynligvis ikke have fået den udbredte brug og stiltiende accept, at det har i dag. Selv om der er andre analyser med større analytisk følsomhed, specificitet, og robusthed, der anvendes til bestemmelse af oxidativ stress, TBARS assay baseret på absorbans ved 532 nm forbliver langt en af de mest almindeligt anvendte assays til bestemmelse af lipid peroxidation20, og dermed vurdering af oxidativ stress.
TBARS-analysen kan kun findes som et dyrt sæt (over 400 amerikanske dollars), hvor instruktionerne ikke giver detaljerede oplysninger om de fleste koncentrationer af de anvendte reagenser. Derudover kan de medfølgende reagenser kun bruges til ét eksperiment, fordi der kun kan laves én farvemetrisk standardkurve pr. Sæt. Dette kan være problematisk for forskere, der har til hensigt at bestemme niveauer af oxidation inden for et par prøver på forskellige tidspunkter, fordi den samme standardkurve ikke kan bruges på flere gange. Derfor skal der købes flere kits til flere eksperimenter. I øjeblikket, medmindre en dyr kit er købt, er der ikke en detaljeret protokol til rådighed for, hvordan man udfører en TBARS assay. Nogle forskere i fortiden har vagt beskrevet, hvordan man udfører en TBARS assay21,22, men hverken en fuldt detaljeret protokol eller omfattende video om, hvordan man udfører TBARS assay uden en dyr kit er tilgængelig i litteraturen.
Her rapporterer vi en detaljeret, analytisk valideret til-formål metode om, hvordan man udfører en TBARS assay på en enkel, reproducerbar og billig måde. Ændringer i lipidperoxidation af humane serum, HepG2 lysater, og lav densitet lipoproteiner ved behandling med Cu (II) ioner er demonstreret som illustrative anvendelser for TBARS assay. Resultaterne viser, at denne TBARS-analyse er konsistent og reproducerbar på daglig basis.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Humane serumprøver blev fremstillet af samtykkende frivillige i henhold til IRB's godkendelse og i overensstemmelse med principperne i Helsinki-erklæringen. Prøverne blev kodet og afidentificeret inden overførsel til analyselaboratoriet.
1. Prøveforberedelse
- HepG2 celle lysater
- Frø ca. 10 x 106 HepG2-celler pr. kolbe i 16 T75 kolber med 14 mL EMEM-medier suppleret med 10% fosterkvægsserum (FBS) og vækstceller i 2 dage.
- Forbered RIPA buffer: I et 50 mL rør tilsættes 1,5 mL 5 M NaCl, 2,5 mL 1 M Tris-HCl (pH = 7), 500 μL NP-40 reagens, og bring derefter det endelige volumen til 50 mL med DI-vand.
- Forbered lysis buffer: aliquot 20 mL RIPA buffer i et 50 mL rør og tilsæt 200 μL af en 100x proteasehæmmeropløsning til at hæmme protein- og lipidforringelse. Opbevares ved 4 °C.
BEMÆRK: Lysis buffer er kompatibel med TBARS reagenser og forstyrrer ikke absorbansen ved 532 nm. Hvis du planlægger at bruge en anden lysisbuffer eller tilføje yderligere ingredienser til lysisbufferen, skal der udføres indledende valideringsundersøgelser for at kontrollere, at lysisbufferkomponenter er kompatible med TBARS-analysen. - Fjern medier, der indeholder 10% FBS, og vask cellerne 2x med 5 mL kold, steril 1x PBS.
- Der tilsættes 1 mL lysisbuffer til T75-kolberne, der indeholder cellerne, og inkuberes i 10 min ved stuetemperatur (RT) med konstant hvirvlende for at sikre, at bufferen er godt fordelt.
- Lysater opsamles i passende mærkede 2 mL snap-cap polypropylenrør og inkuberes på is i 10 min.
- Drej lysates ved 5.000 x g i 10 min på RT for at indsamle cellerester og aspirere supernatanter i et enkelt 15 mL rør.
- Koncentratcellelysende supernatant fire gange ved hjælp af en Speed Vac ved 50 °C og 3 mbar og lav aliquots på 94 μL hver i 2 mL snap-cap polypropylenrør. Opbevares prøver ved -80 °C, indtil de anvendes til in vitrooxidation og/eller TBARS-analyse.
BEMÆRK: For at undgå at koncentrere cellelyset supernatant, celler kan også løsnes ved hjælp af 3 mL af 1x trypsin, neutraliseret med 6 mL af medier, og vaskes 2x med 5 mL af kolde PBS. Cellepiller kan derefter rekonstitueres i 250 μL lysisbuffer, og trin 1.1.6 og 1.1.7 kan derefter udføres. - Der fremstilles en 35 mM CuCl2-lageropløsning i eddikesyre (pH = 4).
- Tilberedet eddikesyreopløsning (pH = 4): Fortynd 1 μL i iseddikesyre i 100 ml DI-vand (pH skal være ca. 4, men bekræft dette med en pH-meter). Tilsæt mere vand eller eddikesyre for at justere pH til 4.
- Vægt ca. 0,1936 g kobber II-chlorid ud og opløses i 10 ml eddikesyreopløsning (pH = 4) for at lave en 144 mM CuCl2-bestand . Aliquot 490 μL fra denne opløsning og tilsættes til 1.510 μL eddikesyre (pH = 4) for at lave en 35 mM CuCl2-opløsning .
- Aliquot 6 μL fra 35 mM CuCl2-lageropløsningen og tilsæt den til seks prøver, der indeholder 94 μL cellelysat, for at lave en endelig CuCl2-koncentration på ca. 2 mM. Der tilsættes 6 μL af en eddikesyreopløsning (pH = 4), som ikke har CuCl2 til seks prøver, der indeholder 94 μL cellelytter, der skal anvendes som kontrol. Det sidste volumen af cellelysatet skal være 100 μL, hvilket er, hvad der vil blive brugt til TBARS-analysen.
BEMÆRK: Det er nødvendigt at fremstille 35 mM CuCl2-lageropløsningen i eddikesyre (pH = 4) for at forhindre udfældning af kobberhydroxid. - Inkuberes prøver i en ovn ved 37 °C i 24 timer, og der udføres en TBARS-analyse på hver prøve, der indeholder et endeligt volumen på 100 μL.
- Trin 1.1.9 og 1.1.11 2x gentages på separate dage for at kontrollere reproducerbarheden af TBARS-analysen for HepG2-cellelysater.
- Lipoproteiner med lav densitet
BEMÆRK: Forrenses lipoprotein (LDL) indeholder typisk en vis mængde EDTA. LDL-prøver, der anvendes her, indeholder 0,01% EDTA. EDTA kan hæmme in vitro Cu(II)-medieret oxidation af LDL. Det kan derfor være nødvendigt at fjerne EDTA fra LDL-prøver forud for forsøg eller analyse. Trin 1.2.1–1.2.5 beskriver denne proces.
FORSIGTIG: Natriumhydroxid er ætsende og forårsager irritation i hud og øjne. Brug ordentlige personlige værnemidler.- Aliquot 24 μL fra en 5,51 mg/mL LDL-bestand (proteinkoncentration bestemt ved modificeret Lowry-metode ved hjælp af BSA som standard) til passende mærket 1 mL snap-cap polypropylenrør. Lav så mange aliquots efter behov og opbevares ved 4 °C, indtil de anvendes i oxidations- og/eller TBARS-analyse.
- Forbered en 10 mM HEPES buffer i 0,15 M NaCl justeret til pH = 7 med NaOH perler: opløse 4,39 g NaCl i 0,49 L vand, derefter tilføje 1,19 g HEPES. Opløs godt med en omrørbar. Tilsæt natriumhydroxidperler, indtil pH er 7. Fortynd til 0,5 L med vand. Opbevar bufferen ved 4 °C og anvendes inden for 3 måneder.
- Der tilsættes 476 μL af 10 mM HEPES-bufferen i 0,15 M NaCl (pH = 7) til de aliquoterede LDL-prøver for at bringe det endelige volumen op på 500 μL. Tilsæt fortyndet LDL-prøve til en 0,5 mL centrifugal spin filter enhed med en 100K molekylvægt cutoff.
- Spin prøver ved 14.000 x g i 10 min på RT, hvilket efterlader en endelig retentate volumen på omkring 30 μL. Rekonstituerede prøver i 480 μL af 10 mM HEPES bufferen i 0,15 M NaCl (pH = 7) og spin igen ved 14.000 x g i 10 min ved RT. Udfør dette trin 2x i alt fire spin-throughs.
- Placer filterenheden på hovedet i et nyt 2 mL snap-cap polypropylenrør og centrifuge ved 1000 x g i 2 min for at indsamle LDL-prøve (slutvolumen = ca. 30 μL).
- Aliquotprøven til passende mærket 1 mL-rør og tilsættes 20 μL vand til hver prøve for at opnå et endeligt volumen på 50 μL.
- Fremstilling af 200 μM CuCl2-lageropløsning i eddikesyre (pH = 4)
- Opløsning af eddikesyre (pH = 4): se trin 1.1.9.1.
- Der fremstilles en 144 mM CuCl2-lageropløsning (se trin 1.1.9.2), og derefter 5,5 μL fra 144 mM CuCl2-bestanden og opløses i et sidste volumen på 4 ml eddikesyre (pH = 4) for at fremstille 200 μM-opløsningen.
- Aliquot 2,7 μL fra 200 μM CuCl2-lageropløsningen og tilsæt den til seks prøver, der indeholder 50 μL LDL, for at opnå en endelig CuCl2-koncentration på ~10 μM. Der tilsættes 2,7 μL fra en eddikesyreopløsning (pH = 4), som ikke indeholder CuCl2, til seks prøver, der indeholder 50 μL LDL, og som skal anvendes til kontrollerne.
- Inkuberes LDL-prøver i 2 timer i en ovn ved 37 °C. Efter 2 timer skal det endelige volumen op på 100 μL for hver prøve med 10 mM HEPES-buffer i 0,15 M NaCl (pH = 7). Udfør straks en TBARS-analyse.
- 1.2.3–1.2.9 2x på to forskellige dage for at teste TBARS-analysens reproduktivitet.
- Humant serum
- Fra en human serumprøve fremstilles aliquots på 94 μL hver i 2 mL snap-cap polypropylenrør og opbevares prøver ved -80 °C.
- 35 mM CuCl2-lageropløsning i eddikesyre (pH = 4): se trin 1.1.9.
- Aliquot 6 μL fra CuCl2-lageropløsningen og tilsæt den til seks prøver, der indeholder 94 μL humane serum, for at lave en endelig CuCl2-koncentration på ca. 2 mM. Der tilsættes 6 μL af en eddikesyreopløsning (pH = 4), som ikke har CuCl2 til seks prøver, der indeholder 94 μL humane serum, som skal anvendes som kontrol.
- Inkuberes humane serumprøver i 24 timer i en ovn ved 37 °C, og oxidationsniveauet bestemmes med TBARS-analyse (afsnit 4).
- 1.3.2-1.3.4 2x på to separate dage for at fastslå reproducerbarheden af TBARS-analysen.
2. Reagens forberedelse
FORSIGTIG: Thiobarbituric syre forårsager hud- og øjenirritation og måske skadeligt ved indånding eller hudabsorption. Eddikesyre kan beskadige indre organer, hvis inhaleres. Forbered alle syreopløsninger i en røghætte.
- Præparat af 8,1% (w/v) natrium dodecylsulfatopløsning (SDS)
- Vægt 32,4 g SDS ud og opløses i 350 mL DI-vand i et bægerglas. Brug en magnetisk rørstang til forsigtigt at opløse SDS og undgå at lave bobler. Bring den endelige volumen op på 400 mL med DI-vand og opbevar SDS-opløsning på RT.
BEMÆRK: Her fremstilles overskydende 8,1% SDS-opløsning; For 96 prøver er der dog kun behov for ca. 20 mL af 8,1 % SDS-opløsningen. Forbered denne løsning i henhold til antallet af prøver, der analyseres.
- Vægt 32,4 g SDS ud og opløses i 350 mL DI-vand i et bægerglas. Brug en magnetisk rørstang til forsigtigt at opløse SDS og undgå at lave bobler. Bring den endelige volumen op på 400 mL med DI-vand og opbevar SDS-opløsning på RT.
- Fremstilling af 3,5 M natriumacetatbuffer (pH = 4)
- Fortynd 100 ml istidseddike i 350 ml DI-vand i et bægerglas. Brug en magnetisk omrøringsstang til forsigtigt at opløse den.
- Forbered en 6,5 M NaOH opløsning ved hjælp af natriumhydroxidperler i vand. Opløs 13 g NaOH perler i 40 mL DI vand og bringe til et endeligt volumen på 50 mL med DI vand.
- Tilsæt langsomt ca. 46 ml af 6,5 M NaOH-opløsningen til eddikesyreopløsningen, mens der blandes med rørestangen (dette bør hæve pH-4, men bekræfte ved langsomt at tilføje NaOH-opløsningen, mens du måler ved hjælp af en pH-meter).
- Bring det endelige volumen op på 500 ml med DI-vand, og opbevar natriumacetatbufferen hos RT.
- Fremstilling af 0,8% vandig opløsning af thiobarbitursyre (justeret til pH = 4)
BEMÆRK: I dette trin optimeres tilberedningen af thiobarbitursyre til store mængder, da et stort antal prøver vil blive analyseret (108 prøver, ikke inklusive standarderne). Forbered denne løsning afhængigt af antallet af prøver, der er planlagt til analyse.- Forbered en 5 M natriumhydroxidopløsning ved hjælp af natriumhydroxidperler og vand: Opløs 4 g natriumhydroxidperler i et sidste volumen på 20 ml vand. Opbevar i en plastikbeholder. Denne opløsning skal være frisklavet til hvert parti.
- Vægt 4 g thiobarbitursyre og tilsæt 450 mL DI vand. Brug en magnetisk omrøringsstang til forsigtigt at opløse den.
BEMÆRK: Denne løsning vil i sidste ende blive bragt til en 500 mL samlet volumen. - Mens opløsning thiobarbituric syre med en rørestang, tilsæt (langsomt og på en dråbelig måde) omkring 3 mL af 5 M NaOH opløsning i 100 μL intervaller. Efter tilsætning af NaOH-opløsningen begynder thiobarbitursyrepartiklerne at opløses.
- Hvis thiobarbitursyrepartiklerne stadig ikke er helt opløst, tilsættes mere af 5 M NaOH-opløsningen i 100 μL-trin, indtil alle thiobarbitursyrepartikler er helt opløst. For denne særlige mængde opløsning tilsættes i alt 4 mL af 5 M NaOH-opløsningen for fuldt ud at opløse thiobarbitursyrepartiklerne.
BEMÆRK: Ved denne koncentration vil thiobarbitursyre ikke opløses helt, medmindre pH er næsten 4. - Stop med at tilføje NaOH, når al thiobarbitursyren er helt opløst. Undgå at overskride en pH-pc på 4. Den endelige pH-situation kan verificeres ved at tage 1 μL fra blandings-thiobarbitursyreopløsningen og placere den på pH-papir.
- Bring det endelige volumen op på 500 mL med DI-vand, og opbevar vandig 0,8% thiobarbitursyreopløsning hos RT.
3. Malondialdehyd bis(dimethyl acetal) standard prøvepræparat
BEMÆRK: Malondialdehyd (MDA) er ustabil og ikke kommercielt tilgængelig. Der er dog forskellige kemiske former for MDA, der er kommercielt tilgængelige, såsom MDA tetrabutylammonium salt, MDA bis (dimethyl acetal) og MDA bis (diethyl acetal). Af disse tre kemiske former anvendes MDA bis(dimethyl acetal) her, fordi de fleste undersøgelser bruger den samme standard21,22. Hvis man vælger at anvende de to andre kemiske former for MDA, bør der foretages forudgående validering af deres egnethed.
- Der fremstilles en 550 μM MDA bis(dimethyl acetal) lageropløsning ved at fortynde 92 μL ren MDA bis(dimethyl acetal) i 1 L DI-vand. Brug en magnetisk omrøringsstang til at blande opløsningen grundigt i 10 min. Opbevar opløsningen ved 4 °C og brug inden for 1 måned.
- Der fremstilles en 200 μM MDA bis(dimethyl acetal) ved fortynding af 726 μL fra 550 μM MDA bis(dimethyl acetal) lager i 1274 μL DI vand. Denne 200 μM MDA bis(dimethyl acetal) opløsning skal fremstilles frisk, hver gang der udføres en TBARS-analyse.
- Standardkurvepræparat: Tag otte 2 ml snap-cap polypropylenrør og mærk dem med bogstaverne A til H. Tilsæt MDA bis(dimethyl acetal) fra 200 μM-bestanden og fortynd dem i vand som beskrevet i tabel 1.
- Tag otte glasrør (13 mm x 100 mm) og mærk dem A-H, og tilsæt derefter 100 μL standard til de tilsvarende rør. Udfør seks gentagelser for den tomme standard (prøve A) for at beregne grænserne for påvisning af TBARS-analysen.
BEMÆRK: Protokollen kan sættes på pause her i højst 1 time.
4. TBARS analyse
BEMÆRK: Når TBARS-analysen er startet, skal den være færdig uden at stoppe.
- Tag så mange glasrør efter behov for antallet af prøver, der skal analyseres og mærke dem med navnene på prøverne. Derefter tilsættes 100 μL af hver forberedt prøve (som beskrevet ovenfor) til hvert glasrør.
- Der tilsættes 200 μL på 8,1 % SDS til hver prøve og standard, og hvirvel forsigtigt glasrøret i en cirkulær bevægelse for at blande prøven.
- Der tilsættes 1,5 ml af 3,5 M natriumacetatbufferen (pH = 4) til hver prøve og standard.
- Der tilsættes 1,5 mL af den vandige 0,8 % thiobarbitursyreopløsning (pH = 4) til hver prøve og standard.
- Det endelige volumen skal op på 4 mL for hver prøve og standard ved tilsætning af 700 μL DI-vand.
- Tæt hætte hvert glasrør og inkuberes i en varmeblok, der er indstillet til 95 °C i 1 time. Dæk glasrørene med aluminiumsfolie for at forhindre kondens i toppen af rørene.
- Fjern glasrørene fra varmeblokken og inkuber på is i 30 min.
- Centrifugeprøver og -standarder ved 1500 x g i 10 min ved 4 °C. Efter centrifugering skal glasrørene, der indeholder prøverne og standarderne, opbevares på RT.
BEMÆRK: Hvis prøverne opbevares på is eller ved 4 °C, vil hele prøven eller standarden udfælde. - Umiddelbart efter centrifugering, aliquot 150 μL supernatant fra hvert rør og sted i en separat brønd af en 96 brønd plade.
- Fjern eventuelle bobler fra hver brønd ved hjælp af en pipettespids.
BEMÆRK: Tilstedeværelsen af bobler vil give inkonsekvente absorbansaflæsninger, hvilket fører til høj assay upræcision. - Læs absorbanser ved 532 nm. Træk den gennemsnitlige absorbansaflæsning af de tomme prøver fra alle andre absorbansaflæsninger.
- Opret en standardkurve ved at afbilde de blankt fratrakte absorbansaflæsninger ved 532 nm vs. den kendte koncentration af hver standard. Tilpas datapunkterne ved hjælp af lineær regression. Beregn ukendte stikprøvekoncentrationer ved hjælp af ligningen af den lineære regressionslinje, der er opnået fra standardkurven.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Under sure forhold (pH = 4) og ved 95 °C giver malondialdehyd (MDA) bis (dimethyl acetal) MDA23. MDA og nært beslægtede kemiske kongenere reagerer med to molekyler af thiobarbituric syre (TBA) til at producere forbindelser kaldet thiobarbituric syre reaktive stoffer (TBARS), som giver en rød-pink farve og har en absorbans λmax ved 532 nm (Figur 1, Figur 2). Ved hjælp af MDA bis (dimethyl acetal) som standard blev der genereret standardkurver (figur 3, tabel 1) for at bestemme grænserne for påvisning og følsomhed af analysen og oxidationsniveauet i tre forskellige biologiske prøver. I alt ni TBARS-analyser blev udført for at bestemme oxidationsniveauet i de tre forskellige prøver på forskellige dage. Der blev derfor genereret i alt ni standardkurver, som vist i figur 3. Den mindste kvadrater procedure24 blev brugt til at bestemme standardafvigelserne for hældningen og y-skæringspunktet, som var henholdsvis 8,67 x 10-6 og 5,66 x 10-4.
Grænserne for påvisning af TBARS-analysen blev fastsat i henhold til standardanalyseprocedurer25 ved at måle absorbanser af de tomme prøver (seks eksperimentelle replikater med to tekniske replikater pr. eksperimentel replikation) på tre forskellige dage. Det mindste skelnelige analysesignal (Sm) blev bestemt ved at opsummere gennemsnittet af det tomme signal (S̄bl) plus et multiplum k af standardafvigelsen for den tomme (ksbl), hvor k = 3. Det vil sige Sm = S̄bl+ ksbl. Ved hjælp af Sm og hældningen af standardkurven (m) blev detektionsgrænsen (cm) beregnet som cm = (Sm - S̄bl)/m. De resulterende data for de tomme prøver på tre forskellige dage viser, at den mindste koncentration af TBARS-stof, der er nødvendig for at give et påviseligt ikke-støjabsorberende signal, er 1,1 μM (tabel 2). Følsomheden af TBARS-analysen er ca. 0,00160 absorbansenheder/μM, hvilket er analysens evne til at skelne mellem forskelle i analysandkoncentrationen (tabel 2).
For at illustrere anvendeligheden af TBARS-analysen ved detektering af ændringer i lipidperoxidation i forskellige biologiske matricer blev CuCl2 brugt til at fremkalde in vitro oxidation af humant serum, HepG2-cellelyater og lipoproteiner med lav densitet. Disse biologiske prøver, der anvendes her, er prototyper af biologiske matricer. For eksempel, baseret på de resultater, der præsenteres her for HepG2 celle lysater, er det rimeligt at forvente, at denne analyse vil arbejde med andre typer af celle lysat; det skal dog valideres analytisk til dette formål. Af de tre biologiske matricer, der anvendes her, er det også almindeligt, at visse typer prøver udviser lave endogene koncentrationer af TBARS. For eksempel var TBARS for HepG2-cellelyater, der ikke blev behandlet med CuCl2 , lige over påvisningsgrænsen for påvisning af analysen (ca. 2 μM; Figur 4). Som man kunne forvente i tilfælde af lave signal-til-støj-forhold, er standardafvigelsen og variationskoefficienten for denne særlige prøve relativt høj (tabel 3). Men da signalet stiger som følge af Cu (II) medieret oxidation, bliver variationskoefficienten lavere. Generelt, efterhånden som absorbansen stiger ud over detektionsgrænsen, forbedres analyse reproducerbarheden (tabel 3).
I forbindelse med denne protokol var der intet ønske om at bruge antioxidanter til at maskere den in vitro Cu(II)-medierede oxidation af biologiske prøver. Kommercielt fremstillet lipoprotein med lav densitet (LDL) kan indeholde 0,01% EDTA. EDTA vil forhindre Cu(II)-medieret oxidation af LDL, men ikke nødvendigvis andre metalmedierede oxidationsreaktioner26,27. Der blev udført en TBARS-analyse på LDL-prøver, der indeholdt EDTA, og TBARS-niveauerne ændrede sig ikke mellem de Cu(II)-behandlede og ubehandlede LDL-prøver (figur 5A). Efter at EDTA var blevet fjernet ved spinfiltrering (se trin 1.2.3-1.2.5), gennemgik LDL imidlertid cu(II)medieret oxidation, som detekteret ved TBARS-analysen (figur 5B).
Det normale interval af lipidperoxideringsprodukter i humane serum fra raske donorer udtrykt i MDA er mellem 1,80-3,94 μM28. For at illustrere det dynamiske område af TBARS-analysen i humane serum blev der tilsat en koncentration på 2 mM Cu(II) ioner til prøverne efterfulgt af inkubation i 24 timer ved 37 °C. Dette resulterede i en stigning på 6x-7x i TBARS (figur 6).
Figur 1: Thiobarbituric syre reaktive stoffer assay skematisk.
100 mikroliter af prøver eller standarder tilsættes til et 13 mm x 100 mm glasrør efterfulgt af tilsætning af reaktive reaktive stoffer (TBARS) (Thiobarbituric acid reaktive stoffer). Efter inkubation ved 95 °C i 1 time inkuberes prøver og standarder i is i 30 min, hvorefter centrifugeres ved 1.500 x g i 10 min ved 4 °C. 150 mikroliter af prøver eller standard supernatant læsses på en 96 brøndplade, og absorbans måles ved 532 nm. Ukendt prøvekoncentration beregnes ved hjælp af ligningen af standardkurven. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Arketypen thiobarbituric syre reaktive stoffer reaktion.
Malondialdehyd bis(dimethyl acetal) giver malondialdehyd under syre-katalyseret hydrolyse1. Frigivet Malondialdehyd (MDA) reagerer derefter med to molekyler af 2-thiobarbituric syre (TBA) (pH = 4 og 95 °C) til at danne MDA-TBA2 adducts, der giver en rød-pink farve og kan måles spectrophotometrisk ved 532 nm. Fordi andre molekyler end MDA, der er afledt af oxiderede lipider, også kan reagere med TBA, kaldes absorbansmålingen ved 532 nm simpelthen en måling af thiobarbitursyrereaktive stoffer eller TBARS. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Malondialdehyd bis(dimethyl acetal) farveimmetriske standardkurver.
Figuren viser ni standardkurver som oprettet på forskellige dage. Nogle punkter overlapper hinanden og kan ikke skelnes fra hinanden. Malondialdehyd bis(dimethyl acetal) blev beriget til kalibratorprøver ved 0, 2,5, 5, 10, 20, 40, 80 og 160 μM (som vist i tabel 1; n = 1 pr. koncentrationspunkt pr. dag). Absorbansen blev målt til 532 nm, idet den gennemsnitlige absorbans af de tomme prøver blev trukket fra alle målinger i det pågældende parti, herunder ubekendte. Hver dag blev ligningen genereret af mindst kvadrater lineær regression brugt til at bestemme TBARS i biologiske prøver. For alle ni standardkurver tilsammen var standardafvigelsen for hældningen 8,67 x 10-6, og standardafvigelsen for y-skæringspunktet var 5,66 x 10-4. Standardafvigelser af hældningen og y-skæringspunktet blev beregnet ved hjælp af den mindste kvadratprocedure24. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Oxidation i HepG2 lysater opdaget af TBARS.
Seks HepG2-cellelyatprøver blev inkuberet med 2 mM CuCl2 [HepG2-cellelyat + 2 mM Cu(II)], og seks prøver blev inkuberet i en opløsning uden CuCl2 (HepG2 cellelyd) i 24 timer ved 37 °C. Efter inkubation blev TBARS-analysen udført på de 12 prøver. Denne procedure blev gentaget 2x i alt tre forskellige dage. Fejllinjer repræsenterer SD. Asterisk angiver statistisk signifikante forskelle mellem kontrol og Cu(II)-behandlede lysater (s < 0,001). Statistisk signifikans blev bestemt ved hjælp af en Mann Whitney U-test i GraphPad. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: Oxidation i lipoprotein med lav densitet opdaget af TBARS.
(A) TBARS-analyse udført i LDL-prøver, der indeholder 0,01 % EDTA. Seks LDL-prøver blev inkuberet med 10 μM CuCl2 [LDL + 10 μM Cu(II)], og seks prøver blev inkuberet med en kontrolopløsning uden tilsat CuCl2 (Native LDL) i 2 timer ved 37 °C. Derefter blev der udført en TBARS-analyse på de 12 prøver. "ns" repræsenterer ingen statistisk betydning. (B) LDL blev spin filtreret ved hjælp af en centrifugal spin filter enhed til at fjerne EDTA. Derefter blev inkubation med og uden tilsat Cu(II) udført igen som beskrevet for (A). TBARS-analysen blev udført umiddelbart efter. Den samme procedure blev gentaget 2x i alt 3 dage. Fejllinjer repræsenterer SD. Asterisk angiver statistisk signifikante forskelle mellem kontrol- og Cu(II)-behandlede LDL-prøver (s < 0,001). Statistisk signifikans blev bestemt ved hjælp af Mann Whitney U-testen i GraphPad. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6: Lipidperoxidation i humane serumprøver, der er påvist af TBARS.
Seks humane serumprøver blev inkuberet med 2 mM CuCl2 [serum + 2 mM Cu(II)], og seks prøver blev inkuberet med en opløsning, der ikke havde tilsat CuCl2 (normalt serum) i 24 timer ved 37 °C. Efter inkubation blev TBARS-analysen udført på de 12 prøver. Denne procedure blev gentaget på yderligere to dage. Fejllinjer repræsenterer SD. Asterisk angiver statistisk signifikante forskelle mellem kontrol- og cu(II)-behandlede serumprøver (s < 0,001). Statistisk signifikans blev bestemt ved hjælp af Mann Whitney U-testen i GraphPad. Klik her for at se en større version af dette tal.
| Glasrør | 200 μM MDA bis (dimethyl acetal) (μL) | Vand (μL) | MDA bis (dimethyl acetal) Endelig koncentration (μM) |
| Aa | 0 | 1000 | 0 |
| B | 12.5 | 987.5 | 2.5 |
| C | 25 | 975 | 5 |
| D | 50 | 950 | 10 |
| E | 100 | 900 | 20 |
| F | 200 | 800 | 40 |
| G | 400 | 600 | 80 |
| H | 800 | 200 | 160 |
Tabel 1: Malondialdehyd bis(dimethyl acetal) standardprøvepræparat. Fra den frisklavede 200 μM malondialdehyd bis(dimethyl acetal) aliquot de foreslåede mængder for at nå den endelige koncentration for standardkurven. Det anbefales at udføre mindst seks gentagelser af den tomme prøve (A) om dagen for at bestemme grænserne for påvisning af metoden.
| Dag | Absorbansa | Sblb | Smc | Følsomhed (absorbansenheder/μM)d | cm (μM)e |
| 1 (n = 6) | 0.0412 | 0.000612 | 0.0430 | 0.00160 | 1.14 |
| 2 (n = 6) | 0.0415 | 0.000632 | 0.0433 | 0.00160 | 1.18 |
| 3 (n = 6) | 0.0413 | 0.000605 | 0.0431 | 0.00160 | 1.13 |
| Alle tre dage (n = 18) | 0.0413 | 0.000589 | 0.0431 | 0.00160 | 1.10 |
| en Absorbans af de tomme prøver på tre forskellige dage med 6 gentagelser om dagen. | |||||
| bSbl = Standardafvigelse af absorbansen af de tomme prøver. | |||||
| cSm = Mindste skelnelige analytiske signal, som blev bestemt ved opsummering af gennemsnittet af det tomme signal (S̄bl) plus et multiplum k af standardafvigelsen af den tomme (ksbl), hvor k = 3. Det vil sige. Sm = S̄bl + ksbl. | |||||
| d Følsomheden af TBARS-analysen, som er standardkurvens hældning. | |||||
| ecm = Detektionsgrænser, der blev beregnet som cm = (Sm - S̄bl)⁄m, hvor m = standardkurvens hældning. | |||||
Tabel 2: Detektionsgrænser for TBARS-analysen.
| Lipoprotein med lav densitet | Human Serum | HepG2 Celle Lysate | |||
| Dag | % CV | Dag | % CV | Dag | % CV |
| 1 (n = 6) | 5.6 | 1 (n = 6) | 7.9 | 1 (n = 6) | 12.6 |
| 2 (n = 6) | 5.4 | 2 (n = 6) | 7.2 | 2 (n = 6) | 15.8 |
| 3 (n = 6) | 3.9 | 3 (n = 6) | 7.0 | 3 (n = 6) | 17.7 |
| Alle tre dage (n = 18)a | 7.4 | Alle tre dage (n = 18) | 9.8 | Alle tre dage (n = 18) | 15.5b |
| Med 10 μM CuCl2 | Med 2 mM CuCl2 | Med 2 mM CuCl2 | |||
| 1 (n = 6) | 4.5 | 1 (n = 6) | 6.0 | 1 (n = 6) | 5.8 |
| 2 (n = 6) | 6.5 | 2 (n = 6) | 4.3 | 2 (n = 6) | 6.0 |
| 3 (n = 6) | 6.7 | 3 (n = 6) | 6.2 | 3 (n = 6) | 8.0 |
| Alle tre dage (n = 18) | 6.1 | Alle tre dage (n = 18) | 5.6 | Alle tre dage (n = 18) | 7.3 |
| en Mellemdagspræcisionen blev beregnet ved at samle data fra alle tre dage. | |||||
| b Præcisionen var begrænset på grund af resultaterne i nærheden af analysen LOD. | |||||
Tabel 3: TBARS's analytisk reproducerbarhed i tre forskellige biologiske prøver.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
På trods af sine begrænsninger1,3,4,7,8,9,10,12,13,14,15,19 og manglende egnethed til sammenligning mellem laboratorier, TBARS assay er en af de ældste29,30 men mest udbredte analyser til måling af oxidativ stress i biologiske prøver. TBARS-analysen er en enkel metode, der kun tager ca. 2 timer at udføre, når alle de nødvendige reagenser er blevet forberedt. Her har vi beskrevet i detaljer, hvordan denne analyse, herunder standardkurve, kan udføres mange gange på en økonomisk måde (ca. $ 3,50 USD for 96 prøver), uden at skulle købe et dyrt sæt til hvert parti prøver.
Alle trin i analysen er kritiske, men der er nogle trin, der kræver ekstra opmærksomhed. For eksempel må pH-1-prisen for thiobarbitursyren ikke være højere end 4. Der bør tages forholdsregler ved tilsætning af natriumhydroxidopløsningen til thiobarbitursyren og undgå at opnå en pH-fejl på over 4. Et surt miljø er nødvendigt for, at reaktionen mellem MDA og TBA kan forekomme, og MDA-standarden frigives fra MDA bis (dimethylactal) ved syrekatalyseret hydrolyse. Derfor kan en høj pH føre til uforudsigelige og meget varierende resultater31.
Selv om dette kan være indlysende for nogle læsere, er det også vigtigt at fjerne eventuelle bobler i 96 brøndpladen, før du måler absorbansen. Tilstedeværelsen af bobler vil give høje absorbansværdier og forskelle mellem replikater, hvilket fører til en høj procentdel af CV'er. Især er der ingen gode stoppesteder, når TBARS-analysen er startet. Den skal være afsluttet, når den er indledt. Endelig er der mange mulige metodiske variationer, der kan anvendes på denne analyse. Den generelle protokol, der er beskrevet her, kan yderligere tilpasses (og valideres) til specifikke applikationer, herunder dem, hvor tilsætning af radikale ådselædere eller andre typer antioxidanter før analyse er påkrævet.
Mens TBARS assay er populær, Er det vigtigt at indse, at det ikke er en molekylært specifik analyse. Talrige kemisk reaktive carbonylholdige organiske molekyler, herunder molekyler, der stammer fra oxiderede biomolekyler bortset fra lipider, kan reagere med TBA og tælles således som TBARS1,32,33,34. Desuden bliver grænserne for påvisning af den absorberende TBARS-analyse ikke meget bedre end ca. 1,1 μM, som bestemt ved denne metode. Grænserne for detektion kan dog forbedres ved hjælp af andre registreringsmetoder. For eksempel giver spektrofluorometri med excitation ved 520 nm og emission ved 550 nm højere følsomhed og bedre grænser for detektion, som tidligere foreslået af Jo og Ahn35. Massespektrometri-baserede metoder kan dramatisk forbedre både specificitet og grænser for detektion. For eksempel er en GC-MS/MS med elektron-capture negative ion kemisk ionisering (ECNICI) metode blevet brugt til at opdage pentafluorobenzyl derivat af MDA i humane serum og urinprøver, med grænser for påvisning af 2 x 10-18 mol MDA på kolonne36. Her forbedrer den kromatografiske adskillelse i kombination med tandemmassespektrometri dramatisk analysens molekylære specificitet også.
Ikke desto mindre er præanalytisk prøvehåndtering, som med andre målinger af oxidative processer i biologiske prøver37,38, afgørende for resultatet af TBARS-målinger. For eksempel resulterer lagring af blodplasma ved -20 °C i langsomme, men dramatiske stigninger i MDA-koncentrationerne39,40. Således bør eksponering af biologiske prøver for optøede eller endog delvist optøede forhold i alt andet end en minimal mængde tid antages at forårsage artefaktiske elevation af TBARS niveauer. Det betyder, at selv beskeden variation i den præanalytiske håndtering og opbevaring af biospecimens, der skal sammenlignes ved hjælp af TBARS-analysen, skal undgås.
I betragtning af disse forbehold i forbindelse med præanalytisk variation samt begrænset følsomhed og specificitet anbefales det, at den absorbansbaserede TBARS-analyse kun anvendes til generel vurdering inden for laboratoriet eller range-finding-eksperimenter. Disse anvendelser omfatter undersøgelser, hvor relative TBARS niveauer er direkte sammenlignet mellem en eller flere grupper af biologisk lignende prøver, der behandles eller opbevares sammen og adskilt af kun en enkelt variabel, der er fuldt kontrolleret af forskere.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen konkurrerende finansielle interesser eller andre interessekonflikter at afsløre.
Acknowledgments
Den forskning, der rapporteres her blev støttet delvist af National Cancer Institute of National Institutes of Health under tildeling nr. R33 CA217702 og initiativet til maksimering af Student Development (IMSD) program. Indholdet er udelukkende forfatternes ansvar og repræsenterer ikke nødvendigvis det officielle syn på National Institutes of Health.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1x Sterile PBS pH 7.4 1 L | VWR, PA | 101642--262 | cell lysis reagent |
| 50 mL self-standing centrifuge tube | Corning, NY | CLS430897 | General material |
| 96 well plate, Non-Treated, clear, with lid, Non-sterile | Thermo Fisher Scientific, MA | 280895 | To measure absorbance |
| Amicon Ultra-0.5 100 kD centrifugal spin filter device | Fisher Scientific, NH | UFC510024 | LDL purification |
| Caps for glass tubes | Thermo Fisher Scientific, MA | 14-930-15D | for TBARS assay |
| Copper II Chloride | SIGMA, MO | 222011-250G | to induce oxidation |
| Culture tubes, Disposable, with Screw-Cap Finish, Borosilicate Glass (13 x 100 mm) | VWR, PA | 53283-800 | for TBARS assay |
| Eagle's Minimum Essential Medium (EMEM) | ATCC, VA | HB-8065 | HepG2 cell media |
| Eppendorf Safe-Lock Tubes, 1.5 mL | eppendorf, NY | 22363204 | General material |
| Eppendorf Safe-Lock Tubes, 2.0 mL | Genesee Sceitific, CA | 22363352 | General material |
| Fetal Bovine Serum US Source | Omega Scientific, CA | FB-11 | for cell culture |
| Glacial Acetic Acid | SIGMA, MO | 27225-1L-R | TBARS Reagent |
| Halt Protease Inhibitor Cocktail (100x) | Thermo Scientific, MA | 87786 | cell lysis reagent |
| HEPES | SIGMA, MO | H3375-250G | LDL solvent |
| HepG2 Cells | ATCC, VA | HB-8065 | Biological matrix prototype |
| Hydrocloric acid (HCl) | Fisher Scientific, NH | A144-212 | cell lysis reagent |
| Legend Micro 17 Centrifuge | Thermo Scientific, MA | 75002431 | General material |
| Low Density Lipoprotein, Human Plasma | Athens Research & Technology, GA | 12-16-120412 | Biological matrix prototype |
| Magnetic Stir Bars, Octagon 6-Assortment | VWR, PA | 58948-025 | General material |
| Malondialdehyde bis (dimethyl acetal) | SIGMA, MO | 8207560250 | TBARS Standard |
| Multiskan Go Microplate Spectrophotometer | Fisher Scientific, NH | 51119200 | To measure absorbance |
| NP-40 | EMD Millipore Corp, MA | 492016-100ML | cell lysis reagent |
| Sodium Chloride | SIGMA, MO | S7653-1KG | cell lysis reagent |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | SIGMA, MO | 436143-100G | TBARS Reagent |
| Sodium hydroxide | SIGMA, MO | 367176-2.5KG | TBARS Reagent |
| SpeedVac Concentrator | Thermo Scientific, MA | SC250EXP | For concentrating cell lysates |
| T-75 Flask, Tissue Culture Treated, 250 mL, w/filter cap | USA Scientific, FL | 658175 | cell culture |
| Thiobarbituric Acid | SIGMA, MO | T5500-100G | TBARS Reagent |
| TRIS base | Fluka, GA | 93362 | cell lysis reagent |
| Trypsin (1x) | VWR, PA | 16777-166 | To detach HepG2 cells |
References
- Tsikas, D. Assessment of lipid peroxidation by measuring malondialdehyde (MDA) and relatives in biological samples: Analytical and biological challenges. Analytical Biochemistry. 524, 13-30 (2017).
- Ohkawa, H., Ohishi, N., Yagi, K. Reaction of linoleic acid hydroperoxide with thiobarbituric acid. Journal of Lipid Research. 19 (8), 1053-1057 (1978).
- Khoubnasabjafari, M., Soleymani, J., Jouyban, A. Avoid Using Spectrophotometric Determination of Malondialdehyde as a Biomarker of Oxidative Stress. Biomarkers in Medicine. 12 (6), 551-554 (2018).
- Morales, M., Munné-Bosch, S. Malondialdehyde: Facts and artifacts. Plant Physiology. 180 (3), 1246-1250 (2019).
- Devasagayam, T. P. A., Boloor, K. K., Ramasarma, T. Methods for estimating lipid peroxidation: An analysis of merits and demerits. Indian Journal of Biochemistry and Biophysics. 40 (5), 300-308 (2003).
- Dasgupta, A., Klein, K. Methods for Measuring Oxidative Stress in the Laboratory. Antioxidants in Food, Vitamins and Supplements. , 19-40 (2014).
- Wade, C. R., van Rij, A. M. Plasma malondialdehyde, lipid peroxides, and the thiobarbituric acid reaction. Clinical Chemistry. 35 (2), 336-336 (1989).
- Khoubnasabjafari, M., Ansarin, K., Jouyban, A. Reliability of malondialdehyde as a biomarker of oxidative stress in psychological disorders. BioImpacts. 5 (3), 123-127 (2015).
- Khoubnasabjafari, M., Ansarin, K., Jouyban, A. Comments Concerning "Comparison of Airway and Systemic Malondialdehyde Levels for Assessment of Oxidative Stress in Cystic Fibrosis". Lung. 193 (5), 867-868 (2015).
- Khoubnasabjafari, M., Ansarin, K., Vaez-Gharamaleki, J., Jouyban, A. Comments on "Salivary 8-hydroxy-2-deoxyguanosine, malondialdehyde, vitamin C, and vitamin E in oral pre-cancer and cancer: diagnostic value and free radical mechanism of action". Clinical Oral Investigations. 20 (2), 395-396 (2016).
- Khoubnasabjafari, M., Ansarin, K., Jouyban, A. Comments on "An Investigation into the Serum Thioredoxin Superoxide Dismutase, Malondialdehyde, and Advanced Oxidation Protein Products in Patients with Breast Cancer". Annals of Surgical Oncology. 24, 573-576 (2017).
- Azizi, S., et al. Effects of analytical procedures on the repeatability of malondialdehyde determinations in biological samples. Pharmaceutical Sciences. 23 (3), 193-197 (2017).
- Azizi, S., et al. A possible reason for the low reproducibility of malondialdehyde determinations in biological samples. Bioanalysis. 8 (21), 2179-2181 (2016).
- Wasowicz, W., Neve, J., Peretz, A. Optimized steps in fluorometric determination of thiobarbituric acid- reactive substances in serum: Importance of extraction pH and influence of sample preservation and storage. Clinical Chemistry. 39 (12), 2522-2526 (1993).
- Jentzsch, A. M., Bachmann, H., Fürst, P., Biesalski, H. K. Improved analysis of malondialdehyde in human body fluids. Free Radical Biology and Medicine. 20 (2), 251-256 (1996).
- Buege, J. A., Aust, S. D. Microsomal lipid peroxidation. Methods in Enzymology. 52, 302-310 (1978).
- Gutteridge, J. M. C. Free-Radical Damage to Lipids, Amino-Acids, Carbohydrates and Nucleic-Acids Determined by Thiobarbituric Acid Reactivity. International Journal of Biochemistry. 14 (7), 649-653 (1982).
- Khoubnasabjafari, M., Ansarin, K., Jouyban, A. Salivary malondialdehyde as an oxidative stress biomarker in oral and systemic diseases. J Dent Res Dent Clin Dent Prospects. 10 (2), 71-74 (2016).
- Halliwell, B., Whiteman, M. Measuring reactive species and oxidative damage in vivo and in cell culture: How should you do it and what do the results mean. British Journal of Pharmacology. 142 (2), 231-255 (2004).
- Lee, R., et al. Evaluating oxidative stress in human cardiovascular disease: methodological aspects and considerations. Current medicinal chemistry. 19 (16), 2504-2520 (2012).
- Morel, D. W., Hessler, J. R., Chisolm, G. M. Low density lipoprotein cytotoxicity induced by free radical peroxidation of lipid. Journal of Lipid Research. 24 (8), 1070-1076 (1983).
- Guzmán-Chozas, M., Vicario-Romero, I. M., Guillén-Sans, R. 2-thiobarbituric acid test for lipid oxidation in food: Synthesis and spectroscopic study of 2-thiobarbituric acid-malonaldehyde adduct. Journal of the American Oil Chemists Society. 75 (12), 1711-1715 (1998).
- Shibata, T., et al. Identification of a lipid peroxidation product as a potential trigger of the p53 pathway. Journal of Biological Chemistry. 28 (2), 1196-1204 (2006).
- Skoog, D. A., West, D. M., Holler, F. J., Crouch, S. R. Sampling, standardization, and calibration. Fundamentals of Analytical Chemistry. 9th ed. , Cengage - Brooks/Cole. Belmont, CA. Ch. 7 153-196 (2014).
- Skoog, D. A., Holler, F. J., Crouch, S. R. Introduction. Principles of Instrumental Analysis. 6th ed. , Cengage - Brooks/Cole. Belmont, CA. Ch. 1 1-24 (2007).
- Seibig, S., Van Eldik, R. Kinetics of [FeII(edta)] Oxidation by Molecular Oxygen Revisited. New Evidence for a Multistep Mechanism. Inorganic Chemistry. 36 (18), 4115-4120 (1997).
- Jeffs, J. W., et al. Delta-S-Cys-Albumin: A Lab Test that Quantifies Cumulative Exposure of Archived Human Blood Plasma and Serum Samples to Thawed Conditions. Molecular & Cellular Proteomics. 18 (10), 2121-2137 (2019).
- Yagi, K. Simple Assay for the Level of Total Lipid Peroxides in Serum or Plasma. Free Radical and Antioxidant Protocols. Methods in Molecular Biology. Armstrong, D. , Humana Press. Totowa, NJ. 101-106 (1998).
- Bernheim, F., Bernheim, M. L. C., Wilbur, K. M. The reaction between thiobarbituric acid and the oxidation products of certain lipides. Journal of Biological Chemistry. 174 (1), 257-264 (1948).
- Wilbur, K. M., Bernheim, F., Shapiro, O. W. The thiobarbituric acid reagent as a test for the oxidation of unsaturated fatty acids by various agents. Archives of Biochemistry. 24 (2), 305-313 (1949).
- Kwon, T. W., Watts, B. M. Determination of malonaldehyde by ultraviolet spectrophotometry. Journal of Food Science. 28 (6), 627-630 (1963).
- Esterbauer, H., Schaur, F. J., Zollner, H. Chemistry and biochemistry of 4-hydroxynonenal, malonaldehyde and related aldehydes. Free Radical Biology & Medicine. 11 (1), 81-128 (1991).
- Dalle-Donne, I., Rossi, R., Colombo, R., Giustarini, D., Milzani, A. Biomarkers of oxidative damage in human disease. Clinical Chemistry. 52 (4), 601-623 (2006).
- Jentzsch, A. M., Bachmann, H., Fürst, P., Biesalski, H. K. Improved analysis of malondialdehyde in human body fluids. Free Radical Biology and Medicine. 20 (2), 251-256 (1996).
- Jo, C., Ahn, D. U. Fluorometric Analysis of 2-Thiobarbituric Acid Reactive Substances in Turkey. Poultry Science. 77 (3), 475-480 (1998).
- Tsikas, D., et al. Development, validation and biomedical applications of stable-isotope dilution GC-MS and GC-MS/MS techniques for circulating malondialdehyde (MDA) after pentafluorobenzyl bromide derivatization: MDA as a biomarker of oxidative stress and its relation to 15(S)-8-iso-prostaglandin F2α and nitric oxide (NO). Journal of Chromatography. B, Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 1019, 95-111 (2016).
- Barden, A. E., Mas, E., Croft, K. D., Phillips, M., Mori, T. A. Minimizing artifactual elevation of lipid peroxidation products (F 2-isoprostanes) in plasma during collection and storage. Analytical Biochemistry. 449 (1), 129-131 (2014).
- Jeffs, J. W., Ferdosi, S., Yassine, H. N., Borges, C. R. Ex vivo instability of glycated albumin: A role for autoxidative glycation. Archives of Biochemistry and Biophysics. 629, 36-42 (2017).
- Lee, D. M. Malondialdehyde in Stored Plasma. Biochemical and Biophysical Research Communications. 95 (4), 1663-1672 (1980).
- Tsikas, D., et al. Simultaneous GC-MS/MS measurement of malondialdehyde and 4-hydroxy-2-nonenal in human plasma: Effects of long-term L-arginine administration. Analytical Biochemistry. 524, 31-44 (2017).
