Summary
La determinazione precisa delle posizioni di legame proteico in tutto il genoma è importante per comprendere la regolazione genica. Qui descriviamo un metodo di mappatura genomica che tratta il DNA immunoprecipitato di cromatina con digestione dell'esonucleasi (ChIP-exo) seguito da sequenziamento ad alta produttività. Questo metodo rileva le interazioni proteina-DNA con una risoluzione di mappatura vicina alla coppia di basi e un elevato rapporto segnale-rumore nei neuroni dei mammiferi.
Abstract
L'identificazione di specifiche interazioni proteina-DNA sul genoma è importante per comprendere la regolazione genica. L'immunoprecipitazione della cromatina accoppiata con il sequenziamento ad alta produttività (ChIP-seq) è ampiamente utilizzata per identificare le posizioni di legame a livello genomico delle proteine leganti il DNA. Tuttavia, il metodo ChIP-seq è limitato dalla sua eterogeneità nella lunghezza dei frammenti di DNA sonicato e del DNA di fondo non specifico, con conseguente bassa risoluzione di mappatura e incertezza nei siti di legame con il DNA. Per superare questi limiti, la combinazione di ChIP con digestione esonucleasi (ChIP-exo) utilizza la digestione delle esonucleasi da 5' a 3' per tagliare il DNA immunoprecipitato di dimensioni eterogenee al sito di reticolamento proteina-DNA. Il trattamento con esonucleasi elimina anche il DNA di fondo non specifico. Il DNA preparato dalla libreria e digerito con esonucleasi può essere inviato per il sequenziamento ad alta produttività. Il metodo ChIP-exo consente una risoluzione di mappatura vicina alla coppia di basi con una maggiore sensibilità di rilevamento e un segnale di fondo ridotto. Di seguito è descritto un protocollo ChIP-exo ottimizzato per le cellule di mammifero e il sequenziamento di nuova generazione.
Introduction
Le posizioni delle interazioni proteina-DNA forniscono informazioni sui meccanismi di regolazione genica. L'immunoprecipitazione della cromatina accoppiata con il sequenziamento ad alta produttività (ChIP-seq) è stata utilizzata per un decennio per esaminare le interazioni proteina-DNA a livello genomico nellecellule viventi 1,2. Tuttavia, il metodo ChIP-seq è limitato dall'eterogeneità nella frammentazione del DNA e dalla contaminazione del DNA non legato che porta a bassa risoluzione di mappatura, falsi positivi, chiamate perse e segnale di fondo non specifico. La combinazione di ChIP con digestione dell'esonucleasi (ChIP-exo) migliora il metodo ChIP-seq tagliando il DNA ChIP ai punti di collegamento incrociato proteina-DNA, fornendo una risoluzione vicina alla coppia di basi e un basso segnale di fondo3,4,5. La risoluzione di mappatura notevolmente migliorata e il basso background fornito da ChIP-exo consentono di determinare posizioni di legame proteina-DNA accurate e complete in tutto il genoma. ChIP-exo è in grado di rivelare motivi di legame del DNA funzionalmente distinti, interazioni cooperative tra fattori di trascrizione (TF) e più siti di collegamento incrociato proteina-DNA in una certa posizione di legame genomico, non rilevabili da altri metodi di mappaturagenomica 3,4,6,7.
ChIP-exo è stato inizialmente utilizzato nel lievito in erba per esaminare il legame dna specifico della sequenza dei TF, per studiare l'organizzazione precisa del complesso di pre-iniziazione della trascrizione e la struttura sub-nucleosomica dei singoli istoniattraverso il genoma 4,8,9. Dalla sua introduzione nel 20114, ChIP-exo è stato utilizzato con successo in molti altri organismi tra cui batteri, topi e cellule umane7,10,11,12,13,14,15,16,17. Nel 2016, Rhee et al. Questo studio ha dimostrato che in assenza di Lhx3, Isl1 viene reclutato in nuovi esaltatori neuronali legati da Onecut1 TF per mantenere l'espressione genica dei geni dell'effettore neuronale. In questo studio, ChIP-exo ha rivelato come più TF riconoscano dinamicamente il tipo di cellula e gli elementi regolatori del DNA specifici dello stadio cellulare in modo combinatorio a una risoluzione di mappatura quasi nucleotidica. Altri studi hanno anche usato il metodo ChIP-exo per comprendere l'interazione tra proteine e DNA in altre linee cellulari di mammiferi. Han et al.7 usò chip-exo per esaminare l'organizzazione a livello genomico dei TF GATA1 e TAL1 nelle cellule erythroid del topo usando chIP-exo. Questo studio ha scoperto che tal1 viene reclutato direttamente nel DNA piuttosto che indirettamente attraverso interazioni proteina-proteina con GATA1 durante la differenziazione erythroid. Studi recenti hanno anche utilizzato ChIP-exo per profilare le posizioni di legame a livello genomico di CTCF, RNA Polimerasi II e segni istonografici per studiare i meccanismi epigenomici e trascrizionale nelle lineecellulari umane 18,19.
Esistono diverse versioni del protocollo ChIP-exo disponibili3,5,20. Tuttavia, questi protocolli ChIP-exo sono difficili da seguire per le ricerche che non hanno familiarità con la preparazione della libreria di sequenziamento di nuova generazione. Un'eccellente versione del protocollo ChIP-exo è stata pubblicata con istruzioni facili da seguire e un video21, ma conteneva molti passaggi enzimatici che richiedono una notevole quantità di tempo per il completamento. Qui si segnala una nuova versione del protocollo ChIP-exo contenente passaggi enzimatici ridotti e tempi di incubazione e spiegazioni per ogni fase enzimatica21. Le reazioni di riparazione finale e di coda dA sono combinate in un unico passaggio utilizzando l'enzima di preparazione finale. I tempi di incubazione per i passaggi di lisciviazione dell'indice e dell'adattatore universale sono ridotti da 2 h a 15 minuti utilizzando un esaltatore di legatura. La reazione della chinasi dopo il passaggio di legatura della scheda di indice descritto nel precedente protocollo ChIP-exo è stata rimossa. Al contrario, durante la sintesi del DNA dell'oligo viene aggiunto un gruppo fosfato a una delle 5' estremità dell'adattatore indice (Tabella 1), che verrà utilizzato per la fase di digestione dell'esonucleasi lambda. Mentre il precedente protocollo ChIP-exo utilizzava la digestione dell'esonucleasi RecJf per eliminare i contaminanti di DNA a singolo filamento, questo passaggio di digestione viene rimosso qui perché non è fondamentale per la qualità della libreria ChIP-exo. Inoltre, per purificare il DNA inverso incrociato dopo l'eluizione del ChIP, viene utilizzato un metodo di purificazione magnetica delle perline al posto del metodo di estrazione fenolo:cloroformio:alcol isoamile (PCIA). Ciò riduce i tempi di incubazione dell'estrazione del DNA. È importante sottolineare che rimuove la maggior parte dei dimeri della scheda formati durante la legatura della scheda di indicizzazione, il che può influire sull'efficienza della PCR mediata dalla legatura.
Il protocollo ChIP-exo qui presentato è ottimizzato per il rilevamento di precise interazioni proteina-DNA nei neuroni dei mammiferi differenziati dalle cellule staminali embrionali del topo (ES). In breve, le cellule neuronali raccolte e incrociate vengono lese, per consentire alla cromatina di essere esposta alla sonicazione, quindi sonicate in modo da ottenere frammenti di DNA di dimensioni appropriata (Figura 1). Le perline rivestite di anticorpi vengono quindi utilizzate per immunoprecipitato selettivamente la cromatina frammentata e solubile alla proteina di interesse. Mentre il DNA immunoprecipitato è ancora sulle perline, vengono eseguite la riparazione finale, la legatura degli adattatori di sequenziamento, la reazione di riempimento e le fasi di digestione delle esonucleasi lambda da 5' a 3 '. La fase di digestione dell'esonucleasi è ciò che conferisce a ChIP-exo la sua altissima risoluzione e l'elevato rapporto segnale-rumore. L'esonucleasi lambda taglia il DNA immunoprecipitato alcune coppie di basi (bp) dal sito di reticolamento, causando così la degradazione del DNA contaminante. Il DNA ChIP trattato con esonucleasi viene eluita dalle perline rivestite di anticorpi, i collegamenti incrociati proteina-DNA sono invertiti e le proteine sono degradate. Il DNA viene estratto e denaturato in DNA ChIP a singolo filamento, seguito dalla ricottura del primer e dall'estensione per realizzare DNA a doppio filamento (dsDNA). Successivamente, viene eseguita la legatura di un adattatore universale alle estremità trattate con esonucleasi. Il DNA risultante viene purificato, quindi amplificato pcr, purificato in gel e sottoposto a sequenziamento di nuova generazione.
Il protocollo ChIP-exo è più lungo del protocollo ChIP-seq, ma non è molto impegnativo dal punto di vista tecnico. Qualsiasi DNA ChIP immunoprecipitato con successo può essere sottoposto a ChIP-exo, con diversi passaggi enzimatici aggiuntivi. I notevoli vantaggi del ChIP-exo, come la risoluzione di mappatura ultra-alta, un segnale di fondo ridotto e la diminuzione di falsi positivi e negativi, per quanto riguarda i siti di legame genomico, superano il costo del tempo.
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Protocol
NOTA: L'acqua distillata autoclavata e deionizzata (ddH2O) è raccomandata per la produzione di tamponi e miscele di master di reazione. Le sezioni 1−4 descrivono la lisi cellulare e la sonicazione, le sezioni 5−7 descrivono l'immunoprecipitazione della cromatina (ChIP), le sezioni 8−11 descrivono le reazioni enzimatiche sulle perline, le sezioni 12 e 13 descrivono l'eluizione del ChIP e la purificazione del DNA, e le sezioni 14−19 descrivono la preparazione della biblioteca.
1. Cellule di raccolta e collegamento incrociato
- Dopo aver differenziato le cellule ES del topo in neuroni postmitotici, aggiungere l'11% di formaldeide alle cellule raccolte a una concentrazione finale dell'1% (v/v). Celle rocciose su una piattaforma a dondolo (rocker, shaker o rotatore) per 15 minuti, a temperatura ambiente (RT, 25 °C).
NOTA: A seconda della proteina bersaglio da reticolare, meno formaldeide reticolare (ad esempio, una concentrazione finale dello 0,5%) o si può usare il doppio reticello con glutarato disuccinidile (DSG). - Aggiungere 2,5 M di glicina a una concentrazione finale di 150 mM per interrompere la reazione di retiatura. Celle rocciose su una piattaforma a dondolo a RT, per 5 minuti.
- Centrifugare le celle reticolate in tubi conici da 15 ml a RT, per 6 minuti, a 1.350 x g. Aspirare la soluzione, quindi rimosombidire le cellule in 5 mL di 1x soluzione salina tamponata con fosfato (PBS).
NOTA: I pellet a celle retigliate possono essere conservati a -80 °C dopo il congelamento flash con azoto liquido.
2. Llisi cellulare
NOTA: I seguenti passaggi di questo protocollo sono per circa 2 x 107 cellule neuronali differenziate dalle cellule ES del mouse. Per rompere le cellule aperte, verranno utilizzati tamponi di lisi contenenti vari detergenti. Aggiungere 50 μL di 1000x stock completo di inibitore della proteasi (CPI) a 50 mL di tampone appena prima dell'uso.
- Preparare i buffer di lisi 1−3 come descritto nella tabella 2.
- Scongelare pellet di cellule reticolate sul ghiaccio, quindi rimescolare accuratamente i pellet di cellule in 3 ml di tampone di lisi 1 in tubi conici da 15 ml. Roccia a 4 °C per 15 minuti su una piattaforma a dondolo. Centrifuga a 1.350 x g per 5 min a 4 °C e aspira il supernatante.
- Rimescolare accuratamente le cellule pellettate in 3 mL di tampone di lysis 2. Roccia a 4 °C per 10 minuti su una piattaforma a dondolo. Centrifuga a 1.350 x g per 5 min a 4 °C e aspira il supernatante.
- Aggiungere 1 mL di tampone di lisi 3 ad ogni pellet, quindi tenere sul ghiaccio. Procedere immediatamente alla sonicazione.
3. Cromatina sonicante
NOTA: Conservare i campioni sul ghiaccio o a 4 °C durante questa procedura di sonicazione per ridurre l'inversione del collegamento incrociato.
- Utilizzando una spatola sterile, aggiungere perline di sonicazione (Table of Materials) fino al segno di graduazione di 0,2 ml su tubi di polistirolo da 15 ml. Lavare le perline di sonicazione vortice in 600 μL di 1x PBS fino a quando non sono visibili macchie secche. Centrifugare i tubi per 5 s a 30 x g e aspirare 1x PBS.
NOTA: La sonicazione nei tubi in polistirolo è più efficiente della sonicazione nei tubi in polipropilene. Se un numero minore di celle (ad esempio, <106 celle) è sonicato, utilizzare tubi in polistirolo da 1,5 ml senza aggiungere perline di sonicazione. - Sospensire accuratamente i lisati nucleari in 1 ml di tampone di lisi 3 (dal passaggio 2.4), quindi trasferire ai tubi di polistirolo da 15 ml contenenti perline di sonicazione. Vortice brevemente i tubi in polistirolo.
- Per frammentare il DNA della cromatina reticolta, il sonicato nucleare si lega a 4 °C per un numero ottimizzato di cicli, con ampiezza di potenza a 30 W e cicli di sonicazione impostati su 30 s on / 30 s off.
NOTA: L'ottimizzazione della sonicazione per ogni tipo di cella e lotto comporterà la migliore resa ChIP-exo. Per 2 x 107 cellule neuronali del topo, 20−30 cicli di sonicazione alle impostazioni menzionate frammenteranno la cromatina nell'intervallo di 100−500 bp. - Al termine della sonicazione, trasferire tutti i supernatanti (lysate sonicati), da ciascun campione, a tubi da 1,5 ml. Aggiungere il 10% di 2-[4-(2,4,4-trimetilpentan-2-il)fenossi]etanolo) a ciascun campione ad una concentrazione finale dell'1%. Mescolare mediante pipettazione.
- Per pellet cell debris, centrifugare campioni a 13.500 x g per 10 min a 4 °C. Trasferire tutti i lysati sonicati (supernatanti) da ciascun campione a nuovi tubi da 1,5 ml.
- Prendere 30 μL di lysate sonicato da ciascun campione (~3% di lysate sonicato) e aggiungere a nuovi tubi da 1,5 ml per controllare la sonicazione. Conservare i listati sonicati rimanenti a 4 °C fino a quando non sono pronti per l'incubazione con perline rivestite di anticorpi.
4. Controllo della sonicazione
- Fare 20 mL di 2x proteinasi K tampone aggiungendo 2 mL di 0,5 M Tris-HCl (pH 8.0), 2 mL di 0,5 M EDTA, 10 mL di 10% sodio dodecil solfato (SDS) e 6 mL di ddHautoclavato 2O. Non aggiungere CPI a questo buffer. Conservare in tubo da 50 mL presso RT.
- Per invertire il crosslink proteina-DNA, rimuovendo le proteine, prendere i 30 μL di cromatina sonicata da ogni campione (dal passaggio 3.6), aggiungere 166 μL di ddH2O autoclavato, 200 μL di tampone 2x proteinasi K e 4 μL di 20 mg/mL proteinasi K. Vortice breve dei campioni, quindi incubare a 65 °C per 1−3 h a 24 x g.
- NOTA: I lisce sonicati possono essere invertite a 65 °C durante la notte.
- Estrarre il DNA utilizzando PCIA (25:24:1) e metodo di precipitazione dell'etanolo come segue.
ATTENZIONE: la PCIA è tossica. Utilizzare sotto una cappa aspirante con dispositivi di protezione individuale standard (DPI).- Aggiungere 400 μL di PCIA a ciascun campione in tubi da 1,5 ml, impostare il vortice alla velocità massima e campioni di vortice per 20 s. Centrifuga a 18.400 x g per 6 min a RT. Si osserveranno due fasi. Trasferire con cura lo strato acquoso superiore (fase chiara) di ciascun campione in nuovi tubi da 1,5 ml.
- Aggiungere 1 μL di 10 mg/mL di RNasi A. Incubare campioni a 37 °C per 30 min.
- Aggiungere 1 μL di glicogeno da 20 mg/mL a ciascun campione, quindi precipitare con 1 mL di etanolo ghiacciato al 100% (conservato in un congelatore a -20 °C). Mescolare brevemente, quindi incubare i campioni nel congelatore a -80 °C per 30 min a 1 h. Centrifugare i campioni a 18.400 x g per 10 min a 4 °C e versare con cura 100% etanolo.
- Lavare pellet con 500 μL di ghiaccio freddo al 70% di etanolo (conservato in un congelatore a -20 °C). Centrifuga a 18.400 x g per 5 min a 4 °C. Versare con cura il 70% di etanolo.
- Incubare campioni in tubi da 1,5 ml a 50 °C fino a evaporare l'etanolo rimanente. Resuspend pellet di DNA in 15 μL di ddH2O autoclavato o ddH2O privo di nucleasi.
- Eseguire i campioni di DNA estratti, insieme a una scala del DNA, in un gel di agarosio all'1,5% a 120−180 V e controllare le dimensioni del DNA sonicato.
5. Incubazione di anticorpi con perline
NOTA: I seguenti passaggi di questo protocollo sono per circa 2 x 107 cellule neuronali differenziate dalle cellule ES del mouse. Non congelare e scongelare le perline magnetiche in nessun momento durante il protocollo ChIP-exo in quanto le perline possono rompersi causando la contaminazione del campione o le prestazioni dell'anticorpo possono essere compromesse.
- Dopo la lisi cellulare e la sonicazione, preparare le perline magnetiche Protein G (Table of Materials) per il ChIP, mescolare le perline magnetiche fino ad omogeneo, quindi aggiungere 25 μL di perline magnetiche a tubi a bassa legatura proteica da 2 ml.
NOTA: Il tipo di perline magnetiche utilizzate dipenderà dalla specie degli anticorpi. - Lavare le perline con 1 mL di soluzione di blocco(tabella 2),mescolare bene, quindi posizionare su un rack magnetico per 1 minuto. Mentre sei ancora su un rack magnetico, rimuovi il supernatante una volta che è chiaro.
- Aggiungere 1 mL di soluzione di blocco alle perline magnetiche. Tubi di roccia per 10 minuti a 4 °C su una piattaforma a dondolo. Ruotare brevemente, quindi posizionare i tubi su un rack magnetico e rimuovere il supernatante.
- Ripetere il passaggio 5.3 altre due volte.
- Aggiungere 500 μL di soluzione di blocco alle perline magnetiche. Ruotare brevemente l'anticorpo contro l'Isl1 (0,04 μg/μL, Tabella dei Materiali),quindi aggiungere 4 μg di anticorpo ai corrispondenti tubi a basso legame proteico da 2 ml contenenti le perline magnetiche in soluzione di blocco.
- Ripetere il passaggio 5.5 senza anticorpi (cioè, il controllo senza anticorpi per chIP).
NOTA: La quantità di anticorpi da aggiungere può essere determinata empiricamente considerando la qualità dell'anticorpo e il numero di cellule utilizzate per il ChIP. - Campioni di roccia a 4 °C per 6−24 h su una piattaforma a dondolo.
6. Immunoprecipitazione della cromatina (ChIP)
- Lavare le perle rivestite con anticorpi dal passo 5.8 con 1 mL di soluzione di blocco. Posizionare i campioni su una piattaforma a dondolo a 4 °C per 5 minuti. Rimuovere il supernatante.
- Ripetere il passaggio 6.1 altre due volte.
- Resuspend perline rivestite con anticorpi in 50 μL di soluzione di blocco, quindi trasferire a nuovi tubi a basso legame proteico da 2 ml. Per ogni campione di ChIP, aggiungere lisati sonicati (~1,0 mL dal passo 3.6) alle perline rivestite di anticorpi in tubi a bassa legante proteica da 2 ml.
- Incubare ogni campione su una piattaforma a dondolo durante la notte a 4 °C.
7. Lavaggi ChIP
NOTA: Conservare i campioni sul ghiaccio o a 4 °C per mantenere il retille proteina-DNA durante i lavaggi ChIP.
- Rendere elevato il tampone di lavaggio del sale, il tampone di lavaggio LiCl e il tampone Tris-HCl da 10 mM (pH 7.4) come descritto nella tabella 3. Conservare in tubi da 50 mL a 4 °C. Aggiungere 50 μL di 1000x stock CPI a tutti i buffer appena prima dell'uso.
- Ruotare brevemente i campioni in tubi a bassa legatura proteica da 2 ml per raccogliere il liquido dai tappi, quindi posizionare su un rack magnetico per 1 minuto e rimuovere con cura il supernatante con una pipetta.
- Per i lavaggi ChIP, aggiungere 1 ml di tampone di lysis 3 (a 4 °C) a ciascun tubo. Mescolare su una piattaforma a dondolo a 4 °C per 5 minuti. Ruotare brevemente i campioni, quindi posizionare su un rack magnetico per 1 minuto e rimuovere il supernatante con una pipetta.
- Aggiungere 1 ml di tampone di lavaggio a sale alto freddo ad ogni tubo. Mescolare su una piattaforma a dondolo a 4 °C per 5 minuti. Ruotare brevemente i campioni, quindi posizionare su un rack magnetico per 1 minuto e rimuovere il supernatante con una pipetta.
- Aggiungere 1 ml di tampone di lavaggio LiCl freddo a ciascun tubo. Mescolare su una piattaforma a dondolo a 4 °C per 5 minuti. Ruotare brevemente i campioni, quindi posizionare su un rack magnetico per 1 minuto e rimuovere il supernatante con una pipetta.
- Aggiungere 1 ml di tampone tris-HCl freddo da 10 mM (pH 7,4) a ciascun tubo. Mescolare su una piattaforma a dondolo a 4 °C per 5 minuti. Ruotare brevemente i campioni, quindi posizionare su un rack magnetico per 1 minuto e rimuovere il supernatante con una pipetta.
NOTA: è possibile utilizzare il buffer Tris-EDTA (pH 8.0) al posto del buffer Tris-HCl (pH 7.4). - Ripetere i passaggi 7.4−7.6 tre volte.
- Trasferire le perline campione con 500 μL di tampone Tris-HCl (pH 7.4) in tubi freschi da 1,5 ml. Ruotare brevemente i campioni, quindi posizionare su un rack magnetico per 1 minuto e rimuovere il supernatante con una pipetta.
8. Terminare la riparazione e la reazione di coda dA sulle perline
NOTA: La sonicazione spesso genera dsDNA non smussato. È necessaria una reazione di riparazione finale per creare DNA contundente prima della reazione di coda dA seguita dalla fase di legatura dell'adattatore di indice. Per la legatura del DNA finale appiccicoso con DNA dell'adattatore indice, il dATP viene aggiunto all'estremità 3 ' di un frammento di dsDNA smussato dalla reazione di coda dA. La miscela di reazione di preparazione finale contiene dATP.
- Dopo i lavaggi ChIP, aggiungere 38 μL di ddH2O autoclavato alle perline campione in tubi da 1,5 ml per la riparazione finale e la reazione di coda dA.
- Aggiungere 5,6 μL di miscela di reazione di preparazione finale e 2,4 μL di miscela enzimatica di preparazione finale(tabella dei materiali)a ciascun campione (volume totale di reazione: 46 μL). Incubare campioni a 20 °C per 30 min.
- Lavare le perline come descritto nei precedenti passaggi di lavaggio ChIP 7.4−7.6.
9. Indicizzazione dell'adattatore sulle perline
NOTA: L'adattatore indice ha 6−10 basi di sequenze di indici codificati a barre, che sono specifiche di un dato campione utilizzato per multiplexare più campioni nel sequenziamento ad alta velocità effettiva. Le sequenze di DNA dell'adattatore indice sono descritte nella tabella 1.
- Per la legatura dell'adattatore di indice, aggiungere 27 μL di tampone Tris-HCl freddo da 10 mM (pH 7,4) alle perline campione. Aggiungere 2 μL di adattatore indice da 15 μM, 0,5 μL di esaltatore di legatura e 15 μL di mix principale di ligasi (tabella deimateriali)a ciascun campione (volume totale di reazione: 44,5 μL).
- Incubare campioni a 20 °C per 15 minuti. Lavare le perline come descritto nei passaggi 7.4−7.6.
10. Reazione di riempimento sulle perline
NOTA: Dopo la legatura dell'adattatore, non esiste un legame fosfodiestere tra l'estremità 5' dell'adattatore e l'estremità 3' del DNA ChIP. Il nick può essere riparato da una reazione di riempimento.
- Aggiungere 47 μL di tampone tris-HCl freddo da 10 mM (pH 7,4) alle perline del campione.
- Rendere la miscela di reazione di riempimento(tabella 4 e tabella dei materiali)sul ghiaccio.
- Aggiungere 11,1 μL di miscela di riempimento a ciascun campione (volume totale di reazione: 58,1 μL). Incubare campioni a 30 °C per 20 minuti. Lavare le perline come descritto nei passaggi 7.4−7.6.
11. Lambda esonucleasi digestione su perline
- Dopo la reazione di riempimento sulle perline, aggiungere 50 μL di ddH2O autoclavato freddo alle perline campione.
- Per digerire il DNA del ChIP nella direzione da 5' a 3', aggiungere 6 μL di tampone di esonucleasi lambda 10x e 2 μL di 5 U/μL lambda esonucleasi(tabelladei materiali , volume totale di reazione: 58 μL). Incubare campioni a 37 °C per 30 minuti. Lavare le perline come descritto nei passaggi 7.4−7.6.
12. Eluizione e retittatura inversa
- Creare un buffer di eluizione ChIP come descritto nella tabella 5.
NOTA: non aggiungere CPI al buffer di eluizione ChIP. - Per eluire campioni di ChIP dalle perline, resuspend campioni in 75 μL di tampone di eluizione ChIP e incubare a 65 °C per 15 min a 130 x g.
- Aggiungere 2,5 μL di 20 mg/mL di proteinasi K(Tabella dei materiali)ai campioni. Brevemente vortice, quindi incubare i campioni durante la notte a 65 °C.
13. Estrazione del DNA
- Dopo che i campioni hanno incubato durante la notte a 65 °C, ruotare brevemente i campioni, posizionarli su un rack magnetico per 1 minuto, quindi trasferire il supernatante da ciascun campione a nuovi tubi da 1,5 ml.
- Aggiungere 1 μL di 10 mg/mL di RNasi A ai campioni. Brevemente vortice, quindi incubare i campioni a 37 °C per 30 min. Aggiungere ~25 μL di ddHautoclavato 2O a volume fino a 100 μL.
- Purificare il DNA utilizzando perline magnetiche(Tabella dei materiali). DNA eluto con 16 μL di ddH2O autoclavato o ddH2O privo di nucleasi.
14. Denaturazione, ricottura del primer ed estensione del primer
- Dopo l'eluizione chIP e il crosslinking inverso, trasferire 16 μL dei campioni di DNA estratti dal passaggio 13.3 ai tubi PCR.
- Rendere la miscela di denaturazione e ricottura del primer(tabella 6 e tabella dei materiali)sul ghiaccio. Aggiungere 1,2 μL di miscela di denaturazione e ricottura del primer a ciascun campione (volume totale di reazione: 17,2 μL). Eseguire campioni utilizzando il programma descritto nella tabella 6 per denaturare e ricottura i primer al DNA del modello.
- Rendere la miscela di estensione del primer(tabella 7 e tabella dei materiali)sul ghiaccio.
- Una volta completato il programma per la denaturazione e i primer ricottori, aggiungere 3 μL di miscela di estensione del primer ai campioni (volume totale di reazione: 20,2 μL). Eseguire esempi utilizzando il programma per l'estensione del primer descritto nella tabella 7.
- Procedere immediatamente alla reazione di coda dA.
15. reazione di coda dA
NOTA: Per la legatura del DNA finale appiccicoso con DNA dell'adattatore universale, il dATP viene aggiunto all'estremità 3 ' di dsDNA smussato dalla reazione di coda dA.
- Rendere la miscela di coda dA(tabella 8 e tabella dei materiali)sul ghiaccio.
- Aggiungere 4,1 μL di miscela di coda dA a ciascun campione (volume totale di reazione: 24,3 μL). Eseguire campioni utilizzando il programma dA-tailing (Tabella 8).
- Procedere immediatamente alla legatura universale dell'adattatore.
16. Legatura universale dell'adattatore
NOTA: l'adattatore universale include sequenze specifiche di sequenziamento ad alta produttività per il riconoscimento del campione di DNA per la chimica del sequenziamento. Le sequenze universali di DNA dell'adattatore sono descritte nella tabella 1.
- Dopo la reazione dA-tailing, creare un mix universale di lisceria dell'adattatore (Tabella 9 e Tabella dei materiali) per la legatura universale dell'adattatore.
- Aggiungere 21,5 μL a ciascun campione (volume totale di reazione: 45,8 μL) e incubare campioni per 15 min a 20 °C.
17. Pulizia del DNA
- Purificare il DNA utilizzando perline magnetiche(Tabella dei materiali). DNA eluto con 21 μL di ddH2O autoclavato o ddH2O privo di nucleasi.
- Conservare i campioni a -20 °C fino a quando non sono pronti per eseguire la purificazione PCR (LM-PCR) mediata dalla legatura e pcr.
18. PCR mediata dalla legatura
NOTA: le sequenze primer LM-PCR sono descritte nella tabella 1.
- Dopo la pulizia del DNA, fare la miscela LM-PCR(tabella 10 e tabella deimateriali) sul ghiaccio.
- Aggiungere 29 μL di miscela LM-PCR a ciascun campione (volume totale di reazione: 50 μL) ed eseguire campioni utilizzando il programma per LM-PCR (Tabella 10).
- Procedere immediatamente alla purificazione del GEL del DNA amplificato PCR, seguita dalla purificazione del DNA per il sequenziamento ad alta produttività.
19. Purodi DNAdel DNA amplificato LM-PCR
- Eseguire i campioni di DNA amplificato LM-PCR, insieme a una scala del DNA, in un gel di agarosio dell'1,5% a 120−180 V e accisa 200-400 bande bp.
- Purificare il DNA dal gel asportato utilizzando un kit di estrazione del gel(Table of Materials).
- Dopo la purificazione del DNA, controllare la concentrazione(Tabella dei materiali)di ogni campione di libreria ChIP-exo. Inviare esempi per il sequenziamento ad alta velocità effettiva per il sequenziamento a lettura singola.
NOTA: La lunghezza di lettura preferita per il sequenziamento a lettura singola è di almeno 35 bp, che è sufficiente per allineare in modo univoco le letture di sequenziamento al genoma di riferimento nelle cellule del topo o dell'uomo. Per la maggior parte dei fattori di trascrizione nelle cellule del topo o dell'uomo, 10−20 milioni di letture per campione ChIP-exo sono sufficienti per identificare le loro posizioni di legame genomico. Sono necessari almeno 30 milioni di letture per campione per mappare le regioni genomiche arricchite in segni istonali nelle cellule dei mammiferi.
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Representative Results
La figura 2A illustra i risultati della sonicazione dopo la llisi cellulare e la sonicazione, con vari cicli, delle cellule dei motoneuroni differenziate dalle cellule ES del topo. Il numero ottimale di cicli di sonicazione (ad esempio, 12 cicli nella Figura 2A) ha generato una forte intensità del DNA in frammenti di DNA 100−400 bp. Le librerie ChIP-exo di alta qualità si basano sulle dimensioni e sulla quantità di DNA di cromatina frammentato. Pertanto, l'ottimizzazione della sonicazione è raccomandata per ogni tipo di cella e lotto di cellule prima di iniziare ChIP-exo.
La figura 2B mostra i prodotti PCR mediati dalla legatura (LM-PCR) dei campioni di DNA ChIP-exo amplificati da cicli PCR 18−21. LM-PCR amplifica i frammenti di DNA ChIP-exo che sono legati con adattatori DNA per il sequenziamento di nuova generazione. Il primer PCR fa parte delle sequenze di adattatori DNA. La dimensione dei frammenti sonicati di DNA è di circa 100−400 bp (Figura 2A). Dopo la digestione dell'esonucleasi lambda, la dimensione dei frammenti di DNA diventerebbe la mezza dimensione del materiale di partenza (50−200 bp). Circa 125 bp di adattatori di DNA sono stati legati ai frammenti di DNA ChIP-exo, quindi la dimensione prevista dei prodotti LM-PCR è di 175−325 bp. Il numero minimo di cicli PCR pur essendo sufficiente per amplificare la libreria ChIP-exo, viene eseguito per evitare un'eccessiva amplificazione del DNA ChIP-exo.
Qui, ChIP-exo per Isl1 è stato eseguito nei motoneuroni derivati dalle cellule ES del mouse. Isl1 è un fattore di trascrizione della programmazione dei motoneuroni, che è specificamente espresso nei motoneuroni postmitotici. I risultati di Isl1 ChIP-exo mostrano quantità significative di DNA ChIP-exo amplificato da 200−400 bp LM-PCR (Figura 2B). La banda intorno ai 100 bp indica gli artefatti PCR da adattatori e primer PCR. L'esecuzione di un controllo senza anticorpi insieme a un campione sperimentale è anche importante per garantire che il DNA di fondo non specifico sia stato digerito dal trattamento con esonucleasi lambda. Ad esempio, abbiamo identificato le posizioni associate a Isl1 nei motoneuroni derivati dalle cellule ES del mouse utilizzando ChIP-exo e ChIP-seq (Figura 3). Il segnale ChIP-exo era altamente focalizzato nei siti di associazione Isl1, rilevando più modelli di associazione del fattore di trascrizione Isl1 cluster. Il segnale ChIP-seq mostrava segnali più ampi, indicando che ChIP-exo di Isl1 ha una risoluzione di mappatura più alta rispetto al ChIP-seq di Isl1.
Figura 1: Schema del protocollo ChIP-exo. Dopo il ChIP (passaggi 1−7), le reazioni di riparazione finale e di coda dA rendono il DNA chIP smussato aggiungendo un gruppo fosfato all'estremità 5 ' del DNA e aggiungendo dATP all'estremità 3 ' del DNA (fase 8). Le estremità sonicate del DNA ChIP, sulle perline sono legate con l'adattatore indice (passaggio 9). Dopo la reazione di riempimento, il DNA dell'adattatore con lo sbalzo di 5' diventa smussato (passaggio 10). Lambda esonucleasi digerisce il DNA sonicato da 5' a 3' fino ai punti di reticolamento proteina (TF)-DNA (fase 11). Dopo l'eluizione, il reverse crosslinking e l'estrazione del DNA (fasi 12 e 13), il DNA denaturato a singolo filamento viene reso a doppio filamento dall'estensione del primer PCR indice (fase 14), seguito dal dA-tailing (fase 15). L'adattatore universale viene quindi legato all'estremità trattata con esonucleasi (passaggio 16). La libreria risultante viene ripulita, amplificata da PCR e sottoposta a sequenziamento di nuova generazione (passaggi 17−19). La mappatura delle estremità 5' dei tag di sequenziamento risultanti al genoma di riferimento delimita la barriera all'esonucleasi e quindi il sito preciso del crosslinking proteina-DNA.
Figura 2: Sonicazione e amplificazione LM-PCR di una libreria ChIP-exo. (A) gel di agarosio all'1,5% del DNA sonicato elettroforeso. 12, 18 e 24 cicli di sonicazione sono stati condotti per trovare cicli di sonicazione ottimali per 2 x 107 cellule di motoneuroni derivati dalle cellule ES del mouse. Dopo la sonicazione, il campione di DNA è stato invertito incrociato ed estratto usando la PCIA e la precipitazione dell'etanolo. Ogni campione conteneva 4 x 105 equivalenti cellulari, che è il 2% delle cellule sonicate. 12 cicli di sonicazione hanno prodotto una maggiore resa di DNA sonicato con la dimensione desiderata (100−500 bp). (B) Gel di agarosio all'1,5% di librerie elettroforate ChIP-exo dopo 18−21 cicli di LM-PCR per nessun controllo anticorpale (No Ab) e Isl1 nei motoneuroni derivati dalle cellule ES del mouse. Ogni campione conteneva 10 x 106 cellule equivalenti dei motoneuroni del topo. Il risultato no antibody ChIP-exo (corsia 2) dimostra che il DNA contaminante non specifico viene eliminato dall'esonucleasi lambda. Le librerie ChIP-exo per Isl1 (corsia 3) mostrano librerie di DNA amplificate intorno ai 200−400 bp, indicando che le librerie ChIP-exo sono state amplificate con successo dalla PCR mediata dalla legatura degli adattatori. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Confronto tra ChIP-exo e ChIP-seq per Isl1 a loci specifici. Le trame riempite di blu e rosso mostrano la distribuzione di tag di sequenziamento per le posizioni legate a ChIP-seq ed ChIP-exo Isl1, rispettivamente, prossimali al gene Slit3 e Fgfr1 nei nascenti motoneuroni spinali differenziati dalle cellule ES del topo.
Tabella 1 : La commissione per i dati Oligonucleotidi utilizzati in questo protocollo.
| Nome Oligo | Lunghezza (nt) | Sequenza | Nota | |||||
| Indicizzato adattatore-forward* | 66 | 5'/Phos/CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATXXXXXXGTGACTGGAGTGTGTGTTGTGCTCTTCCGATCT 3' | 5' fosfato, indice (XXXXXXXX), 3' T-overhang | |||||
| Indice adattatore inverso* | 33 | 5'GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCAC 3' | ||||||
| Adattatore di legatura-forward* | 58 | 5«AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACACGACGCTCTTCCGATCT 3» | ||||||
| Adattatore di legatura inverso* | 34 | 5«GATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGTAG 3» | ||||||
| Primer PCR indice* | 22 | 5'CAAGCAGAAGACGGCATACGAG 3' | ||||||
| Primer PCR universale* | 19 | 5'AATGATACGGCGACCACCG 3' | ||||||
| *Le schede di sequenziamento e i primer PCR di cui sopra sono progettati per illumina hiseq e piattaforme di sequenziamento NextSeq. | ||||||||
Tabella 2: Ricette per tamponi di lisi 1−3 e buffer di blocco. Conservare in tubi da 50 mL a 4 °C. Aggiungere 50 μL di 1000x cpi (inibitore completo della proteasi) a tutti i buffer appena prima dell'uso.
| Buffer di lysis 1 | ||
| Reagente | Volume (mL) | [Finale] |
| 1 M HEPES (pH 7.3) | 2.5 | 50mm |
| 5 M NaCl | 1.4 | 140mm |
| 0,5 M EDTA (pH 8.0) | 0.1 | 1 mM |
| 50% glicerolo | 10 | 10% |
| 10% Octilfenolo etossilato | 2.5 | 0.50% |
| 10% 2-[4-(2,4,4-trimetilpentan-2-il)fenossi]etanolo | 1.25 | 0.25% |
| Autoclavato ddH2O | Riempimento a 50 | |
| Buffer di lysis 2 | ||
| Reagente | Volume (mL) | [Finale] |
| 0,5 M Tris-HCl (pH 8.0) | 1 | 10 mM |
| 5 M NaCl | 2 | 200mm |
| 0,5 M EDTA (pH 8.0) | 0.1 | 1 mM |
| Autoclavato ddH2O | Riempimento a 50 | |
| Buffer di lysis 3 | ||
| Reagente | Volume (mL) | [Finale] |
| 1 M Tris-HCl (pH 8.0) | 0.5 | 10 mM |
| 5 M NaCl | 1 | 100 mM |
| 0,5 M EDTA (pH 8.0) | 0.1 | 1 mM |
| 10% Acido deossicolico | 0.5 | 0.10% |
| Soluzione di sale di sodio N-Lauroilsarcosina al 30% | 0.83 | 0.50% |
| Autoclavato ddH2O | Riempimento a 50 | |
| Soluzione di blocco | ||
| Reagente | Quantità | [Finale] |
| Albumina di siero bovino (BSA) | 250 mg | 0.50% |
| Inibitore completo della proteasi (CPI, 1000x) | 50 μL | 1x |
| Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) | Riempire a 50 mL | |
Tabella 3 : La commissione per i dati Ricette per lavaggi ChIP: tampone high salt wash, tampone LiCl Wash e tampone Tris-HCl da 10 mM (pH 7.4). Conservare in tubi da 50 mL a 4 °C. Aggiungere 50 μL di 1000x stock CPI a tutti i buffer appena prima dell'uso.
| Tampone di lavaggio del sale elevato | ||
| Reagente | Volume (mL) | [Finale] |
| 1 M HEPES (pH 7.3) | 2.5 | 50mm |
| 5 M NaCl | 5 | 500 mM |
| 0,5 M EDTA (pH 8.0) | 0.1 | 1 mM |
| 10% 2-[4-(2,4,4-trimetilpentan-2-il)fenossi]etanolo | 5 | 1% |
| 5% Acido deossicolico | 1 | 0.10% |
| 5% SDS | 1 | 0.10% |
| Autoclavato ddH2O | Riempimento a 50 | |
| Tampone di lavaggio LiCl | ||
| Reagente | Volume (mL) | [Finale] |
| 0,5 M Tris-HCl (pH 8.0) | 2 | 20 mM |
| 0,5 M EDTA (pH 8.0) | 0.1 | 1 mM |
| 1 M LiCl | 12.5 | 250mm |
| 10% Octilfenolo etossilato | 2.5 | 0.50% |
| 5% Acido deossicolico | 5 | 0.50% |
| Autoclavato ddH2O | Riempimento a 50 | |
| Buffer Tris-HCl da 10 mM | ||
| Reagente | Volume (mL) | [Finale] |
| 1 M Tris-HCl (pH 7.4) | 0.5 | 10 mM |
| Autoclavato ddH2O | Riempimento a 50 | |
Tabella 4 : La commissione per i dati Mix master reazione fill-in.
| Reagente | 1x (μL) | [Finale] |
| 20 mg/mL BSA | 0.6 | 0,2 mg/mL |
| Tampone 10x phi29 DNA polimerasi | 6 | 1x |
| 3 mM dNTP | 2.5 | 150 μM |
| 10 U/μL phi29 DNA polimerasi | 2 | 10 U |
| Volume del mix di reazioni | 11.1 |
Tabella 5 : La commissione per i dati Ricetta per il buffer di eluizione ChIP. Conservare in tubi da 50 mL presso RT.
| Reagente | Volume (mL) | [Finale] |
| 0,5 M Tris-HCl (pH 8.0) | 5 | 50mm |
| 0,5 M EDTA (pH 8.0) | 1 | 10 mM |
| 10% SDS | 5 | 1% |
| Autoclavato ddH2O | fino a 50 mL |
Tabella 6 : La commissione per i dati Denaturazione e Primer Annealing reaction master mix e programma.
| Miscela di ricottura denaturante e primer | ||
| Reagente | 1x (μL) | [Finale] |
| 20 mg/mL BSA | 0.2 | 0,2 mg/mL |
| 3 mM dNTP | 0.5 | 75 μM |
| Primer PCR indice 10 μM | 0.5 | 0,25 μM |
| Volume del mix di reazioni | 1.2 | |
| Programma di denaturazione e ricottura primer | ||
| Temperatura (°C) | Ore | |
| 95 | 5 min | |
| 65 | 3 min | |
| 60 | 3 min | |
| 57 | 3 min | |
| 54 | 3 min | |
| 51 | 3 min | |
| 30 | Sempre | |
Tabella 7 : La commissione per l'1, la ricerca Primer Extension reazione master mix e programma.
| Mix di estensione primer | ||
| Reagente | 1x (μL) | [Finale] |
| Tampone 10x phi29 DNA polimerasi | 2 | 1x |
| 10 U/μL phi29 DNA polimerasi | 1 | 75 μM |
| Volume del mix di reazioni | 3 | |
| Programma di estensione Primer | ||
| Temperatura (°C) | Ore | |
| 30 | 20 min | |
| 65 | 10 min | |
| 4 | Sempre | |
Tabella 8: mix e programma del master di reazione dA-Tailing.
| Mix dA-Tailing | ||
| Reagente | 1x (μL) | [Finale] |
| 3 mM dATP | 0.7 | 120 μM |
| Buffer di frammento klenow | 2.4 | 1x |
| Frammento di Klenow da 5 U/μL | 1 | 5 U |
| Volume del mix di reazioni | 4.1 | |
| Programma dA-Tailing | ||
| Temperatura (°C) | Ore | |
| 37 | 30 min | |
| 75 | 20 min | |
| 4 | Sempre | |
Tabella 9 : La commissione per i dati Mix master di reazione di lisgation universal adapter.
| Reagente | 1x (μL) | [Finale] |
| Acqua autoclavata | 5 | |
| Adattatore universale da 15 μM* | 1 | 320 nM |
| Potenziatore di litigazione | 0.5 | 1x |
| Mix principale ligase | 15 | 1x |
| Volume del mix di reazioni | 21.5 | |
| *La sequenza di DNA dell'adattatore universale è descritta nella tabella 1. | ||
Tabella 10 : La commissione per i dati Mix e programma master PCR mediato dalla legatura.
| Mix LM-PCR | ||
| Reagente | 1x (μL) | [Finale] |
| Primer PCR indice 10 μM* | 2 | 0,2 μM |
| Primer UNIVERSALE PCR da 10 μM* | 2 | 0,2 μM |
| 2x Taq DNA polimerasi PCR master mix | 25 | 1x |
| Volume del mix di reazioni | 29 | |
| *Le sequenze primer PCR sono descritte nella tabella 1. | ||
| Programma LM-PCR | ||
| Temperatura (°C) | Ore | Cicli |
| 98 | 30 s | 1 |
| 98 | 10 s | 15−25 |
| 65 | 75 s | |
| 65 | 5 min | 1 |
| 4 | Tenere | |
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Discussion
In questo protocollo, il ChIP seguito dalla digestione dell'esonucleasi viene utilizzato per ottenere librerie di DNA per l'identificazione delle interazioni proteina-DNA nelle cellule dei mammiferi ad altissima risoluzione di mappatura. Molte variabili contribuiscono alla qualità dell'esperimento ChIP-exo. I parametri sperimentali critici includono la qualità degli anticorpi, l'ottimizzazione della sonicazione e il numero di cicli LM-PCR. Questi parametri sperimentali critici sono anche ciò che può limitare gli esperimenti ChIP-exo e saranno discussi di seguito.
In qualsiasi protocollo ChIP, la qualità degli anticorpi è una delle considerazioni più importanti. L'uso di anticorpi di grado ChIP è raccomandato per chip-exo. La qualità dell'anticorpo può essere controllata prima di condurre il protocollo ChIP-exo. ChIP-seq o ChIP-qPCR possono essere utilizzati per convalidare anticorpi di grado ChIP confermando specifiche posizioni di legame del DNA della proteina di interesse. Successivamente, l'ottimizzazione della concentrazione di anticorpi aggiunti alle perline è ideale per garantire che i complessi proteina-DNA siano immunoprecipitati22,23.
La sonicazione della cromatina è un altro passo critico nel protocollo ChIP-exo. La sonicazione è fondamentale per la tosatura non specifica della cromatina, necessaria per un'immunoprecipitazione ottimale alla proteina di interesse24. Le dimensioni e la quantità di DNA sonicato dipendono dal numero di cicli di sonicazione. Un'alta concentrazione di DNA frammentato è importante per garantire che un NUMERO sufficiente di DNA sia immunoprecipitato alla proteina di interesse per la creazione di una libreria di DNA ChIP-exo. Ottenere DNA frammentato da 100−500 bp è l'ideale perché la risoluzione del ChIP-exo è migliore se i frammenti di cromatina sonicata hanno dimensioni di partenza più piccole. Pertanto, la sonicazione ottimale della cromatina deve essere determinata per ogni tipo e lotto di cellule variando il numero di cicli di sonicazione e buffer di sonicazione.
Il parametro critico finale è ottenere l'amplificazione del DNA della libreria ChIP-exo con il numero minimo di cicli LM-PCR per evitare un'amplificazione troppo degli artefatti PCR. Per determinare il numero minimo di cicli PCR per amplificare il DNA ChIP-exo, una piccola porzione di DNA ChIP-exo può essere utilizzata per eseguire più cicli PCR (ad esempio, cicli 10, 15 e 20) e confrontare i prodotti PCR.
ChIP-exo ha molti più passaggi di un chIP-seq tradizionale e, di conseguenza, ogni passaggio deve essere eseguito con attenzione e precisione affinché il protocollo ChIP-exo funzioni. È importante sottolineare che il volume corretto di ogni reagente nelle reazioni enzimatiche deve essere aggiunto a ogni mix di master di reazione21. Pertanto, è consigliabile creare un foglio di calcolo per calcolare il volume di ogni reagente necessario per ogni mix master, quindi stampare le tabelle e controllare ogni reagente dopo l'aggiunta alle miscele master. Anche un'attenta escissione del DNA amplificato è importante; frammenti inferiori a 200 bp contengono spesso dimeri di adattatori, che devono essere rimossi prima del sequenziamento di nuova generazione.
In particolare, la maggior parte dei parametri critici e delle limitazioni di ChIP-exo sono identici a quelli di ChIP-seq. Tuttavia, a differenza di ChIP-seq, ChIP-exo offre una mappatura del genoma ad alta risoluzione con uno sfondo basso. Pertanto, ChIP-exo è il metodo ideale per identificare precise interazioni proteina-DNA in una varietà di sistemi e organismi, contribuendo a rivelare i ruoli significativi delle proteine leganti il DNA nella cellula. Il metodo ChIP-exo sopra descritto può essere utilizzato per esaminare i fattori di trascrizione, i segni di modifica dell'istono e le proteine regolatorie della cromatina nelle cellule viventi a una risoluzione di mappatura più elevata rispetto a ChIP-seq25,26,27. Inoltre, ChIP-exo può rilevare le singole posizioni di legame delle proteine leganti il DNA all'interno di un cluster, mentre ChIP-seq non può a causa della sua risoluzione di mappatura. È importante sottolineare che ChIP-exo visualizza un rapporto segnale-rumore più elevato rispetto a ChIP-seq. Questi vantaggi di ChIP-exo ci permettono di identificare una serie completa di posizioni legate attraverso il genoma. Questo protocollo fornirà una base per i ricercatori interessati a esaminare le posizioni di legame del DNA di varie proteine attraverso il genoma a una risoluzione vicina alla coppia di basi.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Ringraziamo il membro del laboratorio Rhee per aver condiviso dati inediti e preziose discussioni. Questo lavoro è stato supportato dalla sovvenzione RGPIN-2018-06404 (H.R.) del Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose, UltraPure | Invitrogen | 16500 | Checking Sonication (Section 4.3.6) and Gel Purification of LM-PCR Amplified DNA (Section 19.1) |
| Albumin, Bovine Serum (BSA), Protease Free, Heat Shock Isolation, Min. 98% | BioShop | ALB003 | Blocking Solution |
| Antibody against Isl1 | DSHB | 39.3F7 | Antibody incuation with beads (Section 5.6) |
| Bioruptor Pico | Diagenode | B01060010 | Sonicating Chromatin (Section 3.3) |
| Bovine serum albumin (BSA), Molecular Biology Grade | New England BioLabs | B9000S | Fill-in Reaction on Beads (Section 10.2) and Denaturing, Primer Annealing and Primer Extension (Section 14.2) |
| Centrifuge 5424 R | Eppendorf | 5404000138 | Sonicating Chromatin (Section 3.5), Checking Sonication (Section 4.3.1, 4.3.3 and 4.3.4) |
| Centrifuge 5804 R | Eppendorf | 22623508 | Harvest, cross-linking and freezing cells (Section 1.3), Cell lysis (Section 2.2 and 2.3), Sonicating Chromatin (Section 3.1) |
| cOmplete, Mini, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 4693159001 | Added to all buffers, except Proteinase K buffer and ChIP Elution buffer |
| dATP Solution | New England BioLabs | N0440S | dA-Tailing Reaction (Section 15.1) |
| Deoxycholic Acid Sodium Salt | fisher scientific | BP349 | Lysis Buffer 3, High Salt Wash Buffer and LiCl Wash Buffer |
| dNTP Mix, Molecular Biology Grade | Thermo Scientific | R0192 | Fill-in Reaction on Beads (Section 10.2) and Denaturing, Primer Annealing and Primer Extension (Section 14.2) |
| DreamTaq Green PCR Master Mix, 2x | Thermo Scientific | K1081 | Ligation-Mediated PCR (Section 18.1) |
| EDTA, 0.5 M, Sterile Solution, pH 8.0 | BioShop | EDT111 | Lysis Buffer 1-3, Checking Sonication (Section 4.1), High Salt Wash Buffer, LiCl Wash Buffer and ChIP Elution Buffer |
| Ethyl Alcohol Anhydrous, 100% | Commercial alcohols | P006EAAN | Checking Sonication (Section 4.3.3) |
| Formaldehyde, 36.5-38%, contains 10-15% methanol | Sigma | F8775 | Harvest, cross-linking and freezing cells (Section 1.1) |
| Glycerol, Reagent Grade, min 99.5% | BioShop | GLY002 | Lysis Buffer 1 |
| Glycine, Biotechnology Grade, min. 99% | BioShop | GLN001 | Harvest, cross-linking and freezing cells (Section 1.2) |
| Glycogen, RNA Grade | Thermo Scientific | R0551 | Checking Sonication (Section 4.3.3) |
| HEPES, 1 M Sterile-filtered Solution, pH 7.3 | BioShop | HEP003 | Lysis Buffer 1, High Salt Wash Buffer |
| Klenow Fragment (3->5 exo-) | New England BioLabs | M0212S | dA-Tailing Reaction (Section 15.1) |
| Lambda exonuclease | New England BioLabs | M0262S | Lambda Exonuclease Digestion on Beads (Section 11.2) |
| Ligase Enhancer | New England BioLabs | E7645S | NEBNext Ultra II DNA Library Kit. Index Adapter Ligation on Beads (Section 9.1) and Universal Adapter Ligation (Section 16.1) |
| Ligase Master Mix | New England BioLabs | E7645S | NEBNext Ultra II DNA Library Kit. Index Adapter Ligation on Beads (Section 9.1) and Universal Adapter Ligation (Section 16.1) |
| Lithium Chloride (LiCl), Reagent grade | Bioshop | LIT704 | LiCl Wash Buffer |
| Magnetic beads for ChIP (Dynabeads Protein G) | Dynabeads Protein G (magnetic beads for ChIP) | Dynabeads Protein G (magnetic beads for ChIP) | Antibody incubation with beads (Section 5) |
| Magnetic beads for DNA purification (AMPure XP Beads) | Beckman Coulter | A63880 | DNA Extraction (Section 13.3) and DNA Clean-up (Section 17.1) |
| Magnetic rack (DynaMag-2 Magnet) | Invitrogen | 12321D | Used in many steps in Sections: 5 - 11, 13 |
| MinElute Gel Extraction Kit | Qiagen | 28604 | Gel Purification of PCR Amplified DNA (Section 19.2) |
| N-Lauroylsarcosine sodium salt solution, 30% aqueous solution, ≥97.0% (HPLC) | Sigma | 61747 | Lysis Buffer 3 |
| Octylphenol Ethoxylate (IGEPAL CA630) | BioShop | NON999 | Lysis Buffer 1 and LiCl Wash Buffer |
| Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol, Biotechnology Grade (25:24:1) | BioShop | PHE512 | Checking Sonication (Section 4.3.1) |
| phi29 DNA Polymerase | New England BioLabs | M0269L | Fill-in Reaction on Beads (Section 10.2) and Denaturing, Primer Annealing and Primer Extension (Section 14.3 and 14.4) |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS), 1x | Corning | 21040CV | Harvest, cross-linking and freezing cells (Section 1.3) and Sonicating Chromatin (Section 3.1), Antibody incuation with beads (Section 5.1) |
| PowerPac Basic Power Supply | BioRad | 1645050 | Checking Sonication (Section 4.3.6) and Gel Purification of LM-PCR Amplified DNA (Section 19.1) |
| ProFlex PCR System | Applied Biosystems | ProFlex PCR System | Used in Sections: 14.2, 14.4, 15.2, 16.2 and 18.2 |
| Protein LoBind Tube, 2.0 mL | Eppendorf | 22431102 | Antibody Incubation with Beads (Section 5.2) and Chromatin Immunoprecipitation (Section 6.3) |
| Proteinase K Solution, RNA Grade | Invitrogen | 25530049 | Checking Sonication (Section 4.2) and Elution and Reverse Crosslinking (Section 12.3) |
| Qubit 4.0 Fluorometer | Invitrogen | Q33226 | Gel Purification of PCR Amplified DNA (Section 19.3) |
| Quibit dsDNA BR assay kit | Invitrogen | Q32853 | Gel Purification of PCR Amplified DNA (Section 19.3) |
| Rnase A, Dnase and Protease-free | Thermo Scientific | EN0531 | Checking Sonication (Section 4.3.2) and DNA Extraction (Section 13.2) |
| Sodium chloride (NaCl), BioReagent | Sigma | S5886 | Lysis Buffer 1-3, High Salt Wash Buffer |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS), Electrophoresis Grade | BioShop | SDS001 | Checking Sonication (Section 4.1), High Salt Wash Buffer and ChIP Elution Buffer |
| Sonication beads and 15 mL Bioruptor Tubes | Diagenode | C01020031 | Sonicating Chromatin (Section 3.1 and 3.2) |
| ThermoMixer F1.5 | Eppendorf | 5384000020 | Section 4.2, 4.3.2, 4.3.5, 8.2, 9.2, 10.3, 11.2, 12.2, 12.3, 13.2 and 16.2 |
| Trizma hydrochloride solution (Tris-HCl), BioPerformance Certified, 1 M, pH 7.4 | Sigma | T2194 | 10 mM Tris-HCl Buffer |
| Trizma hydrochloride solution (Tris-HCl), BioPerformance Certified, 1 M, pH 8.0 | Sigma | T2694 | Lysis Buffer 2, Lysis Buffer 3, Checking Sonication (Section 4.1), LiCl Wash Buffer and ChIP Elution Buffer |
| Ultra II End Repair/dA-Tailing Module (24 rxn -> 120 rxn) | New England BioLabs | E7546S | End Prep Reaction mix and End Prep Enzyme mix. End-repair and dA-Tailing Reaction on Beads (Section 8.2) |
| VWR Mini Tube Rocker, Variable Speed | VWR | 10159-752 | Used in many steps in sections: 1, 2, 5, 6 and 7 |
| 2-[4-(2,4,4-trimethylpentan-2-yl)phenoxy]ethanol, Triton X-100, Reagent Grade | BioShop | TRX506 | Lysis Buffer 1, Sonicating Chromatin (Section 3.4) and High Salt Wash Buffer |
References
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