Summary
La determinación precisa de las ubicaciones de unión a proteínas en todo el genoma es importante para entender la regulación genética. Aquí describimos un método de mapeo genómico que trata el ADN inmunoprecipitado con cromatina con digestión exonucleasa (ChIP-exo) seguido de secuenciación de alto rendimiento. Este método detecta interacciones proteína-ADN con resolución cartográfica de par base cercano y alta relación señal-ruido en las neuronas de mamíferos.
Abstract
La identificación de interacciones específicas proteína-ADN en el genoma es importante para entender la regulación genética. La inmunoprecipitación de cromatina junto con la secuenciación de alto rendimiento (ChIP-seq) se utiliza ampliamente para identificar ubicaciones de unión a todo el genoma de proteínas que unen el ADN. Sin embargo, el método ChIP-seq está limitado por su heterogeneidad en longitud de fragmentos de ADN sonicados y ADN de fondo no específico, lo que resulta en una baja resolución cartográfica e incertidumbre en los sitios de unión al ADN. Para superar estas limitaciones, la combinación de ChIP con digestión exonucleasa (ChIP-exo) utiliza digestión exonucleasa de 5' a 3' para recortar el ADN inmunoprecipitado de tamaño heterogéneo al sitio de enlace cruzado proteína-ADN. El tratamiento con exonucleasa también elimina el ADN de fondo no específico. El ADN preparado por la biblioteca y digerido por exonuclease puede ser enviado para secuenciación de alto rendimiento. El método ChIP-exo permite una resolución de mapeo cercana al par base con mayor sensibilidad de detección y señal de fondo reducida. A continuación se describe un protocolo ChIP-exo optimizado para células de mamíferos y secuenciación de próxima generación.
Introduction
Las ubicaciones de las interacciones proteína-ADN proporcionan información sobre los mecanismos de regulación genética. La inmunoprecipitación de cromatina junto con la secuenciación de alto rendimiento (ChIP-seq) se ha utilizado durante una década para examinar las interacciones proteína-ADN en todo el genoma en las células vivas1,2. Sin embargo, el método ChIP-seq está limitado por la heterogeneidad en la fragmentación del ADN y la contaminación de ADN no entrante que conducen a una baja resolución cartográfica, falsos positivos, llamadas perdidas y señal de fondo no específica. La combinación de ChIP con digestión exonucleasa (ChIP-exo) mejora el método ChIP-seq recortando el ADN ChIP a los puntos de enlace proteína-ADN, proporcionando una resolución cercana al par base y una señal de fondo baja3,4,5. La resolución cartográfica muy mejorada y los bajos antecedentes proporcionados por ChIP-exo permiten determinar ubicaciones precisas y completas de unión proteína-ADN en todo el genoma. ChIP-exo es capaz de revelar motivos funcionalmente distintos de unión al ADN, interacciones cooperativas entre factores de transcripción (TF) y múltiples sitios de enlace proteína-ADN en una determinada ubicación de unión genómica, no detectable por otros métodos de cartografía genómica3,4,6,7.
ChIP-exo se utilizó inicialmente en levadura en ciernes para examinar la unión de ADN específica de secuencia de los TFs, para estudiar la organización precisa del complejo de transcripción previa a la iniciación, y la estructura sub-nucleosomal de histonas individuales a través del genoma4,8,9. Desde su introducción en 20114,ChIP-exo se ha utilizado con éxito en muchos otros organismos incluyendo bacterias, ratones y células humanas7,10,11,12,13,14,15,16,17. En 2016, Rhee et al.14 utilizaron ChIP-exo en neuronas de mamíferos por primera vez para entender cómo se mantuvo la expresión génica neuronal después de la regulación descendente de la programación tf Lhx3, que forma un complejo heterodímero con otra programación TF Isl1. Este estudio demostró que en ausencia de Lhx3, Isl1 es reclutado para nuevos potenciadores neuronales unidos por Onecut1 TF para mantener la expresión génica de genes efectores neuronales. En este estudio, ChIP-exo reveló cómo múltiples TFs reconocen dinámicamente el tipo de célula y los elementos reguladores de ADN específicos de la etapa celular de una manera combinatoria a la resolución de mapeo de casi nucleótidos. Otros estudios también utilizaron el método ChIP-exo para entender la interacción entre las proteínas y el ADN en otras líneas celulares de mamíferos. Han et al.7 utilizó ChIP-exo para examinar la organización del genoma de los TFs GATA1 y TAL1 en células eritródicas de ratón utilizando ChIP-exo. Este estudio encontró que TAL1 se recluta directamente para el ADN en lugar de indirectamente a través de interacciones proteína-proteínas con GATA1 a lo largo de la diferenciación eritroide. Estudios recientes también utilizaron ChIP-exo para perfilar las ubicaciones de unión a todo el genoma de CTCF, ARN Polymerase II y marcas de histona para estudiar mecanismos epigenómicos y transcripcionales en líneas celulares humanas18,19.
Hay varias versiones del protocolo ChIP-exo disponibles3,5,20. Sin embargo, estos protocolos ChIP-exo son difíciles de seguir para las investigaciones que no están familiarizadas con la preparación de la biblioteca de secuenciación de próxima generación. Una excelente versión del protocolo ChIP-exo fue publicada con instrucciones fáciles de seguir y un video21,pero contenía muchos pasos enzimáticos que requieren una cantidad significativa de tiempo para completarse. Aquí informamos de una nueva versión del protocolo ChIP-exo que contiene pasos enzimáticos reducidos y tiempos de incubación, y explicaciones para cada paso enzimático21. Las reacciones de reparación final y relaves dA se combinan en un solo paso utilizando la enzima de preparación final. Los tiempos de incubación de los pasos de ligadura del adaptador universal y de índice se reducen de 2 h a 15 min utilizando un potenciador de ligadura. Se elimina la reacción quinasa después del paso de ligadura del adaptador de índice descrito en el protocolo ChIP-exo anterior. En su lugar, se agrega un grupo de fosfato durante la síntesis de ADN de oligo a uno de los extremos de 5' del adaptador de índice(Tabla 1),que se utilizará para el paso de digestión lambda exonuclease. Mientras que el protocolo chip-exo anterior utilizó la digestión RecJf exonuclease para eliminar contaminantes de ADN de una sola cadena, este paso de digestión se elimina aquí porque no es crítico para la calidad de la biblioteca ChIP-exo. Además, para purificar el ADN de enlace inverso después de la elución chip, se utiliza un método de purificación de cuentas magnéticas en lugar del método de extracción de fenol:cloroformo:alcohol isoamilo (PCIA). Esto reduce el tiempo de incubación de la extracción de ADN. Es importante destacar que elimina la mayoría de los atenuadores de adaptador formados durante la ligadura del adaptador de índice, lo que puede afectar a la eficiencia de la PCR mediada por ligadura.
El protocolo ChIP-exo presentado aquí está optimizado para la detección de interacciones precisas proteína-ADN en neuronas de mamíferos diferenciadas de las células madre embrionarias (ES) del ratón. Brevemente, las células neuronales cosechadas y reticuladas se miman, para permitir que la cromatina esté expuesta a la sonicación, luego sonicadas para que se obtengan fragmentos de ADN de tamaño adecuado(Figura 1). Las cuentas recubiertas de anticuerpos se utilizan para inmunoprecipitar selectivamente la cromatina fragmentada y soluble a la proteína de interés. Mientras que el ADN inmunoprecipitado todavía está en las cuentas, se realizan pasos de reparación final, ligadura de adaptadores de secuenciación, reacción de relleno y 5' a 3' pasos de digestión exonucleasa lambda. El paso de digestión exonuclease es lo que le da a ChIP-exo su alta resolución y alta relación señal-ruido. Lambda exonuclease recorta el ADN inmunoprecipitado a unos pocos pares de bases (bp) del sitio de enlace cruzado, lo que hace que el ADN contaminante se degrade. El ADN ChIP tratado con exonucleasa se eluta de las cuentas recubiertas de anticuerpos, se invierten los enlaces cruzados proteína-ADN y se degradan las proteínas. El ADN se extrae y desnaturaliza al ADN ChIP de una sola cadena, seguido de recocido de imprimación y extensión para hacer ADN de doble cadena (dsDNA). A continuación, se realiza la ligadura de un adaptador universal a los extremos tratados con exonucleasa. El ADN resultante se purifica, luego pcr amplificado, gel purificado, y sometido a secuenciación de próxima generación.
El protocolo ChIP-exo es más largo que el protocolo ChIP-seq, pero no es muy difícil técnicamente. Cualquier ADN ChIP inmunoprecipitado con éxito puede ser sometido a ChIP-exo, con varios pasos enzimáticos adicionales. Las ventajas notables de ChIP-exo, como la resolución de mapeo ultra alta, una señal de fondo reducida y la disminución de falsos positivos y negativos, con respecto a los sitios de enlace genómico, superan el costo de tiempo.
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Protocol
NOTA: Se recomienda el agua destilada y desionizada autoclavada (ddH2O) para la fabricación de tampones y mezclas maestras de reacción. Las secciones 1-4 describen la lisis celular y la sonicación, las secciones 5-7 describen la inmunoprecipitación de cromatina (ChIP), las secciones 8-11 describen reacciones enzimáticas en cuentas, las secciones 12 y 13 describen la elución chip y la purificación del ADN, y las secciones 14-19 describen la preparación de la biblioteca.
1. Cosecha y reticulación de células
- Después de diferenciar las células ES del ratón en neuronas postmitóticas, agregue un 11% de formaldehído a las células cosechadas a una concentración final del 1% (v/v). Células de roca en una plataforma de balanceo (un balancín, agitador o rotador) durante 15 min, a temperatura ambiente (RT, 25 °C).
NOTA: Dependiendo de la proteína objetivo a cruzar, menos enlace cruzado de formaldehído (por ejemplo, una concentración final de 0,5%) o doble reticulación con glutatrato de disuccinimidilo (DSG) se puede utilizar. - Añadir 2,5 M de glicina a una concentración final de 150 mM para detener la reacción de enlace cruzado. Células de roca en una plataforma de balanceo en RT, durante 5 minutos.
- Centrífuga las células reticuladas en tubos cónicos de 15 ml en RT, durante 6 min, a 1.350 x g. Aspirar la solución, luego resuspend células en 5 ml de solución salina tamponada de fosfato 1x (PBS).
NOTA: Los pellets de celda reticulados se pueden almacenar a -80 °C después de la congelación repentina con nitrógeno líquido.
2. Lisis celular
NOTA: Los siguientes pasos en este protocolo son para aproximadamente 2 x 107 células neuronales diferenciadas de las células ES del ratón. Para romper las células abiertas, se utilizarán tampones de lisis que contengan varios detergentes. Añadir 50 μL de 1000x de material completo de inhibidor de la proteasa (CPI) a 50 ml de tampón justo antes de su uso.
- Prepare los buffers de lisis 1-3 como se describe en la Tabla 2.
- Descongelar pellets celulares cruzados en hielo, luego resuspend completamente pellets celulares en 3 ml de tampón de lisis 1 en tubos cónicos de 15 ml. Roca a 4 °C durante 15 min en una plataforma de balanceo. Centrífuga a 1.350 x g durante 5 min a 4 °C y aspirar sobrenadante.
- Células peletadas completamente resuspend en 3 ml de tampón de lisis 2. Roca a 4 °C durante 10 minutos en una plataforma de balanceo. Centrífuga a 1.350 x g durante 5 min a 4 °C y aspirar sobrenadante.
- Añadir 1 ml de lysis buffer 3 a cada pellet, a continuación, mantener en el hielo. Proceda inmediatamente a la sonicación.
3. Cromatina sonicizante
NOTA: Mantenga las muestras en hielo o a 4 °C durante este procedimiento de sonicación para reducir la reversión del enlace cruzado.
- Usando una espátula estéril, agregue cuentas de sonicación(Tabla de Materiales)hasta la marca de graduación de 0,2 ml en tubos de poliestireno de 15 ml. Lave las cuentas de sonicación por vórtice en 600 μL de 1x PBS hasta que no haya manchas secas visibles. Centrífuga los tubos durante 5 s a 30 x g y aspirar 1x PBS.
NOTA: La sonicación en tubos de poliestireno es más eficiente que la sonicación en tubos de polipropileno. Si se sonica un número menor de células (por ejemplo, <106 células), utilice tubos de poliestireno de 1,5 ml sin añadir cuentas de sonicación. - Resuspendó a fondo los lysatos nucleares en 1 ml de lysis buffer 3 (desde el paso 2.4), luego transferir a los tubos de poliestireno de 15 ml que contienen cuentas de sonicación. Vórtice breve de los tubos de poliestireno.
- Para fragmentar el ADN de cromatina reticulada, los lysatos nucleares sonicados a 4 °C para un número optimizado de ciclos, con amplitud de potencia a 30 W, y ciclos de sonicación ajustados en 30 s on/30 s apagados.
NOTA: La optimización de la sonicación para cada tipo de celda y lote dará como resultado el mejor rendimiento chip-exo. Para 2 x 107 células neuronales del ratón, 20-30 ciclos de sonicación en los ajustes mencionados fragmentarán la cromatina en el rango de 100-500 bp. - Una vez completada la sonicación, transfiera todos los sobrenadantes (lysatos sonicados), de cada muestra, a tubos de 1,5 ml. Añadir 10% 2-[4-(2,4,4-trimetilpentan-2-yl)fenoxi]etanol) a cada muestra a una concentración final del 1%. Mezclar por pipeteo.
- A los desechos de células de pellets, muestras de centrífugas a 13.500 x g durante 10 minutos a 4 °C. Transfiera todos los lysates sonicados (sobrenadantes) de cada muestra a nuevos tubos de 1,5 ml.
- Tome 30 μL de lysato sonicado de cada muestra (~3% de lysate sonicado) y agregue a nuevos tubos de 1,5 ml para comprobar la sonicación. Almacene los liceos sonicados restantes a 4 °C hasta que estén listos para la incubación con cuentas recubiertas de anticuerpos.
4. Comprobación de la sonicación
- Hacer 20 ml de tampón K proteico 2x añadiendo 2 ml de Tris-HCl de 0,5 M (pH 8.0), 2 ml de 0,5 M EDTA, 10 ml de sulfato de dodecilo sódico (SDS) y 6 ml de ddH2O autoclavado. No agregue IPC a este búfer. Conservar en tubo de 50 ml en RT.
- Para revertir el enlace cruzado proteína-ADN, mediante la eliminación de las proteínas, tome los 30 μL de cromatina sonicada de cada muestra (del paso 3.6), agregue 166 μL de ddH2O autoclavado, 200 μL de 2x tampón de proteína K y 4 μL de 20 mg/ml de proteinasa K. V. Vórtice brevemente las muestras, y luego incubar a 65 °C durante 1-3 h a 24 x g.
- NOTA: Los lysates sonicados se pueden reenreconectar a 65 °C durante la noche.
- Extraer ADN usando PCIA (25:24:1) y método de precipitación de etanol de la siguiente manera.
PRECAUCIÓN: PCIA es tóxico. Utilícenlo bajo una campana de humo con equipo de protección personal estándar (EPI).- Añadir 400 μL de PCIA a cada muestra en tubos de 1,5 ml, ajustar el vórtice a la velocidad máxima y muestras de vórtice durante 20 s. Centrífuga a 18.400 x g durante 6 minutos en RT. Se observarán dos fases. Transfiera cuidadosamente la capa acuosa superior (fase clara) de cada muestra a nuevos tubos de 1,5 ml.
- Añadir 1 μL de 10 mg/ml de RNase A. Incubar muestras a 37 °C durante 30 min.
- Añadir 1 μL de glucógeno de 20 mg/ml a cada muestra, luego precipitar con 1 ml de etanol frío al hielo al 100% (almacenado en un congelador de -20 °C). Mezcle brevemente y luego incuba muestras en un congelador de -80 °C durante 30 min a 1 h. Muestras de centrífuga a 18.400 x g durante 10 minutos a 4 °C y verter cuidadosamente 100% etanol.
- Lave pellets con 500 μL de etanol frío en hielo al 70% (almacenado en un congelador de -20 °C). Centrífuga a 18.400 x g durante 5 minutos a 4 °C. Vierta cuidadosamente un 70% de etanol.
- Incubar muestras en tubos de 1,5 ml a 50 °C hasta que se evapore el etanol restante. Pellets de ADN resuspend en 15 μL de ddHautoclavado 2O o ddH2O sin nucleasa.
- Ejecute las muestras de ADN extraídas, junto con una escalera de ADN, en un gel de agarose del 1,5% a 120-180 V y compruebe el tamaño del ADN sonicado.
5. Incubación de anticuerpos con cuentas
NOTA: Los siguientes pasos en este protocolo son para aproximadamente 2 x 107 células neuronales diferenciadas de las células ES del ratón. No congele y descongele cuentas magnéticas en ningún momento durante el protocolo ChIP-exo, ya que las cuentas pueden agrietarse causando contaminación de la muestra o el rendimiento del anticuerpo puede verse comprometido.
- Después de la lisis celular y la sonicación, preparar cuentas magnéticas de proteína G(tabla de materiales)para chIP, mezclar cuentas magnéticas hasta que sean homogéneas, luego añadir 25 μL de cuentas magnéticas a 2 tubos de unión bajo en proteínas de 2 ml.
NOTA: El tipo de cuentas magnéticas utilizadas dependerá de las especies de anticuerpos. - Lavar cuentas con 1 ml de solución de bloqueo(Tabla 2),mezclar bien, luego colocar en un bastidor magnético durante 1 min. Mientras esté todavía en un estante magnético, retire el sobrenadante una vez que esté claro.
- Añadir 1 ml de solución de bloqueo a las cuentas magnéticas. Tubos de roca durante 10 minutos a 4 °C en una plataforma de balanceo. Gire brevemente, luego coloque los tubos en un bastidor magnético y retire el sobrenadante.
- Repita el paso 5.3 dos veces más.
- Añadir 500 μL de solución de bloqueo a cuentas magnéticas. Gire brevemente el anticuerpo contra Isl1 (0,04 μg/μL, Tabla de Materiales),luego agregue 4 μg de anticuerpo a los correspondientes tubos de unión bajo en proteínas de 2 ml que contengan las cuentas magnéticas en la solución de bloqueo.
- Repita el paso 5.5 sin anticuerpo (es decir, el control sin anticuerpos para ChIP).
NOTA: La cantidad de anticuerpos a añadir se puede determinar empíricamente teniendo en cuenta la calidad del anticuerpo y el número de células utilizadas para ChIP. - Muestras de roca a 4 °C para 6-24 h en una plataforma de balanceo.
6. Inmunoprecipitación de cromatina (ChIP)
- Lave cuentas recubiertas de anticuerpos del paso 5.8 con 1 ml de solución de bloqueo. Coloque las muestras en una plataforma de balanceo a 4 °C durante 5 minutos. Retire el sobrenadante.
- Repita el paso 6.1 dos veces más.
- Resuspend cuentas recubiertas de anticuerpos en 50 μL de solución de bloqueo, luego transferir a nuevos tubos de unión bajo en proteína de 2 ml. Para cada muestra de ChIP, agregue lysatos sonicados (~1,0 ml desde el paso 3,6) a cuentas recubiertas de anticuerpos en tubos de unión bajos en proteínas de 2 ml.
- Incuba cada muestra en una plataforma de mecedora durante la noche a 4 °C.
7. ChIP lava
NOTA: Mantenga las muestras en hielo o a 4 °C para mantener el enlace cruzado proteína-ADN durante los lavados chip.
- Haga un búfer de lavado de sal alto, tampón de lavado LiCl y tampón Tris-HCl de 10 mM (pH 7.4) como se describe en la Tabla 3. Conservar en tubos de 50 ml a 4 °C. Añadir 50 μL de 1000x stock CPI a todos los buffers justo antes de su uso.
- Gire brevemente muestras en tubos de unión bajo en proteínas de 2 ml para recoger líquido de las tapas, luego colóquelos en un estante magnético durante 1 minuto y retire el sobrenadante cuidadosamente con una pipeta.
- Para los lavados ChIP, agregue 1 ml de tampón de lisis 3 (a 4 °C) a cada tubo. Mezcle en una plataforma de mecedora a 4 °C durante 5 minutos. Gire brevemente las muestras, luego colóquelos en un estante magnético durante 1 minuto y retire el sobrenadante con una pipeta.
- Agregue 1 ml de tampón de lavado de sal alta en frío a cada tubo. Mezcle en una plataforma de mecedora a 4 °C durante 5 minutos. Gire brevemente las muestras, luego colóquelos en un estante magnético durante 1 minuto y retire el sobrenadante con una pipeta.
- Agregue 1 ml de búfer de lavado LiCl frío a cada tubo. Mezcle en una plataforma de mecedora a 4 °C durante 5 minutos. Gire brevemente las muestras, luego colóquelos en un estante magnético durante 1 minuto y retire el sobrenadante con una pipeta.
- Agregue 1 ml de búfer Tris-HCl frío de 10 mM (pH 7.4) a cada tubo. Mezcle en una plataforma de mecedora a 4 °C durante 5 minutos. Gire brevemente las muestras, luego colóquelos en un estante magnético durante 1 minuto y retire el sobrenadante con una pipeta.
NOTA: El búfer Tris-EDTA (pH 8.0) se puede utilizar en lugar del búfer Tris-HCl (pH 7.4). - Repita los pasos 7.4−7.6 tres veces.
- Transfiera las cuentas de muestra con 500 μL de tampón Tris-HCl (pH 7.4) a tubos frescos de 1,5 ml. Gire brevemente las muestras, luego colóquelos en un estante magnético durante 1 minuto y retire el sobrenadante con una pipeta.
8. Finalizar la reparación y la reacción de dA-tailing en cuentas
NOTA: La sonicación a menudo genera dsDNA final no contundente. Se requiere una reacción de reparación final para hacer ADN contundente antes de la reacción de relaves dA seguida del paso de ligadura del adaptador de índice. Para la ligadura de ADN final pegajoso con ADN del adaptador de índice, dATP se añade al extremo de 3' de un fragmento dsDNA contundente por la reacción de relaves dA. La mezcla de reacción de preparación final contiene dATP.
- Después de lavar chip, añadir 38 μL de ddH2O autoclavado a las cuentas de muestra en tubos de 1,5 ml para la reparación final y la reacción dA-tailing.
- Añadir 5,6 μL de mezcla de reacción de preparación final y 2,4 μL de mezcla de enzimas de preparación final(tabla de materiales)a cada muestra (volumen de reacción total: 46 μL). Incuba muestras a 20 °C durante 30 min.
- Lave las cuentas como se describe en los pasos de lavado chip anteriores 7.4−7.6.
9. Ligadura del adaptador de índice en cuentas
NOTA: El adaptador de índice tiene 6-10 bases de secuencias de índice con código de barras, que son específicas de una muestra determinada utilizada para multiplexar varias muestras en secuenciación de alto rendimiento. Las secuencias de ADN del adaptador de índice se describen en la Tabla 1.
- Para la ligadura del adaptador de índice, agregue 27 μL de búfer Tris-HCl frío de 10 mM (pH 7.4) a las cuentas de muestra. Añadir 2 μL de adaptador de índice de 15 μM, 0,5 μL de potenciador de ligadura y 15 μL de mezcla maestra de ligalosa(tabla de materiales)a cada muestra (volumen de reacción total: 44,5 μL).
- Incuba muestras a 20 °C durante 15 min. Lave las cuentas como se describe en los pasos 7.4−7.6.
10. Reacción de relleno en cuentas
NOTA: Después de la ligadura del adaptador, no hay unión de fosfodiester entre el extremo de 5' del adaptador y el extremo de 3' del ADN ChIP. El nick puede ser reparado por una reacción de relleno.
- Añadir 47 μL de búfer tris-HCl frío de 10 mM (pH 7.4) a las cuentas de muestra.
- Haga la mezcla de reacción de relleno(Tabla 4 y Tabla de Materiales)sobre hielo.
- Añadir 11,1 μL de mezcla de relleno a cada muestra (volumen de reacción total: 58,1 μL). Incuba muestras a 30 °C durante 20 min. Lave las cuentas como se describe en los pasos 7.4−7.6.
11. Digestión exonuclease lambda en cuentas
- Después de la reacción de relleno en las cuentas, agregue 50 μL de ddH2O autoclavado en frío a las cuentas de muestra.
- Para digerir el ADN chip en la dirección de 5' a 3', añadir 6 μL de 10x tampón lambda exonuclease y 2 μL de 5 U/μL exonuclease lambda(Tabla de materiales,volumen de reacción total: 58 μL). Incuba muestras a 37 °C durante 30 min. Lave las cuentas como se describe en los pasos 7.4−7.6.
12. Elución y reticulación inversa
- Realice el búfer de elución ChIP como se describe en la Tabla 5.
NOTA: No agregue CPI al búfer de elución ChIP. - Para obtener muestras chip de las cuentas, resuspend muestras en 75 μL de tampón de elución ChIP e incubar a 65 °C durante 15 min a 130 x g.
- Añadir 2,5 μL de 20 mg/ml de proteinasa K(Tabla de Materiales)a las muestras. Vórtice breve, luego incubar las muestras durante la noche a 65 °C.
13. Extracción de ADN
- Después de que las muestras hayan incubado durante la noche a 65 °C, gire brevemente muestras, colóquelos en un bastidor magnético durante 1 minuto y luego transfiera el sobrenadante de cada muestra a nuevos tubos de 1,5 ml.
- Añadir 1 μL de 10 mg/ml RNase A a las muestras. Vórtice breve, luego incubar las muestras a 37 °C durante 30 min. Añadir ~25 μL de ddH autoclavado2O a volumen de hasta 100 μL.
- Purificar el ADN utilizando cuentas magnéticas(Tabla de Materiales). ADN elute con 16 μL de ddH autoclavado2O o ddH2O sin nucleasa.
14. Desnaturalización, recocido de imprimación y extensión de imprimación
- Después de la elución ChIP y el reticulación inversa, transfiera 16 μL de las muestras de ADN extraídas del paso 13.3 a los tubos PCR.
- Hacer mezcla de desnaturalización y recocido de imprimación(Tabla 6 y Tabla de Materiales)sobre hielo. Añadir 1,2 μL de mezcla de desnaturalización y recocido de imprimación a cada muestra (volumen total de reacción: 17,2 μL). Ejecute muestras utilizando el programa descrito en la Tabla 6 para desnatura y imprimaciones de recocido en el ADN de la plantilla.
- Haga la mezcla de extensión de imprimación(Tabla 7 y Tabla de Materiales)sobre hielo.
- Una vez finalizado el programa de desnatura y recocido, añada 3 μL de mezcla de extensión de imprimación a las muestras (volumen total de reacción: 20,2 μL). Ejecute ejemplos utilizando el programa para la extensión de imprimación descrito en la Tabla 7.
- Proceda inmediatamente a la reacción de dA-tailing.
15. Reacción de dA-tailing
NOTA: Para la ligadura de ADN final pegajoso con ADN de adaptador universal, dATP se añade al extremo de 3' de contundente, dsDNA por la reacción dA-tailing.
- Hacer mezcla de dA-tailing(Tabla 8 y Tabla de Materiales)sobre hielo.
- Añadir 4,1 μL de mezcla de relaves dA a cada muestra (volumen total de reacción: 24,3 μL). Ejecute muestras utilizando el programa para dA-tailing (Tabla 8).
- Proceda inmediatamente a la ligadura universal del adaptador.
16. Ligadura universal del adaptador
NOTA: El adaptador universal incluye secuencias específicas de secuenciación de alto rendimiento para el reconocimiento de muestras de ADN para la química de secuenciación. Las secuencias de ADN del adaptador universal se describen en la Tabla 1.
- Después de la reacción del dA-tailing, haga la mezcla de ligadura del adaptador universal(Tabla 9 y Tabla de Materiales)para la ligadura universal del adaptador.
- Añadir 21,5 μL a cada muestra (volumen total de reacción: 45,8 μL) e incubar muestras durante 15 min a 20 °C.
17. Limpieza del ADN
- Purificar el ADN utilizando cuentas magnéticas(Tabla de Materiales). ADN elute con 21 μL de ddHautoclavado 2O o ddH2O libre de nucleasa.
- Almacene muestras a -20 °C hasta que estén listas para realizar la purificación de PCR (LM-PCR) y PCR mediada por ligaduras.
18. PCR mediado por ligamentos
NOTA: Las secuencias de imprimación LM-PCR se describen en la Tabla 1.
- Después de la limpieza del ADN, haga la mezcla LM-PCR(Tabla 10 y Tabla de Materiales)sobre hielo.
- Añadir 29 μL de mezcla LM-PCR a cada muestra (volumen total de reacción: 50 μL) y ejecutar muestras utilizando el programa para LM-PCR (Tabla 10).
- Proceda inmediatamente a la purificación en gel del ADN amplificado de PCR, seguido de la purificación del ADN para la secuenciación de alto rendimiento.
19. Adn purificación del ADN amplificado LM-PCR
- Ejecute las muestras de ADN amplificadas LM-PCR, junto con una escalera de ADN, en un gel de agarose del 1,5% a 120-180 V y bandas de 200-400 bp.
- Purificar el ADN del gel excado utilizando un kit de extracción de gel(Tabla de Materiales).
- Después de la purificación del ADN, compruebe la concentración(Tabla de Materiales)de cada muestra de la biblioteca ChIP-exo. Envíe ejemplos para secuenciación de alto rendimiento para secuenciación de lectura única.
NOTA: La longitud de lectura preferida para la secuenciación de una sola lectura es de al menos 35 bp, lo que es suficiente para alinear de forma única las lecturas de secuenciación con el genoma de referencia en ratones o células humanas. Para la mayoría de los factores de transcripción en ratones o células humanas, 10-20 millones de lecturas por muestra chip-exo son suficientes para identificar sus ubicaciones de unión genómica. Se requieren al menos 30 millones de lecturas por muestra para mapear regiones genómicas enriquecidas con marcas de histona en células de mamíferos.
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Representative Results
La Figura 2A ilustra los resultados de sonicación después de la lisis celular y la sonicación, con varios ciclos, de células de neuronas motoras diferenciadas de las células ES del ratón. El número óptimo de ciclos de sonicación (por ejemplo, 12 ciclos en la Figura 2A)generó una fuerte intensidad de ADN en fragmentos de ADN de 100-400 bp. Las bibliotecas ChIP-exo de alta calidad se basan en el tamaño y la cantidad de ADN de cromatina fragmentada. Por lo tanto, se recomienda la optimización de la sonicación para cada tipo de celda y lote de celdas antes de iniciar ChIP-exo.
La Figura 2B muestra los productos pcr mediados por ligadura (LM-PCR) de las muestras de ADN ChIP-exo amplificadas por ciclos de PCR de 18-21. LM-PCR amplifica fragmentos de ADN ChIP-exo ligados con adaptadores de ADN para secuenciación de próxima generación. La imprimación PCR forma parte de las secuencias del adaptador de ADN. El tamaño de los fragmentos de ADN sonicados es de alrededor de 100-400 bp (Figura 2A). Después de la digestión lambda exonuclease, el tamaño de los fragmentos de ADN se convertiría en el tamaño medio del material inicial (50-200 bp). Aproximadamente 125 bp de adaptadores de ADN fueron ligados a los fragmentos de ADN ChIP-exo por lo tanto, el tamaño esperado de los productos LM-PCR es de 175-325 bp. El número mínimo de ciclos de PCR, aunque sigue siendo suficiente para amplificar la biblioteca ChIP-exo, se realiza para evitar la sobreamplificación del ADN ChIP-exo.
Aquí, ChIP-exo para Isl1 se realizó en las neuronas motoras derivadas de células ES del ratón. Isl1 es un factor de transcripción de programación de neuronas motoras, que se expresa específicamente en las neuronas motoras postmitóticas. Los resultados de Isl1 ChIP-exo muestran cantidades significativas de ADN ChIP-exo amplificado LM-PCR de 200-400 bp (Figura 2B). La banda alrededor de 100 bp indica artefactos PCR de adaptadores y imprimaciones PCR. Ejecutar un control sin anticuerpos junto con una muestra experimental también es importante para asegurar que el ADN de fondo no específico fue digerido por el tratamiento lambda exonuclease. Como ejemplo, identificamos ubicaciones enlazadas a Isl1 en neuronas motoras derivadas de células ES del ratón utilizando ChIP-exo y ChIP-seq (Figura 3). La señal ChIP-exo estaba muy enfocada en los sitios de enlace Isl1, detectando múltiples patrones de enlace de factores de transcripción Isl1 agrupados. La señal ChIP-seq mostraba señales más amplias, lo que indica que chip-exo de Isl1 tiene una resolución cartográfica más alta que chIP-seq de Isl1.
Figura 1: Esquema del protocolo ChIP-exo. Después de ChIP (pasos 1-7), las reacciones de reparación final y dA-tailing hacen que el ADN chip sea contundente añadiendo un grupo de fosfato al extremo de 5' del ADN y añadiendo dATP al extremo 3' del ADN (paso 8). Los extremos sonicados del ADN chip, en las cuentas están ligados con el adaptador de índice (paso 9). Después de la reacción de relleno, el ADN del adaptador con el voladizo de 5' se vuelve contundente (paso 10). Lambda exonuclease digiere el ADN sonicado de 5' a 3' hasta los puntos de enlace de proteína (TF)-ADN (paso 11). Después de la elución, el enlace cruzado inverso y la extracción de ADN (pasos 12 y 13), el ADN desnaturalizado de una sola hebra se hace doblemente varado por la extensión de imprimación pcr del índice (paso 14), seguido de dA-tailing (paso 15). A continuación, el adaptador universal se liga al extremo tratado con exonucleasa (paso 16). La biblioteca resultante se limpia, se amplifica pcr y se somete a secuenciación de próxima generación (pasos 17-19). Mapear los extremos de 5' de las etiquetas de secuenciación resultantes al genoma de referencia delimita la barrera de la exonucleasa y, por lo tanto, el sitio preciso de reticulación proteína-ADN.
Figura 2: Sonicación y amplificación LM-PCR de una biblioteca ChIP-exo. (A) 1,5% gel de agarose del ADN sonicado electroforesado. Se realizaron 12, 18 y 24 ciclos de sonicación para encontrar ciclos óptimos de sonicación para 2 x 107 células de neuronas motoras derivadas de células ES del ratón. Después de la sonicación, la muestra de ADN fue reticulada inversamente, y extraída usando PCIA y precipitación de etanol. Cada muestra contenía 4 x 105 equivalentes de células, que es el 2% de las células sonicadas. 12 ciclos de sonicación produjeron un mayor rendimiento de ADN sonicado con el tamaño deseado (100-500 bp). (B) Gel de 1,5% agarose de bibliotecas electroforesadas ChIP-exo después de 18-21 ciclos de LM-PCR sin control de anticuerpos (No Ab) e Isl1 en neuronas motoras derivadas de células ES del ratón. Cada muestra contenía 10 x 106 equivalentes celulares de las neuronas motoras del ratón. El resultado no anticuerpo ChIP-exo (carril 2) demuestra que el ADN no específico y contaminante es eliminado por la exonuclease lambda. Las bibliotecas ChIP-exo para Isl1 (carril 3) muestran bibliotecas de ADN amplificadas alrededor de 200-400 bp, lo que indica que las bibliotecas ChIP-exo fueron amplificadas con éxito por PCR mediada por ligaduras adaptadoras. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Comparación de ChIP-exo a ChIP-seq para Isl1 en loci específico. Las gráficas llenas de azul y rojo muestran la distribución de etiquetas de secuenciación para las ubicaciones vinculadas a ChIP-seq y ChIP-exo Isl1, respectivamente, proximal a Slit3 y Fgfr1 en neuronas motoras espinales nacientes diferenciadas de las células ES del ratón.
Tabla 1: Oligonucleótidos utilizados en este protocolo.
| Nombre oligo | Longitud (nt) | Secuencia | Nota | |||||
| Adaptador de índice-reenviado* | 66 | 5'/Phos/CAAGCAGACGGCATACGAGATXXXXXXGGGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT 3' | 5' Fosfato, índice (XXXXXXXX), 3' T-overhang | |||||
| Adaptador de índice inverso* | 33 | 5'GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCAC 3' | ||||||
| Adaptador de ligadura delantero* | 58 | 5'AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTCTCTCTACACGACGCTCTTCCGATCT 3' | ||||||
| Adaptador de ligadura inverso* | 34 | 5'GATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGGTAG 3' | ||||||
| Imprimación de PCR de índice* | 22 | 5'CAAGCAGAAGACGGCATACGAG 3' | ||||||
| Imprimación universal del PCR* | 19 | 5'Ocasión de AATGATACGGCGACCACCG 3' | ||||||
| *Los adaptadores de secuenciación anteriores y las imprimaciones PCR están diseñados para plataformas de secuenciación Illumina HiSeq y NextSeq. | ||||||||
Tabla 2: Recetas para búferes de lisis 1-3 y búfer de bloqueo. Conservar en tubos de 50 ml a 4 °C. Añadir 50 μL de 1000x CPI (inhibidor completo de la proteasa) a todos los buffers justo antes de su uso.
| Búfer de lisis 1 | ||
| Reactivo | Volumen (mL) | [Final] |
| 1 M HEPES (pH 7.3) | 2.5 | 50 mM |
| 5 M NaCl | 1.4 | 140 mM |
| 0,5 M EDTA (pH 8.0) | 0.1 | 1 mM |
| 50% Glicerol | 10 | 10% |
| 10% eoxilato de octilfenol | 2.5 | 0.50% |
| 10% 2-[4-(2,4,4-trimetilpentan-2-yl)fenoxi]etanol | 1.25 | 0.25% |
| Autoclaved ddH2O | Llenar a 50 | |
| Búfer de lisis 2 | ||
| Reactivo | Volumen (mL) | [Final] |
| 0,5 M Tris-HCl (pH 8.0) | 1 | 10 mM |
| 5 M NaCl | 2 | 200 mM |
| 0,5 M EDTA (pH 8.0) | 0.1 | 1 mM |
| Autoclaved ddH2O | Llenar a 50 | |
| Búfer de lisis 3 | ||
| Reactivo | Volumen (mL) | [Final] |
| 1 M Tris-HCl (pH 8.0) | 0.5 | 10 mM |
| 5 M NaCl | 1 | 100 mM |
| 0,5 M EDTA (pH 8.0) | 0.1 | 1 mM |
| 10% Ácido desoxicólico | 0.5 | 0.10% |
| 30% N-Lauroylsarcosina solución de sal sódica | 0.83 | 0.50% |
| Autoclaved ddH2O | Llenar a 50 | |
| Solución de bloqueo | ||
| Reactivo | Cantidad | [Final] |
| Albúmina sérica bovina (BSA) | 250 mg | 0.50% |
| Inhibidor completo de la proteasa (IPC, 1000x) | 50 μL | 1x |
| Solución salina tamponada de fosfato (PBS) | Llenar a 50 mL | |
Tabla 3: Recetas para lavados ChIP: Búfer de lavado de alta sal, tampón de lavado LiCl y búfer Tris-HCl de 10 mM (pH 7.4). Conservar en tubos de 50 ml a 4 °C. Añadir 50 μL de 1000x stock CPI a todos los buffers justo antes de su uso.
| Alto tampón de lavado de sal | ||
| Reactivo | Volumen (mL) | [Final] |
| 1 M HEPES (pH 7.3) | 2.5 | 50 mM |
| 5 M NaCl | 5 | 500 mM |
| 0,5 M EDTA (pH 8.0) | 0.1 | 1 mM |
| 10% 2-[4-(2,4,4-trimetilpentan-2-yl)fenoxi]etanol | 5 | 1% |
| 5% Ácido desoxicólico | 1 | 0.10% |
| 5% SDS | 1 | 0.10% |
| Autoclaved ddH2O | Llenar a 50 | |
| Tampone de lavado LiCl | ||
| Reactivo | Volumen (mL) | [Final] |
| 0,5 M Tris-HCl (pH 8.0) | 2 | 20 mM |
| 0,5 M EDTA (pH 8.0) | 0.1 | 1 mM |
| 1 M LiCl | 12.5 | 250 mM |
| 10% eoxilato de octilfenol | 2.5 | 0.50% |
| 5% Ácido desoxicólico | 5 | 0.50% |
| Autoclaved ddH2O | Llenar a 50 | |
| Búfer Tris-HCl de 10 mM | ||
| Reactivo | Volumen (mL) | [Final] |
| 1 M Tris-HCl (pH 7.4) | 0.5 | 10 mM |
| Autoclaved ddH2O | Llenar a 50 | |
Tabla 4: Mezcla maestra de reacción de relleno.
| Reactivo | 1x (μL) | [Final] |
| 20 mg/ml de BSA | 0.6 | 0,2 mg/ml |
| 10x phi29 Tampón de polimerasa de ADN | 6 | 1x |
| 3 mM dNTPs | 2.5 | 150 μM |
| 10 U/μL phi29 POLIMERASA DE ADN | 2 | 10 U |
| Volumen de mezcla de reacción | 11.1 |
Tabla 5: Receta para el búfer de elución ChIP. Conservar en tubos de 50 ml en RT.
| Reactivo | Volumen (mL) | [Final] |
| 0,5 M Tris-HCl (pH 8.0) | 5 | 50 mM |
| 0,5 M EDTA (pH 8.0) | 1 | 10 mM |
| 10% SDS | 5 | 1% |
| Autoclaved ddH2O | hasta 50 ml |
Tabla 6: Mezcla y programa maestro de reacción de desnaturalización y recocido primer.
| Mezcla de desnaturalización y recocido de imprimación | ||
| Reactivo | 1x (μL) | [Final] |
| 20 mg/ml de BSA | 0.2 | 0,2 mg/ml |
| 3 mM dNTPs | 0.5 | 75 μM |
| 10 μM Índice IMPRIMACIÓN PCR | 0.5 | 0,25 μM |
| Volumen de mezcla de reacción | 1.2 | |
| Programa de desnaturalización y recocido de imprimación | ||
| Temperatura (°C) | Hora | |
| 95 | 5 min | |
| 65 | 3 min | |
| 60 | 3 min | |
| 57 | 3 min | |
| 54 | 3 min | |
| 51 | 3 min | |
| 30 | Siempre | |
Tabla 7: Primera extensión reacción master mix y programa.
| Mezcla de extensión de primer | ||
| Reactivo | 1x (μL) | [Final] |
| 10x phi29 Tampón de polimerasa de ADN | 2 | 1x |
| 10 U/μL phi29 POLIMERASA DE ADN | 1 | 75 μM |
| Volumen de mezcla de reacción | 3 | |
| Programa de extensión de primer | ||
| Temperatura (°C) | Hora | |
| 30 | 20 min | |
| 65 | 10 min | |
| 4 | Siempre | |
Tabla 8: dA-Tailing mezcla maestra de reacción y programa.
| dA-Mezcla de coladores | ||
| Reactivo | 1x (μL) | [Final] |
| 3 mM dATP | 0.7 | 120 μM |
| Tampone de fragmentos klenow | 2.4 | 1x |
| 5 fragmentos de Klenow U/μL | 1 | 5 U |
| Volumen de mezcla de reacción | 4.1 | |
| programa dA-Tailing | ||
| Temperatura (°C) | Hora | |
| 37 | 30 min | |
| 75 | 20 min | |
| 4 | Siempre | |
Tabla 9: Mezcla maestra de reacción de ligadura del adaptador universal.
| Reactivo | 1x (μL) | [Final] |
| Agua autoclavada | 5 | |
| Adaptador universal de 15 μM* | 1 | 320 nM |
| Potenciador de ligadura | 0.5 | 1x |
| Mezcla magistral de ligasa | 15 | 1x |
| Volumen de mezcla de reacción | 21.5 | |
| *La secuencia de ADN del adaptador universal se describe en la Tabla 1. | ||
Tabla 10: Mezcla y programa maestro de PCR mediada por ligamentos.
| Mezcla LM-PCR | ||
| Reactivo | 1x (μL) | [Final] |
| 10 μM Índice IMPRIMACIÓN PCR* | 2 | 0,2 μM |
| 10 μM Imprimación pcr universal* | 2 | 0,2 μM |
| 2x Taq DNA polymerasa PCR master mix | 25 | 1x |
| Volumen de mezcla de reacción | 29 | |
| *Las secuencias de imprimación PCR se describen en la Tabla 1. | ||
| Programa LM-PCR | ||
| Temperatura (°C) | Hora | Ciclos |
| 98 | 30 s | 1 |
| 98 | 10 s | 15-25 |
| 65 | 75 s | |
| 65 | 5 min | 1 |
| 4 | Mantener | |
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Discussion
En este protocolo, chip seguido de digestión exonuclease se utiliza para obtener bibliotecas de ADN para la identificación de interacciones proteína-ADN en células de mamíferos a resolución cartográfica ultra alta. Muchas variables contribuyen a la calidad del experimento ChIP-exo. Los parámetros experimentales críticos incluyen la calidad de los anticuerpos, la optimización de la sonicación y el número de ciclos LM-PCR. Estos parámetros experimentales críticos también son lo que puede limitar los experimentos chip-exo y se discutirán a continuación.
En cualquier protocolo ChIP, la calidad de los anticuerpos es una de las consideraciones más importantes. Se recomienda el uso de anticuerpos de grado ChIP para ChIP-exo. La calidad de los anticuerpos se puede comprobar antes de llevar a cabo el protocolo ChIP-exo. ChIP-seq o ChIP-qPCR se pueden utilizar para validar anticuerpos de grado ChIP confirmando ubicaciones específicas de unión al ADN de la proteína de interés. Posteriormente, optimizar la concentración de anticuerpos añadidos a las cuentas es ideal para garantizar que los complejos proteína-ADN estén inmunoprecipitados22,23.
La sonicación de la cromatina es otro paso crítico en el protocolo ChIP-exo. La sonicación es fundamental para la cizallamiento no específica de la cromatina, necesaria para una inmunoprecipitación óptima a la proteína de interés24. El tamaño y la cantidad de ADN sonicado dependen del número de ciclos de sonicación. Una alta concentración de ADN fragmentado es importante para asegurar que se inmunoprecipita suficiente ADN a la proteína de interés para que se cree una biblioteca de ADN ChIP-exo. Obtener ADN fragmentado de 100-500 bp es ideal porque la resolución de ChIP-exo es mejor si los fragmentos de cromatina sonicadas tienen tamaños iniciales más pequeños. Por lo tanto, la sonicación óptima de cromatina debe determinarse para cada tipo y lote de células variando el número de ciclos de sonicación y los búferes de sonicación.
El parámetro crítico final es obtener la amplificación del ADN de la biblioteca ChIP-exo con el número mínimo de ciclos LM-PCR para evitar la amplificación excesiva de artefactos PCR. Para determinar el número mínimo de ciclos de PCR para amplificar el ADN ChIP-exo, una pequeña porción de ADN ChIP-exo se puede utilizar para ejecutar múltiples ciclos de PCR (por ejemplo, 10, 15 y 20 ciclos) y comparar los productos de PCR.
ChIP-exo tiene muchos más pasos que un ChIP-seq tradicional y, como resultado, cada paso debe realizarse con cuidado y precisión para que el protocolo ChIP-exo funcione. Es importante destacar que el volumen correcto de cada reactivo en las reacciones enzimáticas debe añadirse a cada mezcla maestra de reacción21. Por lo tanto, se recomienda crear una hoja de cálculo para calcular el volumen de cada reactivo necesario para cada mezcla maestra, imprimiendo las tablas y comprobando cada reactivo después de la adición a las mezclas maestras. También es importante una escisión cuidadosa del ADN amplificado; fragmentos por debajo de 200 bp a menudo contienen atenuadores adaptadores, que necesitan ser eliminados antes de la secuenciación de próxima generación.
En particular, la mayoría de los parámetros críticos y limitaciones de ChIP-exo son idénticos a los de ChIP-seq. Sin embargo, a diferencia de ChIP-seq, ChIP-exo ofrece mapeo del genoma de alta resolución con bajo fondo. Por lo tanto, ChIP-exo es el método ideal para identificar interacciones precisas proteína-ADN en una variedad de sistemas y organismos, ayudando a revelar los papeles significativos de las proteínas que unen el ADN en la célula. El método ChIP-exo descrito anteriormente se puede utilizar para examinar factores de transcripción, marcas de modificación de histonas y proteínas reguladoras de cromatina en células vivas a una resolución cartográfica más alta que chIP-seq25,26,27. Además, ChIP-exo puede detectar las ubicaciones de unión individuales de proteínas que unen el ADN dentro de un grupo, mientras que ChIP-seq no puede debido a su resolución de mapeo. Es importante destacar que ChIP-exo muestra una mayor relación señal-ruido en comparación con ChIP-seq. Estas ventajas de ChIP-exo nos permiten identificar un conjunto completo de ubicaciones enlazadas a través del genoma. Este protocolo proporcionará una base para los investigadores interesados en examinar los lugares de unión al ADN de varias proteínas en todo el genoma a una resolución cercana a la pareja base.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Agradecemos al miembro del laboratorio Rhee por compartir datos inéditos y discusiones valiosas. Este trabajo fue apoyado por la subvención RGPIN-2018-06404 (H.R.) del Consejo de Investigación de Ciencias Naturales e Ingeniería de Canadá (NSERC).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose, UltraPure | Invitrogen | 16500 | Checking Sonication (Section 4.3.6) and Gel Purification of LM-PCR Amplified DNA (Section 19.1) |
| Albumin, Bovine Serum (BSA), Protease Free, Heat Shock Isolation, Min. 98% | BioShop | ALB003 | Blocking Solution |
| Antibody against Isl1 | DSHB | 39.3F7 | Antibody incuation with beads (Section 5.6) |
| Bioruptor Pico | Diagenode | B01060010 | Sonicating Chromatin (Section 3.3) |
| Bovine serum albumin (BSA), Molecular Biology Grade | New England BioLabs | B9000S | Fill-in Reaction on Beads (Section 10.2) and Denaturing, Primer Annealing and Primer Extension (Section 14.2) |
| Centrifuge 5424 R | Eppendorf | 5404000138 | Sonicating Chromatin (Section 3.5), Checking Sonication (Section 4.3.1, 4.3.3 and 4.3.4) |
| Centrifuge 5804 R | Eppendorf | 22623508 | Harvest, cross-linking and freezing cells (Section 1.3), Cell lysis (Section 2.2 and 2.3), Sonicating Chromatin (Section 3.1) |
| cOmplete, Mini, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 4693159001 | Added to all buffers, except Proteinase K buffer and ChIP Elution buffer |
| dATP Solution | New England BioLabs | N0440S | dA-Tailing Reaction (Section 15.1) |
| Deoxycholic Acid Sodium Salt | fisher scientific | BP349 | Lysis Buffer 3, High Salt Wash Buffer and LiCl Wash Buffer |
| dNTP Mix, Molecular Biology Grade | Thermo Scientific | R0192 | Fill-in Reaction on Beads (Section 10.2) and Denaturing, Primer Annealing and Primer Extension (Section 14.2) |
| DreamTaq Green PCR Master Mix, 2x | Thermo Scientific | K1081 | Ligation-Mediated PCR (Section 18.1) |
| EDTA, 0.5 M, Sterile Solution, pH 8.0 | BioShop | EDT111 | Lysis Buffer 1-3, Checking Sonication (Section 4.1), High Salt Wash Buffer, LiCl Wash Buffer and ChIP Elution Buffer |
| Ethyl Alcohol Anhydrous, 100% | Commercial alcohols | P006EAAN | Checking Sonication (Section 4.3.3) |
| Formaldehyde, 36.5-38%, contains 10-15% methanol | Sigma | F8775 | Harvest, cross-linking and freezing cells (Section 1.1) |
| Glycerol, Reagent Grade, min 99.5% | BioShop | GLY002 | Lysis Buffer 1 |
| Glycine, Biotechnology Grade, min. 99% | BioShop | GLN001 | Harvest, cross-linking and freezing cells (Section 1.2) |
| Glycogen, RNA Grade | Thermo Scientific | R0551 | Checking Sonication (Section 4.3.3) |
| HEPES, 1 M Sterile-filtered Solution, pH 7.3 | BioShop | HEP003 | Lysis Buffer 1, High Salt Wash Buffer |
| Klenow Fragment (3->5 exo-) | New England BioLabs | M0212S | dA-Tailing Reaction (Section 15.1) |
| Lambda exonuclease | New England BioLabs | M0262S | Lambda Exonuclease Digestion on Beads (Section 11.2) |
| Ligase Enhancer | New England BioLabs | E7645S | NEBNext Ultra II DNA Library Kit. Index Adapter Ligation on Beads (Section 9.1) and Universal Adapter Ligation (Section 16.1) |
| Ligase Master Mix | New England BioLabs | E7645S | NEBNext Ultra II DNA Library Kit. Index Adapter Ligation on Beads (Section 9.1) and Universal Adapter Ligation (Section 16.1) |
| Lithium Chloride (LiCl), Reagent grade | Bioshop | LIT704 | LiCl Wash Buffer |
| Magnetic beads for ChIP (Dynabeads Protein G) | Dynabeads Protein G (magnetic beads for ChIP) | Dynabeads Protein G (magnetic beads for ChIP) | Antibody incubation with beads (Section 5) |
| Magnetic beads for DNA purification (AMPure XP Beads) | Beckman Coulter | A63880 | DNA Extraction (Section 13.3) and DNA Clean-up (Section 17.1) |
| Magnetic rack (DynaMag-2 Magnet) | Invitrogen | 12321D | Used in many steps in Sections: 5 - 11, 13 |
| MinElute Gel Extraction Kit | Qiagen | 28604 | Gel Purification of PCR Amplified DNA (Section 19.2) |
| N-Lauroylsarcosine sodium salt solution, 30% aqueous solution, ≥97.0% (HPLC) | Sigma | 61747 | Lysis Buffer 3 |
| Octylphenol Ethoxylate (IGEPAL CA630) | BioShop | NON999 | Lysis Buffer 1 and LiCl Wash Buffer |
| Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol, Biotechnology Grade (25:24:1) | BioShop | PHE512 | Checking Sonication (Section 4.3.1) |
| phi29 DNA Polymerase | New England BioLabs | M0269L | Fill-in Reaction on Beads (Section 10.2) and Denaturing, Primer Annealing and Primer Extension (Section 14.3 and 14.4) |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS), 1x | Corning | 21040CV | Harvest, cross-linking and freezing cells (Section 1.3) and Sonicating Chromatin (Section 3.1), Antibody incuation with beads (Section 5.1) |
| PowerPac Basic Power Supply | BioRad | 1645050 | Checking Sonication (Section 4.3.6) and Gel Purification of LM-PCR Amplified DNA (Section 19.1) |
| ProFlex PCR System | Applied Biosystems | ProFlex PCR System | Used in Sections: 14.2, 14.4, 15.2, 16.2 and 18.2 |
| Protein LoBind Tube, 2.0 mL | Eppendorf | 22431102 | Antibody Incubation with Beads (Section 5.2) and Chromatin Immunoprecipitation (Section 6.3) |
| Proteinase K Solution, RNA Grade | Invitrogen | 25530049 | Checking Sonication (Section 4.2) and Elution and Reverse Crosslinking (Section 12.3) |
| Qubit 4.0 Fluorometer | Invitrogen | Q33226 | Gel Purification of PCR Amplified DNA (Section 19.3) |
| Quibit dsDNA BR assay kit | Invitrogen | Q32853 | Gel Purification of PCR Amplified DNA (Section 19.3) |
| Rnase A, Dnase and Protease-free | Thermo Scientific | EN0531 | Checking Sonication (Section 4.3.2) and DNA Extraction (Section 13.2) |
| Sodium chloride (NaCl), BioReagent | Sigma | S5886 | Lysis Buffer 1-3, High Salt Wash Buffer |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS), Electrophoresis Grade | BioShop | SDS001 | Checking Sonication (Section 4.1), High Salt Wash Buffer and ChIP Elution Buffer |
| Sonication beads and 15 mL Bioruptor Tubes | Diagenode | C01020031 | Sonicating Chromatin (Section 3.1 and 3.2) |
| ThermoMixer F1.5 | Eppendorf | 5384000020 | Section 4.2, 4.3.2, 4.3.5, 8.2, 9.2, 10.3, 11.2, 12.2, 12.3, 13.2 and 16.2 |
| Trizma hydrochloride solution (Tris-HCl), BioPerformance Certified, 1 M, pH 7.4 | Sigma | T2194 | 10 mM Tris-HCl Buffer |
| Trizma hydrochloride solution (Tris-HCl), BioPerformance Certified, 1 M, pH 8.0 | Sigma | T2694 | Lysis Buffer 2, Lysis Buffer 3, Checking Sonication (Section 4.1), LiCl Wash Buffer and ChIP Elution Buffer |
| Ultra II End Repair/dA-Tailing Module (24 rxn -> 120 rxn) | New England BioLabs | E7546S | End Prep Reaction mix and End Prep Enzyme mix. End-repair and dA-Tailing Reaction on Beads (Section 8.2) |
| VWR Mini Tube Rocker, Variable Speed | VWR | 10159-752 | Used in many steps in sections: 1, 2, 5, 6 and 7 |
| 2-[4-(2,4,4-trimethylpentan-2-yl)phenoxy]ethanol, Triton X-100, Reagent Grade | BioShop | TRX506 | Lysis Buffer 1, Sonicating Chromatin (Section 3.4) and High Salt Wash Buffer |
References
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