Summary
Genom genelinde protein bağlayıcı yerlerin kesin olarak belirlenmesi gen düzenlemesini anlamak için önemlidir. Burada kromatin-immünprecipitated DNA'yı exonuclease sindirimi (ChIP-exo) ve ardından yüksek verimli dizilim ile tedavi eden bir genomik haritalama yöntemini açıklıyoruz. Bu yöntem, memeli nöronlarında yakın baz çifti haritalama çözünürlüğü ve yüksek sinyal-gürültü oranı ile protein-DNA etkileşimlerini tespit eder.
Abstract
Genom üzerindeki spesifik protein-DNA etkileşimlerinin tanımlanması gen düzenlemesini anlamak için önemlidir. Kromatin immünorektasyon, yüksek verimli dizileme (ChIP-seq) ile birleştiğinde, DNA bağlayıcı proteinlerin genom çapındaki bağlayıcı konumlarını tanımlamak için yaygın olarak kullanılmaktadır. Bununla birlikte, ChIP-seq yöntemi, sonicated DNA parçalarının ve spesifik olmayan arka plan DNA'larının uzunluğundaki heterojenliği ile sınırlıdır ve bu da düşük haritalama çözünürlüğü ve DNA bağlayıcı bölgelerde belirsizlik ile sonuçlanır. Bu sınırlamaların üstesinden gelmek için, ChIP'nin exonuclease sindirimi (ChIP-exo) ile kombinasyonu, heterojen olarak boyutlandırılmış immün önyüklenmiş DNA'yı protein-DNA çapraz bağlantı bölgesine kırpmak için 5 ila 3' exonuclease sindirimini kullanır. Exonuclease tedavisi spesifik olmayan arka plan DNA'larını da ortadan kaldırır. Kütüphane tarafından hazırlanan ve exonuclease sindirilen DNA, yüksek verimli sıralama için gönderilebilir. ChIP-exo yöntemi, daha fazla algılama hassasiyeti ve azaltılmış arka plan sinyali ile neredeyse taban çifti eşleme çözünürlüğü sağlar. Memeli hücreleri ve yeni nesil dizileme için optimize edilmiş bir ChIP-exo protokolü aşağıda açıklanmıştır.
Introduction
Protein-DNA etkileşimlerinin yerleri gen düzenleme mekanizmaları hakkında fikir sağlar. Kromatin immünorepitasyonu, yüksek verimli dizileme (ChIP-seq) ile birleştiğinde, canlı hücrelerde genom çapındaki protein-DNA etkileşimlerini incelemek için on yıldır1,2. Bununla birlikte, ChIP-seq yöntemi, düşük haritalama çözünürlüğüne, yanlış pozitiflere, cevapsız çağrılara ve spesifik olmayan arka plan sinyaline yol açan DNA parçalanması ve ilişkisiz DNA kirlenmesinde heterojenlik ile sınırlıdır. ChIP'nin exonuclease sindirimi (ChIP-exo) ile kombinasyonu, ChIP DNA'sını protein-DNA çapraz bağlantı noktalarına kırparak, taban çifti çözünürlüğü ve düşük arka plan sinyali 3 ,4,5sağlayarak ChIP-seq yönteminde gelişir. ChIP-exo tarafından sağlanan büyük ölçüde geliştirilmiş haritalama çözünürlüğü ve düşük arka plan, genom genelinde doğru ve kapsamlı protein-DNA bağlama konumlarının belirlenmesini sağlar. ChIP-exo, fonksiyonel olarak farklı DNA bağlayıcı motifleri, transkripsiyon faktörleri (TF) arasındaki işbirliği etkileşimlerini ve belirli bir genomik bağlama konumundaki çoklu protein-DNA çapraz bağlantı alanlarını ortaya çıkarabilir, diğer genomik haritalamayöntemleriyletespit edilemez 3,4,6,7.
ChIP-exo başlangıçta tomurcuklanan mayada TF'lerin diziye özgü DNA bağlamasını incelemek, transkripsiyon öncesi başlatma kompleksinin kesin organizasyonunu ve genom4,8,9boyunca bireysel histonların nükleozomal yapısını incelemek için kullanılmıştır. 2011 yılında piyasaya sürülmesinden bu yana4, ChIP-exo, bakteriler, fareler ve insan hücreleri 7 , 10 , 11 ,12,13,14,15,16,17dahil olmak üzere diğer birçok organizmada başarıyla kullanılmıştır. 2016 yılında Rhee ve ark.14, başka bir programlama TF Isl1 ile heterodimer kompleksi oluşturan TF Lhx3 programlamasının küçültülmesi sonrasında nöronal gen ekspresyonunun nasıl sürdürüldüğünü anlamak için ilk kez memeli nöronlarında ChIP-exo kullandı. Bu çalışma, Lhx3'ün yokluğunda, Isl1'in nöronal efektör genlerin gen ekspresyonunun sürdürülmesi için Onecut1 TF'ye bağlı yeni nöronal arttırıcılara işe alındığını göstermiştir. Bu çalışmada ChIP-exo, birden fazla TF'nin hücre tiplerini ve hücre aşamasına özgü DNA düzenleyici elementleri neredeyse nükleotid haritalama çözünürlüğünde kombinatoryal bir şekilde nasıl dinamik olarak tanıdığını ortaya koydu. Diğer çalışmalar ayrıca diğer memeli hücre hatlarındaki proteinler ve DNA arasındaki etkileşimi anlamak için ChIP-exo yöntemini kullandı. Han ve ark.7, ChIP-exo kullanarak fare eritroid hücrelerinde GATA1 ve TAL1 TF'lerin genom çapındaki organizasyonunu incelemek için ChIP-exo'yu kullandı. Bu çalışma, TAL1'in eritroid farklılaşması boyunca GATA1 ile protein-protein etkileşimleri yoluyla dolaylı olarak değil, doğrudan DNA'ya işe alındığı bulunmuştur. Son çalışmalar ayrıca, insan hücre hatlarındaki epigenomik ve transkripsiyonel mekanizmaları incelemek için CTCF, RNA Polymerase II ve histone izlerinin genom çapındaki bağlama konumlarının profilini çıkarmak için ChIP-exo'yu kullanmıştır18,19.
ChIP-exo protokolünün çeşitli sürümleri vardır3,5,20. Ancak, bu ChIP-exo protokollerini, yeni nesil sıralama kütüphanesi hazırlığına aşina olmayan araştırmalar için takip etmek zordur. ChIP-exo protokolünün mükemmel bir sürümü, takip edilmesi kolay talimatlar ve bir video21ile yayınlandı, ancak tamamlanması için önemli miktarda zaman gerektiren birçok enzymatic adım içeriyordu. Burada chip-exo protokolünün yeni bir sürümünü bildiriyoruz azaltılmış enzymatic adımlar ve kuluçka süreleri ve her enzymatic adım21için açıklamalar . Uç onarımı ve dA-tailing reaksiyonları, uç hazırlık enzimi kullanılarak tek bir adımda birleştirilir. Dizin ve evrensel bağdaştırıcı ligasyon adımları için kuluçka süreleri, ligasyon arttırıcı kullanılarak 2 h'den 15 dakikaya düşürülür. Önceki ChIP-exo protokolünde açıklanan dizin bağdaştırıcısı ligasyon adımından sonraki kinaz reaksiyonu kaldırılır. Bunun yerine, lambda exonuclease sindirim adımı için kullanılacak olan indeks adaptörünün 5' uçlarından birine(Tablo 1)oligo DNA sentezi sırasında bir fosfat grubu eklenir. Önceki ChIP-exo protokolü, tek iplikli DNA kirleticilerini ortadan kaldırmak için RecJf exonuclease sindirimi kullanırken, bu sindirim adımı chIP-exo kütüphanesinin kalitesi için kritik olmadığı için burada kaldırılır. Ek olarak, ChIP işleminden sonra ters çapraz bağlı DNA'yı arındırmak için fenol:kloroform:izoamil alkol (PCIA) ekstraksiyon yöntemi yerine manyetik boncuk temizleme yöntemi kullanılır. Bu, DNA ekstraksiyonunun kuluçka süresini azaltır. Daha da önemlisi, dizin bağdaştırıcısı ligasyonu sırasında oluşan bağdaştırıcı solukluklarının çoğunu kaldırır ve bu da ligasyon aracılı PCR'nin verimliliğini etkileyebilir.
Burada sunulan ChIP-exo protokolü, fare embriyonik sapı (ES) hücrelerinden farklılaştırılmış memeli nöronlarında kesin protein-DNA etkileşimlerinin tespiti için optimize edilmiştir. Kısaca, hasat edilen ve çapraz bağlı nöronal hücreler, kromatin sonikasyona maruz kalmasını sağlamak için yutulur, daha sonra uygun boyutta DNA parçaları elde edilecek şekilde sonicated (Şekil 1). Antikor kaplı boncuklar daha sonra parçalanmış, çözünür kromatinleri ilgi proteinine seçici olarak immün önseçimli hale getirmek için kullanılır. İmmün olarak kesinleşmemiş DNA hala boncuklardayken, son onarım, dizileme adaptörlerinin ligasyonu, dolgu reaksiyonu ve 5' ila 3' lambda exonuclease sindirim adımları gerçekleştirilir. Exonuclease sindirim adımı, ChIP-exo'ya ultra yüksek çözünürlüğünü ve yüksek sinyal-gürültü oranını veren şeydir. Lambda exonuclease, immün önyüklenmiş DNA'yı çapraz bağlama bölgesinden birkaç baz çifti (bp) keser, böylece kontamine DNA'nın bozulmasına neden olur. Exonuclease ile tedavi edilen ChIP DNA'sı antikor kaplı boncuklardan elde edilir, protein-DNA çapraz bağlantıları tersine çevrilir ve proteinler bozulur. DNA çıkarılır ve tek iplikli ChIP DNA'sına denatüre edilir, ardından çift iplikli DNA (dsDNA) yapmak için astar tavlama ve uzatma yapılır. Daha sonra, evrensel bir bağdaştırıcının exonuclease ile işlenmiş uçlara ligasyonu gerçekleştirilir. Elde edilen DNA saflaştırılır, daha sonra PCR yükseltilir, jel arındırılır ve yeni nesil sıralamaya tabi tutulur.
ChIP-exo protokolü ChIP-seq protokolünden daha uzundur, ancak teknik olarak çok zor değildir. Başarılı bir şekilde bağışıklık sistemi baskılanmış herhangi bir ChIP DNA'sı, birkaç ek enzymatik adımla ChIP-exo'ya tabi tutulabilir. ChIP-exo'nun ultra yüksek haritalama çözünürlüğü, azaltılmış arka plan sinyali ve genomik bağlama alanlarıyla ilgili yanlış pozitif ve negatiflerin azalması gibi önemli avantajları zaman maliyetinden daha ağır basmaktadır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
NOT: Tamponlar ve reaksiyon ana karışımları yapmak için otomatik kapatılmış damıtılmış ve deiyonize su (ddH2O) önerilir. Bölüm 1−4 hücre lizizini ve sonikasyonu, bölüm 5−7 kromatin immün özürlülüğü (ChIP) tanımlar, bölüm 8−11 boncuklar üzerindeki enzimatik reaksiyonları açıklar, bölüm 12 ve 13 ChIP elution ve DNA saflaştırmayı açıklar ve bölüm 14−19 kütüphane hazırlığını tanımlar.
1. Hücrelerin toplanması ve çapraz bağlantısı
- Fare ES hücrelerini postmitotik nöronlara ayırt ettikten sonra, hasat edilen hücrelere% 1'lik son konsantrasyona% 1 formaldehit ekleyin (v /v). Sallanan bir platformda (rocker, çalkalayıcı veya rotator) oda sıcaklığında (RT, 25 °C) 15 dakika boyunca kaya hücreleri.
NOT: Çapraz bağlanacak hedef proteine bağlı olarak, daha az formaldehit çapraz bağlama (örneğin,%0,5'lik son konsantrasyon) veya disüksinidil glutarat (DSG) ile çift çapraz bağlama kullanılabilir. - Çapraz bağlama reaksiyonunu durdurmak için 150 mM'lik son konsantrasyona 2,5 M glisine ekleyin. RT'de sallanan bir platformda 5 dakika boyunca kaya hücreleri.
- Çapraz bağlı hücreleri RT'de 15 mL konik tüplerde, 6 dakika boyunca 1.350 x g'da santrifüj edin. Çözeltiyi aspire edin, ardından hücreleri 5 mL 1x fosfat tamponlu salin (PBS) içinde yeniden biriktirin.
NOT: Çapraz bağlı hücre peletleri sıvı azot ile flaş dondurma işleminden sonra -80 °C'de saklanabilir.
2. Hücre lizisi
NOT: Bu protokoldeki aşağıdaki adımlar, fare ES hücrelerinden ayırt edilen yaklaşık 2 x10 7 nöronal hücre içindir. Açık hücreleri kırmak için çeşitli deterjanlar içeren lizis tamponları kullanılacaktır. Kullanımdan hemen önce 50 mL tampona 50 μL 1000x komple proteaz inhibitörü (CPI) stoğu ekleyin.
- Tablo 2'de açıklandığı gibi 1−3 lizis arabelleği hazırlayın.
- Çapraz bağlı hücre peletlerini buz üzerinde çözün, daha sonra hücre peletlerini 3 mL lizis tamponunda 15 mL konik tüplerde iyice yeniden sunun. Sallanan bir platformda 15 dakika boyunca 4 °C'de kaya. 4 °C'de 5 dakika boyunca 1.350 x g'da santrifüj ve aspirat süpernatant.
- Peletlenmiş hücreleri 3 mL lizis tamponu 2'de iyice yeniden biriktirin. Sallanan bir platformda 10 dakika boyunca 4 °C'de kaya. 4 °C'de 5 dakika boyunca 1.350 x g'da santrifüj ve aspirat süpernatant.
- Her pelete 1 mL lizis tamponu 3 ekleyin, sonra buzda tutun. Hemen sonication devam edin.
3. Sonicating kromatin
NOT: Çapraz bağlantı ters dönüşünü azaltmak için numuneleri bu sonication prosedürü sırasında buzda veya 4 °C'de tutun.
- Steril bir spatula kullanarak, 15 mL polistiren tüplerde 0,2 mL mezuniyet işaretine kadar sonikasyon boncukları (Malzeme Masası)ekleyin. Kuru noktalar görünmeyene kadar sonication boncuklarını 600 μL 1x PBS'de girdapla yıkayın. Tüpleri 5 sn için 30 x g'da santrifüj edin ve 1x PBS'yi aspire edin.
NOT: Polistiren tüplerde sonication polipropilen tüplerde sonication daha verimlidir. Daha az sayıda hücre (örneğin, <106 hücreleri) sonikated ise, sonikasyon boncukları eklemeden 1,5 mL polistiren tüpler kullanın. - Nükleer lizaz tampon 3'ün 1 mL'sinde (adım 2.4'ten itibaren) nükleer lizazları iyice yeniden ıslatır, ardından sonikasyon boncukları içeren 15 mL polistiren tüplere aktarın. Polistiren tüpleri kısaca girdap.
- Çapraz bağlı kromatin DNA'sını parçalamak için, optimize edilmiş sayıda döngü için 4 °C'de sonicate nükleer elyatlar, 30 W'ta güç genliği ve sonication döngüleri 30 s on/30 s kapalı olarak ayarlanır.
NOT: Her hücre türü ve parti için sonication optimizasyonu en iyi ChIP-exo verim ile sonuçlanacaktır. 2 x 107 fare nöronal hücresi için, belirtilen ayarlardaki 20−30 sonication döngüsü kromatin 100−500 bp aralığında parçalanacaktır. - Sonication tamamlandıktan sonra, her örnekten tüm supernatant (sonicated lysates), 1.5 mL tüplere aktarın. Her numuneye %1'lik son konsantrasyonda %10 2-[4-(2,4,4-trimetilpentan-2-yl)fenoksi]etanol) ekleyin. Pipetleme ile karıştırın.
- Hücre kalıntılarını peletmek için, 4 °C'de 10 dakika boyunca 13.500 x g'da santrifüj örnekleri. Her numuneden tüm sonicated lysates (supernatant) yeni 1.5 mL tüplere aktarın.
- Her örnekten 30 μL sonicated lysate alın (~3% sonicated lysate) ve sonication kontrol etmek için yeni 1.5 mL tüpler ekleyin. Kalan sonikatları antikor kaplı boncuklarla inkübasyona hazır olana kadar 4 °C'de saklayın.
4. Sonication kontrol
- 0,5 M Tris-HCl (pH 8,0) 2 mL, 0,5 M EDTA 2 mL, %10 sodyum dodecyl sülfat (SDS) ve 6 mL otoklavlı ddH 2 O ekleyerek 20 mL2xproteinaz K tamponu yapın. Bu arabelleğe TÜFE eklemeyin. RT'de 50 mL tüpte saklayın.
- Protein-DNA çapraz bağlantısını tersine çevirmek için, proteinleri çıkararak, her örnekten 30 μL sonicated kromatin alın (adım 3.6'dan itibaren), 166 μL otomatik kapatılmış ddH2O ekleyin, 200 μL 2x proteinaz K tamponu ve 4 μL 20 mg/mL proteinaz K. Örnekleri kısaca vorteks edin ve ardından 24 x g'da1−3 saat boyunca 65 °C'de kuluçkaya yatırın.
- NOT: Sonicated lysates bir gecede 65 °C'de ters çapraz bağlanabilir.
- PCIA (25:24:1) ve etanol çökeltim yöntemini aşağıdaki gibi kullanarak DNA çıkarın.
DİkKAT: PCIA toksiktir. Standart kişisel koruyucu ekipmana (KKD) sahip bir duman kaputunun altında kullanın.- 1,5 mL tüplerdeki her numuneye 400 μL PCIA ekleyin, girdabı maksimum hıza ayarlayın ve 20 s için girdap örnekleri ekleyin. RT'de 6 dakika boyunca 18.400 x g'da santrifüj. İki aşama gözlenecektir. Her numunenin üst sulu tabakasını (net faz) yeni 1,5 mL tüplere dikkatlice aktarın.
- 30 dakika boyunca 37 °C'de 1 μL 10 mg/mL RNase A. Kuluçka örnekleri ekleyin.
- Her numuneye 1 μL 20 mg/mL glikojen ekleyin, ardından 1 mL buz gibi % 100 etanol (-20 °C dondurucuda saklanır) ile çökelin. Kısa bir süre karıştırın, ardından örnekleri -80 °C dondurucuda 30 dakika ila 1 saat kuluçkaya yatırın. 4 °C'de 10 dakika boyunca 18.400 x g'da santrifüj örnekleri ve% 100 etanol dikkatlice dökün.
- Peletleri 500 μL buz gibi % 70 etanol ile yıkayın (-20 °C dondurucuda saklanır). 4 °C'de 5 dakika boyunca 18.400 x g'da santrifüj. % 70 etanol dikkatlice dökün.
- Kalan etanol buharlaşana kadar numuneleri 50 °C'de 1,5 mL tüplerde kuluçkaya yatırın. DNA peletlerini 15 μL otoklavlı ddH2O veya nükleaz içermeyen ddH 2 O'da yenidenkullanır.
- Çıkarılan DNA örneklerini, DNA merdiveni ile birlikte 120−180 V'da %1,5 agarose jel ile inceleyin ve sonike DNA'nın boyutunu kontrol edin.
5. Boncuklu antikor inkübasyonu
NOT: Bu protokoldeki aşağıdaki adımlar, fare ES hücrelerinden ayırt edilen yaklaşık 2 x10 7 nöronal hücre içindir. Manyetik boncukları ChIP-exo protokolü sırasında herhangi bir noktada dondurmayın ve çözmeyin, çünkü boncuklar numunenin kirlenmesine neden olabilir veya antikorun performansı tehlikeye atılabilir.
- Hücre lizisi ve sonikasyondan sonra, ChIP için Protein G manyetik boncukları (Malzeme Tablosu)hazırlayın, manyetik boncukları homojen olana kadar karıştırın, ardından 2 mL protein düşük bağlama tüplerine 25 μL manyetik boncuk ekleyin.
NOT: Kullanılan manyetik boncukların türü antikorların türüne bağlı olacaktır. - Boncukları 1 mL engelleme çözeltisi ile yıkayın (Tablo 2), iyice karıştırın, ardından 1 dakika boyunca manyetik bir rafa yerleştirin. Hala manyetik bir raftayken, temizlendikten sonra üst üste bindirin.
- Manyetik boncuklara 1 mL blokaj çözeltisi ekleyin. Sallanan bir platformda 4 °C'de 10 dakika boyunca kaya tüpleri. Kısa bir süre döndürün, ardından tüpleri manyetik bir rafa yerleştirin ve süpernatant çıkarın.
- 5.3. adımı iki kez daha yineleyin.
- Manyetik boncuklara 500 μL blokaj çözeltisi ekleyin. Isl1'e (0.04 μg/μL, Malzeme Tablası)karşı antikorları kısaca döndürün, ardından blokaj çözeltisinde manyetik boncukları içeren karşılık gelen 2 mL protein düşük bağlama tüplerine 4 μg antikor ekleyin.
- Antikor olmadan 5.5 adımını tekrarlayın (yani, ChIP için antikor kontrolü yoktur).
NOT: Eklenecek antikor miktarı, antikorun kalitesi ve CHIP için kullanılan hücre sayısı göz önünde bulundurularak ampirik olarak belirlenebilir. - Sallanan bir platformda 6−24 saat boyunca 4 °C'de kaya örnekleri.
6. Kromatin immünprecipitasyon (ChIP)
- Antikor kaplı boncukları 1 mL blokaj çözeltisi ile adım 5.8'den yıkayın. Numuneleri 5 dakika boyunca 4 °C'de sallanan bir platforma yerleştirin.
- 6.1. adımı iki kez daha yineleyin.
- Antikor kaplı boncukları 50 μL blokaj çözeltisinde yeniden depolar, ardından yeni 2 mL protein düşük bağlama tüplerine aktarın. Her ChIP örneği için, 2 mL protein düşük bağlama tüplerinde antikor kaplı boncuklara sonikatlı lysates (adım 3.6'dan ~ 1.0 mL) ekleyin.
- Her numuneyi 4 °C'de bir gecede sallanan bir platformda kuluçkaya yatırın.
7. ChIP yıkamaları
NOT: ChIP yıkamaları sırasında protein-DNA çapraz bağlarını korumak için numuneleri buzda veya 4 °C'de tutun.
- Tablo 3'teaçıklandığı gibi yüksek tuz yıkama tamponu, LiCl yıkama tamponu ve 10 mM Tris-HCl tamponu (pH 7.4) yapın. 4 °C'de 50 mL tüplerde saklayın. Kullanmadan hemen önce tüm tamponlara 50 μL 1000x CPI stok ekleyin.
- Kapaklardan sıvı toplamak için örnekleri 2 mL protein düşük bağlama tüplerinde kısaca döndürün, ardından 1 dakika boyunca manyetik bir rafa yerleştirin ve bir pipetle süpernatant dikkatlice çıkarın.
- ChIP yıkamalar için, her tüpe 1 mL lizis tamponu 3 (4 °C'de) ekleyin. 4 °C'de sallanan bir platformda 5 dakika karıştırın. Örnekleri kısaca döndürün, ardından 1 dakika boyunca manyetik bir rafa yerleştirin ve süpernatant'ı bir pipetle çıkarın.
- Her tüpe 1 mL soğuk yüksek tuz yıkama tamponu ekleyin. 4 °C'de sallanan bir platformda 5 dakika karıştırın. Örnekleri kısaca döndürün, ardından 1 dakika boyunca manyetik bir rafa yerleştirin ve süpernatant'ı bir pipetle çıkarın.
- Her tüpe 1 mL soğuk LiCl yıkama tamponu ekleyin. 4 °C'de sallanan bir platformda 5 dakika karıştırın. Örnekleri kısaca döndürün, ardından 1 dakika boyunca manyetik bir rafa yerleştirin ve süpernatant'ı bir pipetle çıkarın.
- Her tüpe 1 mL soğuk 10 mM Tris-HCl tampon (pH 7.4) ekleyin. 4 °C'de sallanan bir platformda 5 dakika karıştırın. Örnekleri kısaca döndürün, ardından 1 dakika boyunca manyetik bir rafa yerleştirin ve süpernatant'ı bir pipetle çıkarın.
NOT: Tris-HCl arabelleği (pH 7.4) yerine Tris-EDTA tamponu (pH 8.0) kullanılabilir. - 7.4−7.6 adımlarını üç kez tekrarlayın.
- Numune boncuklarını 500 μL Tris-HCl tamponu (pH 7.4) ile taze 1,5 mL tüplere aktarın. Örnekleri kısaca döndürün, ardından 1 dakika boyunca manyetik bir rafa yerleştirin ve süpernatant'ı bir pipetle çıkarın.
8. Boncuklarda onarım ve dA-tailing reaksiyona son verin
NOT: Sonication genellikle kör olmayan uçlu dsDNA oluşturur. DA-tailing reaksiyonunun ardından indeks adaptörü ligasyon adımından önce künt uçlu DNA yapmak için bir son onarım reaksiyonı gereklidir. İndeks adaptörü DNA'sı ile yapışkan uç DNA ligasyonu için dATP, dA-tailing reaksiyon tarafından kör, dsDNA parçasının 3' ucuna eklenir. Son hazırlık reaksiyon karışımı dATP içerir.
- ChIP yıkandıktan sonra, son onarım ve dA-tailing reaksiyonu için1,5mL tüplerdeki numune boncuklarına 38 μL otomatik kapatılmış ddH 2 O ekleyin.
- Her numuneye 5,6 μL uç hazırlık reaksiyon karışımı ve 2,4 μL uç hazırlık enzim karışımı(Malzeme Tablosu)ekleyin (toplam reaksiyon hacmi: 46 μL). Örnekleri 20 °C'de 30 dakika kuluçkaya yatır.
- Önceki ChIP yıkama adımları 7.4−7.6'da açıklandığı gibi boncukları yıkayın.
9. Boncuklarda dizin adaptörü ligasyonu
NOT: Dizin bağdaştırıcısı, yüksek verimli sıralamada birden çok örneği çoklamak için kullanılan belirli bir örneğe özgü 6−10 baz barkodlu diziye sahiptir. Dizin bağdaştırıcısı DNA dizileri Tablo 1'de açıklanmıştır.
- İndeks adaptörü ligasyonu için, numune boncuklarına 27 μL soğuk 10 mM Tris-HCl tamponu (pH 7.4) ekleyin. Her örneğe 2 μL 15 μM indeks adaptörü, 0,5 μL ligasyon arttırıcı ve 15 μL bağ ana karışımı(Malzeme Tablosu)ekleyin (toplam reaksiyon hacmi: 44,5 μL).
- Örnekleri 20 °C'de 15 dakika kuluçkaya yatır. Boncukları 7.4−7.6 adımlarında açıklandığı gibi yıkayın.
10. Boncuklar üzerinde dolgu reaksiyonsu
NOT: Adaptör ligasyonundan sonra, adaptörün 5' ucu ile ChIP DNA'sının 3' ucu arasında fosfodiester bağı yoktur. Nick bir doldurma reaksiyon ile onarılabilir.
- Numune boncuklarına 47 μL soğuk 10 mM Tris-HCl tampon (pH 7.4) ekleyin.
- Dolgu reaksiyon karışımını(Tablo 4 ve Malzeme Tablosu)buz üzerinde yapın.
- Her numuneye 11,1 μL dolgu karışımı ekleyin (toplam reaksiyon hacmi: 58,1 μL). Örnekleri 20 dakika boyunca 30 °C'de kuluçkaya yatır. Boncukları 7.4−7.6 adımlarında açıklandığı gibi yıkayın.
11. Boncuklar üzerinde Lambda exonuclease sindirimi
- Boncuklar üzerinde dolgu reaksiyonunun ardından, numune boncuklarına 50 μL soğuk otoklavlı ddH2O ekleyin.
- ChIP DNA'sını 5' ila 3' yönde sindirmek için, 6 μL 10x lambda exonuclease tamponu ve 2 μL 5 U/μL lambda exonuclease(Malzeme Tablosu, toplam reaksiyon hacmi: 58 μL) ekleyin. Örnekleri 37 °C'de 30 dakika kuluçkaya yatır. Boncukları 7.4−7.6 adımlarında açıklandığı gibi yıkayın.
12. Elution ve ters çapraz bağlama
- Tablo 5'teaçıklandığı gibi ChIP elution arabelleği yapın.
NOT: CHIP elution arabelleğine CPI eklemeyin. - Boncuklardan ChIP örneklerini elüte etmek için, numuneleri 75 μL ChIP elution tamponunda yeniden ıslatın ve 65 °C'de 130 x g'da 15 dakika kuluçkaya yatırın.
- Örneklere 2,5 μL 20 mg/mL proteinaz K (Malzeme Tablosu)ekleyin. Kısaca girdap, sonra örnekleri 65 ° C'de bir gecede kuluçkaya yatırın.
13. DNA ekstraksiyonu
- Numuneler 65 °C'de gece boyunca kuluçkaya yatırıldıktan sonra, örnekleri kısaca döndürün, 1 dakika boyunca manyetik bir rafa yerleştirin, ardından süpernatantı her numuneden yeni 1,5 mL tüplere aktarın.
- Örneklere 1 μL 10 mg/mL RNase A ekleyin. Kısaca girdap, sonra örnekleri 37 ° C'de 30 dakika kuluçkaya yatırın. 100 μL'ye kadar hacme~25 μLotomatik kapatılmış ddH 2 O ekleyin.
- Manyetik boncuklar kullanarak DNA'yı arındırın (Malzeme Tablosu). 16 μL otoklavlı ddH2O veya nükleaz içermeyen ddH2O ile Elute DNA.
14. Denatüre, astar tavlama ve astar uzantısı
- ChIP elution ve ters çapraz bağlamadan sonra, çıkarılan DNA örneklerinin 16 μL'lik kısmını adım 13.3'ten PCR tüplerine aktarın.
- Buz üzerinde denatüre ve astar tavlama karışımı (Tablo 6 ve Malzeme Masası)yapın. Her numuneye 1,2 μL denatüre ve astar tavlama karışımı ekleyin (toplam reaksiyon hacmi: 17,2 μL). Şablon DNA'sına denature ve tavlama astarları için Tablo 6'da açıklanan programı kullanarak örnekleri çalıştırın.
- Buz üzerinde astar uzatma karışımı(Tablo 7 ve Malzeme Masası)yapın.
- Denatüre ve tavlama astarları programı tamamlandıktan sonra, numunelere 3 μL astar uzatma karışımı ekleyin (toplam reaksiyon hacmi: 20,2 μL). Tablo 7'de açıklanan astar uzantısı için programı kullanarak örnekleri çalıştırın.
- Hemen dA-tailing reaksiyona geçin.
15. dA-tailing reaksiyon
NOT: Evrensel adaptör DNA'sı ile yapışkan uç DNA ligasyonu için dATP, dA-tailing reaksiyon tarafından 3' künt, dsDNA ucuna eklenir.
- Buz üzerinde dA-tailing karışımı(Tablo 8 ve Malzeme Masası)yapın.
- Her numuneye 4,1 μL dA-tailing karışımı ekleyin (toplam reaksiyon hacmi: 24,3 μL). Örnekleri dA-tailing için programı kullanarak çalıştırın (Tablo 8).
- Hemen evrensel bağdaştırıcı ligasyonuna geçin.
16. Evrensel adaptör ligasyonu
NOT: Evrensel bağdaştırıcı, sıralama kimyası için DNA örneği tanıma için yüksek verimli sıralamaya özgü diziler içerir. Evrensel adaptör DNA dizileri Tablo 1'de açıklanmıştır.
- dA-tailing reaksiyondan sonra, evrensel adaptör ligasyonu için evrensel adaptör ligasyon karışımını (Tablo 9 ve Malzeme Tablosu)yapın.
- Her numuneye 21,5 μL ekleyin (toplam reaksiyon hacmi: 45,8 μL) ve örnekleri 20 °C'de 15 dakika kuluçkaya yatırın.
17. DNA temizliği
- Manyetik boncuklar kullanarak DNA'yı arındırın (Malzeme Tablosu). 21 μL otoklavlı ddH2O veya nükleaz içermeyen ddH2O ile Elute DNA.
- Numuneleri -20 °C'de ligasyon aracılı PCR (LM-PCR) ve PCR saflaştırması yapmaya hazır olana kadar saklayın.
18. Ligasyon aracılı PCR
NOT: LM-PCR astar dizileri Tablo 1'deaçıklanmıştır.
- DNA temizliğinden sonra, buz üzerinde LM-PCR karışımı (Tablo 10 ve Malzeme Masası) yapın.
- Her numuneye 29 μL LM-PCR karışımı ekleyin (toplam reaksiyon hacmi: 50 μL) ve LM-PCR programını kullanarak numuneleri çalıştırın(Tablo 10).
- Pcr güçlendirilmiş DNA'nın jel saflaştırılmasına ve ardından yüksek verimli sıralama için DNA saflaştırmasına hemen devam edin.
19.LM-PCR güçlendirilmiş DNA'nın DNA p ürifikasyonu
- LM-PCR güçlendirilmiş DNA örneklerini bir DNA merdiveni ile birlikte 120−180 V'te %1,5 agarose jel ve 200-400 bp bandlarda tüketimde çalıştırın.
- Jel çıkarma kiti ( Malzeme Masası) kullanarak dna'yı ekscised jeldenarındırın.
- DNA saflaştırma işleminden sonra, her ChIP-exo kütüphanesi örneğinin konsantrasyonuna(Malzeme Tablosu)bakın. Tek okumalı sıralama için yüksek aktarım hızı sıralaması için örnekler gönderin.
NOT: Tek okumalı sıralama için tercih edilen okuma uzunluğu en az 35 bp'dir, bu da sıralama okumalarını fare veya insan hücrelerindeki referans genoma benzersiz olarak hizalamak için yeterlidir. Fare veya insan hücrelerindeki çoğu transkripsiyon faktörü için, ChIP-exo örneği başına 10−20 milyon okuma, genomik bağlayıcı konumlarını tanımlamak için yeterlidir. Memeli hücrelerindeki histone izleriyle zenginleştirilmiş genomik bölgeleri haritalamak için örnek başına en az 30 milyon okuma gereklidir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Şekil 2A, fare ES hücrelerinden ayırt edilen motor nöron hücrelerinin çeşitli döngülerle hücre lizisi ve sonication sonrası sonikasyon sonuçlarını göstermektedir. En uygun sonication döngüsü sayısı (örneğin, Şekil 2A'da 12döngü) 100−400 bp DNA parçalarında güçlü DNA yoğunluğu yarattı. Yüksek kaliteli ChIP-exo kütüphaneleri parçalanmış kromatin DNA'sının büyüklüğüne ve miktarına dayanmaktadır. Bu nedenle, ChIP-exo'ya başlamadan önce her hücre türü ve hücre grubu için sonication optimizasyonu önerilir.
Şekil 2B, ChIP-exo DNA örneklerinin ligasyon aracılı PCR (LM-PCR) ürünlerinin 18−21 PCR döngüsü ile güçlendirildiğini göstermektedir. LM-PCR, yeni nesil sıralama için DNA adaptörleriyle birleştirilmiş ChIP-exo DNA parçalarını yükseltiyor. PCR astarı DNA adaptörü dizilerinin bir parçasıdır. Sonicated DNA parçalarının boyutu yaklaşık 100−400 bp'dir (Şekil 2A). Lambda exonuclease sindirimden sonra, DNA parçalarının boyutu başlangıç malzemesinin (50−200 bp) yarım boyutu haline gelir. Yaklaşık 125 bp DNA adaptörü ChIP-exo DNA parçalarına bağlandı, böylece LM-PCR ürünlerinin beklenen boyutu 175−325 bp'dir. ChIP-exo kütüphanesini güçlendirmek için hala yeterli olan minimum PCR döngüsü, ChIP-exo DNA'sının aşırı amplifikasyonu önlemek için gerçekleştirilir.
Burada, Isl1 için ChIP-exo fare ES hücre türevi motor nöronlarda gerçekleştirildi. Isl1, özellikle postmitotik motor nöronlarda ifade edilen bir motor nöron programlama transkripsiyon faktörüdür. Isl1 ChIP-exo sonuçları 200−400 bp LM-PCR amplified ChIP-exo DNA(Şekil 2B)önemli miktarlarda göstermektedir. Yaklaşık 100 bp'lik bant, adaptörlerden ve PCR astarlarından PCR yapıtlarını gösterir. Deneysel bir numunenin yanında antikor kontrolü yapılmaması da lambda exonuclease tedavisi ile spesifik olmayan, arka plan DNA'sının sindirilmesini sağlamak için önemlidir. Örnek olarak, ChIP-exo ve ChIP-seq kullanarak fare ES hücre türevi motor nöronlarda Isl1 bağlı konumlarını belirledik (Şekil 3). ChIP-exo sinyali, Isl1 bağlama sahalarında yüksek oranda odaklandı ve birden fazla kümelenmiş Isl1 transkripsiyon faktörü bağlama desenini algıladı. ChIP-seq sinyali, Isl1'in ChIP-exo'sunun Isl1'in ChIP-seq'inden daha yüksek eşleme çözünürlüğüne sahip olduğunu gösteren daha geniş sinyaller gösterdi.
Şekil 1: ChIP-exo iletişim kuralının şeması. ChIP'den sonra (adım 1−7), son onarım ve dA-tailing reaksiyonları, DNA'nın 5' ucuna bir fosfat grubu ekleyerek ve DNA'nın 3' ucuna dATP ekleyerek ChIP DNA'sını kör noktalı hale getirir (adım 8). ChIP DNA'sının sonik uçları, boncuklar üzerindeki dizin adaptörü ile bağlanır (adım 9). Doldurma reaksiyondan sonra, 5' çıkıntlı adaptör DNA'sı künt uçlu hale gelir (adım 10). Lambda exonuclease, sonike DNA 5' ila 3' protein (TF)-DNA çapraz bağlantı noktalarına (adım 11) kadar sindirir. Elution, ters çapraz bağlama ve DNA ekstraksiyonu (adım 12 ve 13) sonrasında, denatüre tek iplikli DNA indeks PCR astar uzantısı (adım 14) tarafından çift iplikli yapılır, ardından dA-tailing (adım 15). Evrensel bağdaştırıcı daha sonra exonuclease ile işlenmiş uca bağlanır (adım 16). Elde edilen kitaplık temizlenir, PCR yükseltilir ve yeni nesil sıralamaya tabi tutulur (adım 17−19). Elde eden sıralama etiketlerinin 5' uçlarını referans genoma eşlemek, dış iskelet bariyerini ve dolayısıyla protein-DNA çapraz bağlamanın kesin yerini çizer.
Şekil 2: ChIP-exo kütüphanesinin sonication ve LM-PCR amplifikasyonu. (A) Elektroforlu sonicated DNA'nın% 1.5 agarose jeli. Fare ES hücre türevi motor nöronların 2 x 107 hücresi için en uygun sonication döngülerini bulmak için 12, 18 ve 24 sonication döngüsü gerçekleştirildi. Sonikasyondan sonra, DNA örneği ters çapraz bağlanır ve PCIA ve etanol çökeltisi kullanılarak çıkarılır. Her örnek, sonikated hücrelerin% 2'si olan 4 x 105 hücre eşdeğeri içeriyordu. 12 sonikasyon döngüsü, istenen boyutta (100−500 bp) daha fazla sonicated DNA verimi üretti. (B) Fare ES hücre türevi motor nöronlarda antikor kontrolü (Ab Yok) ve Isl1 için LM-PCR'nin 18−21 döngüsünü takiben elektroforlu ChIP-exo kütüphanelerinin% 1.5 agarose jeli. Her örnek, fare motoru nöronlarının 10 x10 6 hücre eşdeğerini içeriyordu. Antikorsuz ChIP-exo sonucu (şerit 2), spesifik olmayan, kirletici DNA'nın lambda exonuclease tarafından ortadan kaldırdığını göstermektedir. Isl1 (şerit 3) için ChIP-exo kütüphaneleri, 200−400 bp civarında güçlendirilmiş DNA kütüphaneleri gösterir ve chIP-exo kütüphanelerinin adaptör ligasyon aracılı PCR ile başarıyla yükseltildiğini gösterir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: ChIP-exo'nun Isl1 için ChIP-seq ile belirli bir loci'de karşılaştırılması. Mavi ve kırmızı dolgulu arsalar, fare ES hücrelerinden farklı olan burun spinal motor nöronlarında sırasıyla Slit3 ve Fgfr1 genine proksimal olan ChIP-seq ve ChIP-exo Isl1 bağlı konumlar için sıralama etiketlerinin dağılımını göstermektedir.
Tablo 1: Bu protokolde kullanılan oligonükleotidler.
| Oligo adı | Uzunluk (nt) | Sıra | Not | |||||
| Dizin bağdaştırıcısı ileri* | 66 | 5'/Fos/CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATXXXXXXXXGTGACTGGAGTTCAGACGTTGCTTCCGATCT 3' | 5' Fosfat, indeks (XXXXXXXX), 3' T-çıkınt | |||||
| Dizin bağdaştırıcısı-ters* | 33 | 5'GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCAC 3' | ||||||
| Ligasyon adaptörü ileri* | 58 | 5'AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCACACGACGCTTCCGATCT 3' | ||||||
| Ligasyon bağdaştırıcısı-ters* | 34 | 5'GATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGTAG 3' | ||||||
| Dizin PCR astarı* | 22 | 5'CAAGCAGAAGACGGCATACGAG 3' | ||||||
| Evrensel PCR astar* | 19 | 5'AATGATACGGCGACCACCG 3' | ||||||
| *Yukarıdaki sıralama adaptörleri ve PCR astarları Illumina HiSeq ve NextSeq Sıralama Platformları için tasarlanmıştır. | ||||||||
Tablo 2: Lizis tamponları için tarifler 1−3 ve engelleme tamponu. 4 °C'de 50 mL tüplerde saklayın. Kullanmadan hemen önce tüm tamponlara 50 μL 1000x CPI (komple proteaz inhibitörü) stoğu ekleyin.
| Lizis arabelleği 1 | ||
| Reaktif | Birim (mL) | [Son] |
| 1 M HEPES (pH 7.3) | 2.5 | 50 mM |
| 5 M NaCl | 1.4 | 140 mM |
| 0,5 M EDTA (pH 8,0) | 0.1 | 1 mM |
| %50 Gliserol | 10 | 10% |
| %10 Octylphenol etoksilat | 2.5 | 0.50% |
| %10 2-[4-(2,4,4-trimetilpentan-2-yl)fenoksi]etanol | 1.25 | 0.25% |
| Otomatik kapatılmış ddH2O | 50'ye doldur | |
| Lizis arabelleği 2 | ||
| Reaktif | Birim (mL) | [Son] |
| 0,5 M Tris-HCl (pH 8,0) | 1 | 10 mM |
| 5 M NaCl | 2 | 200 mM |
| 0,5 M EDTA (pH 8,0) | 0.1 | 1 mM |
| Otomatik kapatılmış ddH2O | 50'ye doldur | |
| Lizis arabelleği 3 | ||
| Reaktif | Birim (mL) | [Son] |
| 1 M Tris-HCl (pH 8.0) | 0.5 | 10 mM |
| 5 M NaCl | 1 | 100mm |
| 0,5 M EDTA (pH 8,0) | 0.1 | 1 mM |
| %10 Deoksikolik Asit | 0.5 | 0.10% |
| %30 N-Lauroylsarcosine sodyum tuz çözeltisi | 0.83 | 0.50% |
| Otomatik kapatılmış ddH2O | 50'ye doldur | |
| Engelleme çözümü | ||
| Reaktif | Tutar | [Son] |
| Sığır serum albümin (BSA) | 250 mg | 0.50% |
| Komple Proteaz Inhibitörü (CPI, 1000x) | 50 μL | 1x |
| Fosfat tamponlu salin (PBS) | 50 mL'ye doldurun | |
Tablo 3: ChIP yıkama tarifleri: Yüksek Tuzlu Yıkama tamponu, LiCl Yıkama tamponu ve 10 mM Tris-HCl tampon (pH 7.4). 4 °C'de 50 mL tüplerde saklayın. Kullanmadan hemen önce tüm tamponlara 50 μL 1000x CPI stok ekleyin.
| Yüksek tuz yıkama tamponu | ||
| Reaktif | Birim (mL) | [Son] |
| 1 M HEPES (pH 7.3) | 2.5 | 50 mM |
| 5 M NaCl | 5 | 500 mM |
| 0,5 M EDTA (pH 8,0) | 0.1 | 1 mM |
| %10 2-[4-(2,4,4-trimetilpentan-2-yl)fenoksi]etanol | 5 | 1% |
| %5 Deoksikolik asit | 1 | 0.10% |
| %5 SDS | 1 | 0.10% |
| Otomatik kapatılmış ddH2O | 50'ye doldur | |
| LiCl yıkama tamponu | ||
| Reaktif | Birim (mL) | [Son] |
| 0,5 M Tris-HCl (pH 8,0) | 2 | 20 mM |
| 0,5 M EDTA (pH 8,0) | 0.1 | 1 mM |
| 1 M LiCl | 12.5 | 250 mM |
| %10 Octylphenol etoksilat | 2.5 | 0.50% |
| %5 Deoksikolik asit | 5 | 0.50% |
| Otomatik kapatılmış ddH2O | 50'ye doldur | |
| 10 mM Tris-HCl tampon | ||
| Reaktif | Birim (mL) | [Son] |
| 1 M Tris-HCl (pH 7.4) | 0.5 | 10 mM |
| Otomatik kapatılmış ddH2O | 50'ye doldur | |
Tablo 4: Doldurma reaksiyon ana karışımı.
| Reaktif | 1x (μL) | [Son] |
| 20 mg/mL BSA | 0.6 | 0.2 mg/mL |
| 10x phi29 DNA polimeraz tampon | 6 | 1x |
| 3 mM dNTP'ler | 2.5 | 150 μM |
| 10 U/μL phi29 DNA polimeraz | 2 | 10 U |
| Reaksiyon karışımı hacmi | 11.1 |
Tablo 5: ChIP Elution tamponu tarifi. RT'de 50 mL tüplerde saklayın.
| Reaktif | Birim (mL) | [Son] |
| 0,5 M Tris-HCl (pH 8,0) | 5 | 50 mM |
| 0,5 M EDTA (pH 8,0) | 1 | 10 mM |
| %10 SDS | 5 | 1% |
| Otomatik kapatılmış ddH2O | 50 mL'ye kadar |
Tablo 6: Denaturing ve Primer Tavlama reaksiyon ana karışımı ve programı.
| Denatüre ve astar tavlama karışımı | ||
| Reaktif | 1x (μL) | [Son] |
| 20 mg/mL BSA | 0.2 | 0.2 mg/mL |
| 3 mM dNTP'ler | 0.5 | 75 μM |
| 10 μM İndeks PCR astar | 0.5 | 0,25 μM |
| Reaksiyon karışımı hacmi | 1.2 | |
| Denatüre ve astar tavlama programı | ||
| Sıcaklık (°C) | Saat | |
| 95 | 5 dk | |
| 65 | 3 dk | |
| 60 | 3 dk | |
| 57 | 3 dk | |
| 54 | 3 dk | |
| 51 | 3 dk | |
| 30 | Sonsuza kadar | |
Tablo 7: Astar Uzantısı reaksiyon ana karışımı ve programı.
| Astar uzatma karışımı | ||
| Reaktif | 1x (μL) | [Son] |
| 10x phi29 DNA polimeraz tampon | 2 | 1x |
| 10 U/μL phi29 DNA polimeraz | 1 | 75 μM |
| Reaksiyon karışımı hacmi | 3 | |
| Astar uzatma programı | ||
| Sıcaklık (°C) | Saat | |
| 30 | 20 dk | |
| 65 | 10 dk | |
| 4 | Sonsuza kadar | |
Tablo 8: dA-Tailing reaksiyon ana karışımı ve programı.
| dA-Tailing karışımı | ||
| Reaktif | 1x (μL) | [Son] |
| 3 mM dATP | 0.7 | 120 μM |
| Klenow parça arabelleği | 2.4 | 1x |
| 5 U/μL Klenow parçası | 1 | 5 U |
| Reaksiyon karışımı hacmi | 4.1 | |
| dA-Tailing programı | ||
| Sıcaklık (°C) | Saat | |
| 37 | 30 dk | |
| 75 | 20 dk | |
| 4 | Sonsuza kadar | |
Tablo 9: Evrensel Bağdaştırıcı Ligasyon reaksiyon ana karışımı.
| Reaktif | 1x (μL) | [Son] |
| Otoklavlı su | 5 | |
| 15 μM Evrensel adaptör* | 1 | 320 nM |
| Ligasyon arttırıcı | 0.5 | 1x |
| Ligase ana karışımı | 15 | 1x |
| Reaksiyon karışımı hacmi | 21.5 | |
| *Evrensel adaptör DNA dizisi Tablo 1'deaçıklanmıştır. | ||
Tablo 10: Ligasyon Aracılı PCR ana karışımı ve programı.
| LM-PCR karışımı | ||
| Reaktif | 1x (μL) | [Son] |
| 10 μM İndeks PCR astar* | 2 | 0,2 μM |
| 10 μM Evrensel PCR astar* | 2 | 0,2 μM |
| 2x Taq DNA polimeraz PCR master mix | 25 | 1x |
| Reaksiyon karışımı hacmi | 29 | |
| *PCR astar dizileri Tablo 1'deaçıklanmıştır. | ||
| LM-PCR programı | ||
| Sıcaklık (°C) | Saat | Döngü |
| 98 | 30 sn | 1 |
| 98 | 10 sn | 15−25 |
| 65 | 75 sn | |
| 65 | 5 dk | 1 |
| 4 | Tutun | |
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu protokolde ChIP ve ardından exonuclease sindirimi, memeli hücrelerindeki protein-DNA etkileşimlerinin ultra yüksek haritalama çözünürlüğünde tanımlanması için DNA kütüphaneleri elde etmek için kullanılır. Birçok değişken ChIP-exo deneyinin kalitesine katkıda bulunur. Kritik deneysel parametreler antikorların kalitesini, sonication optimizasyonunu ve LM-PCR döngülerinin sayısını içerir. Bu kritik deneysel parametreler aynı zamanda ChIP-exo deneylerini sınırlayabilir ve aşağıda tartışılacaktır.
Herhangi bir ChIP protokolünde antikor kalitesi en önemli hususlardan biridir. ChIP-exo için ChIP sınıfı antikorların kullanılması önerilir. Antikor kalitesi ChIP-exo protokolünü yapmadan önce kontrol edilebilir. ChIP-seq veya ChIP-qPCR, ilgi çekici proteinin belirli DNA bağlama konumlarını doğrulayarak ChIP sınıfı antikorları doğrulamak için kullanılabilir. Daha sonra, boncuklara eklenen antikorların konsantrasyonunun optimize edilmesi, protein-DNA komplekslerinin immün özürlü olmasını sağlamak için idealdir22,23.
Kromatin sonication ChIP-exo protokolünde bir başka kritik adımdır. Sonication, ilgi proteinine optimal immün önkseçim için gerekli olan kromatin spesifik olmayan kesme için kritiktir24. Sonikasyonlu DNA'nın büyüklüğü ve miktarı sonikasyon döngülerinin sayısına bağlıdır. ChIP-exo DNA kütüphanesinin oluşturulması için ilgi alanı proteinine yeterli miktarda DNA'nın immün önseçimli olmasını sağlamak için yüksek miktarda parçalanmış DNA önemlidir. 100−500 bp parçalı DNA elde etmek idealdir, çünkü sonicated kromatin parçaları daha küçük başlangıç boyutlarına sahipse ChIP-exo'nun çözünürlüğü daha iyidir. Bu nedenle, en uygun kromatin sonication sonication ve sonication tamponları sayısı değiştirilerek hücrelerin her türü ve parti için belirlenmelidir.
Son kritik parametre, PCR yapıtlarının aşırı amplifikasyonu önlemek için chIP-exo kütüphanesi DNA'sının minimum LM-PCR döngüsü sayısı ile amplifikasyonunun elde edilmesidir. ChIP-exo DNA'sını yükseltmek için minimum PCR döngüsü sayısını belirlemek için, ChIP-exo DNA'sının küçük bir kısmı birden fazla PCR döngüsünü (örneğin, 10, 15 ve 20 döngü) çalıştırmak ve PCR ürünlerini karşılaştırmak için kullanılabilir.
ChIP-exo, geleneksel bir ChIP-seq'ten çok daha fazla adıma sahiptir ve sonuç olarak, ChIP-exo protokolünün çalışması için her adım dikkatli ve hassas bir şekilde gerçekleştirilmelidir. Daha da önemlisi, enzymatic reaksiyonlardaki her reaktifin doğru hacmi her reaksiyon ana karışımına eklenmelidir21. Bu nedenle, her ana karışım için gereken her reaktifin hacmini hesaplamak için bir elektronik tablo oluşturulması, ardından tabloların yazdırılması ve ana karışımlara eklendikten sonra her reaktifin denetlenmeleri önerilir. Güçlendirilmiş DNA'nın dikkatli bir şekilde çıkarılması da önemlidir; 200 bp'nin altındaki parçalar genellikle yeni nesil sıralamadan önce kaldırılması gereken bağdaştırıcı soluklukları içerir.
Özellikle, ChIP-exo'nun kritik parametrelerinin ve sınırlamalarının çoğu ChIP-seq ile aynıdır. Bununla birlikte, ChIP-seq'in aksine, ChIP-exo düşük arka plana sahip yüksek çözünürlüklü genom eşlemesi sunar. Bu nedenle, ChIP-exo, çeşitli sistemlerde ve organizmalarda kesin protein-DNA etkileşimlerini tanımlamak için ideal bir yöntemdir ve DNA bağlayıcı proteinlerin hücredeki önemli rollerini ortaya çıkarmanıza yardımcı olur. Yukarıda açıklanan ChIP-exo yöntemi, canlı hücrelerdeki transkripsiyon faktörlerini, histone modifikasyon işaretlerini ve kromatin düzenleyici proteinleri ChIP-seq25 , 26,27'dendaha yüksek haritalama çözünürlüğünde incelemek için kullanılabilir. Buna ek olarak, ChIP-exo bir küme içindeki DNA bağlayıcı proteinlerin tek tek bağlama konumlarını algılayabilirken, ChIP-seq haritalama çözünürlüğü nedeniyle algılayamaz. Daha da önemlisi, ChIP-exo, ChIP-seq ile karşılaştırıldığında daha yüksek bir sinyal-gürültü oranı görüntüler. ChIP-exo'nun bu avantajları, genom boyunca kapsamlı bir dizi bağlı konum belirlememizi sağlar. Bu protokol, genomdaki çeşitli proteinlerin DNA bağlayıcı konumlarını neredeyse baz çifti çözünürlüğünde incelemek isteyen araştırmacılar için bir temel sağlayacaktır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Yayınlanmamış verileri ve değerli tartışmaları paylaştığı için Rhee laboratuvarı üyesine teşekkür ederiz. Bu çalışma Kanada Doğa Bilimleri ve Mühendislik Araştırma Konseyi (NSERC) hibe RGPIN-2018-06404 (H.R.) tarafından desteklendi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose, UltraPure | Invitrogen | 16500 | Checking Sonication (Section 4.3.6) and Gel Purification of LM-PCR Amplified DNA (Section 19.1) |
| Albumin, Bovine Serum (BSA), Protease Free, Heat Shock Isolation, Min. 98% | BioShop | ALB003 | Blocking Solution |
| Antibody against Isl1 | DSHB | 39.3F7 | Antibody incuation with beads (Section 5.6) |
| Bioruptor Pico | Diagenode | B01060010 | Sonicating Chromatin (Section 3.3) |
| Bovine serum albumin (BSA), Molecular Biology Grade | New England BioLabs | B9000S | Fill-in Reaction on Beads (Section 10.2) and Denaturing, Primer Annealing and Primer Extension (Section 14.2) |
| Centrifuge 5424 R | Eppendorf | 5404000138 | Sonicating Chromatin (Section 3.5), Checking Sonication (Section 4.3.1, 4.3.3 and 4.3.4) |
| Centrifuge 5804 R | Eppendorf | 22623508 | Harvest, cross-linking and freezing cells (Section 1.3), Cell lysis (Section 2.2 and 2.3), Sonicating Chromatin (Section 3.1) |
| cOmplete, Mini, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 4693159001 | Added to all buffers, except Proteinase K buffer and ChIP Elution buffer |
| dATP Solution | New England BioLabs | N0440S | dA-Tailing Reaction (Section 15.1) |
| Deoxycholic Acid Sodium Salt | fisher scientific | BP349 | Lysis Buffer 3, High Salt Wash Buffer and LiCl Wash Buffer |
| dNTP Mix, Molecular Biology Grade | Thermo Scientific | R0192 | Fill-in Reaction on Beads (Section 10.2) and Denaturing, Primer Annealing and Primer Extension (Section 14.2) |
| DreamTaq Green PCR Master Mix, 2x | Thermo Scientific | K1081 | Ligation-Mediated PCR (Section 18.1) |
| EDTA, 0.5 M, Sterile Solution, pH 8.0 | BioShop | EDT111 | Lysis Buffer 1-3, Checking Sonication (Section 4.1), High Salt Wash Buffer, LiCl Wash Buffer and ChIP Elution Buffer |
| Ethyl Alcohol Anhydrous, 100% | Commercial alcohols | P006EAAN | Checking Sonication (Section 4.3.3) |
| Formaldehyde, 36.5-38%, contains 10-15% methanol | Sigma | F8775 | Harvest, cross-linking and freezing cells (Section 1.1) |
| Glycerol, Reagent Grade, min 99.5% | BioShop | GLY002 | Lysis Buffer 1 |
| Glycine, Biotechnology Grade, min. 99% | BioShop | GLN001 | Harvest, cross-linking and freezing cells (Section 1.2) |
| Glycogen, RNA Grade | Thermo Scientific | R0551 | Checking Sonication (Section 4.3.3) |
| HEPES, 1 M Sterile-filtered Solution, pH 7.3 | BioShop | HEP003 | Lysis Buffer 1, High Salt Wash Buffer |
| Klenow Fragment (3->5 exo-) | New England BioLabs | M0212S | dA-Tailing Reaction (Section 15.1) |
| Lambda exonuclease | New England BioLabs | M0262S | Lambda Exonuclease Digestion on Beads (Section 11.2) |
| Ligase Enhancer | New England BioLabs | E7645S | NEBNext Ultra II DNA Library Kit. Index Adapter Ligation on Beads (Section 9.1) and Universal Adapter Ligation (Section 16.1) |
| Ligase Master Mix | New England BioLabs | E7645S | NEBNext Ultra II DNA Library Kit. Index Adapter Ligation on Beads (Section 9.1) and Universal Adapter Ligation (Section 16.1) |
| Lithium Chloride (LiCl), Reagent grade | Bioshop | LIT704 | LiCl Wash Buffer |
| Magnetic beads for ChIP (Dynabeads Protein G) | Dynabeads Protein G (magnetic beads for ChIP) | Dynabeads Protein G (magnetic beads for ChIP) | Antibody incubation with beads (Section 5) |
| Magnetic beads for DNA purification (AMPure XP Beads) | Beckman Coulter | A63880 | DNA Extraction (Section 13.3) and DNA Clean-up (Section 17.1) |
| Magnetic rack (DynaMag-2 Magnet) | Invitrogen | 12321D | Used in many steps in Sections: 5 - 11, 13 |
| MinElute Gel Extraction Kit | Qiagen | 28604 | Gel Purification of PCR Amplified DNA (Section 19.2) |
| N-Lauroylsarcosine sodium salt solution, 30% aqueous solution, ≥97.0% (HPLC) | Sigma | 61747 | Lysis Buffer 3 |
| Octylphenol Ethoxylate (IGEPAL CA630) | BioShop | NON999 | Lysis Buffer 1 and LiCl Wash Buffer |
| Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol, Biotechnology Grade (25:24:1) | BioShop | PHE512 | Checking Sonication (Section 4.3.1) |
| phi29 DNA Polymerase | New England BioLabs | M0269L | Fill-in Reaction on Beads (Section 10.2) and Denaturing, Primer Annealing and Primer Extension (Section 14.3 and 14.4) |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS), 1x | Corning | 21040CV | Harvest, cross-linking and freezing cells (Section 1.3) and Sonicating Chromatin (Section 3.1), Antibody incuation with beads (Section 5.1) |
| PowerPac Basic Power Supply | BioRad | 1645050 | Checking Sonication (Section 4.3.6) and Gel Purification of LM-PCR Amplified DNA (Section 19.1) |
| ProFlex PCR System | Applied Biosystems | ProFlex PCR System | Used in Sections: 14.2, 14.4, 15.2, 16.2 and 18.2 |
| Protein LoBind Tube, 2.0 mL | Eppendorf | 22431102 | Antibody Incubation with Beads (Section 5.2) and Chromatin Immunoprecipitation (Section 6.3) |
| Proteinase K Solution, RNA Grade | Invitrogen | 25530049 | Checking Sonication (Section 4.2) and Elution and Reverse Crosslinking (Section 12.3) |
| Qubit 4.0 Fluorometer | Invitrogen | Q33226 | Gel Purification of PCR Amplified DNA (Section 19.3) |
| Quibit dsDNA BR assay kit | Invitrogen | Q32853 | Gel Purification of PCR Amplified DNA (Section 19.3) |
| Rnase A, Dnase and Protease-free | Thermo Scientific | EN0531 | Checking Sonication (Section 4.3.2) and DNA Extraction (Section 13.2) |
| Sodium chloride (NaCl), BioReagent | Sigma | S5886 | Lysis Buffer 1-3, High Salt Wash Buffer |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS), Electrophoresis Grade | BioShop | SDS001 | Checking Sonication (Section 4.1), High Salt Wash Buffer and ChIP Elution Buffer |
| Sonication beads and 15 mL Bioruptor Tubes | Diagenode | C01020031 | Sonicating Chromatin (Section 3.1 and 3.2) |
| ThermoMixer F1.5 | Eppendorf | 5384000020 | Section 4.2, 4.3.2, 4.3.5, 8.2, 9.2, 10.3, 11.2, 12.2, 12.3, 13.2 and 16.2 |
| Trizma hydrochloride solution (Tris-HCl), BioPerformance Certified, 1 M, pH 7.4 | Sigma | T2194 | 10 mM Tris-HCl Buffer |
| Trizma hydrochloride solution (Tris-HCl), BioPerformance Certified, 1 M, pH 8.0 | Sigma | T2694 | Lysis Buffer 2, Lysis Buffer 3, Checking Sonication (Section 4.1), LiCl Wash Buffer and ChIP Elution Buffer |
| Ultra II End Repair/dA-Tailing Module (24 rxn -> 120 rxn) | New England BioLabs | E7546S | End Prep Reaction mix and End Prep Enzyme mix. End-repair and dA-Tailing Reaction on Beads (Section 8.2) |
| VWR Mini Tube Rocker, Variable Speed | VWR | 10159-752 | Used in many steps in sections: 1, 2, 5, 6 and 7 |
| 2-[4-(2,4,4-trimethylpentan-2-yl)phenoxy]ethanol, Triton X-100, Reagent Grade | BioShop | TRX506 | Lysis Buffer 1, Sonicating Chromatin (Section 3.4) and High Salt Wash Buffer |
References
- Johnson, D. S., Mortazavi, A., Myers, R. M., Wold, B. Genome-wide mapping of in vivo protein-DNA interactions. Science. 316 (5830), 1497-1502 (2007).
- Patten, D. K., Corleone, G., Magnani, L. Epigenome Editing: Methods and Protocols. Methods in Molecular Biology. A, J. eltsch, Rots, M. G. 1767, 271-288 (2018).
- Serandour, A. A., Brown, G. D., Cohen, J. D., Carroll, J. S. Development of an Illumina-based ChIP-exonuclease method provides insight into FoxA1-DNA binding properties. Genome Biology. 14 (12), 147 (2013).
- Rhee, H. S., Pugh, B. F. Comprehensive genome-wide protein-DNA interactions detected at single-nucleotide resolution. Cell. 147 (6), 1408-1419 (2011).
- Rhee, H. S., Pugh, B. F. ChIP-exo method for identifying genomic location of DNA-binding proteins with near-single-nucleotide accuracy. Current Protocols in Molecular Biology. Chapter 21, 21-24 (2012).
- Starick, S. R., et al. ChIP-exo signal associated with DNA-binding motifs provides insight into the genomic binding of the glucocorticoid receptor and cooperating transcription factors. Genome Research. 25 (6), 825-835 (2015).
- Han, G. C., et al. Genome-Wide Organization of GATA1 and TAL1 Determined at High Resolution. Molecular and Cellular Biology. 36 (1), 157-172 (2016).
- Rhee, H. S., Bataille, A. R., Zhang, L. Y., Pugh, B. F. Subnucleosomal Structures and Nucleosome Asymmetry across a Genome. Cell. 159 (6), 1377-1388 (2014).
- Rhee, H. S., Pugh, B. F. Genome-wide structure and organization of eukaryotic pre-initiation complexes. Nature. 483 (7389), 295-301 (2012).
- Zhou, X. F., Yan, Q., Wang, N. Deciphering the regulon of a GntR family regulator via transcriptome and ChIP-exo analyses and its contribution to virulence in Xanthomonas citri. Molecular Plant Pathology. 18 (2), 249-262 (2017).
- Kim, D., et al. Systems assessment of transcriptional regulation on central carbon metabolism by Cra and CRP. Nucleic Acids Research. 46 (6), 2901-2917 (2018).
- Niu, B., et al. In vivo genome-wide binding interactions of mouse and human constitutive androstane receptors reveal novel gene targets. Nucleic Acids Research. 46 (16), 8385-8403 (2018).
- Uuskula-Reimand, L., et al. Topoisomerase II beta interacts with cohesin and CTCF at topological domain borders. Genome Biology. 17, (2016).
- Rhee, H. S., et al. Expression of Terminal Effector Genes in Mammalian Neurons Is Maintained by a Dynamic Relay of Transient Enhancers. Neuron. 92 (6), 1252-1265 (2016).
- Pugh, B. F., Venters, B. J. Genomic Organization of Human Transcription Initiation Complexes. Plos One. 11 (2), (2016).
- Wang, S., et al. ATF4 Gene Network Mediates Cellular Response to the Anticancer PAD Inhibitor YW3-56 in Triple-Negative Breast Cancer Cells. Molecular Cancer Therapeutics. 14 (4), 877-888 (2015).
- Barfeld, S. J., et al. c-Myc Antagonises the Transcriptional Activity of the Androgen Receptor in Prostate Cancer Affecting Key Gene Networks. Ebiomedicine. 18, 83-93 (2017).
- McHaourab, Z. F., Perreault, A. A., Venters, B. J. ChIP-seq and ChIP-exo profiling of Pol II, H2A.Z, and H3K4me3 in human K562 cells. Scientific Data. 5, 180030 (2018).
- Perreault, A. A., Sprunger, D. M., Venters, B. J. Epigenetic and transcriptional profiling of triple negative breast cancer. Scientific Data. 6, 190033 (2019).
- Rossi, M. J., Lai, W. K. M., Pugh, B. F. Simplified ChIP-exo assays. Nature Communications. 9 (1), 2842 (2018).
- Perreault, A. A., Venters, B. J. The ChIP-exo Method: Identifying Protein-DNA Interactions with Near Base Pair Precision. Journal of Visualized Experiments. (118), (2016).
- Jezek, M., Jacques, A., Jaiswal, D., Green, E. M. Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) of Histone Modifications from Saccharomyces cerevisiae. Journal of Visualized Experiments. (130), (2017).
- Terranova, C., et al. An Integrated Platform for Genome-wide Mapping of Chromatin States Using High-throughput ChIP-sequencing in Tumor Tissues. Journal of Visualized Experiments. (134), (2018).
- Pchelintsev, N. A., Adams, P. D., Nelson, D. M. Critical Parameters for Efficient Sonication and Improved Chromatin Immunoprecipitation of High Molecular Weight Proteins. PLos One. 11 (1), (2016).
- Yamada, N., Lai, W. K. M., Farrell, N., Pugh, B. F., Mahony, S. Characterizing protein-DNA binding event subtypes in ChIP-exo data. Bioinformatics. 35 (6), 903-913 (2019).
- Yen, K., Vinayachandran, V., Pugh, B. F. SWR-C and INO80 chromatin remodelers recognize nucleosome-free regions near +1 nucleosomes. Cell. 154 (6), 1246-1256 (2013).
- Vinayachandran, V., et al. Widespread and precise reprogramming of yeast protein-genome interactions in response to heat shock. Genome Research. , (2018).
