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Biochemistry

आणविक गतिशीलता सिमुलेशन के साथ ईजीएफआर दैमेटिक म्यूटेशन को सक्रिय करने के संरचनात्मक प्रभावों को समझने

Published: May 20, 2020 doi: 10.3791/61125
Automatic Translation
1, 2, 2,3,4, 1
1Structural Bioinformatics Laboratory, Biochemistry, Faculty of Science and Engineering, Åbo Akademi University, 2Medicity Research Laboratories and Institute of Biomedicine, University of Turku, 3Turku Bioscience Centre, University of Turku and Åbo Akademi University, 4Department of Oncology and Radiotherapy, University of Turku and Turku University Hospital

Summary

इस प्रोटोकॉल का उद्देश्य ईजीएफआर किनेज़ प्रोटीन के उत्परिवर्तन को सक्रिय करने के कारण होने वाले गतिशील संरचनात्मक परिवर्तनों की जांच करने के लिए आणविक गतिशीलता सिमुलेशन का उपयोग करना है।

Abstract

कैंसर रोगियों से रिसेप्टर टायरोसिन किनासेस (आरटीके) के एपिडर्मल ग्रोथ फैक्टर रिसेप्टर (ईजीएफआर) परिवार (एर्बीबी) में होने वाले कई दैहिक उत्परिवर्तनों की सूचना दी गई है, हालांकि अपेक्षाकृत कुछ का परीक्षण किया गया है और एर्बीबी में कार्यात्मक परिवर्तनों का कारण दिखाया गया है। एर्बीबी रिसेप्टर्स को लिगेंड बाइंडिंग पर डिमराइज्ड और सक्रिय किया जाता है, और रिसेप्टर्स के गतिशील अनुरूप परिवर्तन डाउनस्ट्रीम सिग्नलिंग को शामिल करने के लिए अंतर्निहित होते हैं। ईजीएफआर फ़ंक्शन, ए 702वी और ए746एलआरईए750 विलोपन उत्परिवर्तन को बदलने के लिए प्रयोगात्मक रूप से दिखाए गए दो उत्परिवर्तनों के लिए, हम निम्नलिखित प्रोटोकॉल में वर्णन करते हैं कि कैसे आणविक गतिशीलता (एमडी) सिमुलेशन जंगली प्रकार के ईजीएफआर की तुलना में उत्परिवर्ती टायरोसाइन काइनेज संरचना की (1) अनुरूप स्थिरता की जांच कर सकते हैं; (2) संरचनात्मक परिणाम और अनुरूप संक्रमण और उनके संबंधों को कार्यात्मक परिवर्तन ों का अवलोकन करने के लिए; (3) बाध्यकारी एटीपी के बल पर म्यूटेशन के प्रभाव के साथ-साथ सक्रिय असममित डिमर में किनेज़ डोमेन के बीच बाध्यकारी के लिए; और (4) सक्रिय एंजाइम से जुड़े ईजीएफआर बाध्यकारी साइट के भीतर प्रमुख इंटरैक्शन पर म्यूटेशन के प्रभाव। प्रोटोकॉल एक विस्तृत कदम-दर-कदम प्रक्रिया के साथ-साथ मार्गदर्शन प्रदान करता है जो संरचनात्मक गतिशीलता और जैविक कार्य के संबंध की जांच करने के साधन के रूप में एमडी सिमुलेशन का उपयोग करके प्रोटीन संरचनाओं की जांच के लिए अधिक आम तौर पर उपयोगी हो सकता है।

Introduction

रिसेप्टर टायरोसाइन किनासेस (आरटीके) के मानव एपिडर्मल ग्रोथ फैक्टर रिसेप्टर (ईजीबीबी) परिवार (एर्बीबी) में चार सदस्य शामिल हैं-ईजीएफआर/एर्बीबी1/HER1, ErbB2/HER2, ErbB3/HER3 और ErbB4/HER4 । एर्बीबी रिसेप्टर्स सेल विकास और प्रसार, भेदभाव, प्रवासन और अस्तित्व1,,2जैसी मौलिक सेलुलर प्रक्रियाओं को विनियमित करते हैं, और इस प्रकार शक्तिशाली प्रोटो-ऑन्कोजीन हैं। एर्बीबी रिसेप्टर्स, विशेष रूप से ईजीएफआर और एर्बीबी 2 की एबरंट गतिविधि अक्सर मानव कैंसर से जुड़ी हुई है जो एर्ब रिसेप्टर्स कैंसर चिकित्सा विज्ञान2,,3के लिए प्रमुख लक्ष्य बनाती है।

मानव घातक,3,4,5से ईआरबीबी जीन के कई दैहिक परिवर्तन की सूचना मिली है . सबसे अच्छी विशेषता वाले उदाहरणों में गैर-छोटे सेल फेफड़ों के कैंसर (एनएससीएलसी) में ईजीएफआर किनेज़ डोमेन में आवर्ती, सक्रिय बिंदु उत्परिवर्तन और शॉर्ट इन-फ्रेम विलोपन शामिल हैं। ये ईजीएफआर उत्परिवर्तन कैंसर के विकास के प्रमुख ड्राइवरों का प्रतिनिधित्व करते हैं, और कैंसर दवाओं को लक्षित करने वाले ईजीएफआर के प्रति संवेदनशीलता की भविष्यवाणी करते हैं6,,7,,8। हालांकि, अधिकांश कैंसर में, ईजीएफआर में दैहिक उत्परिवर्तन इन आवर्ती "हॉटस्पॉट" के बाहर होते हैं और रिसेप्टर के पूरे 1210-अवशेष अवधि में वितरित किए जाते हैं। दरअसल, ईजीएफआर प्राथमिक अनुक्रम के साथ अधिकांश अवशेषों को मानव कैंसर9में रूपांतरित पाया गया है । फिर भी, कुछ आकर्षण के केंद्र के अलावा, कैंसर से जुड़े EGFR म्यूटेशन के विशाल बहुमत के कार्यात्मक महत्व अज्ञात रहता है ।

एर्बीबी की मोनोमेरिक संरचना में एक बड़ा अमीनो टर्मिनल एक्स्ट्रासेलुलर डोमेन होता है, जिसके बाद एक ही ट्रांसमेम्ब्रान हेलिक्स होता है जिससे इंट्रासेल्युलर टायरोसिन काइनेज डोमेन और सी-टर्मिनल टेल क्षेत्र होता है जिसमें इंट्रासेलुलर सिग्नलिंग प्रोटीन के लिए डॉकिंग साइटें होती हैं। लिगांड बाइंडिंग बाह्य डोमेन में एक नाटकीय अनुरूप परिवर्तन को ट्रिगर करता है, जो एक दूसरे के ऊपर सममित रूप से पार करने वाले डिमराइजेशन हथियारों को उजागर करके रिसेप्टर डिमर्स के गठन की सुविधा प्रदान करता है और उनकी सुगंधित/हाइड्रोफोबिक सतहों के साथ बातचीत करता है । रिसेप्टर डाइमर गठन पर टायरोसिन किनेज डोमेन विषमतापूर्वक(चित्र 1)के संपर्क में आते हैं, जिसके परिणामस्वरूप किनासेस की सक्रियता होती है जो रिसेप्टर मोनोमर की सी-टर्मिनल पूंछ को फॉस्फोरलेट करती है, और बाद में डाउनस्ट्रीम सिग्नलिंग10, 11,11के सक्रियण में होती है।

Figure 1
चित्रा 1: ईजीएफआर डिमर की संरचना। ईजीएफआर डिमराइज होता है जब एक्स्ट्रासेलुलर डोमेन ग्रोथ फैक्टर (ईजीएफ, एपिडर्मल ग्रोथ फैक्टर) को बांधते हैं। रिसीवर किनेज़ डोमेन को एक्टिवेटर किनेज़ डोमेन के साथ असममित बातचीत के माध्यम से सक्रिय किया जाता है, और सी-टर्मिनल पूंछ को टायरोसिन अवशेषों (तामिरात एट अल12से संशोधित) पर ऑटोफोस्फोरिलेटेड किया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

मोनोमर डाइमर संक्रमण के दौरान होने वाले गतिशील संरचनात्मक पुनर्व्यवस्थाओं के कारण, किनेस सक्रियण के साथ जो असममित डिमर के गठन से जुड़ा हुआ है, रिसेप्टर संरचना की पूरी लंबाई के साथ उत्परिवर्तन संभावित रूप से रिसेप्टर फ़ंक्शन पर प्रभाव डाल सकते हैं। यहां हम अपने पिछले अध्ययनों से कई उदाहरणों का वर्णन करते हैं जिसमें उत्परिवर्तन और दृश्य के मॉडलिंग समारोह के परिणामों को समझाने के लिए पर्याप्त थे।

उदाहरण 1: एक रिपोर्ट उत्परिवर्तन, ErbB413में D595V, ErbB4 डामरीकरण और फॉस्फोरिलेशन14में वृद्धि हुई । उत्परिवर्तन के स्थान का दृश्य मनाया कार्यात्मक प्रभावों को समझने में एक महत्वपूर्ण कारक था: D595V एक्टोडोमेन(चित्रा 2ए)के मंद हथियारों के सममित क्रॉसओवर पर हुआ। हथियार काफी हद तक सुगंधित और हाइड्रोफोबिक होते हैं, और वायलाइन द्वारा ध्रुवीय एस्पार्टिक एसिड के प्रतिस्थापन से "चिपचिपा" हाइड्रोफोबिक इंटरैक्शन में वृद्धि होने, डाइमर को स्थिर करने और इसलिए समय की लंबाई में वृद्धि होने की उम्मीद होगी जब फॉस्फोरिलेशन14होता है। यह पहली बार में एक आश्चर्य के लिए प्रत्येक हाथ में aspartate मिल गया था, लेकिन पीछे मुड़कर देखें एक गतिविधि के लिए एक समय तंत्र के रूप में इसके बारे में सोच सकते हैं, जहां ध्रुवीय एसिड साइड चेन अक्षुण्ण dimer के आत्मीयता और जीवनकाल को कम करने और इसलिए सीमित kinase-मध्यस्थता फॉस्फोरिलेशन और संकेत । इसके बाद वीएन द्वारा प्रतिस्थापन ErbB4 डिमर को और स्थिर करके इस सुरक्षा को हटा देगा।

Figure 2
चित्रा 2: एक ErbB4 सक्रिय उत्परिवर्तन और किनेज़-मृत ErbB4 उत्पादन उत्परिवर्तन का स्थान । (A)D595 (सक्रिय D595V उत्परिवर्तन) ErbB4 एक्टोडोमेन मॉडल के सुगंधित/हाइड्रोफोबिक मंद हथियारों पर स्थित है; विकास कारक बाध्यकारी पर हथियार सहयोगी; (आसपास के अवशेषों को लाठी के रूप में दिखाया जाता है)। (ख)ErbB4 में, G802 (निष्क्रिय G802dup उत्परिवर्तन) एटीपी और उत्प्रेरक D861 (निष्क्रिय D861Y उत्परिवर्तन) के एडेनिन अंगूठी के आसपास बाध्यकारी जेब बनाने में मदद करता है दोनों एमजी2 + (नहीं दिखाया) और एटीपी के γ-फॉस्फेट समूह बांधता है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

उदाहरण 2: कोई यह आशा कर सकता है कि किनेज़ डोमेन की एटीपी-बाध्यकारी साइट को लक्षित करने वाले दैहिक उत्परिवर्तन एंजाइमैज़िक गतिविधि को बदल या समाप्त कर देंगे जिससे एक बिगड़ा या काइनेज-डेड रिसेप्टर सिग्नलिंग में असमर्थ हो जाएगा। स्तन, गैस्ट्रिक, कोलोरेक्टल, या एनएससीएलसी15के रोगियों से नौ रिपोर्ट किए गए म्यूटेशन में से दो, जब परीक्षण किया गया तो फॉस्फोरिलेशन गतिविधि16:G802dup (जी → जीजी) और D861Y अत्यधिक कम हो गई थी। दोनों निष्क्रिय दैहिक उत्परिवर्तन टायरोसिन काइनेज डोमेन संरचना(चित्रा 2बी):लचीला ग्लाइसिन, डुप्लिकेट, एडेनिन रिंग साइट और छोटे एस्पपार्टिक एसिड को टर्मिनल फॉस्फेट के पास भारी टायरोसिन द्वारा प्रतिस्थापित करने के एटीपी बाध्यकारी से एमजी2 +-एटीपी के एटीपी के भीतर पाए गए थे। हालांकि, चूंकि ErbB4 ErbB2 के साथ एक विषमताक्रम बना सकता है - एर्बीबी 2 एक विकास कारक को बाध्य नहीं करता है और एक एर्बीबी के साथ सहयोग पर निर्भर करता है जो विषमता के लिए करता है - एर्बीबी 2 (सक्रिय) - ErbB4 (kinase-मृत) heterodimer Erk के माध्यम से सेल प्रसार को प्रोत्साहित करेगा/Akt सिग्नलिंग मार्ग अभी तक कोशिकाओं क्योंकि kinase-मृत ErbB4 और STAT5 मार्ग सक्रियण16की कमी के अंतर नहीं होगा ।

हाल के अध्ययनों में, यह स्पष्ट हो गया कि एर्बीबी के गतिशील आंदोलन एर्बीबी फ़ंक्शन पर कुछ म्यूटेंट के प्रभावों को समझने के लिए प्रासंगिक थे, विशेष रूप से उत्परिवर्तन जो टायरोसिन काइनेज डोमेन के भीतर होते हैं। टायरोसिन किनेज़ डोमेन में एन-लोब (मुख्य रूप से β-शीट) और सी-लोब (मोटे तौर पर अल्फा पेचिक) होते हैं, जिन्हें उत्प्रेरक साइट द्वारा अलग किया जाता है जहां एटीपी बांधता है। एन-लोब में αC हेलिक्स और पी-लूप शामिल हैं, जबकि सी-लोब17, 18, 19,18,19में सक्रियण (ए-लूप) और उत्प्रेरक लूप मौजूद हैं। टायरोसिन किनेज डोमेन की क्रिस्टल संरचनाओं ने दो निष्क्रिय संरचनाओं का खुलासा किया, अधिकांश संरचनाओं में एसआरसी जैसी निष्क्रिय स्थिति होती है। सक्रिय संरचना में ए-लूप का उत्प्रेरक एस्पपार्टेट एटीपी बाध्यकारी साइट की ओर इशारा करता है और αC हेलिक्स एटीपी बाध्यकारी जेब ("αC-in" संरचना) की ओर उन्मुख है, जो एक मजबूत ग्लूटामेट-lysine आयन-जोड़ी बातचीत बनाता है।

क्योंकि ErbBs और घटक kinase डोमेन अत्यधिक गतिशील संस्थाओं रहे हैं, और विशेष रूप से उदाहरण के लिए जहां समारोह और जैविक गतिविधि पर उत्परिवर्तन के प्रभाव को कसकर ErbBs के अनुरूप राज्यों से जुड़ा होने की संभावना है, यह गतिशील परिवर्तन वे अनुभव होगा की सीमा के संबंध में उत्परिवर्तन का आकलन करने के लिए महत्वपूर्ण है । एर्बीबी की एक्स-रे क्रिस्टल संरचनाएं 3 डी संरचना के स्थिर स्नैपशॉट प्रदान करती हैं, जो उत्परिवर्तन के गतिशील परिणामों को समझने के लिए प्रासंगिक हो सकती हैं या नहीं। त्रि-आयामी (3 डी) संरचना के लिए उपलब्ध "ऊर्जा परिदृश्य" के अनुरूप गतिशील परिवर्तनों की सीमा की जांच करने के लिए, आणविक गतिशीलता (एमडी) सिमुलेशन का व्यापक रूप से उपयोग किया जाता है20। म्यूटेशन के मामले में जो टायरोसिन किनेज डोमेन के भीतर स्थानीय अनुरूप परिवर्तन या एक जटिल के स्थिरीकरण का कारण बनेगा, 100 एनएस के आदेश पर सिमुलेशन पर्याप्त हो सकता है। हालांकि, बड़े पैमाने पर अनुरूप परिवर्तन (उदाहरण के लिए, किनेज़ डोमेन के सक्रिय और निष्क्रिय अनुरूपता के बीच संक्रमण) को माइक्रोसेकंड21के क्रम पर लंबे सिमुलेशन समय की आवश्यकता होती है।

नीचे वर्णित प्रोटोकॉल के संबंध में हम टायरोसिन काइनेज डोमेन(चित्र 3)के भीतर दो सक्रिय उत्परिवर्तनों पर विचार करते हैं। दोनों उत्परिवर्तन उन स्थानों पर काइनेज डोमेन के भीतर स्थित हैं जो स्थानीय अनुरूप परिवर्तनों का अनुभव करते हैं जो यह तय करते हैं कि काइनेज सक्रिय है या नहीं, और इस प्रकार एमडी सिमुलेशन दोनों उदाहरणों में लागू किए गए थे। पहले मामले में, हम उन परिवर्तनों पर विचार करते हैं जो सीधे एटीपी बाध्यकारी साइट और ईजीएफआर रिसीवर किनेज़ डोमेन की उत्प्रेरक मशीनरी को प्रभावित करते हैं, विशेष रूप से एनएससीएलसी4,,7में व्यापक रूप से फंसाए गए एक्सन 19 विलोपन उत्परिवर्तन के परिणामों की जांच करते हैं। 746ELREA750 उत्परिवर्तन, जो αC हेलिक्स से पहले 3-αC लूप की लंबाई को कम करता है - हेलिक्स जो किनेज़ सक्रियण पर बाध्यकारी/सक्रिय साइट की ओर बढ़ता है और एटीपी के साथ बातचीत के लिए lysine स्थिति द्वारा हेलिक्स और K745 के E762 के बीच महत्वपूर्ण इलेक्ट्रोस्टैटिक इंटरैक्शन बनाने में भाग लेता है - सक्रियण12के लिए डोमेन को संवेदनशील बनाता है। दूसरे मामले में, हम ईजीएफआर के A702V उत्परिवर्तन पर विचार करते हैं, जिसे आईस्क्रीम प्लेटफॉर्म9 द्वारा उजागर उत्परिवर्तन को सक्रिय करने वाला एक उपन्यास लाभ-कार्य सक्रिय किया गया है और एनएससीएलसी रोगी22में पहचाना गया है। रिसीवर किनेज़ डोमेन पर एलनाइन-702 रिसीवर और एक्टिवेटर किनेज़ डोमेन के इंटरफेस पर मुक्सटामेम्ब्रान सेगमेंट बी पर स्थित है, जिसमें एक्टिवेशन9के लिए इस असममित किनेज़ डाइमर कॉम्प्लेक्स और किनेज़ अनुरूप परिवर्तनों की आवश्यकता होती है।

Figure 3
चित्र 3: ईजीएफआर का असममित किनेज़ डोमेन डाइमर। A702V उत्परिवर्तन एक्टिवेटर और रिसीवर किनेज़ डोमेन के महत्वपूर्ण इंटरफ़ेस पर स्थित होगा, जो αC हेलिक्स के निकट और एक्टिवेटर किनेज़ के आइसोल्यूसिन 941 के करीब है। असममित डिमर के गठन से प्रेरित अनुरूप परिवर्तन किनेज़ सक्रियण का कारण बनते हैं। ELREA अनुक्रम युक्त 3-αC लूप सीधे αC हेलिक्स से पहले; सक्रियण के दौरान, αC हेलिक्स एटीपी बाध्यकारी साइट की ओर आवक बढ़ता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Protocol

नोट: एमडी सिमुलेशन का उपयोग करके ईजीएफआर संरचना पर एईएलईए और A702V उत्परिवर्तन के प्रभावों की जांच करने के लिए उठाए गए विस्तृत कदमों पर इस प्रकार चर्चा की जाती है:

1. संरचना की तैयारी

नोट: एपीओ एक्टिव, एटीपी-बाउंड एक्टिव और एपीओ निष्क्रिय ईजीएफआर मोनोमर संरचनाओं के संरचनात्मक प्रभावों का अध्ययन करने के लिए इस प्रकार तैयार किए जाते हैं।

  1. जंगली प्रकार के एपीओ सक्रिय ईजीएफआर किनेज़ संरचना तैयार करने के लिए कल्पना23 विज़ुअलाइज़ेशन प्रोग्राम(https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/)खोलें। फाइल मेनू में आईडी विकल्प द्वारा लाने पर क्लिक करें और प्रोटीन डेटा बैंक (पीडीबी24)डेटाबेस का चयन करें और पीडीबी कोड 2जीएस 2 2525 (2.8 Å रिज़ॉल्यूशन) निर्दिष्ट करें। पीडीबी विभिन्न प्रायोगिक तकनीकों द्वारा हल की गई 3डी संरचनाओं के लिए एक भंडार है, जिसमें एक्स-रे क्रिस्टलोग्राफी, न्यूक्लियर मैग्नेटिक रेओनेंस स्पेक्ट्रोस्कोपी, क्रायो-इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी और न्यूट्रॉन विवर्तन शामिल हैं ।
  2. ईजीएफआर पीडीबी संरचनाओं 1M14 26 (2.6 Å) और3W2S 27 (1.9 Å) से इन खंडों को लेकर2जीजी2 के लापता संरचनात्मक तत्वों का निर्माण करें। ऐसा करने के लिए, 1M14 और 3W2S खोलें और उन्हें 2GS2 पर अधिरोपित करें टूल्स → स्ट्रक्चर तुलना मेनू में मैचमेकर विकल्प का उपयोग करके।
    1. 1M14 और 3W2S से जोड़े जाने वाले खंडों को क्रॉप करें। 2GS2 में अंतराल से पहले अवशेषों के टर्मिनल परमाणुओं का चयन करें और 1M14 और 3W2S से जोड़े जाने वाले परमाणुओं (जोड़े गए खंडों के बारे में विस्तृत जानकारी के लिए, तालिका 1देखें)। कमांड लाइन टाइप बॉन्ड सेल और हिट एंटरपर । यह संरचना टेम्पलेट संरचना है।
  3. ईजीएफआर किनेज़ डोमेन के एईएलईएलईए विलोपन उत्परिवर्ती रूप का निर्माण करने के लिए चरण 1.2 से टेम्पलेट संरचना का उपयोग करें। टेम्पलेट संरचना के अनुक्रम को सहेजकर ज़ेलेयरिया ईजीएफआर के फास्टा प्रारूप अनुक्रम का उत्पादन करें(पसंदीदा → अनुक्रम → फ़ाइल → सहेजें)और फिर अवशेष संख्या 746-750 पर ELREA अनुक्रम को हटाना।
    1. कल्पना में ΤELREA EGFR अनुक्रम खोलें और अनुक्रम मेनू का उपयोग करके 2GS2 टेम्पलेट संरचना के अनुक्रम के साथ संरेखित करें। संरेखण खिड़की में मॉडलर (होमोलॉजी)28 विकल्प → संरचना का चयन करें।
    2. पॉप-अप विंडो पर 2GS2 समग्र संरचना को टेम्पलेट और उत्परिवर्ती अनुक्रम के रूप में निर्दिष्ट किया गया है ताकि क्वेरी को मॉडल किया जा सके। फिर ठीक दबाए। zDOPE स्कोर (आमतौर पर सबसे कम स्कोर) और दृश्य निरीक्षण के आधार पर परिणामी मॉडल के बीच एक उत्परिवर्ती मॉडल का चयन करें।
  4. एटीपी-बाउंड वाइल्ड-टाइप ईजीएफआर किनेज़ संरचना तैयार करने के लिए, प्रमुख संरचना के रूप में पीडीबी संरचना2ITX 29 (2.98 Å) का उपयोग करें। 1.2 चरण में प्रक्रिया के बाद संरचनाओं 2GS625 (2.6 Å) और 3W2S का उपयोग करके लापता खंडों का निर्माण करें (तालिका1 देखें। एक पाठ संपादक में पीडीबी फ़ाइल खोलकर और एएनपी के N3B नाइट्रोजन परमाणु को ऑक्सीजन परमाणु में बदलकर परिणामी संरचना में लिगांड एएनपी को परिवर्तित करें।
  5. चरण 1.1 में कहा गया है कि कल्पना में चरण 1.4 में संरचना खोलें। एमजी 2 + आयन के लिए एक समान स्थिति प्राप्त करने के लिए पीडीबी संरचना2ITN 29 (2.47 Å) से इस संरचना में मैग्नीशियम आयन जोड़ें।2+
  6. चरण 1.5 के परिणामस्वरूप संरचना के साथ, चरण 1.3 के बाद 1ELREA उत्परिवर्ती रूप को मॉडल करें।
एपीओ एक्टिव ईजीएफआर एपीओ निष्क्रिय ईजीएफआर एटीपी-बाउंड एक्टिव ईजीएफआर
प्रमुख संरचना 2जी2 2जी7 2ITX
लापता छोरों का निर्माण करने के लिए उपयोग की जाने वाले संरचनाएं 1M14 (723-725) 3W2S (958-984) 2जी6 (862-865)
3W2S (967-981) 4HJO (848-850) 3W2S (990-1001)

तालिका 1: एपीओ सक्रिय, एपीओ निष्क्रिय और एटीपी-बाउंड सक्रिय संरचनाओं के समग्र मॉडल बनाने के लिए उपयोग की जाने वाली संरचनाएं। प्रमुख संरचना में लापता क्षेत्रों (कोष्ठक में अमीनो एसिड रेंज) सूचीबद्ध संरचनाओं से बनाए गए थे।

  1. जंगली प्रकार के एपीओ निष्क्रिय ईजीएफआर किनेज़ संरचना को तैयार करने के लिए, पीडीबी संरचना 2जीएस 725 (2.6 Å) को चरण 1.1 के रूप में खोलें और बंधे लिगांड और क्रिस्टलीय पानी को हटा दें। चरण 1.2में प्रक्रिया का उपयोग करके संरचनाओं 3W2S और 4HJO30 (2.75 Å) से 2जीएस 7 (तालिका 1 देखें) में लापता खंडों को जोड़ें। अंतिम निष्क्रिय ईजीएफआर संरचना के आधार पर, चरण 1.3 में प्रक्रिया का उपयोग करके उत्परिवर्ती मॉडल तैयार करें।
    नोट: A702V उत्परिवर्तन अध्ययन के लिए, ईजीएफआर असममित डाइमर संरचना का अध्ययन किया जाता है क्योंकि उत्परिवर्तन का अध्ययन काइनेज डोमेन के मुक़ाबले बी सेगमेंट में स्थित है जो डिमर इंटरफेस का एक बड़ा हिस्सा बनाता है। जंगली प्रकार और A702V उत्परिवर्ती EGFR संरचनाओं के रूप में इस प्रकार तैयार कर रहे हैं:
  2. जंगली प्रकार असममित डिमर संरचना का निर्माण पीडीबी संरचना 2GS2 से किया जाता है, जो शुरू में मोनोमेरिक रूप में प्रदर्शित होता है। जैविक असेंबली में परिवर्तित करने के लिए जिसमें असममित व्यवस्था में एक्टिवेटर और रिसीवर किनासे शामिल हैं, कल्पना में (1.1) के रूप में 2GS2 खोलें और यूनिट सेल मेनू → उच्च-क्रम संरचना → उपकरणों पर क्लिक करके समरूपता गणना करें। 2जी2 संरचना का चयन करें और प्रतियां बनाओदर्ज करें । अंत में, समरूपता संचालन के परिणामस्वरूप डिमर की कई प्रतियों से एक असममित डिमर का चयन करें और बचाएं।
  3. चरण 1.8 से जंगली प्रकार असममित ईजीएफआर संरचना का उपयोग करके, कल्पना में रोटमर्स विकल्प के → टूल्स → स्ट्रक्चर एडिटिंग का उपयोग करके एलेनिन 702 की जगह एलिन 702वी उत्परिवर्ती का निर्माण करें।
    नोट: सामूहिक रूप से, छह मोनोमेरिक और दो डिमेरिक ईजीएफआर संरचनाएं क्रमशः ΤELREA और A702V उत्परिवर्तन अध्ययन के लिए तैयार की जाती हैं। प्रत्येक संरचना को बाद में उस्ताद कार्यक्रम31 में प्रोटीन तैयारी जादूगर का उपयोग करके सिमुलेशन के लिए संसाधित किया जाता है और एमडी सिमुलेशन एंबर कार्यक्रम32के साथ किया जाता है।
  4. फ़ाइल → आयात संरचना विकल्प का उपयोग करके उस्ताद में संरचना खोलें। फिर प्रोटीन तैयारी जादूगर बटन पर क्लिक करें और निम्नलिखित का चयन करें: हाइड्रोजन परमाणुओं को जोड़ें, लापता साइड-चेन परमाणुओं का निर्माण करें, प्रोपका का उपयोग करके पीएच 7.0 पर आयनइज़ करने योग्य अवशेषों के प्रोटोनेशन राज्यों का निर्धारण करें, हाइड्रोजन बॉन्डिंग के लिए शतावरी, ग्लूटामाइन और हिस्टीडीन अवशेषों के अभिविन्यास को अनुकूलित करें, और अंत में संरचना को कम करें।

2. सिस्टम सेटअप

  1. एंबर सॉफ्टवेयर पैकेज में शामिल लीप प्रोग्राम खोलें। ff14SB बल क्षेत्र३३ (source leaprc.protein.ff14SB)और TIP3P पानी अणुओं३४ (source leaprc.water.tip3p)आयात । एटीपी-बाउंड सिस्टम के लिए एटीपी35 (लोडम्बरपराम्स frcmod.फॉस्फेट, लोडम्बरप्रेप एटीपी.प्रेप) केलिए पैरामीटर भी आयात करते हैं। फिर, संरचना(mol = loadpdb संरचना.pdb)लोड करें।
  2. स्पष्ट TIP3P पानी के अणुओं के साथ एक ऑक्टाहेड्रल बॉक्स में संरचना को हल करें जो प्रोटीन के सतह परमाणुओं(सोलवेटमोक्ट मोल टिप3पीबॉक्स 10.0)से सभी दिशाओं में 10 Å का विस्तार करता है।
  3. निर्मित प्रणाली(मोल की जांचकरें) और आवश्यक आयनों(ऐडशंस मोल ना + 0)जोड़कर इसे बेअसर करें। बायोमॉलिक्यूलर सिस्टम को पर्याप्त रूप से मॉडल करने के लिए, सिस्टम नमक एकाग्रता को 0.15 मीटर(ऐडशंस मोल ना + एक्स, ऐडशंस मोल सीएल-एक्स)में लाने के लिए सिमुलेशन बॉक्स में अतिरिक्त एनए+/ सीएल- परमाणुओं को जोड़ें, जहां एक्स का परिणाम है: वांछित नमक एकाग्रता * पानी के अणुओं की संख्या * पानी के अणुओं की मात्रा * Agadro की संख्या।
  4. टोपोलॉजी उत्पन्न करें और सिस्टम की फाइलों को समन्वित करें, जो बाद के उत्पादन सिमुलेशन(सेवएम्बरपरम मोल X.prmtop X.inpcrd)के लिए इनपुट के रूप में काम करते हैं।

3. आणविक गतिशीलता सिमुलेशन

  1. एंबर का उपयोग करना, शुरू में सिमुलेशन प्रणाली को सबसे तेज वंश के 5000 चक्रों के अधीन करता है और प्रतिकूल विन्यास को दरकिनार करने के लिए ढाल ऊर्जा न्यूनतमीकरण को संयोजित करता है। कई चरणों में न्यूनतमीकरण को पूरा करें, धीरे-धीरे 25 किलो कैलोरी मोल-1 Å -2 से 0 किलो कैलोरी मोल-1 Å-2से सोल्यूट परमाणुओं पर लागू संयम को कम करें।-1
    1. न्यूनतमीकरण इनपुट फ़ाइल में, min.in,कुल न्यूनतमीकरण चक्र (मैक्ससाइक = 5000) और एनसीवाईसी के लिए मैक्ससाइक चर को समायोजित करें ताकि सबसे तेज वंश एल्गोरिदम के लिए चक्रों की संख्या को राज्य किया जा सके। संयममास्क पैरामीटर द्वारा निर्दिष्ट सोल्यूट परमाणुओं पर संयम बल लागू करने के लिए restraint_wt चर का उपयोग करें। फिर इस प्रकार कम करने के रूप में चलाते हैं:
      $AMBERHOME/बिन/सैंडर-ओ-आई min.in-ओ न्यूनतम-पी एक्स.प्रमस्टॉप-सी X.inpcrd-r min.rst-रेफरी X.inpcrd
      नोट: उपयोग की गई रणनीति और वास्तविक पैरामीटर किसी की अपनी प्राथमिकताओं के अनुसार भिन्न हो सकते हैं। विवरण और मार्गदर्शन एंबर मैनुअल और वेबसाइट(https://ambermd.org/index.php)से पाया जा सकता है
  2. 0 K से 300 K तक 100 पीएस के लिए सिस्टम को गर्म करें जो सोल्यूट परमाणुओं पर 10 किलो कैलोरी मोल-1 Å -2 संयम स्थापित करता है। ऐसा करने के लिए, टेम्पी सेट = 0.0, temp0 = 300.0, dt = 0.002 पीएस, nstlim = 50000 और restraint_wt = 10 heat.in इनपुट फ़ाइल में। निम्नलिखित आदेश के साथ हीटिंग को पूरा करें:
    $AMBERHOME/बिन/सैंडर-ओ-आई heat.in-ओ हीट.आउट-पी एक्स.प्रमस्टॉप-सी न्यूनतम rst-r heat.rst-x heat.mdcrd-ref min.rst
  3. एक एनपीटी पहनावा के तहत ९०० पीएस के लिए प्रणाली को बराबर करना; परमाणुओं की निरंतर संख्या, तापमान(temp0 = 300.0)और दबाव(ntp = 1),यह Berendsen विधि(ntt = 1)के साथ नियंत्रित । लंबी दूरी के इलेक्ट्रोस्टैटिक इंटरैक्शन के लिए 9 Å दूरी कटऑफ(कट = 9.0)सेट करें। धीरे-धीरे सोल्यूट एटम संयम को 0.1 किलो कैलोरी मोल-1 Å-2 (restraint_wt = 0.1)तक कम करें। समतुल्य इनपुट फ़ाइल equil.in चलाएं जो उपरोक्त मापदंडों का वर्णन इस प्रकार है:
    $AMBERHOME/बिन/सैंडर-ओ-आई equil.in-ओ equil.out-p X.prmtop-c heat.rst-r equil.rst-x equil.mdcrd-रेफरी हीट.rst
  4. एक अनर्गल 5 एनएस सिमुलेशन के साथ संतुलन को अंतिम रूप (सेट डीटी = 0.002 पीएस, ntslim = 2500000)।
    $AMBERHOME/बिन/सैंडर-ओ-आई equil_final.in-o equil_final.out-p X.prmtop-c equil.rst-r equil_final.rst-x equil_final.mdcrd-ref equil.rst
  5. जांच करें कि तापमान, दबाव, घनत्व और ऊर्जा मूल्यों की जांच करके सिस्टम को बराबर कर दिया गया है।
    $AMBERHOME/बिन/process_mdout.perl heat.out equil.out equil_final.out
    xmgrace सारांश। TEMP/घनत्व/ईटीओटी/EPTOT/EKTOT
  6. 100 एनएस के लिए उत्पादन सिमुलेशन को पूरा करें (सेट डीटी = 0.002 पीएस, एनटीस्लिम = 5000000 prod.inमें) और हर 10 पीएस(एनटीडब्ल्यूएक्स = 5000)संरचनाओं को बचाएं।
    $AMBERHOME/बिन/सैंडर-ओ-आई prod.in-ओ prod.out-p X.prmtop-c equil_final.rst-r prod.rst-x prod.mdrcd-रेफरी equil_final.rst

4. विश्लेषण

  1. दृश्य निरीक्षण
    1. X.prmtop एम्बर टोपोलॉजी फ़ाइलों और वीएमडी36में इसी prod.mdcrd प्रक्षेपवक्र फ़ाइलों को खोलकर जंगली प्रकार और उत्परिवर्ती ईजीएफआर किनेज़ सिमुलेशन के दौरान नमूना किए गए संरचनाओं की कल्पना करें। सुविधाजनक माध्यमिक संरचना अभ्यावेदन का उपयोग करना, रिकॉर्ड किए गए प्रक्षेपवक्र से प्रोटीन की समग्र संरचनात्मक गतिशीलता का विश्लेषण करें। परमाणुओं/ब्याज के अवशेषों के बीच विशिष्ट बातचीत देखें, जैसे उत्प्रेरक आवश्यक K745-E762 नमक पुल ।
    2. वैकल्पिक रूप से, पीडीबी प्रारूप में सिमुलेशन के दौरान नमूना कई संरचनाओं को बचाएं और उन्हें कल्पना कार्यक्रम का उपयोग करके खोलें। मैचमेकर विकल्प का उपयोग करके प्रारंभिक या औसत संरचना पर संरचनाओं को अधिरोपित करें। फीका सफेद में ठोस और गठबंधन संरचनाओं के बाकी में प्रारंभिक/औसत संरचना प्रदर्शित करें । यह दृष्टिकोण किसी को अधिक स्पष्टता के साथ रिकॉर्ड किए गए संरचनात्मक आंदोलनों की कल्पना करने की अनुमति देता है।
      नोट: प्रभावी अभ्यावेदन और एमडीएस से अनुरूप कलाकारों की टुकड़ी के प्रसंस्करण के लिए सुझाव मेल्विन एट अल३७में पाया जा सकता है ।
  2. आरएमएसडी और आरएमएसएफ विश्लेषण
    1. प्रोटीन की वैश्विक स्थिरता का विश्लेषण करने और विभिन्न संरचनात्मक इकाइयों के लचीलेपन की जांच करने के लिए सीपीप्ट्राज कार्यक्रम38 के साथ रूट-मीन स्क्वायर विचलन (आरएमएसडी) और रूट-मीन स्क्वायर उतार-चढ़ाव (आरएमएसएफ) गणनाओं की गणना करें। rmsd.in और rmsf.in इनपुट फाइलों में, आरएमएस फिटिंग के संदर्भ के रूप में प्रारंभिक संरचना के रीढ़ के परमाणुओं (आरएमएसडी के लिए) और सीα परमाणुओं (आरएमएसएफ के लिए) को इंगित करें। rmsd/rmsf.in फाइलों में एम्बर टोपोलॉजी फाइल्स(parm X.promtop)और इसी प्रक्षेपवक्र फाइलों(trajin prod.mdcrd)आयात करते हैं । इसके बाद कमांड सीपीप्टराज-i rmsd/rmsf.inचलाएं । विश्लेषण के लिए आउटपुट डेटा को प्लॉट करें।
    2. वैकल्पिक रूप से, संरचना कलाकारों की टुकड़ी को संरेखित करें और सीα एटम आरएमएसडी के आधार पर प्रत्येक अवशेष को रंग दें। ऐसा करने के लिए, कल्पना में संरचनाएं खोलें और उन्हें मैचमेकर विकल्प के साथ संरेखित करें।
      1. विशेषता द्वारा प्रस्तुत करने → चित्रण → उपकरण परजाएं । गुण और क्लिक करें ठीकके रूप में अनुरूप पहनावा और Cα RMSD के अवशेषों का चयन करें । इसके बाद संरचनाओं का चेन ट्रेस नीले → सफेद → लाल रंग से रंगा जाएगा, जो क्रमशः उच्च, मध्यम और निम्न संरचनात्मक स्थिरता के क्षेत्रों को दर्शाती है ।
  3. हाइड्रोजन बॉन्ड विश्लेषण
    1. एटीपी और वाइल्ड-टाइप/ΤELREA EGFRs के बीच हाइड्रोजन बॉन्ड इंटरैक्शन का विश्लेषण करें । इस कार्य को अंजाम देने के लिए सीपीटीराज स्क्रिप्ट तैयार करें, hbond.in। 3.5 Å से कम या बराबर की दाता-स्वीकारकर्ता दूरी के साथ हाइड्रोजन बांड को परिभाषित करें और 135 डिग्री से अधिक या बराबर का एक बांड कोण। एटीपी और ईजीएफआर(एचबीओएंड ऑल नोइंट्रामोल डिस्ट 3.5 आउट एनएचबी.एग्राउट एवगबी.डैट)के बीच नोइंट्रामोल वेरिएबल यानी हाइड्रोजन बांड के साथ केवल इंटरमोल्यूलर हाइड्रोजन बांड के लिए विश्लेषण निर्दिष्ट करें। सीपीटीराज के रूप में स्क्रिप्ट चलाते हैं -मैं hbond.in।
    2. उदाहरण के लिए अवशेष K745 और E762 के बीच इंट्रामोल्यूलर इंटरैक्शन का आकलन करने के लिए इस स्क्रिप्ट का उपयोग करें, जो ईजीएफआर किनेज़ गतिविधि के लिए प्रमुख अवशेष हैं। ऐसा करने के लिए, K745 को हाइड्रोजन बॉन्ड डोनर और E762 को hbond.in हाइड्रोजन बॉन्ड स्वीकारकर्ता के रूप में निर्दिष्ट करें और तदनुसार स्क्रिप्ट चलाएं।
  4. परमाणुओं के बीच की दूरी की निगरानी
    1. वीएमडीमें जंगली प्रकार और ΤELREA एपीओ ईजीएफआर के प्रक्षेप पथ को खोलकर K745 और E762 के बीच की दूरी को मापें। माउस → लेबल → बॉन्ड पर क्लिक करके ग्लू762 और Lys745 के Nz के C <3>s काचयन करें । ग्राफिक्स → लेबल केसाथ ग्राफ की साजिश रचकर सिमुलेशन के दौरान दूरी → बॉन्ड → ग्राफ की निगरानी करें।
  5. मुफ्त ऊर्जा गणना
    1. एटीपी और जंगली प्रकार/ΤELREA EGFRs के बीच अनुमानित बाध्यकारी मुक्त ऊर्जा की गणना करने के लिए, और जंगली प्रकार के एक्टिवेटर और रिसीवर किनासेस/A702V EGFRs के बीच, एम्बर पैकेज में उपलब्ध आणविक यांत्रिकी सामान्यीकृत जन्म सतह क्षेत्र (एमएम-जीबीएसए) मॉड्यूल39 का उपयोग करें। एईएलईए अध्ययन में रिसेप्टर के रूप में लिगांड और ईजीएफआर के रूप में एटीपी सेट करें। A702V अध्ययन में, रिसीवर किनेज़ को लिगांड और रिसेप्टर के रूप में एक्टिवेटर किनेज़ के रूप में निर्दिष्ट करें।
    2. सबसे पहले लीप प्रोग्राम में लिगांड, रिसेप्टर और लिगांड-रिसेप्टर कॉम्प्लेक्स पीडीबी फाइल्स को अलग से तैयार करें, जो पीबीआरएडीआई वैल्यू को mbondi2में सेट करते हैं । पीडीबी फाइलों के लिए, गैस चरण एम्बर टोपोलॉजी (.prmtop) और समन्वय (.inpcrd) फ़ाइलों को बचाएं।
    3. फिर, एमएमजीबीएसए इनपुट फ़ाइल में, mmgbsa.in, igb = 2, साल्टकॉन = 0.1सेट करें। सिमुलेशन के प्रक्षेप पथ, तैयार रिसेप्टर/लिगांड एम्बर फाइलों और mmgbsa.in में मापदंडों का उपयोग करके बाध्यकारी ऊर्जा गणनाओं को निष्पादित करें, जो अंबर में उपलब्ध MMPBSA.py स्क्रिप्ट के साथ इस प्रकार हैं:
      $AMBERHOME/bin/MMPBSA.py-O-i mmgbsa.in-o mmgbsa.dat-sp X.prmtop-cp complex.prmtop-rp रिसेप्टर.prmtop-lp ligand.prmtop-y prod.mdcrd-eo output.csv
    4. रेखांकन की साजिश रचकर आउटपुट डेटा, आउटपुट.सीएसवीका विश्लेषण करें।

Representative Results

वर्णित प्रोटोकॉल का उपयोग ईजीएफआर किनेज़ संरचना पर एईएलईए और ए 702वी म्यूटेशन के संरचनात्मक प्रभावों का अध्ययन करने के लिए किया गया था। प्रोटोकॉल का एक आवेदन एमडी सिमुलेशन से आरएमएसडी और आरएमएसएफ मूल्यों की गणना करके स्थानीय संरचनात्मक/संरचनात्मक स्थिरता पर म्यूटेशन के प्रभाव की जांच करना था । चूंकि A702V उत्परिवर्तन मुक्सामेम्ब्रान बी सेगमेंट में स्थित है, इसलिए शुरुआती संरचना के सापेक्ष रिसीवर किनेज़ के इस सेगमेंट के आरएमएसडी की गणना जंगली प्रकार और A702V ईजीएफआर दोनों के लिए की गई थी। परिणाम(चित्रा 4ए)से पता चला है कि उत्परिवर्ती के juxtramembrane बी खंड १०० एनएस सिमुलेशन के दौरान अनुरूप स्थिरता में वृद्धि हुई है (औसत RMSD ०.७ Å-9 जंगली प्रकार के ईजीएफआर किनेज़ डोमेन (औसत आरएमएसडी 1.1 Å - 95% सीआई 0.01) की तुलना में 5% आत्मविश्वास अंतराल (सीआई) 0.009) । यह बहुत संभावना है कि एलैनिन 702 (मिथाइल ग्रुप साइड चेन) के प्रतिस्थापन के कारण डाइमर इंटरफेस पर सख्त हाइड्रोफोबिक इंटरैक्शन का परिणाम है, जो एक भारी हाइड्रोफोबिक अवशेषों, वैलिन (आइसोप्रोपिल ग्रुप साइड चेन) के लिए है, जिससे एक्टिवेटर किनेज़ डोमेन के आइसोलेयूसिन 941 के साथ रिसीवर किनेज़ डोमेन पर V702 की हाइड्रोफोबिक इंटरैक्शन में वृद्धि हुई है।

ΤELREA उत्परिवर्तन 13-αC लूप पर स्थित है, जो कार्यात्मक रूप से महत्वपूर्ण αC हेलिक्स के निकट है; αC हेलिक्स की संरचना ईजीएफआर किनेज़ के सक्रिय और निष्क्रिय राज्यों के बीच बदलाव के लिए महत्वपूर्ण है। सक्रिय राज्य में αC हेलिक्स की अनुरूप स्थिरता एमडी सिमुलेशन(चित्रा 4बी):कुल मिलाकर, के दौरान हेलिक्स के भीतर अवशेषों के Cα परमाणुओं पर आरएमएसएफ की जांच करके मूल्यांकन किया गया था जंगली प्रकार (औसत आरएमएसएफ 1.5 Å - 95% सीआई 0.4) की तुलना में उत्परिवर्ती (औसत आरएमएसएफ 1.5 Å - 95% सीआई 0.57) में कम उतार-चढ़ाव हैं; एन-टर्मिनल अवशेषों के लिए दर्ज उतार-चढ़ाव में सबसे अधिक अंतर के साथ। जंगली प्रकार के किनेज़ डोमेन और एलईएलआरईए किनेज़ डोमेन की औसत संरचना पर क्रमशः नमूना संरचनाएं भी इन परिणामों का समर्थन करती हैं(चित्र 4सी):जंगली-प्रकार और एएलईए किनेज़ डोमेन दोनों में 3-αC लूप और αC ह्लिक्स के अलावा सुपरपोस संरचनाओं के लिए समग्र समान स्थिरता है जो स्पष्ट रूप से 1ELREA EGFR में अधिक स्थिर हैं। इन निष्कर्षों से संकेत मिलता है कि ELREA अनुक्रम को हटाने से सक्रिय राज्य αC हेलिक्स के आंदोलन को नियंत्रित करता है, इसलिए निरोधक और इस तरह सक्रिय संरचना को स्थिर करता है। इसके अलावा, चूंकि αC हेलिक्स असममित डिमर इंटरफ़ेस का हिस्सा है, इसलिए उत्परिवर्ती में αC हेलिक्स पर संयम बहुत अधिक असममित डाइमर को स्थिर करेगा, सक्रिय राज्य की अवधि को लंबा करेगा।

प्रोटोकॉल का एक और आवेदन सिमुलेशन के दौरान होने वाली प्रमुख अंतर-और अंतरमॉलिकीय इंटरैक्शन के व्यवहार की जांच करना है। इस प्रकार, K745 और E762 के बीच बातचीत, जो ईजीएफआर एंजाइमेटिक गतिविधि के लिए मौलिक है, एमडी सिमुलेशन(चित्रा 5ए)के दौरान दो अवशेषों के साइड-चेन ध्रुवीय परमाणुओं के बीच गठित हाइड्रोजन बांड के प्रतिशत अधिभोग को मापने के द्वारा सक्रिय रूप जंगली-प्रकार और ΤELREA EGFR kinase दोनों के लिए विश्लेषण किया गया था: यह प्रमुख इलेक्ट्रोस्टैटिक इंटरैक्शन अधिक बार जंगली प्रकार के परिजनेज डोमेन की तुलना में एकेएलआरईए काइनेज डोमेन में बनाया गया था, जो कि E762 को समायोजित करता है। सिमुलेशन केदौरानएमजी 2 + - एटीपी और वाइल्ड-टाइप और एएलईएलआरईए ईजीएफआर किनेज़ डोमेन(चित्रा 5बी)के बीच बातचीत का भी आकलन किया गया(चित्रा 5सी):हाइड्रोजन बांड की संख्या अधिक थी ΤELREA (औसत मूल्य 4.0 - 95% सीआई 0.03) की तुलना में जंगली प्रकार के ईजीएफआर (औसत मूल्य 3.2 - 95% सीआई 0.04) के लिए। हाइड्रोजन बांड के आगे विश्लेषण से पता चला है कि K745 ΤELREA EGFR में एटीपी के फॉस्फेट समूहों के साथ अधिक बार बातचीत करता है, जो अधिक स्थिर K745-E762 बातचीत से जुड़ा हुआ है जो ELREA उत्परिवर्ती EGFR kinase डोमेन के अनुकरण में उल्लेख किया गया है।

प्रोटोकॉल में वर्णित एमडी सिमुलेशन प्रोटीन-प्रोटीन और प्रोटीन-लिगांड इंटरैक्शन के लिए बाध्यकारी की सापेक्ष मुक्त ऊर्जा का आकलन करने में भी उपयोगी हैं। जंगली प्रकार और A702V EGFRs के एक्टिवेटर और रिसीवर किनेज डोमेन के बीच बाध्यकारी ऊर्जा, और एटीपी और जंगली प्रकार और ΤELREA उत्परिवर्ती EGFR kinase डोमेन के बीच, आणविक यांत्रिकी सामान्यीकृत जन्म सतह क्षेत्र (MMGBSA) गणना(चित्रा 6ए):A702V उत्परिवर्ती से गणना की गई एक कम औसत ΤGबांध मूल्य का उत्पादन (औसत ΤGबांध =-76 किलो कैलोरी/ 5% CI 0.47), जंगली प्रकार के ईजीएफआर डोमेन के विपरीत अधिक अनुकूल डिमर इंटरैक्शन का प्रतिनिधित्व करते हुए (औसत ا اا बांध = -61 किलो कैलोरी/ यह अवलोकन A702V ईजीएफआर किनेज़ डोमेन के लिए देखी गई हाइड्रोफोबिक इंटरैक्शन में वृद्धि के कारण अधिक स्थिर मुक़ाबले बी सेगमेंट और सख्त डिमर इंटरफेस के अनुरूप है। जंगली प्रकार और ΤELREA EGFR kinase डोमेन(चित्रा 6बी)के लिए बाध्यकारी एटीपी के मामले में, MMGBSA गणना एंटेल्रिया उत्परिवर्ती (औसत 1जी बांध-1 के साथ मजबूत एटीपीबाध्यकारी भविष्यवाणी 57 किलो कैलोरी/मोल - 95% सीआई 0.43) जंगली प्रकार के ईजीएफआर (औसत 10जीबांध -48 किलो कैलोरी/मोल - 95% सीआई 0.33) की तुलना में। यह परिणाम जंगली प्रकार के डोमेन की तुलना में एटीपी और एटेल्रिया ईजीएफआर(चित्रा 5सी)के बीच दर्ज हाइड्रोजन बांड की अधिक संख्या के अनुरूप है।

सिमुलेशन के दौरान देखे गए अनुरूप परिवर्तनों की जांच करने के लिए प्रोटोकॉल को भी नियोजित किया जा सकता है। वर्तमान अध्ययन में, निष्क्रिय ईजीएफआर संरचना पर एज़ेल्रिया उत्परिवर्तन के प्रभावों का अध्ययन सिमुलेशन से नमूना संरचना के दृश्य निरीक्षण और सुपरपोजिशन द्वारा किया गया था। विश्लेषण ने सक्रिय राज्य में संक्रमण के दौरान अपेक्षित संरचनात्मक परिवर्तन के साथ,एएलईए ईजीएफआर किनेज़ डोमेन(चित्रा 7ए)में αC हेलिक्स की आवक आंदोलन का पर्दाफाश किया। इसके विपरीत, जंगली प्रकार के निष्क्रिय ईजीएफआर के αC हेलिक्स ने अपनी प्रारंभिक संरचना(चित्र 7बी)को बनाए रखा। इस प्रकार, एमडी सिमुलेशन इस प्रस्ताव का समर्थन करते हैं कि किनेज़ गतिविधि40, 41,41को बढ़ाने के लिए प्रायोगिक रूप से दिखाए गए विलोपन उत्परिवर्तन, सक्रिय राज्य की ओर निष्क्रिय काइनेज से एक अनुरूप बदलाव को बढ़ावा देता है।

Figure 4
चित्रा 4: एमडी सिमुलेशन के दौरान सक्रिय ईजीएफआर किनेज़ डोमेन की जंगली-प्रकार और उत्परिवर्ती अनुरूप स्थिरता। (A)आरएमएसडी (रीढ़ परमाणुओं) जंगली प्रकार (नीला) और A702V (लाल) रिसीवर kinase डोमेन के मुक़ाबले बी खंड पर । (ख)आरएमएसएफ (Cα परमाणुओं) αC हेलिक्स के अवशेषों पर: जंगली प्रकार (नीला) और ΤELREA (सोना) । (ग)जंगली प्रकार (बाएं) और ΤELREA (दाएं) EGFR kinase डोमेन के नमूना अनुरूपता नमूना; औसत संरचना के संबंध में प्रत्येक अवशेषों के आरएमएसडी (Cα परमाणुओं) के आधार पर रंगीन श्रृंखला निशान। रंग नीले से सफेद से लाल रंग तक होता है, जो उच्च से कम अनुरूप स्थिरता के क्षेत्रों का प्रतिनिधित्व करता है। ध्यान दें कि अलग-अलग काइनेज डोमेन के "मुक्त" एन-टर्मिनल क्षेत्र, रंगीन लाल, अक्षुण्ण ईजीएफआर संरचना में गतिशीलता के इस स्तर को प्रदर्शित नहीं करेंगे। चकरोबोर्टी एट अल9 से अनुकूलित आंकड़े (चित्र 4ए को जर्नल ऑफ बायोलॉजिकल केमिस्ट्री कीअनुमति से पुन: उत्पन्न किया गया है) और तामीरात एट अल12। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्रा 5: एमडी सिमुलेशन के दौरान सक्रिय रिसीवर किनेज़ में देखी गई मुख्य विशेषताएं: K745-E762 नमक पुल, αC हेलिक्स और एटीपी के साथ बातचीत। (A)वाइल्ड-टाइप (ब्लू) और एएलईआरईए (गोल्ड) ईजीएफआर किनेज डोमेन के सिमुलेशन के दौरान K745-E762 इंटरैक्शन का प्रतिशत अधिभोग। (ख)जंगली प्रकार के अवशेष और एटीपी (लाठी) के साथ बातचीत करने वाले म्यूटेंट। एमजी2 + (हरा) एटीपी और D855 के साथ निर्देशांक करता है। (ग)एमडी सिमुलेशन के दौरान वाइल्ड-टाइप और एएलईएलईए ईजीएफआर किनेज डोमेन दोनों के साथ एटीपी द्वारा बनाए गए हाइड्रोजन बांडों की संख्या । तामिरत एट अल12से चित्रा । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 6
चित्र 6: सिमुलेशन के दौरान उत्परिवर्ती किनेज़ डोमेन के लिए बाध्यकारी की कम सापेक्ष मुक्त ऊर्जा देखी जाती है। (A)वाइल्ड-टाइप (ब्लू) और A702V (लाल) ईजीएफआर के एक्टिवेटर और रिसीवर किनेज डोमेन के बीच बातचीत के लिए गणना की गई बाध्यकारी ऊर्जा। (ख)एएमपी के बीजीबांधने से वाइल्ड-टाइप (ब्लू) और एएलईआरईए (गोल्ड) ईजीएफआर किनेज डोमेन । चकरोबोर्टी एट अलसे अनुकूलित आंकड़े (चित्र 6ए को जर्नल ऑफ बायोलॉजिकल केमिस्ट्री कीअनुमति से पुन: उत्पन्न किया गया है) और तामीरात एट अल12। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 7
चित्रा 7: जंगली प्रकार और 1ELREA निष्क्रिय EGFR kinase डोमेन से स्थानबद्ध संरचनाएं। αC हेलिक्स और ए-लूप हेलिक्स(ए)वाइल्ड-टाइप (नीले रंग में औसत संरचना) और(बी)ΤELREA EGFRs (सोने) की संरचना। अन्य नमूना संरचनाएं, फीका सफेद; एमडी सिमुलेशन, गुलाबी से पहले प्रारंभिक संरचनाएं। तामिरत एट अल12से चित्रा । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Discussion

इस अध्ययन में वर्णित प्रोटोकॉल स्थानीय और वैश्विक संरचनात्मक परिवर्तनों की जांच करने के लिए आणविक गतिशीलता सिमुलेशन का उपयोग करने पर केंद्रित है जो ईजीएफआर किनेज़ डोमेन के दैहिक उत्परिवर्तन को सक्रिय करने से उत्पन्न होता है। यद्यपि जंगली-प्रकार और उत्परिवर्ती ईजीएफआर की एक्स-रे क्रिस्टल संरचनाएं अमूल्य संरचनात्मक अंतर्दृष्टि प्रदान करती हैं, वे एक या कुछ स्थिर अभ्यावेदनों को चित्रित करती हैं। हालांकि, एर्ब्स के जैविक कार्य में निहित एंजाइमेटिक रूप से निष्क्रिय और सक्रिय टायरोसिन किनेज़ के बीच आवश्यक संक्रमण है, जो किनेज़ मोनोमर के बीच संरचना और इंट्रामोल्यूलर इंटरैक्शन दोनों में गतिशील परिवर्तन लागू करता है। इस प्रकार एमडी सिमुलेशन को ईजीएफआर टायरोसाइन किनेज़ डोमेन की गतिशील प्रकृति की जांच करने के लिए किया गया था, जिसमें जंगली प्रकार की संरचना, पेश किए गए एएलएलआरईए विलोपन उत्परिवर्तन और A702V उत्परिवर्तन शामिल थे। ये सिमुलेशन संरचनाओं में इन उत्परिवर्तनों की संभावित भूमिका को स्पष्ट करने में सफल रहे और कैसे टायरोसिन किनेज़ डोमेन के अनुरूप होने पर उनके प्रभाव से ईजीएफआर किनेज़ गतिविधि में प्रयोगात्मक रूप से देखी गई वृद्धि होगी।

इस प्रोटोकॉल में एक महत्वपूर्ण कदम उत्परिवर्तन के प्रभाव का आकलन करने के लिए एक प्रासंगिक संरचना का उपयोग है । एक प्रासंगिक सिमुलेशन इनपुट संरचना का चयन करने का एक तरीका स्थिर 3 डी संरचना में उत्परिवर्तन के स्थान की कल्पना करना और पड़ोसी अमीनो एसिड और संरचनात्मक इकाइयों के संबंध में इसके संभावित प्रभाव की जांच करना है। उदाहरण के लिए, इस अध्ययन में, चूंकि A702V ईजीएफआर उत्परिवर्तन मुक़ाबला बी सेगमेंट में स्थित है जो असममित डिमर इंटरफेस बनाता है, मोनोमर के विपरीत सिमुलेशन के लिए डाइमर संरचना का उपयोग महत्वपूर्ण है। एक मोनोमेरिक संरचना के उपयोग ने रिसीवर किनेज़ के मुक्सामेब्रैन बी सेगमेंट को सॉल्वेंट में उजागर किया होगा, इसे स्थिर बातचीत से वंचित कर दिया होगा, उत्परिवर्तन द्वारा एक बड़े हाइड्रोफोबिक अवशेषों में बढ़ाया गया और एक्टिवेटर किनेज़ के सी-लोब अवशेषों से आइसोल्यूसिन 941 के साथ बातचीत की जाएगी। इसके अलावा, यह उल्लेखनीय है कि पीडीबी फ़ाइल में निर्देशांक द्वारा प्रतिनिधित्व की गई 3 डी संरचना आवश्यक रूप से जैविक रूप से प्रासंगिक संरचना के अनुरूप नहीं है जिसका उपयोग अध्ययन के लिए किया जाना चाहिए। उदाहरण के लिए, एर्बीबी4, पीडीबी कोड 3बीसीई की संरचना के साथ, पीडीबी एक ट्राइमर के अनुरूप है, लेकिन यह क्रिस्टल संपर्कों के कारण होता है (इस संरचना की कल्पना करते समय मोनोमर के बीच कुछ संपर्क देखे जाते हैं)। पीडीबी फ़ाइल के भीतर मैट्रिस का उपयोग क्रिस्टलीय रूप से संबंधित संरचनाओं के पुनर्निर्माण के लिए (उदाहरण के लिए, कल्पना की जा सकती है, जिसे मूल प्रकाशन42में रिपोर्ट के अनुसार जैविक रूप से प्रासंगिक 3 डी संरचना के अनुरूप श्रृंखलाओं की पहचान करने के लिए कल्पना की जा सकती है। प्रोटोकॉल का एक और आवश्यक कदम सिमुलेशन इनपुट संरचना को ठीक से तैयार करना है, जैसे कि विभिन्न लूप क्षेत्रों में लापता अमीनो एसिड का निर्माण, और विशेष रूप से जहां उत्परिवर्तन के आसपास स्थित है। यद्यपि पीडीबी में कई जंगली-प्रकार की ईजीएफआर संरचनाएं मौजूद हैं, लेकिन केवल सीमित संख्या में उत्परिवर्ती ईजीएफआर संरचनाएं उपलब्ध हैं। नतीजतन, उत्परिवर्ती संरचनाओं को भी मॉडलिंग करने की आवश्यकता है; A702V जैसे एकल अवशेष उत्परिवर्तन के लिए, कल्पना का उपयोग अवशेषों को म्यूटेट करने के लिए किया जाता था; जबकि, 1ELREA हटाने उत्परिवर्तन के लिए, मॉडलर का उपयोग किया गया था।

सिमुलेशन इनपुट फ़ाइलों में उपयोग किए गए विभिन्न मापदंडों - उदाहरण के लिए, न्यूनतमीकरण चक्रों की संख्या, सिस्टम को एक बार में वांछित तापमान तक गर्म करना या इसके बजाय कई मध्यवर्ती तापमान के माध्यम से धीरे-धीरे गर्म करना, संतुलन के लिए समय अवधि और उत्पादन सिमुलेशन के लिए - अध्ययन के अणु, काम के उद्देश्य और किसी की अपनी प्राथमिकताओं के आधार पर संशोधित किया जा सकता है। एमडी सिमुलेशन करते समय, इनपुट फ़ाइलों, उपयोग में सिमुलेशन सॉफ्टवेयर से संबंधित मुद्दों या यहां तक कि उपयोगकर्ता त्रुटि से उत्पन्न होने वाली त्रुटियों में आना भी आम बात है। इसलिए, किसी भी त्रुटि संदेश की सावधानीपूर्वक जांच करके त्रुटियों के स्रोत को समझना बहुत महत्वपूर्ण है। अधिकांश सिमुलेशन कार्यक्रमों में एक मेलिंग सूची होती है जहां उपयोगकर्ता सॉफ्टवेयर डेवलपर्स और अन्य उपयोगकर्ताओं के लिए प्रश्न पूछ सकते हैं जिसके द्वारा अधिकांश समस्याओं का समाधान किया जा सकता है। इसके अतिरिक्त, उपयोगकर्ता मैनुअल मान्यताओं और सीमाओं सहित सिमुलेशन प्रोटोकॉल के विवरण को समझने के लिए महत्वपूर्ण सहायता प्रदान करते हैं। यद्यपि एमडी सिमुलेशन अणुओं के गतिशील गुणों का पता लगाने के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण है, याद रखें कि कम्प्यूटेशनल परिणामों को उनकी वैधता का आकलन करने के लिए जानकारी के अन्य स्रोतों के साथ मिलकर सावधानीपूर्वक मूल्यांकन करने की आवश्यकता है। जब भी संभव हो, शोधकर्ताओं के साथ मिलकर काम करें जो अध्ययन के तहत प्रोटीन पर विशेषज्ञ हैं, खासकर जहां प्रासंगिक गीले प्रयोगशाला प्रयोगात्मक अध्ययन किए जाते हैं, जो संरचनात्मक व्याख्या के लिए परिणाम प्रदान करने के साथ-साथ उन प्रयोगों का सुझाव देने का काम करते हैं जो परिकल्पनाओं का परीक्षण करने के लिए संरचनात्मक टिप्पणियों के आधार पर किए जा सकते हैं ।

इस अध्ययन में, प्रोटोकॉल ईजीएफआर किनेज़ संरचनाओं पर एईएलईए और ए 702वी म्यूटेशन के गतिशील संरचनात्मक प्रभावों की जांच करने में प्रभावी था। सिमुलेशन से पता चला है कि ΤELREA कार्यात्मक रूप से आवश्यक αC हेलिक्स को नियंत्रित करता है और निष्क्रिय किनेज़ से एक स्थिर सक्रिय किनेज़ में एक अनुरूप बदलाव को बढ़ावा देता है। सिमुलेशन परिणाम स्वतंत्र रूप से दवा प्रतिक्रिया डेटा द्वारा समर्थित होते हैं जो फेफड़ों के कैंसर सेल लाइनों पर टायरोसिन किनेज़ अवरोधकों के प्रभावों का प्रदर्शन करते हैं, जिनमें एक्सईलरे हटाने का उत्परिवर्तन और जंगली प्रकार के ईजीएफआर होते हैं, जहां सक्रिय काइनेज संरचना को पहचानने वाली दवाओं द्वारा अधिक अवरोध की सूचना दी गईथी। A702V उत्परिवर्तन के साथ, एमडी सिमुलेशन, जंगली प्रकार की तुलना में, एक्टिवेटर-रिसीवर किनेज़ इंटरफेस के स्थिरीकरण में वृद्धि के साथ-साथ एक्टिवेटर और रिसीवर किनेज़ की उच्च आत्मीयता को एक दूसरे के लिए इंगित करता है, साथ ही ईजीएफआर किनेज़ के सक्रिय संरचना के रखरखाव का समर्थन करता है। रिसीवर किनेज़ के मुक़ाबले बी सेगमेंट पर स्थित A702V उत्परिवर्तन, सक्रिय राज्य की अवधि को लम्बा करने के लिए कार्य करते हुए एक्टिवेटर किनेज़ के साथ हाइड्रोफोबिक इंटरैक्शन में वृद्धि करेगा। A702V उत्परिवर्तन विकास कारक के अभाव में सेल अस्तित्व का समर्थन करता है और ईजीएफआर म्यूटेशन9के लिए इन विट्रो स्क्रीनिंग में पहचाना गया था।

Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

इस शोध को फिनलैंड अकादमी (308317, 320005), सिग्रिड जुसेलियस फाउंडेशन और टॉर, जो और पेंटी बोर्ग मेमोरियल फंड से एम.एस.जे. को अनुदान द्वारा वित्त पोषित किया जाता है, और फिनलैंड अकादमी (274728, 316796), फिनलैंड के कैंसर फाउंडेशन और तुर्कू विश्वविद्यालय केंद्रीय अस्पताल से केई को दिया जाता है। M.Z.T. सूचना और संरचनात्मक जीव विज्ञान के Åbo अकादमी डॉक्टरेट नेटवर्क द्वारा वित्त पोषित है। हम कंप्यूटिंग संसाधनों के लिए सीएससी आईटी सेंटर फॉर साइंस और बायोसेंटर फिनलैंड बायोइन्फॉर्मेटिक्स नेटवर्क के तहत आईटी समर्थन के लिए डॉ जुक्का लेटोनेन को धन्यवाद देते हैं; और बायोसेंटर फिनलैंड स्ट्रक्चरल बायोलॉजी इंफ्रास्ट्रक्चर नेटवर्क ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Amber software University of California, San Francisco Version 2018 Executable
Chimera program Resource for Biocomputing, Visualization, and Informatics at the University of California, San Francisco Version 1.13.1 Executable
EGFR struture files The Protein Data Bank 3D coordinates of EGFR structures
Maestro Schrödinger LLC Version 2018-3 Executable
Modeller program The Andrej Šali Lab, Departments of Biopharmaceutical Sciences and Pharmaceutical Chemistry, University of California San Francisco Included in the Chimera program
VMD software Theoretical and Computational Biophysics Group, University of Illinois at Urbana-Champaign Version 1.9.3 Executable

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Tamirat, M. Z., Kurppa, K. J.,… More

Tamirat, M. Z., Kurppa, K. J., Elenius, K., Johnson, M. S. Deciphering the Structural Effects of Activating EGFR Somatic Mutations with Molecular Dynamics Simulation. J. Vis. Exp. (159), e61125, doi:10.3791/61125 (2020).

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