Summary
このプロトコルは、脊髄損傷研究のための最小限の副次的損傷で、マウスモデルにおける安定したトランセクション型脊髄損傷の誘導のための正確なラミネクトミーを作成する方法を記述する。
Abstract
脊髄損傷(SCI)は、主に外傷の結果として、不可逆的かつ永久的な機能喪失をもたらす。SCIから生じる衰弱性障害を克服するために、細胞移植方法などのいくつかの治療オプションが研究されています。ほとんどの前臨床試験はSCIのげっ歯類モデルで行われる。SCIのラットモデルは広く使用されてきましたが、マウスモデルはラットモデルよりも大きな利点を持つことができますが、マウスモデルはあまり注目されていません。マウスの小型はラットよりも動物の維持費を下げることに相当し、多数のトランスジェニックマウスモデルの入手可能性は多くの種類の研究に有利である。動物に反復可能で正確な傷害を誘発することは、小さなげっ歯類で高精度の手術を必要とするSCI研究の主な課題です。横断型傷害モデルは、移植ベースの治療研究のために過去10年間に一般的に使用されてきた傷害モデルであったが、マウスにおける完全な横断型傷害を誘発するための標準化された方法は存在しない。我々は、胸椎レベル10(T10)でC57BL/6マウスにおける完全な横断型損傷を誘発するための外科プロトコルを開発した。この手順では、回転車の代わりに小さな先端ドリルを使用して薄層を正確に除去し、その後、丸みを帯びた切刃を持つ薄い刃を使用して脊髄切開を誘導する。この方法は、最小限の副次的な筋肉および骨損傷を伴う小さなげっ歯類における再現性のある横断型傷害を引き起こし、したがって、特に行動機能の結果が分析される交結合因子を最小限に抑える。
Introduction
脊髄損傷(SCI)は、健康と生活習慣の劇的な変化をもたらす複雑な医学的問題です。SCIの治療法はなく、SCIの病態生理学は十分に理解されていません。動物SCIモデル、特にげっ歯類モデルは、新しい治療法を試す貴重なツールを提供し、何十年もの間SCIを探求するために使用されてきました。現在までに、前臨床SCI研究の72%以上がラットモデルを採用しており、マウス1を使用したわずか16%と比較して。ラットは、ヒトSCに似た大きなサイズおよび空洞を形成する傾向のために、従来、新しい治療アプローチを研究するための好ましいモデル動物であったが、マウス(多くのトランスジェニックマウスモデルを含む)はSCI2の細胞および分子機構を研究するためにより頻繁に使用されている。マウスモデルは、ラットよりも簡単に取り扱い、より速い生殖率と低コストの点で追加の利点を提供します。マウスはまた、ヒト1、2、3とのゲノム類似度の高い程度を示す。マウスモデルの大きな欠点は、脊髄損傷4,5を作成および治療するための外科的介入のための課題を生み出す、著しく小さいサイズとして同定されている。
既存の文献には、マウスモデルで安定したSCIを誘導するための堅牢で再現可能な外科プロトコルの必要性を強調するギャップがあります。したがって、我々はこれらの限界を克服するために、このプロトコルで新しい、正確な外科的アプローチを提供する。このプロトコルは、マウスにおける横断型損傷を誘発するための詳細なガイドラインを提供し、この傷害タイプは、傷害6に続く再生および変性変化を研究するのに最も適していると認識されており、ならびに神経可塑性、神経回路および組織工学アプローチ7。胸部レベルSCIが文献1で最も一般的に使用されているため、下部胸部領域で傷害を誘発することを選択した。
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Protocol
すべての手続きは、オーストラリア国民保健医療研究評議会のガイドラインに基づき、グリフィス大学動物倫理委員会(ESK/04/16 AECおよびMSC/04/18 AEC)の承認を得て実施されました。
1. 手術のための動物のセットアップ手順
- 動物を麻酔し、安定させる。
- 8~10週齢の雌C57BL/6マウスを使用してください。麻酔の誘導のために1 L/分酸素の5%イオブルランを使用してください。麻酔の維持のために、1 L/分酸素の1.5-2%のイオブルランを使用してください。尾足と後足の痛みの反射の欠如を確立することによって適切な麻酔を確認します。
- 抗抗生物質カバーの鎮痛とエンロフロキサシン(10mg/kg体重)のブプレノルフィン(0.03 mg/kg体重)を投与し、体重に応じて皮下に投与する。Meloxicam (2 mg/kg 体重) 長期鎮痛のために与えることができます必要に応じて.
- 加熱パッドで37 °Cで動物の体温を安定させ続ける
- 背中の毛皮を剃って、背骨の上に外科領域を露出させる。切開部位を殺菌する前に、外科領域から剃った毛皮を取り除きます。ポビドーネ消毒液と手術精神に浸した滅菌綿棒で剃った領域を殺菌します。
- マウスの足を手術領域にテープで貼り付け、動物を安定化させる(図1A)。楕円形の窓をマウスの上に置きます (図 1B)。
2. ラミネクトミー
- 外科メスを使用してT10椎骨レベルで垂直正中切開を行います。
- T10椎骨の棘のプロセスを見つけ、ラミネン切れの部位を決定します。椎骨の体は、脊椎プロセス8 の先端にわずかに頭蓋にある( 図2を参照)。先端はT11の椎骨8の中間点に置く。
- 切開を約2.5cm長くし、T10椎骨の脊椎が切開の長さの中間に近いようにします。
- 皮膚を反射し、リトラクタで引き込む。
- ストレート鉗子を使用して、下の鼻隠しから皮膚を持ち上げます。これにより、リトラクタを配置するためのスペースが作成されます。これらは外科フィールドを開いたままにします。
- 皮下組織と筋膜の鈍い解剖を行い、棘のプロセスを露出させる。
- メスの鈍い縁を使用して、皮下組織と下層筋膜に小さな中線切開を行い、T9-T11椎骨の棘を露出させる。鈍い解剖を行い、鼻隠しを反映するために、細かい先端鉗子(非鋭利)を使用してください。
- パラスピナスの筋肉を分割して分離し、ラミネエを露出させます。
- T9-T11椎骨の脊椎に沿って背部幹筋肉とパラスピンの筋肉を分割するためにメスの鈍い先端を使用してください。層内の筋肉の鈍い解剖を行い、椎骨の層を露出させるために鈍い細かい先端鉗子を使用してください。これは、任意の出血を最小限に抑える必要があります.
注:出血がある場合は、それを制御し、外科分野から血液をクリアするために、温めた生理布(37°C)の灌漑と綿棒を使用してください。 - T10椎骨の横のプロセスの周りに小さいポケットを作るために同じ鉗子を使用しなさい。曲面鉗子を使用して、T10椎体を、作成したポケットに、横断プロセスの下で引っ掛けてT10椎体を安定化させる(図1C)。
- T10ラミネートを温かい生理食い物で十分に洗い流し、綿棒で静かに拭き取り、骨の表面をはっきりと視覚化します。両側に表面に沿って筋肉/靭帯の付属品が残っていないことを確認してください。
- T9-T11椎骨の脊椎に沿って背部幹筋肉とパラスピンの筋肉を分割するためにメスの鈍い先端を使用してください。層内の筋肉の鈍い解剖を行い、椎骨の層を露出させるために鈍い細かい先端鉗子を使用してください。これは、任意の出血を最小限に抑える必要があります.
- 細かい先端(直径0.55mm、長さ7mm)のドリルを使用して、ラミネートを両側で破ります。
- ドリルの先端を使用して、T9-T10椎間スペースからT10-T11の両方の積層に沿ったT10-T11椎間スペースまでの垂直経路を、ドリルをオンにすることなくトレースします。これは、ドリルビットが組織を捕捉しないようにするためです(図1D)。
- 今ドリルをオンにし、ゆっくりと慎重にT10椎骨の右層に垂直の溝を掘ります。ラミネクトミーのこの部分は、直線垂直線で骨の厚さを通して正確な外科的欠陥を作成する必要があります。椎骨を安定させるために、曲がった鉗子でグリップを維持します。
- ドリルの先端が骨を貫通せず、脊髄を傷つけていないことを確認してください。ラミナの左側で同じプロセスを繰り返し、曲がった鉗子で椎骨を安定させます。暖かい生理布をして、残りの骨片を洗い流します。
- 神経アーチの後部を持ち上げて取り外します(図1F)。
- 角度付きの細かい先端鉗子を使用して、スピンスプロセスをつかみ、二国間掘削によって分離された層状層全体を取り除きます。もし出血があったら再度灌漑し、ラミ切除窓の下に露出した脊髄を明確に可視化する(図1E)。
3. トランセクション
- 露出したコードの切除によって、ブレードの単一のスライスで脊髄損傷を誘発する。
- 狭い丸い切断刃を使用して、ラミネクトミーウィンドウの中央でコードをスライスします。完全な横断損傷を誘発するために脊柱の横部の凹部を掃引することを確認する(図1G)。
- 鈍い細かい先端鉗子を使用して、横断損傷の完全性を確認し、セクションのサイトで残りの接続を取り除きます。
- 手術層を閉じる前に、もしもしも出血をコントロールする。
- 暖かい生理音を使用して、切り離されたコードの切り株から発生する出血を灌漑し、クリアします。綿棒を使用して、必要に応じて止めるために穏やかな圧力を加えます。脊髄を圧迫しないように注意してください。
4. 閉鎖と即時の術後ケア
- 筋肉を一緒に持ってきて、層の縫合をします。
- 横断部位で止止ができたら、T10椎骨の湾曲した鉗子グリップを解放する。解剖された筋肉のエッジを正中線に沿って一緒に持って行き、良い割り当てを達成します。
- 5-0ポリグラクチン910吸収性縫合糸を用いて層内の筋肉を縫合する。脊椎の自然な湾曲が縫合線で緊張を引き起こしたり、縫合糸を開いたりして、ラミネクトミー部位を露出させないようにしてください。
- 皮下組織と皮膚を閉じます。
- 皮膚切開を閉じるために5-0非吸収性シルク縫合糸を使用してください。閉鎖前に皮膚の下に出血、血栓または破片が残っていないことを確認してください。このステップでは、温かい生理食糸による最終灌漑が必要な場合があります。
- 麻酔を停止します。回復するまで10〜30分間動物を観察してください。動物はこの期間暖房パッドに残る必要があります。ケージに水ゲルと水分補給食品を提供します。
- 術後ケアのために、ブプレノルフィン(1日2回)、エンフロキサシン(1日1回)を予防的に最初の2日間含む。さらに、動物倫理委員会のガイドラインに従って、少なくとも1日2回膀胱を手動で空にする。
注:この実験の動物は、持続性疼痛(ブプレノルフィンの追加用量を与えるために)または感染(追加のenrofloxacin)、栄養および水分補給状態(脱水後注射液を与える)および自己トミーの兆候(軽度の自己トミーの場合は創傷ケアを提供する)のチェックを含む、一般的な健康と幸福のために1日2回評価された。安楽死の決定を含む術後ケアのこれらの側面は、制度的動物倫理委員会の指導を受けて決定することが強く推奨される。
5. 傷害モデルの評価
- モータ機能の損失を確立します。
- バッソマウススケール(BMS)を使用して、開いたフィールドでの損傷の2、7、14、21、28日後に、損傷したマウスの運動行動を評価して、機能9の喪失を判断する(図3C–E)。
- 傷害の組織学的確認
- 安楽死後に椎骨柱で負傷した脊髄を収穫する(動物倫理委員会の承認を得たため、この実験では二酸化炭素で行われる)。
- 4%パラホルムアルデヒドで一晩の沈水によって組織を固定し、3週間にわたって20%エチレンジアミンテトラ酢酸(EDTA)で処理することによって骨を脱灰し、48時間ごとに新鮮なEDTAを置き換えます。
- 脱灰した棘をクライオ切除用に準備し、厚さ30μmのセクションに切ります。
- ゼラチンコーティングガラススライド上に、抗GFAP抗体およびHoechst 33342による免疫染色用のセクションを取り付けます。
- 蛍光顕微鏡(図3A)上のスライドを画像化し、画像解析ソフトウェア(例えば、ニコン解析ソフトウェア - NIS Elements [図3B])を使用して傷害サイズの測定を行います。
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Representative Results
図1に示すように得られる方法は、マウス(図1A)の適切な安定化と脊椎および麻痺組織の良好な視覚化を伴う(図1B)。棘プロセスと薄層は、最小限の筋肉解剖および失血で明確に可視化することができる(図1C、強調表示されたゾーン)。図1Dに示すように、細かい先端のドリルが実行され、四角形に示すようにラミネクトミー ウィンドウが作成されます。結果として生じるラミネクトミーのウィンドウは明確であり、脊髄への直接視覚化およびアクセスを可能にする(図1E、強調表示されたゾーン)。このプロセスの概念を概念的に説明する図1Fを参照してください。狭い切り抜きブレードは、離散的なラミネクトミーウィンドウ(図1G)を通して容易に収まり、滑らかなスワイプモーションで完全な横断型損傷を作成することができます(図1H–I)。したがって、この方法は、最小限の筋肉解剖、最小限の副次的骨損傷を引き起こし、最小限の失血で安定した完全な横断型傷害をもたらす。動物における重度のSCIの誘導にもかかわらず、外科的処置および術後ケアは、動物の高い生存率をもたらした。この原稿のために報告されたすべての動物は脊髄手術を生き延びた。そして、私たちの研究室によるその後の手術は、生存率が>99%をもたらしました。
マウスに対してTransection型SCIを誘導するこの方法が再現可能で一貫しているかどうかを評価するために、我々は、損傷した脊髄を、神学/免疫神学および行動検査(n=8動物)を用いて分析した(図2)。アストロサイトマーカーに対する免疫標識は、グリア線維性酸性タンパク質(GFAP)は、インタクトな脊髄の境界を区分し、長手方向の切片で見ると傷害部位が臍帯切り株間の領域である(図3A)。トランセクション部位で一貫したサイズの欠陥が誘発され、平均最小距離は550.4±17.3μm(図3B)であった。オープンフィールドテストのバッソマウススケール(BMS)9を展開する行動データは、負傷したマウスが傷害後に後肢の動きを示さないことを示した(図3C)。これは、最大28日間のBMSのスコア0で表されます。したがって、このプロトコルは、完全で信頼性の高いトランセクション型傷害を生じ、傷害レベル以下の機能を完全に失い、麻痺の自発的な逆転を招かない(図3D,E)。
図1:横断損傷プロトコルの主要なステップ。(A)動物のセットアップと手術前の安定化。手術からの概略と写真は両方とも示されている。(B)深部筋層を露出させる切開、レトラクター配置および鈍解解を示す概略図及び写真。(C)T10椎骨の鉗子と露出の薄層を用いて脊柱の安定化。写真の長方形は、T10椎骨の層状および棘のプロセスを強調しています。(D)細かい先端ドリルは、ラミネクトミーを行う。この写真の長方形は、ラミネクトミーウィンドウをたどります。(E)脊髄がはっきりと見える四角形で強調表示された完全なラミネクトミーウィンドウ。(F)完全なラミネクトミーを行う掘削概念を示す一連の模式図、断面方向。(G)この写真は、細かい刃の切り傷の刃の使用を示しており、(H)では、完全な損傷が四角形の内側に見え、脊髄を横切る暗い赤い横線として見えます。(I) ラミテクトミーと傷害部位の全体の概観を示す図。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:T10の椎骨ランドマーク識別を説明する模式図。 T10椎骨の棘のプロセスは胸部脊柱の自然な湾曲で触診することができる最も顕著なランドマークの1つである。この時点で、棘プロセスは形態を変え、紡突過程の先端がT10点から頭蓋を突き出すようにし、紡突過程の先端はT10点から頭蓋を循環する。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:C57BL/6マウスで誘発された横断型傷害の代表的な結果。(A)脊髄の縦断面は、完全な横断型損傷を明らかにする。組織を反転顕微鏡で画像化した。抗GFAP免疫標識標識は、アストロサイト(赤色)を標識し、核はHoechst 33342(青)で標識される。最短点の線形測定を用いた傷害ギャップは550μmであった。スケールバー= 200 μm. IS = 傷害部位, IVD = 椎間板, SC = 脊髄, VB = 椎体.(B)8動物で傷害サイズを測定した。平均傷害サイズは550.4±17.3μm、最大は577.8 μm、最小525.4 μmであった(C)モータの挙動は、損傷前にすべてのマウスで9点、損傷部位(n=8マウス)未満の機能の完全な喪失を示すバッソマウススケール(BMS)で採点された。(D) 怪我の前に健康なマウスの足取り.(E)怪我の後に同じマウスの足取り。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
この方法は、マウスのT10椎体レベルで完全な横断型傷害を誘発し、動物の完全な対麻痺を生じ、傷害のレベルを下回る。全体的に、この方法は、最小限の出血、ごくわずかの巻き添え損傷と安定した、再現性の傷害をもたらす。ラミネクトミー10を伴わないトランセクションの以前に発表された方法と比較して、この方法は、脊椎の曲率を操作することなく直接可視化、傷害の完全性をより良く制御し、出血を制御し、止血を達成する能力を強化するという点で利点を提供する。この方法の利点は、プロトコルがT10以外の他の椎体レベルで使用するために変更することができること、ならびにヘミセクション、部分的な後部切片、後根の破壊、クラッシュおよび挫傷のような他の傷害タイプを実行することができる。
このプロトコルの主要なコンポーネントは、細かいドリルを使用することです。ドリルの使用は、高いスキルレベルとより広範なトレーニングを必要とするかもしれないが、それはクリーンで完全な洗浄術を達成する。もう一つの重要な要因は、マイクロハサミの代わりに、トランセクションのための狭刃のナイフの使用です。これははさみを使用するのと比較して、より少ない不要な担保損傷をもたらす。しかし逆に、横圧力が大きすぎると、椎体に何らかの損傷を引き起こす可能性があります。記載されたプロトコルは、外科医にいくつかのトラブルシューティングを実行する必要があります。もし、ラミネクトミーの窓へのアクセスを制限することができる。細かい先端鉗子の突起の1つを挿入することは外科医が把握し、残っている骨の拍車を壊すことを可能にする。しかし、その過程で露出した脊髄を傷つけないように注意する必要があります。もし、もし、もしラミネクトミーが骨の縁をギザギザにした場合、再び掘削を行って、ラミネクトミーのマージンをまっすぐにすることができる。これは、ラミネクトミーウィンドウが十分に広い場合には実用的でない可能性があり、その場合、ラミネクトミー部位を改ざんすることなく、トランセクションを行う必要があります。
ユーザーは、生き生きとした生存手術を試みる前に、cadaveric解剖において、関連する脊椎レベルで少なくとも8〜10回のラミネ切除処置を行うことを強く推奨する。ドリル保持と操縦のテクニックは簡単ですが、ユーザーが機器を知る必要があるかもしれません。ここでは、掘削手順中に脊椎と手の安定化を支援するための有用なアドバイスも提供します。ユーザーが右手で行われる場合、脊椎は左手で湾曲した鉗子を使用して安定させ、鉗子が頭蓋の側面から脊柱に近づくようにする必要があります。これは、右側(または優勢な)手に保持されたドリルで近づく脊椎の尾部の側面を明確に保ちます。ドリルは親指、人差し指、中指の間のピンサーグリップで保持する必要があります。手は手首の内側の端と伸ばした5本目の指に沿って十分に支持されるべきです。肘が身体に触れるように腕を完全に引き付けたままにして、練習中にドリルグリップをより良く制御するのに役立ちます。ドリルアクションは、書き込み用のペンを使用するのと異なり、手首ではなく、ドリルを保持している指での動きのみを含む必要があります。
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Disclosures
著者らは開示するものは何もない。
Acknowledgments
この研究は、グリフィス大学留学生(博士)がRRに奨学金を提供し、JEとJSJへのペリークロス財団助成金、JSJとJEへのクレム・ジョーンズ財団助成金、クイーンズランド州の自動車事故保険委員会がJSJとJEに助成金を与えることによって支援されました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Baytril injectable 50 mg/mL, 50 mL | Provet | BAYT I | Post-operative care drug |
| Betadine 500 mL | Provet | BETA AS | Consumable |
| Castroviejo needle holder, locking | ProSciTech | T149C | Reusable |
| Ceramic zirconia blade, round with sharp sides, single edge, angled | ProSciTech | TXD101A-X | Reusable |
| Cotton swabs (5pcs) | Multigate | 21-893 | Consumable |
| Dremel Micro | DREMEL | 8050-N/18 | Cordless rotary tool |
| Dressing forceps fine | Multigate | 06-306 | Single use disposable |
| Drill bits | Kemmer Präzision | SM 32 M 0550 070 | Reusable |
| Dumont #7b forceps | Fine Science Tools | 11270-20 | Reusable |
| Dumont tweezers, style 5 | ProSciTech | T05-822 | Reusable |
| Fur trimmer | WAHL | WA9884-312 | Zero Overlap Hair Trimmer |
| Iris scissors, Ti, sharp tips, straight, 90mm | ProSciTech | TY-3032 | Reusable |
| Isoflurane isothesia NXT 250 | Provet | ISOF 00 HS | Anaesthetic agent |
| Colibri Retractor - 4cm | Fine Science Tools | 17000-04 | Reusable |
| Scalpel handle | ProSciTech | T133 | Reusable |
| Signature latex surgical gloves size 7.5 | Medline | MSG5475 | Consumable |
| Sodium Chloride 0.9% | STS | PHA19042005 | Consumable |
| Sterile Dressing Pack | Multigate | 08-709 | Single use disposable |
| Sterile Fluid Impervious Drape 60x60 cm | Multigate | 29-220 | Single use disposable |
| Surgical spirit 100 mL | Provet | # SURG SP | Consumable |
| Suture Material - SILK BLK 45CM 5/0 FS-2 | Johnson & Johnson Medical | 682G | Silk Suture |
| Suture Material - Vicryl 70CM 5-0 S/A FS-2 | Johnson & Johnson Medical | VCP421H | Vicryl Suture |
| Temgesic 0.3 mg in 1 mL, x 5 ampoules (class S8 drug) | Provet | TEMG I | Post-operative care drug |
References
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