Indução da lesão da medula espinhal tipo transssecção completa em camundongos

Summary

Este protocolo descreve como criar uma laminectomia precisa para indução de lesão medular do tipo transecção estável no modelo do camundongo, com danos colaterais mínimos para a pesquisa de lesão medular.

Abstract

A lesão medular (SCI) leva em grande parte à perda irreversível e permanente da função, mais comumente como resultado de um trauma. Várias opções de tratamento, como métodos de transplante celular, estão sendo pesquisadas para superar as deficiências debilitantes decorrentes da SCI. A maioria dos ensaios pré-clínicos em animais são realizados em modelos de roedores de SCI. Embora os modelos de ratos de SCI tenham sido amplamente utilizados, os modelos de mouse têm recebido menos atenção, embora os modelos de mouse possam ter vantagens significativas sobre os modelos de ratos. O pequeno tamanho dos camundongos equivale a menores custos de manutenção animal do que para ratos, e a disponibilidade de inúmeros modelos de camundongos transgênicos é vantajosa para muitos tipos de estudos. Induzir lesões repetidas e precisas nos animais é o principal desafio para a pesquisa de SCI, que em pequenos roedores requer cirurgia de alta precisão. O modelo de lesão do tipo transeção tem sido um modelo de lesão comumente usado na última década para pesquisas terapêuticas baseadas em transplante, no entanto, um método padronizado para induzir uma lesão completa do tipo transeção em camundongos não existe. Desenvolvemos um protocolo cirúrgico para induzir uma lesão completa do tipo transecção em camundongos C57BL/6 no nível vertebral torácico 10 (T10). O procedimento utiliza uma pequena broca de ponta em vez de rongeurs para remover precisamente a lâmina, após a qual uma lâmina fina com borda arredondada é usada para induzir a transeção medular. Este método leva a lesões reprodutíveis do tipo transecção em pequenos roedores com dano muscular e ósseo colateral mínimo e, portanto, minimiza fatores de confusão, especificamente onde os desfechos funcionais comportamentais são analisados.

Introduction

A lesão medular (SCI) é um problema médico complexo que resulta em mudanças drásticas na saúde e no estilo de vida. Não há cura para a SCI, e a fisiopatologia da SCI não é completamente compreendida. Os modelos de SCI animal, em particular modelos de roedores, oferecem uma ferramenta inestimável para testar novos tratamentos, e têm sido usados para explorar SCI por décadas. Até o momento, mais de 72% dos estudos pré-clínicos de SCI empregaram modelos de ratos, em comparação com meros 16% que usaram camundongos¹. Embora os ratos, devido ao seu maior tamanho e tendência a formar cavidades semelhantes às SCIs humanas, tenham sido tradicionalmente os animais modelo preferidos para estudar novas abordagens terapêuticas, os camundongos (incluindo muitos modelos de camundongos transgênicos) estão sendo usados com mais frequência para estudar mecanismos celulares e moleculares do SCI². O modelo de mouse oferece benefícios adicionais em termos de manuseio mais fácil, taxas reprodutivas mais rápidas e custos mais baixos do que ratos; camundongos também apresentam alto grau de similaridade genômica com humanos^1,2,3. A maior desvantagem do modelo de camundongos tem sido identificada como o tamanho significativamente menor que cria desafios para intervenções cirúrgicas para a criação e tratamento de lesões medular^4,5.

Há uma lacuna na literatura existente que destaca a necessidade de um protocolo cirúrgico robusto e reprodutível para induzir SCI estável no modelo do mouse. Por isso, fornecemos uma abordagem cirúrgica nova e precisa neste protocolo para superar essas limitações. Este protocolo fornece diretrizes aprofundadas para induzir uma lesão tipo transeção em camundongos, uma vez que este tipo de lesão tem sido reconhecido como o mais adequado para estudar alterações regenerativas e degenerativas após uma lesão⁶, bem como neuroplasticidade, circuitos neurais e abordagens de engenharia tecidual⁷. Optamos por induzir a lesão na região torácica inferior, uma vez que o nível torácico SCI é mais utilizado na literatura¹.

Protocol

Todos os procedimentos foram realizados com a aprovação do Comitê de Ética Animal da Universidade Griffith (ESK/04/16 AEC e MSC/04/18 AEC) sob as diretrizes do Conselho Nacional de Saúde e Pesquisa Médica da Austrália.

1. Procedimento de configuração animal para a cirurgia

1. Anestesiar e estabilizar o animal.
   1. Use camundongos C57BL/6 fêmeas de 8 a 10 semanas. Use 5% de isoflurane em 1 L/min de oxigênio para indução de anestesia. Para manutenção da anestesia, use 1,5-2% de isoflurane em 1 L/min de oxigênio. Confirme a anestesia apropriada estabelecendo uma falta de reflexo de dor nas patas traseiras e traseiras.
2. Administre buprenorfina (0,03 mg/kg de peso corporal) para analgesia e enrofloxacina (10 mg/kg de peso corporal) para cobertura de antibióticos, subcutânea de acordo com o peso corporal. Meloxicam (peso corporal de 2 mg/kg) pode ser dada para analgesia de longo prazo, se necessário.
3. Mantenha a temperatura corporal do animal estável a 37 °C com uma almofada de aquecimento
   1. Raspe a pele traseira para expor a área cirúrgica sobre a coluna dorsal. Remova a pele raspada da área cirúrgica antes de esterilizar o local da incisão. Esterilize a área raspada com cotonetes de algodão estéreis embebidos em líquido antisséptico de iodo povidone e espírito cirúrgico.
4. Tape as patas do camundongo na área cirúrgica para estabilizar o animal (Figura 1A). Coloque uma cortina de janela oval sobre o mouse(Figura 1B).

2. Laminectomia

1. Faça uma incisão vertical midline no nível vertebral T10 usando um bisturi cirúrgico.
   1. Localize o processo espinhoso da vértebra T10 para determinar o local da laminectomia. O corpo da vértebra fica ligeiramente craniano na ponta do processo espinhoso⁸ (ver Figura 2). A ponta repousa aproximadamente no ponto médio da vértebra T11⁸.
   2. Faça a incisão ~2,5 cm de comprimento, de modo que a coluna vertebral da vértebra T10 esteja aproximadamente no meio do comprimento da incisão.
2. Reflita a pele e retrate com retratores.
   1. Use os fórceps retos para levantar a pele da fáscia subjacente. Isso criará espaço para que os retrações sejam colocados; estes manterão o campo cirúrgico aberto.
3. Realizar dissecção contundente de tecido subcutâneo e fáscia para expor os processos espinhosos.
   1. Use a borda cega do bisturi para fazer uma pequena incisão midline no tecido subcutâneo e fáscia subjacente para expor as espinhas das vértebras T9-T11. Use os fórceps finos da ponta (não-afiados) para realizar dissecção contundente e refletir a fáscia.
4. Divida e separe os músculos para-espinhosos para expor o laminado.
   1. Use a ponta cega do bisturi para dividir os músculos do tronco dorsal e os músculos para-espinhos ao longo das espinhas das vértebras T9-T11. Use os fórceps de ponta finas para realizar dissecção contundente dos músculos em camadas e expor a lâmina das vértebras. Isso deve minimizar qualquer sangramento.
      NOTA: Se houver algum sangramento, use irrigação salina aquecida (37 °C) e cotonetes de algodão para controlá-lo e limpar o sangue do campo cirúrgico.
   2. Use os mesmos fórceps para fazer pequenos bolsões ao redor dos processos transversais da vértebra T10. Use as fórceps curvas para estabilizar o corpo vertebral T10, enganchando seus pinos sob os processos transversais, nos bolsos criados(Figura 1C).
   3. Enxágue completamente a laminae T10 com soro fisiológico quente e limpe delicadamente com cotonetes de algodão para visualizar claramente a superfície óssea. Certifique-se de que não há ligações musculares/ligamentares ao longo da superfície bilateralmente.
5. Use uma broca com uma ponta fina (0,55 mm de diâmetro, 7 mm de comprimento) para quebrar o laminado bilateralmente.
   1. Use a ponta da broca para traçar um caminho vertical do espaço intervertebral T9-T10 até o espaço intervertebral T10-T11 ao longo do laminado T10, sem ligar a broca. Isto é para garantir que a broca não pegue nenhum tecido(Figura 1D).
   2. Agora ligando a broca, lentamente e cuidadosamente cavar uma trincheira vertical na lâmina direita da vértebra T10. Esta parte da laminectomia deve criar um defeito cirúrgico preciso em toda a espessura do osso em uma linha vertical reta. Mantenha o aperto com os fórceps curvos para manter a vértebra estável.
6. Certifique-se de que a ponta da broca não penetre através do osso e machuque a medula espinhal. Repita o mesmo processo no lado esquerdo da lâmina, mantendo a vértebra estável com os fórceps curvos. Irrigar com soro fisiológico quente para lavar todos os fragmentos ósseos restantes.
7. Levante e remova a parte posterior do arco neural(Figura 1F).
   1. Use os fórceps finos angulares para segurar o processo espinhoso e remova todo o segmento dorsal do laminado separado pela perfuração bilateral. Irrigar e cotonete novamente se houver algum sangramento, para visualizar claramente a medula espinhal exposta sob a janela de laminectomia(Figura 1E).

3. Transeção

1. Induzir a lesão medular por transeção do cordão exposto com uma única fatia da lâmina.
   1. Use a lâmina estreita e redonda de corte para cortar o cabo no centro da janela de laminectomia. Certifique-se de varrer os recessos laterais da coluna vertebral para induzir uma lesão de transeção completa(Figura 1G).
2. Confirme a completude da lesão da transeção usando os fórceps de ponta finas e remova quaisquer conexões restantes no local da transeção.
3. Controle o sangramento, se houver, antes de fechar as camadas cirúrgicas.
4. Use o soro fisiológico quente para irrigar e limpar qualquer sangramento que ocorra dos tocos do cordão transectado. Use um cotonete para aplicar pressão suave para alcançar hemostasia, se necessário. Tome cuidado para não comprimir a medula espinhal.

4. Encerramento e atendimento pós-operatório imediato

1. Unir os músculos e suturar em camada.
   1. Uma vez que a hemostasia é alcançada no local da transeção, solte o aperto curvo das vértebras T10. Aproxime as bordas dos músculos dissecados ao longo da linha média para alcançar uma boa posição.
   2. Sutura os músculos em uma camada usando 5-0 poliglactina 910 suturas absorvíveis. Certifique-se de que a curvatura natural da coluna vertebral não cause qualquer tensão na linha de sutura ou abra as suturas, expondo o local da laminectomia.
2. Feche tecido subcutâneo e pele.
   1. Use suturas de seda não absorvíveis 5-0 para fechar a incisão da pele. Certifique-se de que não há sangramento, coágulos ou detritos remanescentes sob a pele antes do fechamento. Uma irrigação final com soro fisiológico quente pode ser necessária nesta etapa.
3. Pare a anestesia. Observe o animal por 10-30 minutos até a recuperação. O animal deve permanecer na almofada de aquecimento por esta duração. Forneça gel de água e alimentos hidratados na gaiola.
4. Para cuidados pós-operatórios, incluem buprenorfina (duas vezes por dia), enrofloxacina (uma vez por dia) nos dois primeiros dias profilaticamente. Além disso, esvaziar manualmente a bexiga pelo menos duas vezes por dia, aderindo às diretrizes do comitê de ética animal.
   NOTA: Os animais deste experimento foram avaliados duas vezes por dia para sua saúde geral e bem-estar, o que incluiu a verificação de dor persistente (para dar doses adicionais de buprenorfina) ou infecção (enrofloxacina adicional), seu estado de nutrição e hidratação (dar fluidos injetáveis se desidratado) e quaisquer sinais de autotomia (fornecer cuidados com feridas se autotomia menor). Recomenda-se fortemente que esses aspectos do cuidado pós-operatório, incluindo as decisões de eutanásia, sejam determinados com a orientação do comitê institucional de ética animal.

5. Avaliação do modelo de lesão

1. Estabelecendo a perda da função motora.
   1. Avalie o comportamento motor nos camundongos feridos 2, 7, 14, 21 e 28 dias após a lesão em campo aberto usando a Escala de Ratinho Basso (BMS) para determinar a perda da função⁹ (Figura 3C-E).
2. Confirmação histológica da lesão
   1. Colher as medulas espinhais lesionadas com as colunas vertebrais após a eutanásia (feita com dióxido de carbono neste experimento, conforme aprovado pelo comitê de ética animal).
   2. Fixar o tecido por submersão durante a noite em 4% paraformaldeído e descalcificar os ossos por tratamento com 20% de ácido tetraáctico de diamina de etileno (EDTA) ao longo de 3 semanas, substituindo EDTA fresco a cada 48 h.
   3. Prepare as espinhas decalcificadas para crio-seção e corte-as em seções de 30 μm de espessura.
   4. Monte as seções em lâminas de vidro revestidas de gelatina para imuno-coloração com anticorpos anti-GFAP e Hoechst 33342.
   5. Imagem dos slides em um microscópio fluorescente (Figura 3A) e realize medições do tamanho da lesão usando software de análise de imagem (por exemplo, software de análise Nikon - NIS Elements [Figura 3B]).

Representative Results

O método resultante, como retratado na Figura 1,envolve estabilização adequada do camundongo (Figura 1A) e boa visualização da coluna vertebral e tecido paraspinous(Figura 1B). Processo espinhoso e laminae podem ser claramente visualizados com dissecção muscular mínima e perda de sangue(Figura 1C, zona destacada). A perfuração da ponta fina é realizada como mostrado na Figura 1D, para criar uma janela de laminectomia, como mostrado pelo retângulo. A janela de laminectomia resultante é clara e permite visualização direta e acesso à medula espinhal (Figura 1E, zona destacada). O conceito esquemático desse processo é explicado na Figura 1F. A lâmina de transeção estreita pode facilmente caber através da janela de laminectomia discreta(Figura 1G) e em um movimento de deslizar suave, uma lesão completa do tipo transection pode ser criada(Figura 1H-I). Assim, este método causa dissecção muscular mínima, dano ósseo colateral mínimo, e resulta em uma lesão estável do tipo transecção completa com perda mínima de sangue. Apesar da indução de SCI grave nos animais, o procedimento cirúrgico e o cuidado pós-operatório resultaram em altas taxas de sobrevivência dos animais. Todos os animais reportados para este manuscrito sobreviveram à cirurgia da medula espinhal; e cirurgias subsequentes pelo nosso laboratório resultaram em uma taxa de sobrevivência de >99%.

Para avaliar se este método de indução do tipo de transeção SCI em camundongos era reprodutível e consistente, analisamos a medula espinhal ferida utilizando histologia/imunohistoquímica e teste comportamental (n = 8 animais) (Figura 2). A imunolabelagem contra o marcador de astrócito proteína ácida fibrilar ladato (GFAP) demarcou o limite da medula espinhal intacta, sendo o local da lesão a região entre os tocos do cordão umbilical quando visto com seções longitudinais(Figura 3A). Um defeito de tamanho consistente foi induzido no local da transeção, com uma distância mínima média de 550,4 ± 17,3 μm(Figura 3B). Dados comportamentais que implantam a Escala de Ratinho Basso (BMS)⁹ de um teste de campo aberto mostraram que os camundongos feridos não apresentam nenhum movimento do membro traseiro após a lesão(Figura 3C). Isso é representado por uma pontuação de 0 na BMS por até 28 dias após a lesão. Assim, o protocolo produz lesão completa e confiável do tipo transeção, resultando em perda completa da função abaixo do nível de lesão e não leva à reversão espontânea da paralisia(Figura 3D,E).

Figura 1: Passos-chave no protocolo de lesão de transeção. (A) Configuração animal e estabilização antes da cirurgia. Esquema e fotografia da cirurgia são mostrados. (B) Esquema e fotografia mostrando incisão, colocação do retrátil e dissecção contundente para expor as camadas musculares profundas. (C) Estabilização da coluna vertebral com fórceps e exposição de laminado de vértebra T10. O retângulo na fotografia destaca o processo laminado e espinhoso da vértebra T10. (D) Broca de ponta fina para realizar laminectomia. O retângulo nesta fotografia traça a janela da laminectomia. (E) Janela completa de laminectomia destacada pelo retângulo, dentro da qual a medula espinhal é claramente visível. (F) Série de desenhos esquemáticos mostrando o conceito de perfuração para realizar uma laminectomia completa, em uma orientação transversal. (G) Esta fotografia retrata o uso de uma faca de transeção de lâmina fina para realizar a lesão completa do tipo transeção, e em (H) a lesão completa é visível dentro do retângulo, como uma linha transversal vermelha escura através da medula espinhal. (I) Esquema mostrando a visão geral da laminectomia e local da lesão. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Um esquema explicando a identificação do marco vertebral para T10. O processo espinhoso da vértebra T10 é um dos pontos turísticos mais proeminentes que podem ser palpatados na curvatura natural da coluna torácica. Neste ponto os processos espinhosos mudam a morfologia de modo que as pontas dos processos espinhosos cranianos a partir de T10 ponto caudally, e as pontas dos processos espinhosos caudal a partir de T10 ponto cranialmente. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Resultados representativos da lesão tipo transeção induzida em camundongos C57BL/6. (A) Uma seção longitudinal da medula espinhal revela a lesão completa do tipo transeção. O tecido foi imageado em um microscópio invertido. A imunolabelling anti-GFAP rotula osstrócitos (vermelho) enquanto os núcleos são rotulados com Hoechst 33342 (azul). A diferença de lesão utilizando uma medição linear do ponto mais curto foi de 550 μm. Barra de escala = 200 μm. IS = local da lesão, IVD = disco intervertebral, SC = medula espinhal, VB = corpo vertebral. (B) O tamanho da lesão foi medido em 8 animais. O tamanho médio da lesão foi de 550,4 ± 17,3 μm com máxima de 577,8 μm e mínima de 525,4 μm. (C) O comportamento motorizado na Escala de Ratinho Basso (BMS), que foi de 9 em todos os camundongos antes da lesão e permaneceu em 0 por 4 semanas após a lesão, indicando uma perda completa da função motora abaixo do local da lesão (n = 8 ratos). (D) Marcha de um rato saudável antes da lesão. (E) Marcha do mesmo rato após a lesão. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussion

Este método induz uma lesão completa do tipo transeção no nível vertebral T10 em camundongos, o que resulta em paraplegia completa do animal, abaixo do nível de lesão. No geral, este método resulta em sangramento mínimo, danos colaterais insignificantes e uma lesão estável e reprodutível. Em comparação com os métodos de transeção publicados anteriormente sem laminectomia^10,este método oferece os benefícios em termos de visualização direta sem manipular a curvatura da coluna vertebral, melhor controle sobre a completude da lesão e maior capacidade de controlar o sangramento e alcançar hemostasia. A vantagem deste método é que o protocolo pode ser modificado para uso em quaisquer outros níveis vertebrais que não o T10, bem como para realizar outros tipos de lesões, como hemi-seções, trans seções dorsais parciais, avulsões de raiz dorsal, esmagamento e contusões.

Um componente importante deste protocolo é que ele emprega o uso de uma broca de ponta fina. Embora o uso da broca possa exigir um alto nível de habilidade e um treinamento mais extenso, ele consegue uma laminectomia limpa e completa. Outro fator crucial é o uso de uma faca de lâminas estreitas para transeção, em vez de micro-tesouras. Isso resulta em danos colaterais menos indesejados em comparação com o uso de tesouras. Por outro lado, no entanto, se muita pressão lateral for exercida, a lâmina pode causar algum ferimento no corpo vertebral. O protocolo descrito pode exigir que o cirurgião realize algumas soluçãos de problemas. Se a laminectomia não for realizada corretamente, pode haver esporas ósseas remanescentes, o que pode restringir o acesso à janela de laminectomia. Inserir um dos pinos dos fórceps finos pode permitir que o cirurgião agarre e quebre todas as esporas ósseas restantes. No entanto, deve-se tomar cuidado para não ferir a medula espinhal exposta no processo. Se a laminectomia resultar em uma borda óssea irregular, a perfuração pode ser realizada novamente para endireitar a margem de laminectomia. Isso pode ser impraticável se a janela de laminectomia já estiver larga o suficiente, nesse caso, a transeção deve ser realizada sem adulterar o local da laminectomia.

Recomenda-se fortemente que os usuários pratiquem os procedimentos de laminectomia pelo menos 8 a 10 vezes no nível espinhal relevante em uma dissecção cadavérica antes de tentar em uma cirurgia de sobrevivência ao vivo. Embora, as técnicas de retenção e manobra da broca sejam simples, elas podem exigir que os usuários se familiarizem com o equipamento. Aqui, também fornecemos alguns conselhos úteis para ajudar na estabilização da coluna vertebral e da mão durante o procedimento de perfuração. Se o usuário for destro, a coluna deve ser estabilizada usando os fórceps curvos com a mão esquerda para que os fórceps se aproximem da coluna vertebral do aspecto craniano. Isso mantém o aspecto caudal da coluna vertebral claro para se aproximar com a broca realizada na mão direita (ou predominante). A broca deve ser realizada com uma pinça entre polegar, índice e dedos médios. A mão deve ser bem apoiada ao longo da borda medial do pulso e do quinto dedo estendido. Manter o braço completamente adutado para que o cotovelo toque o corpo possa ajudar a obter um melhor controle sobre a aderência da broca durante a prática. A ação de perfuração deve envolver apenas movimento nos dedos que seguram a broca e não no pulso, não muito diferente de usar uma caneta para escrever.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Baytril injectable 50 mg/mL, 50 mL	Provet	BAYT I	Post-operative care drug
Betadine 500 mL	Provet	BETA AS	Consumable
Castroviejo needle holder, locking	ProSciTech	T149C	Reusable
Ceramic zirconia blade, round with sharp sides, single edge, angled	ProSciTech	TXD101A-X	Reusable
Cotton swabs (5pcs)	Multigate	21-893	Consumable
Dremel Micro	DREMEL	8050-N/18	Cordless rotary tool
Dressing forceps fine	Multigate	06-306	Single use disposable
Drill bits	Kemmer Präzision	SM 32 M 0550 070	Reusable
Dumont #7b forceps	Fine Science Tools	11270-20	Reusable
Dumont tweezers, style 5	ProSciTech	T05-822	Reusable
Fur trimmer	WAHL	WA9884-312	Zero Overlap Hair Trimmer
Iris scissors, Ti, sharp tips, straight, 90mm	ProSciTech	TY-3032	Reusable
Isoflurane isothesia NXT 250	Provet	ISOF 00 HS	Anaesthetic agent
Colibri Retractor - 4cm	Fine Science Tools	17000-04	Reusable
Scalpel handle	ProSciTech	T133	Reusable
Signature latex surgical gloves size 7.5	Medline	MSG5475	Consumable
Sodium Chloride 0.9%	STS	PHA19042005	Consumable
Sterile Dressing Pack	Multigate	08-709	Single use disposable
Sterile Fluid Impervious Drape 60x60 cm	Multigate	29-220	Single use disposable
Surgical spirit 100 mL	Provet	# SURG SP	Consumable
Suture Material - SILK BLK 45CM 5/0 FS-2	Johnson & Johnson Medical	682G	Silk Suture
Suture Material - Vicryl 70CM 5-0 S/A FS-2	Johnson & Johnson Medical	VCP421H	Vicryl Suture
Temgesic 0.3 mg in 1 mL, x 5 ampoules (class S8 drug)	Provet	TEMG I	Post-operative care drug