Summary
CENP-A allestedsnærværendelation er et vigtigt krav til CENP-A deposition på centromere, arvet gennem dimerization mellem celledeling, og uundværlig for celle levedygtighed. Her beskriver vi massespektrometrianalyse for at identificere allestedsnærværendelation af EYFP-mærket CENP-A (EYFP-CENP-A) protein.
Abstract
Undersøgelse af strukturen og dynamikken i kinetochores og centromeres er vigtigt at forstå kromosomal ustabilitet (CIN) og kræft progression. Hvordan kromosommal placering og funktion af en centromere (dvs. centromere identitet) bestemmes og deltage i nøjagtig kromosom adskillelse er et grundlæggende spørgsmål. CENP-A foreslås at være ikke-DNA-indikator (epigenetisk mærke) af centromere identitet, og CENP-A allestedsnærværendelation er nødvendig for CENP-A deposition på centromere, arvet gennem dimerization mellem celledeling, og uundværlig for celle levedygtighed.
Her beskriver vi massespektrometrianalyse for at identificere allestedsnærværende allestedsnærværende EYFP-CENP-A K124R-mutant, hvilket tyder på, at allestedsnærværendelation ved en anden lysin induceres på grund af EYFP-mærkningen i CENP-A K124R-proteinet. Lysin 306 (K306) allestedsnærværendelation i EYFP-CENP-A K124R blev identificeret med succes, hvilket svarer til lysin 56 (K56) i CENP-A gennem massespektrometri analyse. En advarsel diskuteres i brugen af GFP / EYFP eller tagging af høj molekylvægt protein som et redskab til at analysere funktionen af et protein. Nuværende tekniske grænse er også drøftet for påvisning af allestedsnærværende bands, identifikation af sted-specifikke allestedsnærværendelation (r), og visualisering af allestedsnærværende i levende celler eller en bestemt enkelt celle i hele celle cyklus.
Metoden til massespektrometri analyse præsenteres her kan anvendes på humane CENP-A protein med forskellige tags og andre centromere-kinetochore proteiner. Disse kombinatoriske metoder, der består af flere analyser/ analyser, kan anbefales til forskere, der er interesseret i at identificere allestedsnærværende roller.
Introduction
I de fleste eukaryoter skal spindelmikrottbuler knyttes til en enkelt region af hvert kromosom, der betegnes som centromere. Kinetochore er et kompleks af proteiner, der er placeret på centromere. Undersøgelse af timingen af centromere og kinetochore protein bevægelser og strukturen af kinetochores og centromeres er vigtigt for at forstå kromosom ustabilitet (CIN) og kræft progression. De centrale spørgsmål er, hvordan kromosommal placering og funktion af en centromere (dvs. centromere identitet) bestemmes, og hvordan de deltager i nøjagtig kromosom adskillelse. I de fleste arter definerer tilstedeværelsen af et særligt nukleososom, der indeholder et specifikt histonlignende protein kaldet CENP-A, centromeres identitet. Det foreslås derfor, at CENP-A er ikke-DNA-indikator (epigenetisk mærke) af centromere identitet. Det er vigtigt at belyse mekanismen for, hvordan CENP-A definerer centromere identitet hos mennesker.
Holliday-krydsgenkendelsesproteinet (HJURP) er den CENP-A-specifikke chaperon , som deponerer CENP-A i centromeric nucleosomes1,2,3. Vi har tidligere rapporteret, at CUL4A-RBX1-COPS8 E3 ligase er påkrævet for CENP-A allestedsnærværendelation på lysin 124 (K124) og centromere lokalisering4. Også, vores resultater viste, at centromere rekruttering af nyligt syntetiseret CENP-A kræver allerede eksisterende ubiquitylated CENP-A5. Således blev der fremlagt en model, der antydede, at CENP-A allestedsnærværendelation er nedarvet gennem dimerisering mellem celledivisioner.
I modsætning til vores resultater og yu et al.,, negative resultater vedrørende CENP-A og dens centromeric lokalisering blev for nylig offentliggjort6. Artiklen hævdede, at CENP-A ændringer på lysin 124 (K124) kan undværes til etablering, vedligeholdelse og langsigtet funktion af menneskelige centromeres, baseret på deres negative resultater viser, at mutationen af K124R ikke påvirke CENP-A centromere lokalisering hverken celle levedygtighed6. Der er imidlertid plads nok til debat i deres resultater og konklusioner, og vi har allerede beskrevet, hvilket problem der kunne være i deres tidligere publikation7. Man skal være opmærksom på, at de fusionerede proteiner med CENP-A, som har meget større molekylvægt end størrelsen af endogene CENP-A: fx, de smeltede ~ 30 kDa forbedret gul fluorescerende protein (EYFP) til ~ 16 kDa CENP-A og analyserede EYFP-CENP-A K124R fusion protein i deres RPE-1 CENP-A-/knockout F system. K124 ubiquitin forventes ikke at binde direkte til HJURP baseret på strukturelle forudsigelser4,men tilsætning af mono-ubiquitin forventes at have en indvirkning på protein kropsbygning af CENP-A. Proteinet i CENP-A-kropsbygning kan ændres ved tilstedeværelsen af et stort fusionsprotein, og denne konformationsændring kan maskere de strukturelle ændringer forårsaget af tab af allestedsnærværendelation. Vi foreslår, at fusionen af store protein inducerer allestedsnærværendelation på en anden lysin end K124 i EYFP-CENP-A K124R mutant og denne allestedsnærværendelation på et andet sted hæmmer / masker den oprindelige K124R enkelt mutant fænotype. Der blev rapporteret om dokumentation for, at der forekommer allestedsnærværende allestedsnærværende oplysninger i forskellige lysin i CENP-A K124R-proteinet med et stort tagprotein (EYFP), i vores tidligere publikation8. Det blev konstateret, at EYFP-mærkning fremkalder ubiquitination af et andet lysinsted for EYFP-CENP-A K124R, og at EYFP-CENP-A K124R-mutant binder sig til HJURP. Som følge heraf hæmmer og maskerer denne allestedsnærværendelation på et andet sted den oprindelige K124R-enkelt mutant fænotype, og både EYFP-CENP-A WT og K124R-mutanter viste centromere lokalisering (vi brugte og sammenlignede pBabe-EYFP-CENP-A WT og K124R-mutant sammen med pBabe-EYFP-kontrol.). Resultaterne viste, at flagmærkede eller umærkede CENP-A K124R-mutanter er dødelige, men kan reddes ved en monoubiquitinfusion, hvilket tyder på, at CENP-A allestedsnærværende forholdation er uundværlig for cellernes levedygtighed.
I de senere år har mange undersøgelser udviklet forskellige analyser til identifikation af posttranslationelle modifikationer (PTM'er) af CENP-A-protein og andre centromere-kinetochoreproteiner både in vivo og in vitro9,10,11. Svarende til PTM'er af histon proteiner, der er en vigtig mekanisme, der regulerer funktionen af kromatin, PTM'er af centromeric kromatin komponenter er også involveret i en væsentlig mekanisme til at regulere den overordnede struktur og funktion af centromeres. De fleste CENP-A PTM-anlæg er specifikke for CENP-A-holdige nukleosomer, selv om nogle få af dem er bevaret i histon H3, hvilket tyder på, at ændring af disse restkoncentrationer bidrager til den centromerespecifikke funktion. PTMs af CENP-A herunder fosforylering, acetylation, methylering, og allestedsnærværendelation blev tidligere rapporteret9, hvilket tyder på, at CENP-A er udsat for en række PTM'er og deres kombinatoriske arrays på sin amino endestation og C-terminus histone-fold domæne. Betydningen af CENP-A ændringer i flere funktioner blev afsløret af mange grupper, herunder vores. Disse funktioner omfatter CENP-A deposition på centromeres, protein stabilitet, og rekruttering af CCAN (konstituerende centromere-associerede netværk)9. Begrænsede undersøgelser og resultater af CENP-A-PTM'er er imidlertid præforme, hvor der foretages sammenligninger med en af kanoniske histoner, der direkte eller indirekte regulerer deres funktion. Tekniske rapporter med fokus på metoden til identifikation af disse CENP-A-PTM'er er også begrænsede.
Da CENP-A allestedsnærværendelation er nødvendig for CENP-A deposition på centromere12, arvet gennem dimerization mellem celledeling5, og uundværlig for celle levedygtighed8, metoden til at identificere CENP-A allestedsnærværendelation ville være afgørende i fremtiden at studere den funktionelle aktivitet, positionering, og struktur af centromere. Derfor beskriver vi her massespektrometrianalyse for at identificere allestedsnærværende allestedsnærværende EYFP-CENP-A K124R-mutant, hvilket tyder på, at EYFP-mærkningen fremkalder allestedsnærværende allestedsnærværende i CENP-A K124R-mutantprotein8. Protokoller for andre kontrolanalyser og analyser (immunofluorescensanalyse, analyse af koloniudvækst og in vivo allestedsnærværendelationsanalyse) præsenteres også for at drøfte resultatet af en grundig massespektrometrianalyse korrekt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Cellekultur og retrovirustransfektion af pBabe-EYFP-CENP-A konstruktioner
BEMÆRK: EYFP-CENP-A udtrykkes fra pBabe-EYFP-CENP-A på et proteinniveau, der svarer til det endogene CENP-A. Total cellulære CENP-A protein erstattes med denne EYFP-CENP-A efter afbrydelse af CENP-A-/F allel af Cre recombinase som i RPE-1 CENP-A-/- celler6.
- Klargøring af supernatanten indeholdende retrovirus ved hjælp af 293T-emballageceller.
- Dag 0: Spred 293T emballageceller på 6-brønds kulturpladen (1,0 x 106 celler/brønd). Kulturceller i høj-glucose DMEM med 10% FBS og 1% penicillin-streptomycin. Cellerne inkuberes ved 37 °C i en atmosfære på 5% CO2 i 24 timer.
BEMÆRK: For optimale resultater bestemmes empirisk den celletæthed, der skal anvendes i såning. - Dag 1: Tilbered transfekture reaktion omkring 23 timer efter spredning (24 h punkt er 0 h punkt af transfekturet). Transfect-udtryksplasmid af hver pBabe-EYFP (B3182), pBabe-EYFP-CENP-A WT (B3161) og pBabe-EYFP-CENP-A K124R (B3164) (se tabel 1).
- Vælg en kombination af hjælpemand/emballageplasmider, der er anført i tabel 2, og føj dem til rør, der indeholder en af de ovenfor nævnte plasmider. Der er for det meste disse 3 kombinationer for hjælper / emballage plasmider (Tabel 2). Enhver kombination arbejdede i disse forsøg og viste lignende transfektion effektivitet.
- Der fremstilles 50 μL reduceret serummedium, og der blandes 2,0 μg af hver pBabe-EYFP (B3182), pBabe-EYFP-CENP-A WT (B3161) og pBabe-EYFP-CENP-A K124R (B3164) (se tabel 1)tilføjelse af en kombination af hjælpe- og emballeringsplasmider, der er anført i tabel 2 (se nedenfor). Inkuber denne blanding ved stuetemperatur i 5 min. Denne blanding er opløsning A.
- Der fremstilles yderligere 50 μL reduceret serummedium, og der blandes henholdsvis 1,5 μL transfekturereagenser I og II (Tabel over Materialer). Inkuber denne blanding ved stuetemperatur i 5 min. Denne blanding er opløsning B.
BEMÆRK: Eventuelt tilsættes kun 6,0 μL transfekturereagens III (polyethyleneimin [PEI]; 1,0 mg/ml) i opløsning B eller tilsættes 6,0 μL transfekturereagens III ud over transfekturereagenser I og II i opløsning B (Materialetabel). - Bland opløsningerne A og B sammen, og inkuber ved stuetemperatur i 15 min.
- Efter vask af de dyrkede celler én gang med PBS tilsættes blandingen af opløsning A og B (dvs. DNA-lipidkompleks) direkte til hver brønd af den 6-brønds kulturplade, der har 500 μL reduceret serummedium. Den endelige koncentration af plasmid er 3,3 μg/ml.
- Efter inkubation af cellerne ved 37 °C i en atmosfære på 5% CO2 i 4,5 timer, ændre medium til høj-glukose DMEM med 10% FBS og 1% penicillin-streptomycin. Sæt 2 ml/brønd af kulturmedium efter medium ændring i 6-brønd kultur plade.
- Cellerne dyrkes ved 37 °C i en atmosfære på 5% CO2 i 48 timer efter transfekture. Udfør retrovirusinfektion på dag 3 ved hjælp af supernatanten, der indeholder retrovirus.
- Dag 0: Spred 293T emballageceller på 6-brønds kulturpladen (1,0 x 106 celler/brønd). Kulturceller i høj-glucose DMEM med 10% FBS og 1% penicillin-streptomycin. Cellerne inkuberes ved 37 °C i en atmosfære på 5% CO2 i 24 timer.
- Retrovirusinfektion af CENP-A-/F RPE-1-målceller.
- Dag 2: En dag før infektion spredes CENP-A-/F RPE-1-målceller for at transfect i 6-brøndkulturen godt (2,25 x 105 celler /brønd). Kulturceller i DMEM: F12 medium (Tabel over Materialer) med 10% FBS og 1% penicillin-streptomycin.
BEMÆRK: Spred celler til koloni udvækst assays, immunofluorescens, og western blot analyse som kontrol. For optimale resultater, empirisk bestemme celletæthed til brug i såning. - Dag 3 (viruss infektionsdag): Ved 48 timer efter transfektion af 293T-emballageceller indsamles supernatanten, der indeholder virus, og filtreres gennem 0,45 μm-filter (brug ikke et 0,2 μm filter, der vil forskyde viruskuverten). Det anbefales at bruge polyethersulfon (PES) filtre.
- Inficere CENP-A-/F RPE-1 celler med virus. For en brønd af 6-brønden kultur plade, tilsættes 1 ml friske medier, 1 ml virus supernatant og polybrene til en endelig koncentration på 8 μg/ml. CENP-A-/F RPE-1-celler inkuberes ved 37 °C i en atmosfære på 5% CO2 i 4 dage indtil dag 7 efter transfektion.
BEMÆRK: Inkubationstiden for CENP-A-/F RPE-1-cellevækst bestemmes empirisk ved at følge analyser for optimale resultater.
- Dag 2: En dag før infektion spredes CENP-A-/F RPE-1-målceller for at transfect i 6-brøndkulturen godt (2,25 x 105 celler /brønd). Kulturceller i DMEM: F12 medium (Tabel over Materialer) med 10% FBS og 1% penicillin-streptomycin.
2. Immunofluorescensanalyse af celler, der indeholder pBabe-EYFP-CENP-A
- Dag 7: 4 dage efter retrovirus infektion af pBabe-EYFP-CENP-A konstruktioner, fjerne dyrkningsmediet ved aspiration. Skyl cellerne én gang med TBS (25 mM Tris-HCl, pH 7,5; 125 mM NaCl). Påfør TBS på siden af dyrkningsbrøndene for at undgå at forstyrre cellernes overflade.
BEMÆRK: Det optimale tidspunkt for cellefiksering skal bestemmes empirisk. Immunofluorescence signaler fra både EYFP-CENP-A WT og K124R kan påvises på centromere mindst 4 dage efter retrovirus infektion af pBabe-EYFP-CENP-A konstruktioner selv uden Cre infektion (data ikke vist, Figur 1C-E for data med Cre infektion). - Udfør methanolcellefiksering og immunofluorescensfarvning som beskrevet tidligere13.
- Da primære antistoffer bruger et anti-GFP-antistof (1:1.000 fortynding) og et anti-CENP-B-antistof (fortyndingsforhold på 1:200) til en centromere placeringsmarkør i TBS indeholdende 4% gedeserum (se Tabel over Materialer for anvendte antistoffer).
- Fjern overskydende monteringmed en køkkenrulle og forsegle kanterne af dækslerne med neglelak på det sidste trin.
- Der henvises til den tidligere beskrevne metode13 for immunfluorescens billedobservation, erhvervelse, kvantificering og analyse af resterende signaler fra EYFP-CENP-A på centromere.
- Udfør billederhvervelse, behandling, herunder deconvolution, kvantificering og analyse ved hjælp af Softwares A eller SoftwareS B1 og B2 (se Tabel over Materialer). Du kan eventuelt bruge Software C1-C3 (se Tabel over Materialer) til et konfokalt laserscanningsmikroskop.
BEMÆRK: Se 2.6.1 i supplerende kodningsfiler for alle kommandoer, der bruges i software A. Se 2.6.2 i supplerende kodningsfiler for alle kommandoer, der bruges i Software B1 og B2.
3. Koloni udvækst assays ved hjælp af pBabe-EYFP-CENP-A efter retro-Cre virus infektion
BEMÆRK: Årsagen til at udføre denne analyse er at sammenligne cellens levedygtighed mellem EYFP-CENP-A WT og K124R-mutant efter afbrydelsen af CENP-A-/F-allelen af Cre recombinase (efter udskiftning af det samlede cellulære CENP-A-protein).
- Retrovirustransfektion af pBabe-EYFP-CENP-A konstruktioner.
- Udfør retrovirustransfektction af CENP-A-/F RPE-1 celler som beskrevet i afsnit 1. Kulturceller i DMEM: F12 medium med 10% FBS og 1% penicillin-streptomycin i 72 timer efter virusinfektionen.
- Tre dage efter retrovirusinfektion af pBabe-EYFP-CENP-A-konstruktioner (på dag 6) tilsættes blasticidin S (10 μg/ml) i brønde, der indeholder transficerede celler, og som skal anvendes til analyse- og kontrolforsøg i koloninedvækst. Celler dyrkes mindst 14 dage efter virusinfektion i nærvær af blasticidin S. Skift mediet indeholdende blasticidin S hver 5.
BEMÆRK: Hvis cellerne når omkring 80% sammenløb før såning til kolonien assay (3.2.7. og 3.2.8), passage cellerne på 1:2 og 1:5 forholdet ved trypsinisering og plating i en 6 godt kultur plade. - Saml celler til western blot på dag 7 for at bekræfte proteinudtrykket af pBabe-EYFP-CENP-A konstruktioner uden Cre-infektion. Udfør western blot analyse som beskrevet i afsnit 4. Resultaterne er vist i figur 1B (bane 1-4).
- For koloni udvækst assay med Cre virus infektion, holde cellerne vokser i 14 dage efter virusinfektion i overværelse af blasticidin S (dvs. vokse celler i blasticidin S indeholder medium indtil dag 17 for de resultater, der præsenteres her).
- Retro-Cre virusinfektion af pBabe-puro-Cre
BEMÆRK: Dag 0 i trin 3.2.1 svarer til dag 13 i punkt 3.1.- Dag 0 til dag 3: Udfør retrovirustransfektction af CENP-A-/F RPE-1-celler ved hjælp af pBabe-puro-Cre (B3027) som udtryksplasmid (se afsnit 1 for yderligere oplysninger). Sørg for, at dyrkningsmediet tilsættes blasticidin S (10 μg/ml).
- Dag 4: Trypsinize celler til at frigøre det fra pladen. Plade 500 eller 5.000 celler i tre eksemplarer i 6-brønds kulturpladen. Kulturceller i DMEM: F12 medium med 10% FBS og 1% penicillin-streptomycin.
- Dag 5: Tilsæt blasticidin S (10 μg/ml) til dyrkningsmediet. For 5.000 eller 500 cellers plettering celler med blasticidin S (10 μg/ml) 3-24 dage (indtil dag 14 i [3.2.7]) eller 3-28 dage (indtil dag 18 i [3.2.8]) efter virusinfektion af konstruktioner (pBabe-EYFP-CENP-A konstruktioner).
BEMÆRK: I denne analyse af udvækst i kolonien tilsættes transfekturet pBabe-puro-Cre sammen med transfekturet pBabe-EYFP-CENP-A. Transinfektionen af pBabe-EYFP-CENP-A udføres i 3.1. Transinfektionen af pBabe-puro-Cre udføres i 3.2.1. - Dag 10 (7 dage efter retro-Cre virusinfektion): Opsaml celler til vestlig blotting analyse for at bekræfte proteinudtømning af endogene CENP-A efter retro-Cre virus infektion og / eller protein udtryk for pBabe-EYFP-CENP-A konstruktioner på samme dag 10.
- Udfør vestlig blotting som beskrevet i afsnit 4 på samme dag 10. Resultaterne er vist i figur 1B (bane 5-7).
- Udfør immunfluorescensanalyse (afsnit 2 ovenfor) for at bekræfte, at både EYFP-CENP-A WT og K124R lokaliseret til centromere 7 dage efter inaktivering af den resterende endogene CENP-A-alle. Resultaterne er vist i figur 1C-1E.
- Dag 14: Udfør koloniens udvækstanalyse med pladen sået med 5.000 celler. Cellerne i 10 min. i methanol og pletten i 10 min. i en krystalo violet opløsning (2,3 % krystal violet, 0,1 % ammoniumoksalat, 20 % ethanol (se figur 2B). Tæl antallet af kolonier ved hjælp af OpenCFU-softwaren (se figur 2C).
- Dag 18: Brug pladen sået med 500 celler. Plet- og pletceller som beskrevet i trin 3.2.7 (se figur 2B). Antallet af kolonier tælles (se figur 2C).
4. Western blot analyse ved hjælp af pBabe-EYFP-CENP-A
BEMÆRK: Der henvises til den tidligere beskrevne metode13 for Western blot-analyse ved hjælp af antistoffer, der er angivet i figur 1B og figur 2A og tabel over materialer til EYFP-CENP-A-proteiner.
- Isoler proteiner ved at lyse cellerne dyrket med forskellige virusinfektioner. Brug derefter 20 μg protein i en brønd af SDS PAGE gel. Proteinerne overføres til en PVDF-membran som beskrevet tidligere13.
- Membranen 3x vaskes efter inkubationer med primære sekundære antistoffer. Detekter og analyser proteinbåndene på membranen med det infrarøde billedsystem og/eller chemiluminescens imager til immunoblotdetektion. Disse resultater er vist i figur 1B og figur 2A.
- For at det infrarøde billedsystem kan detektere og analysere proteinbåndene, skal du se trin 4.2.1 i supplerende kodningsfiler.
- Brug chemiluminescence imager til at opdage og analysere proteinbånd, se trin 4.2.2 i Supplerende kodning filer. Til dette system skal du bruge et ultrafølsomt udvidet chemiluminescent (ECL)substrat (Tabel over Materialer).
- Eventuelt skal du bruge western blot stripping buffer til at fjerne præindkubede antistoffer fra PVDF membranen og reblot det med forskellige antistoffer til næste tur af vestlige analyse. Empirisk bestemme den optimerede inkubationstid og temperatur til at bruge.
5. Cellekultur, transfekture og in vivo allestedsnærværendelationsanalyser ved hjælp af pQCXIP-EYFP-CENP-A
BEMÆRK: Proteinniveauet for EYFP-CENP-A udtrykt fra pQCXIP-vektor er ~ 10x højere end det endogene CENP-A-proteinniveau. Brugen af denne vektor letter immunudsedningen af en højere mængde af EYFP-CENP-A-proteinerne, observation af EYFP-CENP-A-proteinets allestedsnærværende allestedsnærværende bånd og identifikation af allestedsnærværende EYFP-mærket CENP-A (EYFP-CENP-A) protein gennem massespektrometrianalyse.
- Transfektion for in vivo allestedsnærværendelationsanalyser ved hjælp af pQCXIP-EYFP-CENP-A.
- Frø 36,2 x 105 CENP-A-/F RPE-1 celler i en 10 cm væv kulturskål. Kulturceller i høj-glucose DMEM med 10% FBS og 1% penicillin-streptomycin.
BEMÆRK: For at opnå optimale resultater bestemmes empirisk den celletæthed, der skal anvendes til såning. Der fremstilles mindst 2 skåle til én prøve af immunforgrundelse (IP) for at opnå mindst 1 mg totalprotein. - Cellerne inkuberes ved 37 °C i en atmosfære på 5% CO2 i 18 timer.
- Ved 17 timer efter såning fremstilles transfekturereagenserne.
- Opløsning A blandes 6,7 μg plasmid af hver pQCXIP-EYFP (B3252), pQCXIP-EYFP-CENP-A WT (B3254), pQCXIP-EYFP-CENP-A K124R (B3256) (Tabel 1) i 335 μL reduceret serum og inkuberes ved stuetemperatur i 5 min. Tilsæt 6,7 μg plasmid af pCGN-HA-Ubiquitin (B2806) til alle prøver.
BEMÆRK: Alle vektorer er anført i tabel 1. - Opløsning B blandes ved at blande henholdsvis 10,1 μL transfekturereagenser I og II i 335 μL reduceret serummedium og inkuberes ved stuetemperatur i 5 min.
BEMÆRK: Et valgfrit trin er kun at tilsætte 40,2 μL transfekturereagens III (polyethyleneimidin [PEI]; 1,0 mg/ml) i opløsning B eller tilsættes 40,2 μL transfektiv reagens III ud over transfekturereagenser I og II i opløsning B (Materialetabel). - Bland opløsningerne A og B sammen, og inkuber ved stuetemperatur i 15 min.
- Efter vask af de dyrkede celler én gang med PBS tilsættes blandingen af opløsning A og B (dvs. DNA-lipidkompleks) direkte til hver af de enkelte 10 cm vævskulturskål, der har 3,35 ml μL reduceret serummedium.
BEMÆRK: Den endelige koncentration er 1,67 μg/ml plasmid. - Cellerne inkuberes ved 37 °C-inkubatoren med 5% CO2 i 4,5 timer. Efter 4,5 timer ændres mediet til DMEM med høj glukose med 10% FBS og 1% penicillin-streptomycin.
- Cellerne dyrkes ved 37 °C med 5% CO2 i 48 timer efter transfekture. Indsamle celler til celle lysater forberedelse.
- Frø 36,2 x 105 CENP-A-/F RPE-1 celler i en 10 cm væv kulturskål. Kulturceller i høj-glucose DMEM med 10% FBS og 1% penicillin-streptomycin.
- Forberedelse af protein A perler bundet med anti-GFP antistof.
- Der skales 25 μL (50% v/v) protein A-perler for én immunforsorg (IP). Vask med buffer A1 (Tabel over Materialer) mindst 3x for at fjerne EtOH, og lav 50% opløsning med buffer A1 (20 mM Tris-HCl, pH 7.4; 50 mM NaCl; 0,5% Nonidet P-40; 0,5% deoxycholate; 0,5% SDS; 1 mM EDTA; komplet EDTA-fri proteasehæmmer reagent).
- Der tilsættes 2,0 μL anti-GFP-antistof (Anti#76: Hjemmelavet antistof) til de ovenfor fremstillede perler, og der tilsættes 10x volumen buffer A1 sammenlignet med nettoperlervolumen.
- End-to-end-rotationen udføres ved 4 °C i 4-18 timer. Den optimale tidslængde for end-to-end rotation bestemmes empirisk ud fra immunoprecipitationens effektivitet.
- Centrifuger perlerne ved 100 x g i 1 min og fjern det ubundne supernatant. Tilføj buffer A1 for at re-gøre en 50% (v / v) opløsning af perlerne. Brug 25 μL (50% v/v) af denne opløsning til én IP-reaktion.
- Immunoprecipitation (IP) ved hjælp af protein En sepharoseperler bundet med anti-GFP antistof.
- Lyse celler opnået i trin 5.1.9 i buffer A1 ved sonikering og fryse-tø proces.
- Mål proteinkoncentrationerne, og normalisering af proteinmængderne mellem forskellige IP-prøver. Fjern 5 % af prøven fra hvert rør for at køre som 5 % inputprøve i SDS-PAGE.
BEMÆRK: Den 5% Input prøve kan fryses i flydende nitrogen og på stocked ved -80 °C, hvis det ikke er indlæst inden for en dag. - Bland resten af 95% lysat med 25 μL (50% v/v) protein A perler bundet til anti-GFP antistof, der blev fremstillet i trin 5.2. End-to-end-rotationen udføres ved 4 °C i 4-18 timer.
BEMÆRK: Den optimale tidslængde for end-to-end-rotation skal bestemmes empirisk. - Centrifugeprotein A-perler med det protein, der er bundet til det (dvs. immuncipitænere) med 100 x g i 1 min, og fjern supernatanten. Immunoprecipitatterne vaskes med buffer A1 ved centrifugering ved 100 x g i 1 min. Udfør dette trin 4x.
- 5% Input og resten af 95% immunopretræst med henholdsvis 2x og 4x SDS-PAGE-belastningsbuffer14. Kog disse to prøver i 5 min og derefter indlæse dem på en 10,0% denaturering SDS-polyacrylamide gel til elektroforese i forskellige baner. Brug større SDS-PAGE gel (f.eks 17 cm x 15 cm) til elektroforese. Hvis prøverne køres i mindre gel, er det muligvis ikke muligt at observere klare/skarpe allestedsnærværende bånd.
- Western blot-analysen udføres som beskrevet i afsnit 4 ved hjælp af de antistoffer, der er angivet i den foregående rapport8. Resultatet vises i figur 2A.
- Brug western blot stripping buffer til at fjerne de præinkuberede antistoffer fra PVDF membranen og reblot det med forskellige antistoffer til den næste runde af vestlige blot analyse.
6. Massespektrometri til identifikation af allestedsnærværende allestedsnærværende allestedsnærværende lygningsstedet for EYFP-CENP-A K124R-mutanten
- Transfektion til massespektrometrianalyse ved hjælp af pQCXIP-EYFP-CENP-A.
- Frø CENP-A-/F RPE-1 celler i en 10 cm væv kulturskål. Kontroller, at celletætheden er 36,2 x 105 celler pr. skål. Kulturceller i høj-glucose DMEM med 10% FBS og 1% penicillin-streptomycin. Der fremstilles mindst 20 skåle til én immunforudgrundsprøve (IP) for at opnå mindst 10 mg protein i alt (se 5.3).
BEMÆRK: For optimale resultater bestemmes empirisk den celletæthed, der skal anvendes i såning. - Cellerne inkuberes ved 37 °C i en atmosfære på 5% CO2 i 18 timer. Klargør transfekturereagenserne ~ 23 h efter spredning (24 h point er 0 h point af transfekturet).
- Efter 17 timer efter såning fremstilles transfekturereagenser og transfect-cellerne som (4.1.3). Transficerede celler har pCGN-HA-Ubiquitin (B2806) og pQCXIP-EYFP-CENP-A K124R (B3256).
- Cellerne inkuberes ved 37 °C i en atmosfære på 5% CO2 i 48 timer efter transfekturet. Indsamle celler til celle lysater.
- Lyse celler i buffer A1 og udfør immunforudånding som (5.2) og (5.3). Disse to af immunforestigningslysaterneefter (6.1.6) og (6.1.7) foreløber.
BEMÆRK: I (6.1.6) skal prøven køres i tris-glycingeler med standardtrier. I (6.1.7) skal prøven køres i de kommercielt tilgængelige 4%-12% Bis-Tris proteingeléer. Se også Diskussion. - Opbevar en prøve for 10 % af de samlede immunoprecipitants for at bekræfte EYFP-CENP-A allestedsnærværendelation og for præcist at bestemme placeringen af allestedsnærværende EYFP-CENP-A som beskrevet i afsnit 5. Denne prøve køres i tris-glycingeler med standard. SDS-PAGE og western blot blev udført som (5.3).
- Opbevar en anden prøve for 90% af de samlede immunoprecipitanter til massespektrometrianalyse. Kør denne prøve inden for to brønde af de kommercielt tilgængelige 4%-12% Bis-Tris protein geler. Udfør Coomassie blå farvning ved hjælp af Coomassie blå opløsning. Punktafgifter og skåret ud gel regionen 50-70 kDa (formodede mono-Ub-EYFP-CENP-A K124R region). Brug denne gel region for massespektrometri analyse.
- Frø CENP-A-/F RPE-1 celler i en 10 cm væv kulturskål. Kontroller, at celletætheden er 36,2 x 105 celler pr. skål. Kulturceller i høj-glucose DMEM med 10% FBS og 1% penicillin-streptomycin. Der fremstilles mindst 20 skåle til én immunforudgrundsprøve (IP) for at opnå mindst 10 mg protein i alt (se 5.3).
- Massespektrometri analyse ved hjælp af in-gel fordøjelse.
- Skær hver gel skive af interesse i små stykker (1 mm2)og læg den i 0,5 ml protein lav binding rør.
- Vask med 100 μL 50% (v/v) acetonitril i 25 mM NH4HCO3,vortex 10-15 min, spin ned, kassér supernatanten, gentag 3x.
- Prøven koncentreres ved hjælp af støvsugerkoncentratoren på benchtop i 30 minutter for at tørre gelstykkerne.
- Der tilsættes 10 μL 10 ng/μL sekvenseringsgrad trypsin, og gelstykkerne skal rehydreres i 5 min.
- Tilsæt 25 mM NH4HCO3 lige nok til at dække gel stykker, fordøje ved 37 °C natten over.
- Den fordøjede supernatant overføres til et rent 0,65 ml silikoneglas. Der tilsættes 50% (v/v) acetonitril/5% (v/v) myresyre (30 μL eller nok til at dække), vortex 10 min, spin og overførsel til samme ekstraktionsrør. Gentag 3x.
- Tilsæt 10 μL acetonitril til gelstykkerne, vortex 5 min, og spin ned. Overfør supernatanten til samme rør.
- Prøverne koncentreres ved hjælp af støvlekoncentratoren på benchtop til 2 μL, der tilsættes 8 μL 3% (v/v) acetonitril /2% (v/v) myresyre til prøven, vortex i 15 minutter og spin ned ved 16.000 x g i 30 min. Prøverne er klar til massespektrometrianalyse.
- Udfør ms dataindsamling med LC-MS/ MS ved hjælp af en flydende kromatografi system (Tabel over Materialer) kombineret med en massespektrometri instrument ( Tabel overMaterialer).
- 8 μL rekonstitueret prøve indsprøjtes på en rplc-kolonne (reverse phase liquid chromatography).
- Adskil peptiderne med en 2-80% gradient af opløsningsmiddel B i 60 min. Sørg for, at hældningen består af en stigende procentdel af opløsningsmiddel B fra 2% til 22% i 40 min, 22% til 35% opløsningsmiddel B i 12 min, derefter klatre til 80% opløsningsmiddel B i 4 min, og endelig holde på 80% opløsningsmiddel B for de sidste 4 min. Indstil strømningshastigheden konstant på 300 nL / min.
BEMÆRK: Opløsningsmiddel A indeholder 0,1% myresyre og 2% acetonitril, opløsningsmiddel B indeholder 0,1% myresyre og 98% acetonitril. Alle koncentrationer vises som volumen/volumen. - Indsaml massespektrometridata ved hjælp af dataafhængig anskaffelsestilstand. Opsaml kort MS-spektre i 350-1500 m/z for 250 ms. Vælg de 50 intense topprækursorer med ladning 2-5 for yderligere fragmentering. Saml MS/MS-spektre i 100-2000 m/z for 100 ms, Ekskludering af prækursorer fra genvalg for 15 s.
- Hvis du vil søge i databasen, skal du åbne den kommercielle software (se Tabel over Materialer)for at analysere massespektrometridata på skrivebordet.
- Hvis du vil foretage en ny søgning, skal du klikke på knappen "LC" i den øverste menu. Klik derefter på knappen "Tilføj" for at overføre de oprindelige MS-rådatafiler.
- Vælg "Human Protein ID" i "Paragon Method" som databasesøgningsmetode. Søg i de oprindelige MS-rådatafiler i forhold til UniProt Homo Sapiens-databasen (der indeholder 160.566 sekvenser, http://www.uniprot.org/proteomes/UP611385640).
- Indstil søgeparametre som følgende: vælg trypsin som fordøjelsesenzymet, tillad op til 3 manglende spaltninger, 4 modifikationer og 2-5 ladninger pr. peptid. Indstil massefejl op til 20 ppm for den første søgning og 0,02 Da for fragmenterede ioner. Angiv FDR-tærskler (false discovery rate) for protein-, peptid- og modifikationssteder, der er mindre end 1 %. Indstil alle de andre parametre i softwaren til standardværdier (se figur 3 for massespektrometrianalyse).
- Klik på knappen "Gem som" til højre for den øverste menu, vælg en mappe til lagring af søgeresultaterne, skriv søgenavnet, og klik på knappen "Gem".
- Klik på knappen "Proces" til højre for den øverste menu for at starte søgningen. Når søgningen er afsluttet, gemmes data med det indtastede søgenavn automatisk i den valgte mappe. Dataene kan nemt åbnes af Software F.
- Hvis du vil have MS/MS-spektre for et bestemt peptid, skal du dobbeltklikke på søgeresultaterne for at åbne det ved hjælp af Software F. Først skal du klikke på proteinet i proteinlisten øverst i menuen og derefter klikke på peptidet midt i menuen. MS/MS for dette peptid vises nederst i menuen.
- Hvis du vil eksportere og gemme MS/MS-spektre, skal du højreklikke på MS/MS-spektrene nederst i menuen, vælge kopiér og derefter indsætte i en passende fil, f.eks.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
EYFP-CENP-A K124 mutant viser allestedsnærværendelation, interaktion med HJURP, og ingen fejl i centromere lokalisering hverken celle dødelighed. Her blev det system, der blev rapporteret af Fachinetti et al. (2017)6, genindsat: I diploid humane (RPE-1) celler, der bærer en afbrudt, og en 'floxed'' CENP-A allel (CENP-A-/F), blev EYFP-CENP-A udtrykt fra den retrobe-EYFP-vektor. I dette system kan udtrykket af endogen CENP-A fra CENP-A-/F-allelen blive forstyrret af Cre recombinase6. Genkonstruktioner af EYFP- CENP-A WT eller K124R mutant (Figur 1A), som redder tabet af endogene CENP-A, blev stabilt udtrykt, da der blev udført retroviral integration. Det resterende udtryk for endogen CENP-A fra CENP-A-/F-allelen blev derefter afbrudt af Cre recombinase. Udtrykket af endogene CENP-A blev ikke påvist 7 dage efter induktion af Cre recombinase (Figur 1B, baner 5-7). Både EYFP-CENP-A WT og K124R proteinudtryk blev anset for at være på samme niveau som det oprindelige endogene CENP-A-proteinniveau (figur 1B, bane 3, 4, 6 og 7). Både EYFP-CENP-A WT- og K124R-mutanter viste centromerelokalisering 7 dage efter afbrydelsen af det resterende udtryk for endogen CENP-A fra CENP-A-/F allelen (Figur 1C-1E). Både EYFP-CENP-A WT og K124R-mutanten udviste allestedsnærværende forhold og interaktion med HJURP i modsætning til tilfældet flagmærket eller umærket CENP-A WT og K124R-mutanten (Figur 2A; data, der ikke er vist for flagmærket eller umærket CENP-A)8. Cellelevedygtigheden blev også behandlet ved at udføre den udvækstanalyse af kolonien 14 dage efter afbrydelsen af den resterende endogene CENP-A-allel (figur 2B). Både EYFP-CENP-A WT- og K124R-mutanter udviste et tilsvarende antal ''reddede''-kolonier 14 dage efter afbrydelsen af den resterende endogene CENP-A-allel (figur 2B og 2C). Således er vores resultater i overensstemmelse med dem, der rapporteres af Fachinetti et al.6.
Allestedsnærværende lysin 306 (K306) i EYFP-CENP-A K124R blev afsløret ved massespektrometri analyse. Det blev konstateret, at både EYFP-CENP-A WT og K124R-mutanten udviser allestedsnærværende forhold og interaktion med HJURP i modsætning til tilfældet flagmærket eller umærket CENP-A WT og K124R-mutanten (Figur 2A; data, der ikke er vist for flagmærket eller umærket CENP-A)8. Disse resultater tyder på, at fusionen af EYFP-protein fremkalder allestedsnærværende behandling hos en anden lysin end K124 i EYFP-CENP-A K124R-mutant, og denne allestedsnærværendelation på et andet sted fremmer samspillet mellem EYFP-CENP-A K124R med HJURP. Allestedsnærværendelation ved lysin 306 (K306) i EYFP-CENP-A K124R blev afsløret i CENP-A-/F-celler ved IP-massespektrometrianalyse (figur 3A og figur 3B). Lysin 306 (K306) i EYFP-CENP-A K124R svarer til lysin 56 (K56) i CENP-A. Samlet set tyder vores resultater på, at fusionen af stort protein (f.eks. EYFP-tagging) fremkalder allestedsnærværende behandling ved en anden lysin end K124 i CENP-A, og denne allestedsnærværendelation på et andet sted hæmmer/maskerer den oprindelige K124R enkelt mutant fænotype.
Figur 1: EYFP-CENP-A K124-mutant lokaliserer ved centromeres. (A) Repræsentationer af de forskellige CENP-A proteinkonstruktioner mærket med EYFP (forbedret gult fluorescerende protein) ved N-endestationen. Røde bogstaver markerer placeringen af K124R aminosyre substitution i den angivne konstruktion (venstre). Resultaterne af de analyser, der er udført i denne undersøgelse, er vist (til højre). (B) Western blot analyse viste ikke tilstedeværelsen af påviselige endogene CENP-A. Immunoblots analyse for at kontrollere for tilstedeværelsen af udtryk for de angivne redningskonstruktioner (ca. 45 kDa) før og efter Cre-infektion. Proteinudtrykket af pBabe-EYFP-konstruktioner blev bekræftet før Cre-infektion (vognbane 1-4) samt efter Cre-infektion (vognbane 5-6). Fraværet af det endogene CENP-A-protein (ca. 15 kDa) blev bekræftet i CENP-A-/- cellelinjer indsamlet 7 dage efter Cre-infektion (vognbane 5-6). GAPDH protein blev brugt som en lastning kontrol. (C) EYFP-CENP-A K124 mutant lokaliserer ved centromeres. CENP-A-/F RPE-1-celler blev cotransficeret med indicerede konstruktioner, dyrket 7 dage efter retro-Cre virusinfektion og immunostained. Visualisering af DAPI (blå), EYFP (grøn) og endogene CENP-B (rød), der fungerede som en centromere placeringskontrol. Vægtstang, 10 μm. (D) Lokaliseringsmønstrene vist i (C) opsummeres som histogrammer. Mere end 200 interfaseceller med EYFP-positive signaler blev talt pr. eksperiment (n ≥ 3 forsøg), og gennemsnitsprocenterne (±SD) vises. ''Andre (Ikke-centromere)'' viser for det meste beskadigede celler, døde celler eller celler med nukleolarlokalisering i interfase, som blev observeret på grund af transfektion eller andre behandlinger. Der blev ikke observeret nogen signifikant (n.s.) forskel i K124R sammenlignet med WT (Student's t-test). (E) EYFP-afledte signaler ved centromeres vist i (C) blev kvantificeret. Signalerne blev normaliseret til WT's, og gennemsnitsprocenterne (±SEM) vises. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: EYFP-CENP-A K124-mutant er ubiquitylated og interagerer med HJURP, og celleoverkommeligheden blev ikke påvirket af K124R-mutationen af EYFP-CENP-A. (A) EYFP-CENP-A K124-mutanten er ubiquitylated og interagerer med HJURP. In vivo allestedsnærværendelation assay. CENP-A-/F RPE-1-celler blev transficeret med de angivne konstruktioner. Proteiner i 5% af de samlede cellelysater (Input) og immunoprecipitater (IP) ved hjælp af anti-GFP kanin polyklonal antistof blev påvist ved western blot analyse ved hjælp af de angivne antistoffer. Det er angivet, at putative di-Ub-EYFP-CENP-A (**) og den formodede mono-Ub-EYFP-CENP-A (*) er angivet. Dette tal er blevet ændret fra Niikura et al.8. ( B)Repræsentative billeder fra koloniens udvækstanalyse som vist i ordningen (øverst) af to forskellige betingelser ([1] og [2]) for de angivne transfektanter i EYFP-CENP-A. cC) Histogrammer, der sammenfatter kolonioverlevelse af forsøgene i afsnit B. Gennemsnitsprocenterne (±SEM) for mere end 3 uafhængige forsøg (n ≥ 3) normaliseres med procentdelen af overlevende kolonier i EYFP-CENP-A WT (EYFP-WT). p < 0,0001 og ** p < 0,01 sammenlignet med EYFP kontrol (Student's t-test). Der blev ikke observeret nogen signifikant (n.s.) forskel i K124R sammenlignet med WT (Student's t-test). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Fragmenter af allestedsnærværende EYFP-CENP-A K124R peptider blev påvist ved massespektrometrianalyse. (A) Tegn på allestedsnærværende allestedsnærværende lysin 306 (K306) af EYFP-CENP-A K124R i RPE-1 CENP-A-/F-celler. Lysin 306 (K306) af EYFP-CENP-A K124R svarer til lysin 56 (K56) i CENP-A. LQKLRGGSTHLLIR peptid (dækning 95,9%, tillid 87.8%) identificeret ved kollisionsinduceret dissociationsanalyse. M/z (Da) værdierne for b (grøn) og y (rød) i spektre (A), der påvises under fragmenteringen, fremhæves med grønt i tabellen (B). Den allestedsnærværende K306 bekræftes af LRGG motiv (ufuldstændig spaltning) af b-3 ion (m/ z 753.4730) og y-8 ion (m / z 1350.8328). (B) Tabellen fremhæver m/z-værdierne (Da) for b (grøn) og y (rød) i spektrene (A). LQK[Umc]STHLLIR i tabellen (B) angiver LQKLRGGSTHLLIR peptid vist i (A). Disse tal er blevet ændret fra Niikura et al.8. Klik her for at se en større version af dette tal.
| B-tal | Relevante egenskaber | Reference | Kilde |
| B3027 | pBabe-puro-Cre | Niikura et al., 2019 | Dr. Amruta Ashtekar, Dr. Lawrence S. Kirschner |
| B3182 | pBabe-EYFP delte et pr. år | Niikura et al., 2019 | - |
| B3161 | pBabe-EYFP-CENP-A WT | Niikura et al., 2019 | Dr. Daniele Fachinetti, Dr. Don W. Cleveland |
| B3164 | pBabe-EYFP-CENP-A K124R | Niikura et al., 2019 | Dr. Daniele Fachinetti, Dr. Don W. Cleveland |
| B3031 | psPAX2 delte et 2.-28. | Niikura et al., 2019 | Dr. John Thompson, Dr. Gustavo W. Leone |
| D3032 | pMD2.g | Niikura et al., 2019 | Dr. John Thompson, Dr. Gustavo W. Leone |
| B3189 | Pgp | Niikura et al., 2019 | Dr. Kenji Tago (Jichi Medical Univeristy, Japan) |
| B3190 | pCI-VSVG | Niikura et al., 2019 | Dr. Kenji Tago (Jichi Medical Univeristy, Japan) |
| B3001 | pPAM | Niikura et al., 2019 | - |
| B3252 | pQCXIP-EYFP | Niikura et al., 2019 | - |
| B3254 | pQCXIP-EYFP-CENP-A WT | Niikura et al., 2019 | - |
| B3256 | pQCXIP-EYFP-CENP-A K124R | Niikura et al., 2019 | - |
| B2806 | pCGN-HA-Ubiquitin | Niikura et al., 2019 | - |
Tabel 1: Plasmidvektorer, der anvendes i denne undersøgelse.
| B-tal | Hjælper/emballage plasmid vektorer | Kombination 1 | Kombination 2 | Kombination 3 |
| B3031 | psPAX2 (lentiviral gag/pol vektor) | 2 μg | ||
| D3032 | pMD2.g (lentiviral env vektor) | 2 μg | ||
| B3189 | pGP (retroviral gag/pol vektor) | 2 μg | ||
| B3190 | pCI-VSVG (retroviral env vektor) | 2 μg | ||
| B3001 | pPAM (amphotropic hjælper vektor kodning retroviral gag-pol-env) | 2 μg |
Tabel 2: Kombinationer af hjælpe-/emballageplasmidvektorer, der anvendes i (1.1.3): Transinfektion af retrovirus af pBabe-EYFP-CENP-A konstruktioner.
Supplerende kodningsfiler. Klik her for at downloade disse filer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her beskrev vi metoder til massespektrometri analyse for at identificere allestedsnærværendelation af EYFP-CENP-A K124R mutant tyder på, at EYFP tagging inducerer allestedsnærværendelation på en anden lysin i CENP-A K124R mutant protein8. I vores resultater identificerede vi med succes allestedsnærværende lysin 306 (K306) i EYFP-CENP-A K124R, der svarer til lysin 56 (K56) i CENP-A gennem massespektrometrianalyse. Massespektrometri analyse beskrevet her er en efterligne metode, som vi tidligere identificere lysin 124 (K124) allestedsnærværendelation site af CENP-A WT-Flag12. Derfor kan denne metode anvendes på humant CENP-A protein med forskellige tags og andre centromere-kinetochore proteiner. Massespektrometrianalysen baseret på LC-MS/MS accepteres almindeligvis for at identificere potentielle posttranslationelle ændringer (PTM'er) af et bredt spektrum af proteiner. Vores kombinatoriske metoder bestående af flere analyser / analyser (dvs. in vivo allestedsnærværende kodikation, koloni outgrowth assay, og massespektrometri analyse) kunne anbefales til forskere, der er interesseret i at identificere funktionelle roller allestedsnærværende (r) af deres mål protein (r).
Denne protokol omfatter dog ikke påvisning af ubiquitylerede bånd og/eller identifikation af stedspecifikke allestedsnærværende aktiviteter af disse proteiner i levende celler eller en bestemt enkelt celle under hele cellecyklussen. Disse år optogenetiske tilgange er udviklet dramatisk og giver en stor indvirkning på kvantitative undersøgelser af celle-signalering systemer. Optogenetik har oprindeligt givet tilgange, der præcist aktiverer eller hæmmer individuelle neuroner ved hjælp af mikrobiele, mikrobielle opsinbaserede systemer. I øjeblikket kan proteinaktivitet med hidtil uset spatiotemporal præcision styres ved at udnytte naturlige genetisk kodede fotoreceptorer, og forskellige genetisk kodede værktøjer tillader lyskontrol af mange biologiske processer, herunder proteinphorylatation15. Derfor optogenetik er et lovende system til at undersøge spatiotemporal protein kinase signalering på cellulære og hele organismen niveauer. Antallet af lysstyrede proteinkinaser er hastigt voksende, selv om det nuværende antal stadig er begrænset. Udviklingen af lyskontrolleret protein allestedsnærværendelation er imidlertid forsinket, og høj molekylvægt mærkning af fotoreceptorer kan forstyrre allestedsnærværende behandling af både WT og mutant proteiner og funktionelt ændre den indfødte proteinfunktion som angivet. Derfor er udviklingen af lavere molekylvægt tagging eller sondering teknik er presserende forpligtet til at visualisere allestedsnærværende og / eller at undersøge spatiotemporal protein allestedsnærværende signalering på de levende cellulære og hele organismen niveauer.
I denne undersøgelse er EYFP vektorkontrol afgørende for kontrolanalyser og analyser (immunfluorescensanalyse, koloniudvækstanalyse og in vivo allestedsnærværende analyse) for at drøfte resultatet af større massespektrometrianalyse korrekt. Ikke-specifik interaktion med EYFP-protein observeres ofte i immunoprecipitationsforsøget, og EYFP-vektorkontrol er derfor nødvendig for at evaluere den sande interaktion mellem EYFP-sammensmeltet protein(er). Vores massespektrometri analyse ved hjælp af EYFP-CENP-A K124R udtrykt i RPE-1 CENP-A-/F celler viste ikke allestedsnærværendelation på lysin steder i EYFP polypeptid sekvens. Under andre ukendte forhold kan det dog forventes, at lysinstedet i EYFP-polypeptidsekvensen er allestedsnærværende i EYFP- og/eller andet mærket fusionsprotein med høj molekylvægt.
For koloni udvækst assays, anbefales det at indsamle celler til western blot analyse for at bekræfte protein udtynding af endogene CENP-A efter retro-Cre virus infektion og protein udtryk for pBabe-EYFP-CENP-A konstruktioner. På denne måde kan vi bedømme, om kolonien udvækst fænotype er virkelig på grund af det eneste udtryk for udefrakommende CENP-A WT eller mutanter. For enhver western blot analyse, hvis stripning udføres for at reblot membranen med forskellige antistoffer til næste tur af vestlige blot analyse, bør man bruge det samme kvantitative detektionssystem som en tidligere tur blot for den næste tur blot med forskellige antistoffer. Man skal sørge for, at båndene i den foregående turs skamplet ikke kan spores mod membranens sigtede område i næste svings skamplet med forskellige antistoffer. Eller brug det samme kvantitative detektionssystem som den foregående svings skamplet, og kontroller, om inkubationen med det blotte sekundære antistof, der blev anvendt i den foregående omgangs skamplet, ikke fører til påvisning af proteinbånd, før du starter næste svings skamplet med forskellige antistoffer. For in vivo allestedsnærværendelation assay, er det vigtigt at køre større SDS-PAGE gel ved hjælp af apparatet til at køre større SDS-PAGE gel (Gel elektroforese apparat I eller II). Empirisk, større SDS-PAGE gel ville adskille proteinbånd klart og øge følsomheden af påvisning af de svage bånd, der kunne have været dårligt påvist i den mindre gel (dvs. protein bands synes skarpere i større gel).
Det er yderst vigtigt at vælge korrekt SDS-PAGE gel til at kortlægge post-translationelle ændringer (PTMs) af et bestemt protein grundig LC-MS / MS. Den mest udbredte gel system til SDS-PAGE er Laemmli system, som bruger Tris-glycin geler bestående af en stabling gel komponent og opløsning gel komponent. I dette klassiske system er pH- og ionstyrken for de buffere, der anvendes i stablingsgelen (Tris, pH 6.8) og opløsningsgel (Tris, pH 8.8), forskellige fra den buffer, der anvendes til kørsel af gelen (Tris, pH 8.3). Båndforvrængning, tab af opløsning eller artefaktbånd kan være forårsaget af laemmli-systemets meget alkaliske pH-værdi. Den foregående rapport beskrev de vigtigste årsager til dårlig båndopløsning med Laemmli-systemet16, herunder ustabilitet og kort udløbsperiode for løsningsgelen på grund af hydrolyse af polyacrylamid ved den høje pH- kemiske ændringer af prøveproteiner, reoxidation af reducerede disulfider af cysteinrester af proteiner og spaltning af Asp-Pro-bindinger af proteiner med opvarmning ved 95-100 °C i Laemmli-prøvebuffer ved pH 5.2. De kommercielt tilgængelige 4%-12% Bis-Tris protein geler er Bis-Tris HCI-buffered (pH 6.4) og drives på pH ca. 7.0 i modsætning til traditionelle Tris-glycin geler16. De mange fordele, der sammenlignes med Laemmli-systemet, genereres af bis-tris-systemernes neutrale drifts pH-værdi16, herunder høj stabilitet og den lange udløbsperiode for løsningsgelen, forbedret prøveproteinstabilitet under elektroforese ved neutral pH-værdi, hvilket fører til skarpere båndopløsning og nøjagtige resultater og fuldstændig reduktion af disulfider og fravær af spaltning af Asp-Pro-bindinger. I denne rapport kunne vi med held kortlægge PTM'er af EYFP-CENP-A K124R protein (Figur 3) ved hjælp af kommercielt tilgængelige 4%-12% Bis-Tris protein geler. Derfor er de kommercielt tilgængelige 4% -12% Bis-Tris protein geler stærkt anbefales at bruge til dette formål.
Til kortlægning af post-translationelle modifikationer (PTM'er) af et bestemt protein anvendes in-gel-fordøjelsen af målprotein kombineret med LC-MS/MS i vid udstrækning. I denne undersøgelse, vi søgte at identificere allestedsnærværende steder EYFP-CENP-A K124R ved hjælp af affinitet rensning-massespektrometri (AP-MS) strategi. Derfor er det første vigtige skridt at opnå en stor mængde allestedsnærværende EYFP-CENP-A K124R protein med høj renhed ved hjælp af immunoprecipitation fra EYFP-CENP-A K124R overekspressende celler, hvilket i høj grad kunne lette identifikationen og bekræftelsen af ubiquitinationssteder for EYFP-CENP-A K124R af LC-MS/MS. For at reducere interferensen af ikke-allestedsnærværende EYFP-CENP-A K124R-protein, vestlige blots af anti-GFP, anti-HA (Ub), anti-Ubiquitin (se afsnit [6.1.6]), og Coomassie blå farvning (se afsnit [6.1.7]) blev udført for præcist at bestemme placeringen af allestedsnærværende EYFP-CENP-A K124R på SDS-SIDE gel. Endelig blev kun et minimeret område af gelbånd, der indeholder allestedsnærværende EYFP-CENP-A K124R, fjernet for in-gel fordøjelse kombineret med LC-MS/MS for at opnå optimerede resultater. Når de tørrede peptider rekonstitueres, før LC-MS/MS anvendes, blev der anvendt 3% (v/v) acetonitril /2% (v/v) myresyre for at hjælpe med bedre opløselighed og genfindingshastighed af peptider. Nogle gange databasen søgning kan resultere i PTMs, som ikke rigtig eksisterer på grund af den omtrentlige tildeling algoritme søgemaskine. Således et andet kritisk skridt er at bekræfte EYFP-CENP-A K124R ubiquitination sites via manuelt gennemgå MS / MS af allestedsnærværende peptider ved hjælp af Software F (Tabel over Materialer), som kunne fjerne "uvirkelige" allestedsnærværende steder indført ved omtrentlig tildeling ved database søgning. Sammenfattende har denne AP-MS-strategi etableret en effektiv og robust rørledning til identifikation af EYFP-CENP-A K124R-ubiquitinationssteder med afgørende biologisk betydning. Endnu vigtigere er det, at denne rørledning også kunne udvides bredt til at undersøge ptm'er for forskellige funktionelle proteiner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen konkurrerende interesser.
Acknowledgments
Vi takker Chao-Jun Li på Model Animal Research Center, Nanjing University for massespektrometri analyse. Vi takker Yanmini Dalal, Tatsuo Fukagawa, og nuværende forskere ved Model Animal Research Center, Nanjing University og Greehey Children's Cancer Research Institute for deres nyttige diskussion, eksperimentel vejledning, og reagenser. Vi takker Don W. Cleveland, Daniele Fachinetti, Yanmini Dalal, Minh Bui, Gustavo W. Leone, John Thompson, Lawrence S. Kirschner, Amruta Ashtekar, Ben E. Black, Glennis A. Logsdon, Kenji Tago og Dawn S. Chandler for deres generøse gaver af reagenser. Y.N. blev støttet af Jiangsu-provinsen ''Double- First-Class'' Construction Fund, Jiangsu-provinsen Natural Science Fund (SBK2019021248), Jiangsu-provinsen 16th Six Big Talent Peaks Fund (TD-SWYY-001), Jiangsu-provinsen "Foreign Expert Hundred Talents Program" Fund (SBK2019010048) og National Natural Science Foundation i Kina (31970665). Denne undersøgelse blev delvist støttet af NCI-tilskud R21 CA205659.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equpiments/Tools | |||
| 0.5 ml protein low binding tubes | Eppendorf | 022431064 | For mass spectrometry analysis |
| 10cm cell culture dish | BIOFIL/JET, China | 700224 | 10 cm tissue culture dish (Yohei lab, PN63) |
| 6 Well Cell Culture Cluster | Fisher/Corning Incorporated | 07-200-83 | 6-well culture plate |
| CentriVap | LABCONCO | - | Benchtop vacuum concentrator for vaccum dry peptides for mass spectrometry analysis |
| ChromXP C18CL, 120A, 15 cm x 75 μm | Eksigent Technologies | 805-00120 | Liquid chromatography (RPLC) column for mass spectrometry analysis |
| HCX PL APO 100x oil immersion lens | Leica | LEICA HCX PL APO NA 1.40 OIL PHE | 100X Oil immersion lens |
| HCX PL APO 63x oil immersion lens | Leica | LEICA HCX PL APO NA 1.40 OIL PH 3 CS | 63X Oil immersion lens |
| Immobilon-FL PVDF Transfer Membrane | EMD Millipore | IPVH00010 | For western blot |
| Leica DM IRE2 motorized fluorescence microscope | Leica | - | motorized fluorescence microscope |
| Leica EL6000 compact light source | Leica | External light source for fluorescent excitation | |
| Micro Cover glass (22 mm x 22 mm) | Surgipath | 105 | Cover glass (22 mm x 22 mm) |
| Model V16-2 polyacrylamide gel electrophoresis apparatus | Apogee Electrophoresis/CORE Life Sciences | 31071010 | Gel electrophoresis apparatus I to apply bigger SDS-PAGE gel |
| nanoLC.2D | Eksigent Technologies | - | liquid chromatography system for mass spectrometry analysis |
| NuPAGE 4%-12% Bis-Tris Protein Gels | Thermo Fisher | NP0335BOX | The commercially available 4%-12% Bis-Tris protein gels for mass spectrometry analysis |
| Olympus FLUOVIEW FV3000 confocal laser scanning microscope | Olympus | - | Confocal laser scanning microscope (https://www.olympus-lifescience.com.cn/en/support/ downloads/#!dlOpen=%23detail847250519) |
| ORCA-R2 Degital CCD camera | Hamamatsu | C10600-10B | CCD camera |
| PAP Pen | Binding Site | AD100.1 | For a water repellant barrier in immunofluorescent staining |
| TISSUE CULTURE DISHES 10CM | VWR | 25382-166 | 10 cm tissue culture dish |
| Vertical electrophoresis for gel running (big size) | Junyi, China | JY-SCZ6+ | Gel electrophoresis apparatus II to apply bigger SDS-PAGE gel (Yohei lab, PE23) |
| VWR Micro Slides, Frosted | VWR International | 48312-013 | Micro slides |
| Primary antibodies | |||
| Anti-CENP-A antibody | Stressgen/Enzo Life Sciences | KAM-CC006 | Mouse monoclonal antibody |
| Anti-CENP-B antibody | Novus Biologicals | H00001059-B01P | Mouse monoclonal antibody |
| anti-GAPDH | ABCAM | ab37168 | Rabbit polyclonal antibody |
| anti-GAPDH | Invitrogen | PA1987 | Rabbit polyclonal antibody |
| anti-GFP antibody | ANTI #76 (Homemade antibody) | Rabbit polyclonal antibody | |
| anti-HA (3F10) | Roche | 11815016001 | Rat monoclonal antibody |
| anti-HJURP | Proteintech Group | 15283–1-AP | Rabbit polyclonal antibody |
| anti-Ubiquitin | Bethyl Laboratories | A300-317A-1 | Rabbit polyclonal antibody |
| Reagents | |||
| Bio-Rad Protein Assay | Bio-Rad | 500-0006 | Commercial protein assay reagent I for measurement of protein concentration (compatible with 0.1% SDS) |
| Branson SONIFIER 450 | Sonicator | ||
| Branson Ultrasonics sonicator Microtip Step, Solid, Threaded 9.5 mm | VWR Scientific Products Inc. | 33995-325 | Disruptor horn for sonication |
| Branson Ultrasonics sonicator Microtip Tapered 6.5 mm | VWR Scientific Products Inc. | 33996-185 | Microtip for sonication |
| Buffer A1 | - | - | 20 mM Tris-HCl, pH 7.4; 50 mM NaCl; 0.5% Nonidet P-40; 0.5% deoxycholate; 0.5% SDS; 1 mM EDTA; complete EDTA-free protease inhibitor reagent |
| Complete EDTA-free protease inhibitor cocktail | Roche | 11-873-580-001 | Complete EDTA-free protease inhibitor reagent for buffer A1 |
| Coomassie brilliant blue R-250 | BBI Life Sciences | CAS 6104-59-2 | Coomassie blue solution for mass spectrometry analysis |
| Crystal violet solution (2.3% crystal violet, 0.1% ammonium oxylate, 20% ethanol) | SigmaI-Aldrich | HT90132-1L | For colony staining |
| DAPI | SIGMA-SLDRICH | D9542 | For nuclear staining |
| DMEM: F12 Medium | ATCC | 30-2006 | DMEM: F12 Medium |
| Fetal Bovine Serum, certified, heat inactivated, US origin | Life Technologies/Gibco | 10082 | FBS (fetal bovine serum) |
| High-glucose DMEM (Dulbecco’s modified Eagle’s medium) | Life Technologies/BioWhittaker | 12-604 | high-glucose DMEM |
| Lipofectamin 3000 | Life Technologies/Invitrogen | L3000 | Transfection reagent I for chemical transfection |
| Lipofectamin 3000, P3000 solution | Life Technologies/Invitrogen | L3000 | Transfection reagent II for chemical transfection |
| Methanol | Fisher | A412-4 | Fixation reagant |
| Non fat powdered milk (approved substitution for carnation powdered milk) | Fisher Scientific | NC9255871 (Reorder No. 190915; Lot# 90629) | Non-fat skim milk |
| Opti-MEM I | Life Technologies/Invitrogen | 31985 | Reduced serum media |
| p-phenylenediamine | SIGMA-SLDRICH | P6001 | For mounting medium |
| Penicillin, Streptomycin; Liquid | Fisher/Gibco | 15-140 | Penicillin-streptomycin |
| Poly-L-Lysine SOLUTION | SIGMA-SLDRICH | P 8920 | Poly-L-Lysine, 0.1% w/v, in water |
| Polyethyleneimine [PEI]; 1.0 mg/ml | Polysciences | 23966–2 | Transfection reagent III for chemical transfection |
| Protein A sepharose CL-4B beads | GE Healthcare/Amersham | 17-0963-03 | Protein A sepharose CL-4B beads for in vivo ubiquitylation assays using pQCXIP-EYFP-CENP-A |
| Restore Western Blot Stripping Buffer | Thermo Scientific | PI21059 | Western Blot Stripping Buffer I |
| Sequencing grade trypsin | Promega | V5111 | For mass spectrometry analysis |
| SuperSignal West Femto Maximum Sensitivity Substrate | Thermo | 34095 | Ultra-sensitive enhanced chemiluminescent (ECL) substrate |
| UltraPure Distilled Water | Life Technologies/Invitrogen/Gibco | 10977 | Sterile tissue culture grade water |
| Western Blot Stripping Buffer II ((50 mM Tris-HCl, pH 6.85; 2% SDS; 50 mM DTT; 100 mM 2-Mercaptoethanol) | - | - | Western Blot Stripping Buffer II |
| Secondary antibodies | |||
| Alexa Fluor 488 Goat Anti-Rabbit IgG | Life Technologies/Invitrogen | A11008 | fluorophore-conjugated secondary antibody (Affinity-purified secondary antibody) |
| Alexa Fluor 594 Goat Anti-Mouse IgG | Life Technologies/Invitrogen | A11005 | fluorophore-conjugated secondary antibody (Affinity-purified secondary antibody) |
| Softwares | |||
| Acquisition FV31S-SW software | Olympus | - | Sofware C1 (https://www.olympus-lifescience.com.cn/en/support/ downloads/#!dlOpen=%23detail847250519) |
| Analysis FV31S-DT software | Olympus | - | Sofware C2 (https://www.olympus-lifescience.com.cn/en/support/ downloads/#!dlOpen=%23detail847250519) |
| cellSens Dimension software Ver. 1. 18 | Olympus | - | Sofware C3 (https://www.olympus-lifescience.com.cn/en/ software/cellsens/) |
| Image Studio Analysis Software Ver 4.0 | LI-COR Biosciences | - | Software D |
| Molecular Imager Versadoc MP4000 System | Bio-Rad | - | Chemiluminescence imager for immunoblot detection |
| Odyssey CLx Infrared imaging System | LI-COR Biosciences | - | Infrared imaging system for immunoblot detection |
| OpenCFU saftware | - | - | For colony counting (http://opencfu.sourceforge.net/) |
| Openlab version 5.5.2. Scientific Imaging Software | Improvision/PerkinElmer | - | Software A |
| ProteinPilot Software version 4.5 | AB SCIEX | - | Software F for mass spectrometry analysis |
| Quantity One 1-D analysis software | Bio-Rad | - | Software E |
| TripleTOF 5600+ System | AB SCIEX | - | Mass spectrometry instrument |
| Volocity version 6.3 3D Image Analysis Software (Volocity Acquisition) | PerkinElmer | - | Software B1 |
| Volocity version 6.3 3D Image Analysis Software (Volocity Quantification) | PerkinElmer | - | Software B2 |
References
- Dunleavy, E. M., et al. HJURP is a cell-cycle-dependent maintenance and deposition factor of CENP-A at centromeres. Cell. 137 (3), 485-497 (2009).
- Foltz, D. R., et al. Centromere-specific assembly of CENP-a nucleosomes is mediated by HJURP. Cell. 137 (3), 472-484 (2009).
- Bernad, R., et al. Xenopus HJURP and condensin II are required for CENP-A assembly. J Cell Biol. 192 (4), 569-582 (2011).
- Niikura, Y., et al. CENP-A K124 Ubiquitylation Is Required for CENP-A Deposition at the Centromere. Developmental Cell. 32 (5), 589-603 (2015).
- Niikura, Y., Kitagawa, R., Kitagawa, K. CENP-A Ubiquitylation Is Inherited through Dimerization between Cell Divisions. Cell Reports. 15 (1), 61-76 (2016).
- Fachinetti, D., et al. CENP-A Modifications on Ser68 and Lys124 Are Dispensable for Establishment, Maintenance, and Long-Term Function of Human Centromeres. Developmental Cell. 40 (1), 104-113 (2017).
- Niikura, Y., Kitagawa, R., Kitagawa, K. CENP-A Ubiquitylation Is Required for CENP-A Deposition at the Centromere. Developmental Cell. 40 (1), 7-8 (2017).
- Niikura, Y., Kitagawa, R., Fang, L., Kitagawa, K. CENP-A Ubiquitylation Is Indispensable to Cell Viability. Developmental Cell. 50 (6), 683-689 (2019).
- Srivastava, S., Foltz, D. R. Posttranslational modifications of CENP-A: marks of distinction. Chromosoma. 127 (3), 279-290 (2018).
- Srivastava, S., Zasadzinska, E., Foltz, D. R. Posttranslational mechanisms controlling centromere function and assembly. Current Opinion in Cell Biology. 52, 126-135 (2018).
- Ohkuni, K., Takahashi, Y., Basrai, M. A. Protein purification technique that allows detection of sumoylation and ubiquitination of budding yeast kinetochore proteins Ndc10 and Ndc80. Journal of Visualized Experiment. (99), e52482 (2015).
- Niikura, Y., et al. CENP-A K124 Ubiquitylation Is Required for CENP-A Deposition at the Centromere. Developmental Cell. 32 (5), 589-603 (2015).
- Niikura, Y., Kitagawa, K. Immunofluorescence Analysis of Endogenous and Exogenous Centromere-kinetochore Proteins. Journal of Visualized Experiment. (109), e53732 (2016).
- Lamb, J. R., Tugendreich, S., Hieter, P. Tetratrico peptide repeat interactions: to TPR or not to TPR. Trends in Biochemical Sciences. 20 (7), 257-259 (1995).
- Leopold, A. V., Chernov, K. G., Verkhusha, V. V. Optogenetically controlled protein kinases for regulation of cellular signaling. Chemical Society Reviews. 47 (7), 2454-2484 (2018).
- Thermofisher, Inc. Protein gel electrophoresis technical handbook. , Available from: https://www.thermofisher.com/content/dam/LifeTech/global/Forms/PDF/protein-gel-electrophoresis-technical-handbook.pdf (2015).
