Summary
CENP-Aのユビキタスは、細胞分裂間の二量体化によって受け継がれ、細胞の生存率に不可欠なセントロメレでのCENP-A沈着にとって重要な要件です。ここでは、EYFP タグ付き CENP-A (EYFP-CENP-A) タンパク質のユビキタス性を同定するための質量分析分析について説明します。
Abstract
キネトコレスとセントロメアの構造とダイナミクスを研究することは、染色体不安定性(CIN)および癌進行を理解する上で重要である。染色体の位置と中心の機能(すなわち、セントロメアの同一性)がどのように決定され、正確な染色体分離に参加しているかは、根本的な問題である。CENP-Aは、中心性同一性の非DNA指標(エピジェネティックマーク)であることが提案されており、細胞分裂間の二量体化によって継承されたCENTP-A沈着にはCENP-Aのユビキテレンスが必要であり、細胞生存能に不可欠である。
ここでは、CENP-A K124R変異タンパク質におけるEYFPタギングのために異なるリジンでのユビキタス化が誘導されることを示唆する、EYFP-CENP-A K124R変異体のユビ分量を同定するための質量分析分析について述べている。EYFP-CENP-A K124Rにおけるリジン306(K306)のユビキタス化が同定され、これは、質量分析を通じてCENP-Aのリジン56(K56)に相当する。GFP/EYFPの使用、またはタンパク質の機能を分析するツールとしての高分子量タンパク質のタグ付けについて注意点が説明されています。現在の技術的限界は、ユビキタスバンドの検出、部位特異的なユビキタス性の同定、および細胞全体の周期の間に生きている細胞または特定の単一細胞におけるユビキタス化の視覚化についても議論されている。
ここで提示される質量分析法は、異なるタグおよび他のセントロメアキネトコレタンパク質を有するヒトCENP-Aタンパク質に適用することができる。いくつかのアッセイ/分析からなるこれらの組み合わせ方法は、ユビキタスの機能的役割を特定することに興味を持っている研究者に推奨される可能性があります。
Introduction
ほとんどの真核生物では、スピンドル微小管は、セントロメアと呼ばれる各染色体の単一領域に付着する必要があります。キネトコレは、セントロメアに位置するタンパク質の複合体です。セントロメアとキネトコレタンパク質の動きのタイミングとキネトコレスとセントロメレスの構造を研究することは、染色体不安定性(CIN)および癌進行を理解するために重要です。重要な問題は、染色体の位置と中心の機能(すなわち、セントロメアの同一性)がどのように決定され、それらが正確な染色体分離にどのように関与しているかである。ほとんどの種では、CENP-Aと呼ばれる特定のヒストン様タンパク質を含む特殊なヌクレオソームの存在がセントロメア同一性を定義する。そこで、CENP-Aが中心同一性の非DNA指標(エピジェネティックマーク)であることを提案する。CENP-Aがヒトのセントロメア同一性をどのように定義するかを解明することが重要です。
ホリデイ接合認識タンパク質(HJURP)は、CENP-A特異的シャペロンであり、CENTP-Aを中心核組中11、2、32,3に沈着させる。我々は、リジン124(K124)およびセントロメレローカリゼーション4のCENP-A ubiquityationに、CUL4A-RBX1-COPS8 E3リガーゼが必要であることを以前に報告している。また、我々の結果は、新たに合成されたCENP-Aのセントロメア募集には、既存のユビキタスCENP-A5が必要であることを示した。したがって、CENP-Aのユビキタス化は細胞分裂間の二量体化によって継承されることを示唆するモデルが提供された。
我々の調査結果及びYuらのそれとは対照的に、CENP-Aとその中心局在化に関する否定的な結果が最近発表された6.記事は、リジン124(K124)に対するCENP-A修飾は、K124Rの突然変異がCENP-Aの局在性に影響を及ぼさなかったことを示す否定的な結果に基づいて、ヒトセントロメレの確立、維持、および長期機能に欠かせないと主張した。しかし、彼らの結果と結論には議論の余地が十分にあり、我々はすでに彼らの前の出版物7にどのような問題があるかを説明しました。彼らは内因性CENP-Aのサイズよりもはるかに大きな分子量を持つCENP-Aとタンパク質を融合させることに注意を払う必要があります:例えば、彼らは〜30 kDa強化黄色蛍光タンパク質(EYFP)を〜16 kDa CENP-Aに融合し、RPE-1 CENP-A-Fノックアウト中のEYFP-CENP-A K124R融合タンパク質を分析しました。K124ユビキチンは、構造予測4に基づいてHJURPに直接結合するとは考えられていないが、モノユビキチンの添加はCENP−Aのタンパク質の立体構造に影響を与えると予測される。CENP-Aの立体構造は、大きな融合タンパク質の存在によって変化する可能性があり、この立体構造変化は、ユビキサリ化の喪失によって引き起こされる構造変化を隠す可能性がある。我々は、大型タンパク質の融合が、EYFP-CENP-A K124R変異体におけるK124以外のリジンでのユビキスチン化を誘導し、別の部位におけるこのユビキタス化が、元のK124R単一変異型を阻害/マスクすることを示唆する。大きなタグタンパク質を有するCENP-A K124R変異タンパク質(EYFP)の異なるリジンにおいてユビキタンスが起こるという証拠は、我々の前の出版物8で報告された。EYFPタグはEYFP-CENP-A K124Rの別のリジン部位のユビキチン化を誘導し、EYFP-CENP-A K124R変異体がHJURPに結合することを発見した。その結果、別の部位でのこのユビキタス性は、元のK124R単突然変異表現型を阻害/マスクし、EYFP-CENP-A WTおよびK124R変異体の両方がセントロメア局在化を示した(pBabe-EYFP-CENP-A WTおよびK124R変異体をpBabe-EYFP対照と共に使用し、比較した)。この結果は、Flagタグ付きまたはタグなしCENP-A K124R変異体が致死的であるが、モノウビキチン融合によって救出できることを示し、CENP-Aのユビキタス化が細胞生存に不可欠であることを示唆した。
近年、多くの研究では、IN IN 9、10、11の両方で、CENP-Aタンパク質および他のセントロメアキネトコレタンパク質の翻訳後修飾(PTM)を同定するための異なるアッセイ,10を11開発している。9クロマチンの機能を調節する主要なメカニズムであるヒストンタンパク質のPTMに類似した、中心クロマチン成分のPTMはまた、全体的な構造と中心の機能を調節するために不可欠なメカニズムに関与しています。CENP-A PTM部位の大部分はCENP-A含有ヌクレオソームに特異的であるが、それらのいくつかはヒストンH3で保存されているが、これらの残基の修飾が中心基質特異的な機能に寄与することを示唆している。リン酸化、アセチル化、メチル化、およびユビ価化を含むCENP-AのPTMは、以前に報告された9であり、CENP-Aがそのアミノ末語およびC末語ヒストンフォールドドメイン上の様々なPTMおよびその組合せ配列を受けていることを示唆した。複数の機能におけるCENP-Aの変更の重要性は、我々を含む多くのグループによって明らかにされた。これらの機能は、セントロメアでのCENP-A沈着、タンパク質安定性、およびCCAN(構成中心性関連ネットワーク)9の募集を伴う。しかし、CENP-A PTMの限られた研究と所見は、直接的または間接的にその機能を調節する正規のヒストンの1つと比較される場合に前形化される。これらのCENP-A PTMを特定するための方法論に焦点を当てた技術報告書も制限されています。
CENP-Aの積み重ねには、細胞分裂5の間の二量体化によって継承され、細胞生存率8に不可欠なCENTP-A沈着にはCENP-Aのユビメンテーションが必要であるため、CENP-Aのユビキタス性を同定する方法は、将来的には、中心の機能活性、位置、構造を研究するために不可欠である。そこで、ここでは、EYFPタグ付けがCENP-A K124R変異タンパク質8中の異なるリジンでのユビキタス化を誘導することを示唆するEYFP-CENP-A K124R変異体のユビキタス性を同定するための質量分析分析について説明する。他の制御アッセイおよび分析のプロトコル(免疫蛍光分析、コロニー成長アッセイ、インビボのユビキタスアッセイ)も提示され、主要な質量分析分析の結果を適切に議論する。
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Protocol
1. pBabe-EYFP-CENP-Aコンストラクトの細胞培養およびレトロウイルストランスフェクション
注:EYFP-CENP-Aは、内因性CENP-Aと同様のタンパク質レベルでpBabe-EYFP-CENP-Aから発現されます。総細胞性CENP-Aタンパク質は、RPE-1 CENP-A-----細胞6のようにCREリコンビナーゼによるCENP-A-/Fアレルの破壊後に、このEYFP-CENP-Aと置換される。
- 293T包装細胞を用いたレトロウイルスを含む上清の調製。
- 0日目:6ウェル培養プレート(1.0 x 106細胞/ウェル)に293T包装細胞を広げます。10%FBSおよび1%ペニシリンストレプトマイシンを有する高グルコースDMEM中の培養細胞。細胞を37°Cで5%CO2の雰囲気で24時間2インキュベートします。
注: 最適な結果を得るには、シード処理に使用するセル密度を実証的に決定します。 - 1日目:広がった後23時間前後でトランスフェクション反応を調製する(24時間点はトランスフェクションの0hポイント)。各pBabe-EYFP(B3182)のトランスフェクト発現プラスミド、pBabe-EYFP-CENP-A WT(B3161)、およびpBabe-EYFP-CENP-A K124R(B3164)(表1参照)
- 表2に記載されているヘルパー/パッケージングプラスミドの組み合わせを1つ選択し、上記のプラスミドの1つを含むチューブに追加します。ヘルパー/パッケージングプラスミドのこれらの3つの組み合わせが主にあります(表2)。これらの実験で任意の組み合わせが働き、同様のトランスフェクション効率を示した。
- 50 μLの減らされた血清培地を調製し、各pBabe-EYFP(B3182)、pBabe-EYFP-CENP-A WT(B3161)、およびpBabe-EYFP-CENP-CenP-A K124R(B3164)を混合します(表1) Table 2この混合物を室温で5分間インキュベートする。この混合物は、溶液Aである。
- さらに50μLの減らされた血清培地を調製し、それぞれ1.5μLのトランスフェクション試薬IとIIを混合する(材料表)。この混合物を室温で5分間インキュベートする。この混合物は、溶液Bである。
注:必要に応じて、トランスフェクション試薬III(ポリエチレンイミン[PEI];1.0 mg/mL)のみを溶液Bに添加するか、トランスフェクション試薬IおよびIIに加えてトランスフェクション試薬Iiiを6.0 μL添加する(材料表)。 - 溶液AとBを混ぜ合わせ、室温で15分間インキュベートします。
- 培養細胞をPBSで1回洗浄した後、溶液AとB(すなわち、DNA-脂質複合体)の混合物を、500μL減少した血清培地を有する6ウェル培養板の各ウェルに直接添加する。プラスミドの最終濃度は3.3μg/mLです。
- 4.5時間5%CO2の雰囲気で37°Cで細胞をイン2キュベートした後、10%FBSおよび1%ペニシリンストレプトマイシンで培地を高グルコースDMEMに変更します。培地交換後に培地を6ウェル培養板に2mL/ウェル入れる。
- トランスフェクション後48時間5%CO2の雰囲気で37°Cの細胞を培養した。レトロウイルスを含む上清を用いて3日目にレトロウイルス感染を行う。
- 0日目:6ウェル培養プレート(1.0 x 106細胞/ウェル)に293T包装細胞を広げます。10%FBSおよび1%ペニシリンストレプトマイシンを有する高グルコースDMEM中の培養細胞。細胞を37°Cで5%CO2の雰囲気で24時間2インキュベートします。
- CENP-A-/FRPE-1標的細胞のレトロウイルス感染。
- 2日目:感染の前日、CENP-A-/FRPE-1標的細胞を広げて6ウェル培養ウェル(2.25 x 105細胞/ウェル)にトランスフェクトする。DMEMの培養細胞:F12培地(材料表)10%FBSおよび1%ペニシリンストレプトマイシンを有する。
注:コロニー伸長アッセイ、免疫蛍光、およびウェスタンブロット分析のための細胞をコントロールとして広げます。最適な結果を得るには、シード処理に使用する細胞密度を経験的に決定します。 - 3日目(ウイルス感染日):293T包装細胞のトランスフェクション後48時間で、0.45 μmフィルターを介してウイルスとフィルターを含む上清を収集します(ウイルスエンベロープをせん断する0.2 μmフィルタを使用しないでください)。ポリエーテルサルホン(PES)フィルタを使用することをお勧めします。
- CENP-A-/F RPE-1細胞をウイルスに感染させる。6ウェル培養プレートの1ウェルに対して、新鮮な培地1mL、1mLウイルス上清、ポリブレンを8μg/mLの最終濃度に加えます。CENP-A-/F RPE-1細胞をトランスフェクション後7日目まで4日間5%CO22の雰囲気で37°Cでインキュベートします。
注:CENP-A-/F RPE-1細胞増殖のインキュベーション期間は、最適な結果を得るための分析を次のようにして経験的に決定する必要があります。
- 2日目:感染の前日、CENP-A-/FRPE-1標的細胞を広げて6ウェル培養ウェル(2.25 x 105細胞/ウェル)にトランスフェクトする。DMEMの培養細胞:F12培地(材料表)10%FBSおよび1%ペニシリンストレプトマイシンを有する。
2. pBabe-EYFP-CENP-Aを含む細胞の蛍光免疫分析
- 7日目:pBabe-EYFP-CENP-Aコンストラクトのレトロウイルス感染の4日後、吸引により培地を除去する。TBS(25 mMトリス-HCl、pH 7.5;125 mM NaCl)で細胞を一度リンスします。細胞の表面を乱さないように培養井戸の側面にTBSを適用します。
注: 細胞固定の最適な時間ポイントは経験的に決定する必要があります。EYFP-CENP-A WTおよびK124Rの両方の免疫蛍光シグナルは、クレ感染がなくてもpBabe-EYFP-CENP-A構築物のレトロウイルス感染後少なくとも4日後のセントロメアで検出可能である(Cre感染を伴うデータについては図Figure 11C-E)。 - メタノール細胞固定及び免疫蛍光染色を行う13.
- 一次抗体は、抗GFP抗体(1:1,000希釈)および抗CENP-B抗体(希釈比1:200)を4%ヤギ血清を含むTBS中のセントロメア位置マーカーに使用します(抗体使用の表を参照)。
- ペーパータオルで余分な取り付け媒体を取り除き、最後のステップでマニキュアでカバースリップの端を密封します。
- 免疫蛍光画像観察、取得、定量、およびセントロメアでのEYFP-CENP-Aの残りのシグナルの分析については、前述の方法13を参照してください。
- ソフトウェア A またはソフトウェア B1 および B2 を使用した画像取得処理、デコンボリューション、定量化、および解析を行います (資料表を参照)。コンフォーカルレーザー走査顕微鏡には、オプションでソフトウェア C1-C3 (材料表を参照) を使用します。
注: ソフトウェア A で使用されるすべてのコマンドについては、補足コード ファイルの 2.6.1 を参照してください。ソフトウェア B1 および B2 で使用されるすべてのコマンドについては、補足コーディングファイルの 2.6.2 を参照してください。
3. レトロクレウイルス感染後のpBabe-EYFP-CENP-Aを用いたコロニーの成長アッセイ
注:このアッセイを行う理由は、CREリコンビナーゼによるCENP-A-/F対立遺伝子の破壊後のEYFP-CENP-A WTとK124R変異体の細胞生存率を比較するためです(全細胞CENP-Aタンパク質の置換後)。
- pBabe-EYFP-CENP-Aコンストラクトのレトロウイルストランスフェクション。
- セクション1に記載されているようにCENP-A-/F RPE-1細胞のレトロウイルストランスフェクションを行う。DMEMにおける培養細胞:F12培地は、ウイルス感染後72時間、10%FBSおよび1%ペニシリン・ストレプトマイシンを有する。
- pBabe-EYFP-CENP-Aコンストラクトのレトロウイルス感染の3日後(6日目)、コロニー成長アッセイおよびコントロール実験に使用されるトランスフェクション細胞を含むウェルにブラストシジンS(10μg/mL)を添加する。細胞は、ブラストシジンS.の存在下でウイルス感染後少なくとも14日後に増殖し、5日ごとにブラストシジンSを含む培地を変化させる。
注:コロニーアッセイの播種前に細胞が約80%の合流率に達した場合(3.2.7.および3.2.8)、トリプシン法と6ウェル培養プレートでのめっきにより、細胞を1:2および1:5比で通過させます。 - 7日目にウェスタンブロットの細胞を採取し、Cre感染のないpBabe-EYFP-CENP-Aコンストラクトのタンパク質発現を確認します。セクション 4 で説明されているように、ウェスタン ブロット分析を実行します。結果は図1B(レーン1-4)に示されている。
- クレウイルス感染によるコロニーの成長アッセイについては、ブラストシジンSの存在下でウイルス感染後14日間細胞を増殖させ続ける(すなわち、ここで提示された結果については17日目まで培地を含むブラストシジンSで細胞を増殖させる)。
- pBabe-po-Creのレトロクレウイルス感染
注: ステップ 3.2.1 の 0 日目はセクション 3.1 の 13 日目に対応します。- 0日目から3日目まで:pBabe-puro-Cre(B3027)を発現プラスミドとして使用してCENP-A-/F RPE-1細胞のレトロウイルストランスフェクションを行う(詳細はセクション1を参照)。ブラストシジンS(10μg/mL)を培地に添加してください。
- 4日目:細胞をトリプシン化してプレートから取り外す。プレート500または5,000細胞を6ウェル培養プレートに三重化する。DMEMにおける培養細胞:F12培地10%FBSおよび1%ペニシリンストレプトマイシンを有する。
- 5日目:ブラストシジンS(10μg/mL)を培地に添加します。5,000または500細胞のメッキの場合、ブラストシジンS(10 μg/ml)3-24日([3.2.7]の14日目まで)または3-28日([3.2.8]の18日目まで)を含む細胞を選択します。
注:このコロニーの成長アッセイでは、pBabe-EYFP-CENP-Aのトランスフェクションと共にpBabe-puro-Creのトランスフェクションが追加されます。pBabe-EYFP-CENP-Aのトランスフェクションは3.1で行われます。pBabe-puro-Creのトランスフェクションは3.2.1で行われます。 - 10日目(レトロクレウイルス感染から7日目):10日目にレトロクレウイルス感染後の内因性CENP-Aのタンパク質枯渇および/またはpBabe-EYFP-CENP-A構築物のタンパク質発現を確認するために、ウェスタンブロッティング分析用の細胞を収集します。
- 同じ10日目のセクション4に記載されているように、ウェスタンブロッティングを行います。結果は図1B(レーン5-7)に示されている。
- 免疫蛍光分析(上記2項)を行い、残存する内因性CENP-Aアレルの不活性化から7日後にEYFP-CENP-A WTおよびK124Rの両方がセントロメアに局在することを確認した。結果は 図1C-1Eに示されています。
- 14日目:5,000個の細胞を播種したプレートでコロニーの成長アッセイを行う。メタノール中の10分間の細胞を固定し、結晶バイオレット溶液中で10分間染色する(2.3%結晶バイオレット、0.1%シュウ酸アンモニウム、20%エタノール(図2B参照)。OpenCFU ソフトウェアを使用してコロニーの数をカウントします (図 2Cを参照)。
- 18日目:500個の細胞を播種したプレートを使用します。ステップ 3.2.7 で説明されているようにセルを固定して染色します (図 2Bを参照)。コロニーの数をカウントします (図 2Cを参照)。
4. pBabe-EYFP-CENP-Aを用いたウェスタンブロット分析
注:図1Bおよび図2AおよびEYFP-CENP-Aタンパク質の材料表に示されている抗体を用いたウェスタンブロット分析については、前述の方法13を参照してください。
- 異なるウイルス感染で増殖した細胞を除去することによってタンパク質を分離する。次に、20 μgのタンパク質をSDS PAGEゲルの1ウェルに使用します。上記のとおりにPVDF膜にタンパク質を移す13.
- 一次二次抗体でインキュベーション後に膜3xを洗浄します。免疫ブロット検出用の赤外線画像システムおよび/または化学発光イメージャーを用いて、膜上のタンパク質バンドを検出して分析します。これらの結果は、図 1Bおよび図 2Aに示されています。
- 赤外線イメージングシステムでタンパク質バンドを検出して解析するには、「補足的なコーディングファイル」のステップ4.2.1を参照してください。
- 化学発光イメージャーを使用してタンパク質バンドを検出して分析し、補足的なコーディングファイルのステップ4.2.2を参照してください。このシステムでは、超高感度の高められた化学発光(ECL)基板(材料表)を使用します。
- 必要に応じて、ウェスタンブロットストリッピングバッファーを使用して、PVDF膜から事前インキュベートされた抗体を取り除き、ウェスタン分析の次のターンのために異なる抗体でリブロットします。使用する最適なインキュベーション時間と温度を経験的に決定します。
5. 細胞培養、トランスフェクション、および生体内での pQCXIP-EYFP-CENP-A を用いたインビボユビエキシトリションアッセイ
注:pQCXIP-ベクターから発現されるEYFP-CENP-Aのタンパク質レベルは、内因性CENP-Aタンパク質レベルよりも〜10倍高い。このベクターの使用は、EYFP-CENP-Aタンパク質の高い量の免疫沈降、EYFP-CENP-Aのユビキタスバンドの観察、および質量分析を通じたEYFPタグ付きCENP-A(EYFP-CENP-A)タンパク質のユビキタス性の同定を促進する。
- pQCXIP-EYFP-CENP-Aを用いたインビボのユビキタス化アッセイのトランスフェクション。
- シード 36.2 x 105 CENP-A-/F RPE-1 細胞を 10 cm の組織培養皿に入れます。10%FBSおよび1%ペニシリンストレプトマイシンを有する高グルコースDMEM中の培養細胞。
注: 最適な結果を得るには、シード処理に使用するセル密度を実証的に決定します。1つの免疫沈降(IP)サンプルに対して少なくとも2つの皿を準備し、最低1mgの総タンパク質を得る。 - 5%CO2の雰囲気で37°Cで細胞を18時間2インキュベートします。
- 播種後17時間で、トランスフェクション試薬を調製する。
- 各pQCXIP-EYFP(B3252)、pQCXIP-EYFP-CENP-A WT(B3254)、pQCXIP-EYFP-CENP-A-A K124R(B3256)(表1)を335μLの減らされた血清培地の335 μLに混合することによって、溶液Aを作る、 室温で5分間インキュベートし、pCGN-HA-ユビキチン(B2806)の6.7 μgプラスミドを全てのサンプルに加えます。
注 : すべてのベクトルは、表 1に示されています。 - トランスフェクション試薬IとIIをそれぞれ335μL減らした血清培地に混合し、室温で5分間インキュベートして溶液Bを作ります。
注:オプションのステップは、40.2 μLトランスフェクション試薬III(ポリエチレンイミン[PEI];1.0 mg/mL)のみを溶液Bに添加するか、またはトランスフェクション試薬IおよびIIに加えて、40.2 μLトランスフェクション試薬IIIを加える(材料表) です。 - 溶液AとBを混ぜ合わせ、室温で15分間インキュベートします。
- 培養細胞をPBSで1回洗浄した後、3.35 mL μL減少した血清培地を有する個々の10cm組織培養皿のそれぞれに、溶液AとB(すなわちDNA-脂質複合体)の混合物を直接加える。
注意:最終濃度はプラスミドの1.67 μg/mLです。 - 37°Cインキュベーターで細胞を4.5時間5%CO2でインキュベートします。4.5時間後、10%FBSと1%ペニシリンストレプトマイシンで培地を高グルコースDMEMに変更します。
- トランスフェクション後48時間5%CO2で237°Cで細胞を培養した。細胞ライセート調製のための細胞を収集します。
- シード 36.2 x 105 CENP-A-/F RPE-1 細胞を 10 cm の組織培養皿に入れます。10%FBSおよび1%ペニシリンストレプトマイシンを有する高グルコースDMEM中の培養細胞。
- 抗GFP抗体と結合したプロテインAビーズの調製。
- 25 μL (50% v/v) のプロテイン A ビーズを使用して、免疫沈降(IP)の1つの反応を行います。バッファーA1(材料表)を使用して洗浄してEtOHを除去し、バッファーA1(20 mM Tris-HCl、pH 7.4;50 mM NaCl;0.5%ノニデットP-40;0.5%デオキシコール酸;0.5%SDS;1 mM EDTA;完全なEDTA阻害剤)で50%溶液を作る。
- 上で調製したビーズに抗GFP抗体(Anti#76:自家製抗体)を2.0 μL添加し、純ビーズ量と比較して10倍のバッファーA1を追加します。
- 4~18時間4°Cでエンドツーエンド回転を行います。エンドツーエンド回転の最適な時間長さは、免疫沈降の効率に基づいて経験的に決定されなければならない。
- 100 x gでビーズを 1 分間遠心し、バインドされていない上清を取り除きます。バッファ A1 を追加して、ビーズの 50% (v/v) 溶液を作り直します。IPの1つの反応のためにこの解決の25 μL(50%v/v)を使用して下さる。
- 抗GFP抗体と結合したプロテインAセファローズビーズを用いた免疫沈降(IP)
- ステップ5.1.9で得られた細胞を超音波処理および凍結融解処理によりバッファA1で行う。
- 異なるIPサンプル間でタンパク質濃度を測定し、タンパク質量を正規化します。各チューブからサンプルの5%を取り出し、SDS-PAGEで5%入力サンプルとして実行します。
注:5%入力サンプルは、液体窒素で凍結し、1日以内にロードされていない場合は-80°Cでストックすることができます。 - 残りの95%のリセートを、ステップ5.2で調製した抗GFP抗体に結合したプロテインAビーズの25μL(50%v/v)と混合します。4~18時間4°Cでエンドツーエンド回転を行います。
注: エンドツーエンド回転に最適な時間の長さは、経験的に決定する必要があります。 - 遠心分離タンパク質Aは、100xgで100xgのタンパク質に結合したタンパク質(すなわち、免疫g沈降物)を有するビーズを1分間、上清を除去する。100 x gで1分間遠心分離して緩衝A1で免疫沈降物を洗浄し、このステップ4xを行います。
- 5%入力と残りの95%の免疫沈降物を2xおよび4x SDS-PAGE負荷バッファー14とそれぞれ混合する。これらの2つのサンプルを5分間沸騰させ、異なるレーンで電気泳動のために10.0%変性SDSポリアクリルアミドゲルにロードします。電気泳動には大きなSDS-PAGEゲル(例えば、17cm x 15 cm)を使用してください。サンプルを小さなゲルで実行すると、明確/鋭いユビキタスバンドを観察できないことがあります。
- 前の報告8に示された抗体を用いて、セクション4で説明したようにウェスタンブロット分析を行う。結果は図 2Aに示されています。
- ウェスタンブロットストリッピングバッファーを使用して、PVDF膜から事前インキュベートされた抗体を取り除き、次のウェスタンブロット分析のために異なる抗体でレブロットします。
6. EYFP-CENP-A K124R変異体のユビキタス部位を同定するための質量分析
- pQCXIP-EYFP-CENP-Aを用いた質量分析のためのトランスフェクション
- 10 cmの組織培養皿にCENP-A-/F RPE-1細胞をシードします。細胞密度が1皿あたり36.2 x 105セルであることを確認してください。10%FBSおよび1%ペニシリンストレプトマイシンを有する高グルコースDMEM中の培養細胞。1つの免疫沈降(IP)サンプルに対して少なくとも20個の皿を準備し、少なくとも10mgの総タンパク質を得る(5.3参照)。
注: 最適な結果を得るには、シード処理に使用するセル密度を実証的に決定します。 - 37°Cの細胞を18時間5%CO2の雰囲気で2インキュベートし、広がった後にトランスフェクション試薬~23時間(24時間点はトランスフェクションの0hポイント)を準備します。
- 播種後17時間で、トランスフェクション試薬とトランスフェクト細胞を(4.1.3)として調製する。トランスフェクトされた細胞は、pCGN-HA-ユビキチン(B2806)およびpQCXIP-EYFP-CENP-A K124R(B3256)を有する。
- トランスフェクション後48時間5%CO2の雰囲気で37°Cの細胞をインキュベートします。細胞のライセートのための細胞を収集します。
- リーゼ細胞は緩衝A1内で、(5.2)および(5.3)として免疫沈降を行う。以下の2つの免疫沈降法を(6.1.6)および(6.1.7)として実行します。
注: (6.1.6) では、サンプルを標準のトリスグリシンゲルで実行します。(6.1.7)で、市販のビストリスタンパク質ゲルでサンプルを実行します。「ディスカッション」も参照してください。 - EYFP-CENP-Aのユビキタンスを確認し、セクション5に記載されているようにユビキチン化EYFP-CENP-Aの位置を正確に決定するために、免疫沈降剤全体の10%に対して1つのサンプルを保持します。このサンプルを標準的なトリスグリシンゲルで実行します。SDS-PAGEおよびウェスタンブロットは(5.3)として行った。
- 質量分析のために、免疫沈降物質全体の90%を別のサンプルに保管してください。市販の4%-12%ビストリスタンパク質ゲルの2つのウェル内でこのサンプルを実行します。クマシーブルー溶液を使用してクマシーブルー染色を行います。50-70 kDaのゲル領域を切り出して切り出す(推定モノ-Ub-EYFP-CENP-A K124R領域)。質量分析分析にこのゲル領域を使用します。
- 10 cmの組織培養皿にCENP-A-/F RPE-1細胞をシードします。細胞密度が1皿あたり36.2 x 105セルであることを確認してください。10%FBSおよび1%ペニシリンストレプトマイシンを有する高グルコースDMEM中の培養細胞。1つの免疫沈降(IP)サンプルに対して少なくとも20個の皿を準備し、少なくとも10mgの総タンパク質を得る(5.3参照)。
- インゲル消化を用いた質量分析法解析
- 目的の各ゲルスライスを小さく(1mm2)にダイスし、0.5mLのタンパク質低結合チューブに入れる。
- 100 μL 50%(v/v)アセトニトリルを25 mM NH4HCO3で洗浄し、渦10~15分、スピンダウン、上清を捨て、3倍に繰り返します。
- ベンチトップ真空濃縮器を使用してサンプルを30分間濃縮し、ゲル片を乾燥させます。
- 10 ng/μLシーケンシンググレードのトリプシンを10 μL加え、ゲル片を5分間水分補給します。
- 25 mM NH4HCO3を追加するだけでゲル片をカバーし、一晩で37 °Cで消化します。
- 消化した上清をクリーンな0.65 mLシリコンチューブに移します。50%(v/v)アセトニトリル/5%(v/v)ギ酸(30 μLまたはカバーするのに十分)、渦10分、スピン、および同じ抽出管への転写を加えます。3x を繰り返します。
- ゲル片に10μLのアセトニトリルを加え、5分で渦を巻き、スピンダウンします。上清を同じチューブに移します。
- ベンチトップ真空濃縮器を使用してサンプルを2 μLに濃縮し、サンプルに8 μL 3%(v/v)アセトニトリル/2%(v/v)ギ酸、15分間の渦、30分間16,000 x gでスピンダウンします。
- 液体クロマトグラフィーシステム(表)と質量分析計装置(材料表)を使用して、LC-MS/MSでMSデータ取得を行います。
- 再構成したサンプルを8 μLの逆相液体クロマトグラフィー(RPLC)カラムに注入します。
- 60分間に2~80%の溶媒Bの勾配でペプチドを分離し、勾配は40分間で2%から22%、12分間で22%から35%の溶媒Bに増加し、4分で80%の溶媒Bに上昇し、最後の40分間は一定の量で80%の溶媒Bで保持することを確認します。
注:ソルベントAは0.1%のギ酸および2%アセトニトリルを含み、溶媒Bは0.1%のギ酸および98%のアセトニトリルを含んでいる。すべての濃度は体積/体積として表示されます。 - データ依存取得モードを使用して質量分析データを収集します。簡単に言えば、MSスペクトルを350~1500 m/zで250 msで収集し、さらに断片化を行う場合は、チャージ2~5の上位50個の強烈な前駆体を選択します。MS/MSスペクトルを100~2000 m/zで100 msで収集し、15秒の再選択から前駆体イオンを除外します。
- データベース検索の場合は、デスクトップ上の質量分析データを分析するために、商用ソフトウェア(「材料表」を参照)を開きます。
- 新しい検索を行う場合は、上部メニューの[LC]ボタンをクリックします。次に、[追加] ボタンをクリックして、元の MS 生データ ファイルをアップロードします。
- データベース検索方法として「パラゴン法」の「ヒトタンパク質ID」を選択します。元の MS 生データ ファイルを UniProt Homo Sapiens データベース (160,566 のシーケンスを含む)から検索http://www.uniprot.org/proteomes/UP611385640。
- 次のように検索パラメータを設定:消化酵素としてトリプシンを選択し、最大3つの欠損切断、4つの修飾および2〜5の電荷をペプチドあたり可能にする。最初の検索では最大 20 ppm の質量誤差を設定し、断片化したイオンの場合は 0.02 Da に設定します。タンパク質、ペプチド、および修飾部位の偽発見率(FDR)閾値を1%未満で指定します。ソフトウェアの他のすべてのパラメータをデフォルト値に設定します(質量分析解析の場合は図3を参照)。
- 上部メニューの右側にある [名前を付けて保存]ボタンをクリックし、検索結果を保存するフォルダを選択し、検索名を入力して [保存] ボタンをクリックします。
- 上部メニューの右側にある [処理] ボタンをクリックして、検索を開始します。検索が終了すると、入力した検索名を持つデータが、選択したフォルダに自動的に保存されます。データはソフトウェアFによって容易に開くことができる。
- 特定のペプチドの MS/MS スペクトルを取得するには、検索結果をダブルクリックしてソフトウェア F で開きます。まず、メニュー上部のタンパク質リストでタンパク質をクリックし、メニューの中央にあるペプチドをクリックします。このペプチドのMS/MSはメニューの下部に表示されます。
- MS/MS スペクトルをエクスポートして保存するには、メニューの下部にある MS/MS スペクトルを右クリックし、[コピー] を選択して、PPT 形式や doc. 形式などの適切なファイルに貼り付けます。
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Representative Results
EYFP-CENP-A K124変異体は、ユビエキタリミン、HJURPとの相互作用、およびセントロメア局在化の欠陥を示さない細胞致死性を示す。ここでファキネッティらによって報告されたシステム(2017)66は再構成された:1つの破壊を運ぶ二倍化ヒト(RPE-1)細胞と1つの'floxed'CENP-Aアレル(CENP-A-/F)、EYFP-CENP-AはpBabe-EYFPウイルスベクターから発現した。CENP-A-/F CENP-Aこのシステムでは、CENP-A-/Fアレルからの内因性CENP-Aの発現は、クレリコンビナーゼ6によって破壊される可能性がある。内因性CENP-Aの喪失を救うEYFP-CENP-A WTまたはK124R変異体(図1A)の遺伝子構築物は、レトロウイルス集積が行われたときに安定的に発現した。CENP-A-/Fアレルからの内因性CENP-Aの残りの発現は、その後、クレリコンビナーゼによって破壊された。内因性CENP-Aの発現は、クレリコンビナーゼの誘導の7日後には検出されなかった(図1B、レーン5-7)。EYFP-CENP-A WTおよびK124Rタンパク質発現はいずれも、初期内因性CENP-Aタンパク質レベルと同様のレベルであることが判明した(図1B、レーン3、4、6、および7)。EYFP-CENP-A WTおよびK124R変異体はいずれも、CENP-A-/F-/Fアレルからの内因性CENP-Aの残りの発現の破壊後7日目にセントロメア局在化を示した(図1C-1E)。EYFP-CENP-A WTおよびK124R変異体はいずれも、フラグタグ付きまたはタグなしCENP-A WTおよびK124R突然変異体の場合とは異なり、HJURPとのユビキタス性および相互作用を示した(図2A;フラグタグ付きまたはタグなしCENP-Aについては示されていないデータ)8.細胞生存率はまた、残存内因性CENP-Aアレーレの破壊の14日後にコロニー成長アッセイを行うことにより対処した(図2B)。EYFP-CENP-A WTおよびK124R変異体はいずれも、残存する内因性CENP-Aアレーレの破壊の14日後に同様の数の「救出された」コロニーを示した(図2Bおよび2C)。したがって、我々の結果は、Fachinettiら6によって報告されたものと一致している。
EYFP-CENP-A K124Rのリジン306(K306)におけるユビキタンスは、質量分析法によって明らかにされた。EYFP-CENP-A WTとK124R変異体の両方が、フラグタグ付きまたはタグなしCENP-A WTおよびK124R突然変異体(図2A;フラグタグ付きまたはタグなしCENP-A)の場合とは異なり、HJURPとのユビキタス化および相互作用を示すことがわかった。これらの結果は、EYFPタンパク質の融合が、EYFP-CENP-A K124R変異体におけるK124以外のリジンでのユビキスチン化を誘導し、別の部位におけるこのユビキタス化が、EYFP-CENP-A K124RとHJURPとの相互作用を促進することを示唆している。EYFP-CENP-A K124Rにおけるリジン306(K306)におけるユビキサミンが、IP質量分析法によってCENP-A-/F細胞で明らかにされた(図3Aおよび図3B)。EYFP-CENP-A K124Rのリジン306(K306)は、CENP-Aのリジン56(K56)に相当する。まとめると、大型タンパク質の融合(EYFPタグ付加)がCENP-AのK124以外のリジンでのユビキスチン化を誘発し、別の部位でのこのユビキタス化は、元のK124R単一突然変異表現型を抑制/マスクすることを示唆している。
図1:EYFP-CENP-A K124変異体はセントロメアで局地化する。(A) N末でEYFP(高められた黄色蛍光タンパク質)でタグ付けされた異なるCENP-Aタンパク質構築物の表現。赤い文字は、示された構成体におけるK124Rアミノ酸置換の位置を示す(左)。本研究で実施したアッセイの結果は示されている(右)。(B)ウェスタンブロット分析は検出可能な内因性CENP-Aの存在を示さなかった。免疫ブロット分析は、クレの感染前後に示された救助コンストラクト(ca. 45 kDa)の発現の有無をチェックする。pBabe-EYFPコンストラクトのタンパク質発現は、Cre感染前(レーン1-4)、およびCre感染後(レーン5-6)の前に確認された。内因性CENP-Aタンパク質(ca. 15 kDa)の不存在は、Cre感染の7日後に採取されたCENP-A-/-細胞株(レーン5-6)で確認された。GAPDHタンパク質は、負荷制御として使用した。(C)EYFP-CENP-A K124変異体はセントロメアで局地化する。CENP-A-/F RPE-1細胞は、示された構築物でコトランスフェクトされ、レトロクレウイルス感染の7日後に培養され、免疫染色された。DAPI(青)、EYFP(緑)、および内因性CENP-B(赤)の可視化は、セントロメア位置制御として役立った。スケールバー、10 μm。(D) ヒストグラムとして要約した(C)に示す局化パターン。EYFP陽性シグナルを有する200以上の相間細胞を実験ごとにカウントし(n≥ 3実験)、平均パーセンテージ(±SD)を示した。「その他(非セントロメア)」は、トランスフェクションやその他の治療のために観察された相間におけるヌクレオラー局在化を有する細胞、死細胞、または細胞の大部分を描いている。K124RではWT(学生のt検定)と比較して有意な(n.s.)差は認められない。(E)(C)に示すセントロメレスにおけるEYFP由来シグナルを定量化した。EシグナルをWTの信号に正規化し、平均パーセント(±SEM)を示しています。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:EYFP-CENP-A K124変異体は、ユビキタンス化され、HJURPと相互作用し、細胞生存率はEYFP-CENP-AのK124R突然変異の影響を受けなかった。(A) EYFP-CENP-A K124変異体は、ユビキタンス化され、HJURPと相互作用する。インビボユビキタスアッセイ。CENP-A-/F RPE-1細胞は、示された構成体でトランスフェクトされた。全細胞ライセート(Input)および免疫沈降(IP)の5%のタンパク質を抗GFPウサギポリクローナル抗体を用いて、示された抗体を用いたウェスタンブロット分析により検出した。推定di-Ub-EYFP-CENP-A(**)と推定モノ・ユー・イーFP-CENP-A(*)が示されています。この図は、新倉ら8から修正されています。(B) EYFP-CENP-Aの示されたトランスフェクタントに対する2つの異なる条件([1]および[2])のスキーム(上)に示すようにコロニーの成長アッセイからの代表的な画像。(C)(B)における実験のコロニー生存を要約したヒストグラム。C3つ以上の独立した実験の平均パーセンテージ(±SEM)は、EYFP-CENP-A WT(EYFP-WT)で生存コロニーの割合で正規化されます。eyFP コントロール (学生の t 検定) と比較した p < 0.0001 および **p < 0.01。K124RではWT(学生のt検定)と比較して有意な(n.s.)差は認められない。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:質量分析法により、エキビキシル化されたEYFP-CENP-A K124Rペプチドの断片を検出した。(AA ) RPE-1 CENP-A-/F細胞におけるEYFP-CENP-A K124Rのリジン306(K306)におけるユビキスメトリションの証拠EYFP-CENP-A K124Rのリジン306(K306)は、CENP-Aのリジン56(K56)に相当する。LQKLRGGSTHLLIRペプチド(カバレッジ95.9%、信頼度87.8%)衝突誘発解離解析によって識別されるが表示される。断片化中に検出された(A)のスペクトル内のb(緑)およびy(赤)イオンのm/z(Da)値は、(B)の表で緑色でハイライト表示されます。K306のユビキタス化は、b-3イオン(m/z 753.4730)およびy-8イオン(m/z 1350.8328)のLRGGモチーフ(不完全切断)によって確認される。(B)(A)スペクトルのb(緑)とy(赤)イオンのm/z(Da)値を強調する。(B)の表中のLQK[Umc]STHLLIRは、(A)に示すLQKLRGGSTHLLIRペプチドを示す。これらの数値は、新倉ら8から修正されています。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
| B番号 | 関連する特性 | 参照 | ソース |
| B3027 | pバベ・プロ・クレ | 新倉ら,2019年 | アムルタ・アシュテカール博士 ローレンス・S・キルシュナー博士 |
| B3182 | pバベ-エイプ | 新倉ら,2019年 | - |
| B3161 | pバベ-エイプ-チェンプ-A WT | 新倉ら,2019年 | ダニエレ・ファシネッティ博士、ドン・W・クリーブランド博士 |
| B3164 | pBabe-EYFP-CENP-A K124R | 新倉ら,2019年 | ダニエレ・ファシネッティ博士、ドン・W・クリーブランド博士 |
| B3031 | psPAX2 | 新倉ら,2019年 | ジョン・トンプソン博士、グスタボ・W・レオーネ博士 |
| D3032 | pMD2.g | 新倉ら,2019年 | ジョン・トンプソン博士、グスタボ・W・レオーネ博士 |
| B3189 | Pgp | 新倉ら,2019年 | 田田健二(日本の慈地医療大学) |
| B3190 | を使用します。 | 新倉ら,2019年 | 田田健二(日本の慈地医療大学) |
| B3001 | pPAM | 新倉ら,2019年 | - |
| B3252 | アイクプ | 新倉ら,2019年 | - |
| B3254 | PQCXIP-EYFP-CENP-A WT | 新倉ら,2019年 | - |
| B3256 | PQCXIP-EYFP-CENP-A K124R | 新倉ら,2019年 | - |
| B2806 | pCGN-HA-ユビキチン | 新倉ら,2019年 | - |
表1:本研究で用いたプラスミドベクター
| B番号 | ヘルパー/パッケージングプラスミドベクター | コンビネーション 1 | コンビネーション2 | コンビネーション3 |
| B3031 | psPAX2 (レンチウイルス性ギャグ/ポールベクター) | 2μg | ||
| D3032 | pMD2.g (レンチウイルスenvベクター) | 2μg | ||
| B3189 | pGP (レトロウイルス性ギャグ/polベクトル) | 2μg | ||
| B3190 | pCI-VSVG (レトロウイルス性envベクター) | 2μg | ||
| B3001 | pPAM (レトロウイルス性 gag-pol-env をコードするアンホトロピックヘルパーベクター) | 2μg |
表2:ヘルパー/パッケージングプラスミドベクターの組み合わせ(1.1.3):pBabe-EYFP-CENP-Aコンストラクトのレトロウイルストランスフェクション。
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Discussion
ここでは、EYFPタグ付けがCENP-A K124R変異タンパク質8の異なるリジンでのユビキタス化を誘導することを示唆するEYFP-CENP-A K124R変異体のユビキタンスを同定するための質量分析分析の方法を説明した。結果として、質量分析によりCENP-Aのリジン56(K56)に対応するEYFP-CENP-A K124Rのリジン306(K306)のユビキタンスを同定しました。ここで説明する質量分析法は、以前にCENP-A WT-Flag12のリジン124(K124)のユビキタスサイトを同定した模擬法である。12したがって、この方法は、異なるタグおよび他のセントロメアキネトコレタンパク質を有するヒトCENP-Aタンパク質に適用することができる。LC-MS/MSに基づく質量分析は、広い範囲のタンパク質の潜在的な翻訳後修飾(PTM)を同定するために一般に受け入れられています。いくつかのアッセイ/分析(すなわち、インビボのユビキタス化アッセイ、コロニー成長アッセイ、質量分析)からなる組み合わせ方法は、標的タンパク質のユビキタス化の機能的役割を特定することに興味がある研究者に推奨される可能性があります。
しかし、このプロトコルは、細胞全体の周期の間に、細胞の全細胞または特定の単一細胞におけるこれらのタンパク質の、ユビキタスバンドの検出および/または同定をカバーしていません。近年の光遺伝学的アプローチは劇的に開発され、細胞シグナル伝達系の定量的研究に大きな影響を与えています。光遺伝学は、もともと単一成分、微生物オプシンベースのシステムを使用して個々のニューロンを正確に活性化または阻害するアプローチを提供してきました。現在、前例のない時空間的な精度を持つタンパク質活性は、自然の遺伝的にコードされた光受容体を利用することによって制御することができ、様々な遺伝的にコードされたツールは、タンパク質リン酸化を含む多くの生物学的プロセスの光制御を可能にする15。したがって、光遺伝学は、細胞および生物全体のレベルでの時空間的タンパク質キナーゼシグナル伝達を調査する有望なシステムである。光制御プロテインキナーゼの数は急速に拡大していますが、現在の数はまだ限られています。しかし、光制御タンパク質のユビキタス化の開発が遅れ、光受容体の高分子量タギングは、WTおよび変異型タンパク質の両方のユビキタス化を混乱させ、機能的に天然タンパク質機能をaforestatedとして変化させる可能性がある。したがって、ユビキタス化を可視化し、生きている細胞および生物レベル全体での時空間的タンパク質のユビキタスシグナル伝達を調べるには、より低い分子量タグ付けまたは探査技術の開発が緊急に必要である。
本研究では、EYFPベクター制御は、主要質量分析の結果を適切に検討するために、制御アッセイおよび分析(免疫蛍光分析、コロニー成長アッセイ、および生体内ユビキタス化アッセイ)に不可欠である。免疫沈降実験では、EYFPタンパク質との非特異的相互作用がしばしば観察されるため、EYFP融合タンパク質の真の相互作用を評価するためには、EYFPベクターコントロールが不可欠です。RPE-1 CENP-A-/F細胞で発現したEYFP-CENP-A K124Rを用-/Fいた質量分析では、EYFPポリペプチド配列中のリジン部位に対するユビキタス化は示されなかった。しかし、他の未知の条件では、EYFPポリペプチド配列中のリジン部位が高分子量のEYFPおよび/または他のタグ付き融合タンパク質においてユービティ化することが期待できる。
コロニーの成長アッセイの場合、レトロクレウイルス感染後の内因性CENP-Aのタンパク質枯渇とpBabe-EYFP-CENP-Aコンストラクトのタンパク質発現を確認するために、ウェスタンブロット分析用の細胞を収集することが推奨されます。このようにして、コロニーの伸び表現型が本当に外因性CENP-A WTまたは突然変異体の唯一の発現によるものであるかどうかを判断することができる。ウェスタンブロット分析では、次のウェスタンブロット分析のために異なる抗体で膜をリブロットするためにストリッピングが行われる場合、異なる抗体を持つ次のターンのブロットに対して、以前のターンのブロットと同じ定量検出システムを使用する必要があります。前のターンのブロットのバンドが、異なる抗体を持つ次のターンのブロットの膜の目的領域で検出不可能であることを確認する必要があります。または、前のターンのブロットと同じ定量検出システムを使用し、前のターンのブロットで使用された単なる二次抗体とのインキュベーションが、異なる抗体で次のターンのブロットを開始する前にタンパク質バンドの検出につながらないかどうかを確認します。インビボのユビキタス化アッセイのためには、より大きなSDS-PAGEゲル(ゲル電気泳動装置IまたはII)を実行する装置を用いて、より大きなSDS-PAGEゲルを実行することが重要である。経験的には、より大きなSDS-PAGEゲルは、タンパク質バンドを明確に分離し、小さなゲルで不十分に検出された可能性のあるかすかなバンドの検出の感度を高めるであろう(すなわち、タンパク質バンドはより大きなゲルで鋭く見える)。
特定のタンパク質の翻訳後修飾(PTM)を徹底的にLC-MS/MSにマッピングするには、適切なSDS-PAGEゲルを選択することが非常に重要です。SDS-PAGEに最も広く使用されているゲルシステムは、積層ゲル成分と溶解ゲル成分を含むトリスグリシンゲルを使用するレムリ系です。この古典的なシステムでは、スタックゲル(Tris、pH 6.8)および解決ゲル(Tris、pH 8.8)に使用されるバッファーのpHおよびイオン強度は、ゲルを実行するために使用されるバッファー(Tris,pH 8.3)とは異なります。バンドの歪み、分解能の損失、またはアーティファクトバンドは、Laemmliシステムの高度にアルカリ性の動作pHによって引き起こされる可能性があります。前の報告書は、Laemmliシステム16でバンド分解不良の主な原因を説明し、高pHでのポリアクリルアミドの加水分解による溶解ゲルの不安定性および短い有効期限を含む、 サンプルタンパク質の化学的変化、タンパク質のシステイン残基の還元ジスルフィドの再酸化、およびpH 5.2でのレムリサンプルバッファーで95-100°Cの加熱を伴うタンパク質のAsp-Pro結合の切断。市販の4%-12%ビストリスタンパク質ゲルは、ビストリスHCI緩衝(pH 6.4)であり、従来のトリスグリシンゲル16とは異なり、pH ca.7.0で動作する。Laemmliシステムと比較する多数のメリットは、Bis-Trisシステム16の中性動作pHによって生成され、分解ゲルの高い安定性と長い有効期限、中性pHでの電気泳動時のサンプルタンパク質安定性の向上により、より鋭いバンド分解と正確な結果、ジスルフィドの完全な減少およびAsp-Pro結合の切断の欠如を含む。本レポートでは、市販の4%-12%ビストリスタンパク質ゲルを使用してEYFP-CENP-A K124Rタンパク質のPTM(図3)をマッピングすることに成功しました。そのため、市販の4%-12%ビストリスタンパク質ゲルは、この目的のために使用することを強くお勧めします。
特定のタンパク質の翻訳後修飾(PTM)をマッピングするために、LC-MS/MSと結合した標的タンパク質のインゲル消化が広く使用されている。本研究では、アフィニティー精製質量分析法(AP-MS)戦略を用いてユビキチン化部位EYFP-CENP-A K124Rを同定することを目的とした。したがって、最初の重要なステップは、EYFP-CENP-A K124R過剰発現細胞からの免疫沈降を用いて高純度のユビキチン化されたEYFP-CENP-A K124Rタンパク質を大量に得ることで、EYFP-CENP-A K124Rのユビキチン化部位の同定と確認を大きく促進する可能性があります。非ユビキチン化EYFP-CENP-A K124Rタンパク質の干渉を低減するために、 SDS-PAGEゲル上のエキキチン化されたEYFP-CENP-A K124Rの位置を正確に決定するために、抗GFP、抗HA(Ub)、反ユビキチン(セクション[6.1.6])、およびクマシーブルー染色(セクション[6.1.7]を参照)のウェスタンブロットを正確に決定するために行われました。最後に、ユビキチン化EYFP-CENP-A K124Rを含むゲルバンドの最小化された領域のみをLC-MS/MSと結合してインゲル消化のために切除し、最適化された結果を得た。LC-MS/MSを操作する前に乾燥したペプチドを再構成する場合、3%(v/v)アセトニトリル/2%(v/v)ギ酸を使用して、ペプチドの溶解度と回収率を向上させた。データベース検索の結果、検索エンジンのおおよその割り当てアルゴリズムのために実際には存在しない PTM が発生することがあります。したがって、もう一つの重要なステップは、EYFP-CENP-A K124Rユビキチン化部位を手動でソフトウェアF(材料表)の助けを借りてユビキチン化ペプチドのMS/MSをレビューすることによって、データベース検索によっておおよその割り当てによって導入された「非現実的な」ユビキチン化部位を排除することによって確認することです。要約すると、このAP-MS戦略は、重要な生物学的意義を有するEYFP-CENP-A K124Rユビキチン化部位の同定のための効率的で堅牢なパイプラインを確立した。さらに重要なことに、このパイプラインは、様々な機能性タンパク質のPTMを調査するために広く拡張される可能性もあります。
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Disclosures
著者らは競合する利益を宣言しない。
Acknowledgments
南京大学モデル動物研究センターのChao-Jun Liに質量分析に感謝します。ヤンミニ・ダラル、深川達夫、そして南京大学・グリーヒー小児がん研究所のモデル動物研究センターの研究者の皆さんに、有益な議論、実験指導、試薬をありがとうございました。ドン・W・クリーブランド,ダニエレ・ファキネッティ,ヤンミニ・ダラル,ミン・ブイ,グスタボ・W・レオーネ,ジョン・トンプソン,ローレンス・S・キルシュナー,アムルタ・アシュテカール,ベン・E・ブラック,グレニス・A・ログドン,田先健二,ドーン・S・チャンドラーに試薬の寛大な贈り物に感謝します。Y.N. 江蘇省「二重一流」建設基金、江蘇省自然科学基金(SBK2019021248)、江蘇省第16回シックス・ビッグ・タレント・ピークス・ファンド(TD-SWYY-001)、江蘇省「外国人専門家百人財プログラム」基金(SBK2019010048)、国立自然科学財団(3666年)この研究の一部は、NCI助成金R21 CA205659によってサポートされました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equpiments/Tools | |||
| 0.5 ml protein low binding tubes | Eppendorf | 022431064 | For mass spectrometry analysis |
| 10cm cell culture dish | BIOFIL/JET, China | 700224 | 10 cm tissue culture dish (Yohei lab, PN63) |
| 6 Well Cell Culture Cluster | Fisher/Corning Incorporated | 07-200-83 | 6-well culture plate |
| CentriVap | LABCONCO | - | Benchtop vacuum concentrator for vaccum dry peptides for mass spectrometry analysis |
| ChromXP C18CL, 120A, 15 cm x 75 μm | Eksigent Technologies | 805-00120 | Liquid chromatography (RPLC) column for mass spectrometry analysis |
| HCX PL APO 100x oil immersion lens | Leica | LEICA HCX PL APO NA 1.40 OIL PHE | 100X Oil immersion lens |
| HCX PL APO 63x oil immersion lens | Leica | LEICA HCX PL APO NA 1.40 OIL PH 3 CS | 63X Oil immersion lens |
| Immobilon-FL PVDF Transfer Membrane | EMD Millipore | IPVH00010 | For western blot |
| Leica DM IRE2 motorized fluorescence microscope | Leica | - | motorized fluorescence microscope |
| Leica EL6000 compact light source | Leica | External light source for fluorescent excitation | |
| Micro Cover glass (22 mm x 22 mm) | Surgipath | 105 | Cover glass (22 mm x 22 mm) |
| Model V16-2 polyacrylamide gel electrophoresis apparatus | Apogee Electrophoresis/CORE Life Sciences | 31071010 | Gel electrophoresis apparatus I to apply bigger SDS-PAGE gel |
| nanoLC.2D | Eksigent Technologies | - | liquid chromatography system for mass spectrometry analysis |
| NuPAGE 4%-12% Bis-Tris Protein Gels | Thermo Fisher | NP0335BOX | The commercially available 4%-12% Bis-Tris protein gels for mass spectrometry analysis |
| Olympus FLUOVIEW FV3000 confocal laser scanning microscope | Olympus | - | Confocal laser scanning microscope (https://www.olympus-lifescience.com.cn/en/support/ downloads/#!dlOpen=%23detail847250519) |
| ORCA-R2 Degital CCD camera | Hamamatsu | C10600-10B | CCD camera |
| PAP Pen | Binding Site | AD100.1 | For a water repellant barrier in immunofluorescent staining |
| TISSUE CULTURE DISHES 10CM | VWR | 25382-166 | 10 cm tissue culture dish |
| Vertical electrophoresis for gel running (big size) | Junyi, China | JY-SCZ6+ | Gel electrophoresis apparatus II to apply bigger SDS-PAGE gel (Yohei lab, PE23) |
| VWR Micro Slides, Frosted | VWR International | 48312-013 | Micro slides |
| Primary antibodies | |||
| Anti-CENP-A antibody | Stressgen/Enzo Life Sciences | KAM-CC006 | Mouse monoclonal antibody |
| Anti-CENP-B antibody | Novus Biologicals | H00001059-B01P | Mouse monoclonal antibody |
| anti-GAPDH | ABCAM | ab37168 | Rabbit polyclonal antibody |
| anti-GAPDH | Invitrogen | PA1987 | Rabbit polyclonal antibody |
| anti-GFP antibody | ANTI #76 (Homemade antibody) | Rabbit polyclonal antibody | |
| anti-HA (3F10) | Roche | 11815016001 | Rat monoclonal antibody |
| anti-HJURP | Proteintech Group | 15283–1-AP | Rabbit polyclonal antibody |
| anti-Ubiquitin | Bethyl Laboratories | A300-317A-1 | Rabbit polyclonal antibody |
| Reagents | |||
| Bio-Rad Protein Assay | Bio-Rad | 500-0006 | Commercial protein assay reagent I for measurement of protein concentration (compatible with 0.1% SDS) |
| Branson SONIFIER 450 | Sonicator | ||
| Branson Ultrasonics sonicator Microtip Step, Solid, Threaded 9.5 mm | VWR Scientific Products Inc. | 33995-325 | Disruptor horn for sonication |
| Branson Ultrasonics sonicator Microtip Tapered 6.5 mm | VWR Scientific Products Inc. | 33996-185 | Microtip for sonication |
| Buffer A1 | - | - | 20 mM Tris-HCl, pH 7.4; 50 mM NaCl; 0.5% Nonidet P-40; 0.5% deoxycholate; 0.5% SDS; 1 mM EDTA; complete EDTA-free protease inhibitor reagent |
| Complete EDTA-free protease inhibitor cocktail | Roche | 11-873-580-001 | Complete EDTA-free protease inhibitor reagent for buffer A1 |
| Coomassie brilliant blue R-250 | BBI Life Sciences | CAS 6104-59-2 | Coomassie blue solution for mass spectrometry analysis |
| Crystal violet solution (2.3% crystal violet, 0.1% ammonium oxylate, 20% ethanol) | SigmaI-Aldrich | HT90132-1L | For colony staining |
| DAPI | SIGMA-SLDRICH | D9542 | For nuclear staining |
| DMEM: F12 Medium | ATCC | 30-2006 | DMEM: F12 Medium |
| Fetal Bovine Serum, certified, heat inactivated, US origin | Life Technologies/Gibco | 10082 | FBS (fetal bovine serum) |
| High-glucose DMEM (Dulbecco’s modified Eagle’s medium) | Life Technologies/BioWhittaker | 12-604 | high-glucose DMEM |
| Lipofectamin 3000 | Life Technologies/Invitrogen | L3000 | Transfection reagent I for chemical transfection |
| Lipofectamin 3000, P3000 solution | Life Technologies/Invitrogen | L3000 | Transfection reagent II for chemical transfection |
| Methanol | Fisher | A412-4 | Fixation reagant |
| Non fat powdered milk (approved substitution for carnation powdered milk) | Fisher Scientific | NC9255871 (Reorder No. 190915; Lot# 90629) | Non-fat skim milk |
| Opti-MEM I | Life Technologies/Invitrogen | 31985 | Reduced serum media |
| p-phenylenediamine | SIGMA-SLDRICH | P6001 | For mounting medium |
| Penicillin, Streptomycin; Liquid | Fisher/Gibco | 15-140 | Penicillin-streptomycin |
| Poly-L-Lysine SOLUTION | SIGMA-SLDRICH | P 8920 | Poly-L-Lysine, 0.1% w/v, in water |
| Polyethyleneimine [PEI]; 1.0 mg/ml | Polysciences | 23966–2 | Transfection reagent III for chemical transfection |
| Protein A sepharose CL-4B beads | GE Healthcare/Amersham | 17-0963-03 | Protein A sepharose CL-4B beads for in vivo ubiquitylation assays using pQCXIP-EYFP-CENP-A |
| Restore Western Blot Stripping Buffer | Thermo Scientific | PI21059 | Western Blot Stripping Buffer I |
| Sequencing grade trypsin | Promega | V5111 | For mass spectrometry analysis |
| SuperSignal West Femto Maximum Sensitivity Substrate | Thermo | 34095 | Ultra-sensitive enhanced chemiluminescent (ECL) substrate |
| UltraPure Distilled Water | Life Technologies/Invitrogen/Gibco | 10977 | Sterile tissue culture grade water |
| Western Blot Stripping Buffer II ((50 mM Tris-HCl, pH 6.85; 2% SDS; 50 mM DTT; 100 mM 2-Mercaptoethanol) | - | - | Western Blot Stripping Buffer II |
| Secondary antibodies | |||
| Alexa Fluor 488 Goat Anti-Rabbit IgG | Life Technologies/Invitrogen | A11008 | fluorophore-conjugated secondary antibody (Affinity-purified secondary antibody) |
| Alexa Fluor 594 Goat Anti-Mouse IgG | Life Technologies/Invitrogen | A11005 | fluorophore-conjugated secondary antibody (Affinity-purified secondary antibody) |
| Softwares | |||
| Acquisition FV31S-SW software | Olympus | - | Sofware C1 (https://www.olympus-lifescience.com.cn/en/support/ downloads/#!dlOpen=%23detail847250519) |
| Analysis FV31S-DT software | Olympus | - | Sofware C2 (https://www.olympus-lifescience.com.cn/en/support/ downloads/#!dlOpen=%23detail847250519) |
| cellSens Dimension software Ver. 1. 18 | Olympus | - | Sofware C3 (https://www.olympus-lifescience.com.cn/en/ software/cellsens/) |
| Image Studio Analysis Software Ver 4.0 | LI-COR Biosciences | - | Software D |
| Molecular Imager Versadoc MP4000 System | Bio-Rad | - | Chemiluminescence imager for immunoblot detection |
| Odyssey CLx Infrared imaging System | LI-COR Biosciences | - | Infrared imaging system for immunoblot detection |
| OpenCFU saftware | - | - | For colony counting (http://opencfu.sourceforge.net/) |
| Openlab version 5.5.2. Scientific Imaging Software | Improvision/PerkinElmer | - | Software A |
| ProteinPilot Software version 4.5 | AB SCIEX | - | Software F for mass spectrometry analysis |
| Quantity One 1-D analysis software | Bio-Rad | - | Software E |
| TripleTOF 5600+ System | AB SCIEX | - | Mass spectrometry instrument |
| Volocity version 6.3 3D Image Analysis Software (Volocity Acquisition) | PerkinElmer | - | Software B1 |
| Volocity version 6.3 3D Image Analysis Software (Volocity Quantification) | PerkinElmer | - | Software B2 |
References
- Dunleavy, E. M., et al. HJURP is a cell-cycle-dependent maintenance and deposition factor of CENP-A at centromeres. Cell. 137 (3), 485-497 (2009).
- Foltz, D. R., et al. Centromere-specific assembly of CENP-a nucleosomes is mediated by HJURP. Cell. 137 (3), 472-484 (2009).
- Bernad, R., et al. Xenopus HJURP and condensin II are required for CENP-A assembly. J Cell Biol. 192 (4), 569-582 (2011).
- Niikura, Y., et al. CENP-A K124 Ubiquitylation Is Required for CENP-A Deposition at the Centromere. Developmental Cell. 32 (5), 589-603 (2015).
- Niikura, Y., Kitagawa, R., Kitagawa, K. CENP-A Ubiquitylation Is Inherited through Dimerization between Cell Divisions. Cell Reports. 15 (1), 61-76 (2016).
- Fachinetti, D., et al. CENP-A Modifications on Ser68 and Lys124 Are Dispensable for Establishment, Maintenance, and Long-Term Function of Human Centromeres. Developmental Cell. 40 (1), 104-113 (2017).
- Niikura, Y., Kitagawa, R., Kitagawa, K. CENP-A Ubiquitylation Is Required for CENP-A Deposition at the Centromere. Developmental Cell. 40 (1), 7-8 (2017).
- Niikura, Y., Kitagawa, R., Fang, L., Kitagawa, K. CENP-A Ubiquitylation Is Indispensable to Cell Viability. Developmental Cell. 50 (6), 683-689 (2019).
- Srivastava, S., Foltz, D. R. Posttranslational modifications of CENP-A: marks of distinction. Chromosoma. 127 (3), 279-290 (2018).
- Srivastava, S., Zasadzinska, E., Foltz, D. R. Posttranslational mechanisms controlling centromere function and assembly. Current Opinion in Cell Biology. 52, 126-135 (2018).
- Ohkuni, K., Takahashi, Y., Basrai, M. A. Protein purification technique that allows detection of sumoylation and ubiquitination of budding yeast kinetochore proteins Ndc10 and Ndc80. Journal of Visualized Experiment. (99), e52482 (2015).
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- Lamb, J. R., Tugendreich, S., Hieter, P. Tetratrico peptide repeat interactions: to TPR or not to TPR. Trends in Biochemical Sciences. 20 (7), 257-259 (1995).
- Leopold, A. V., Chernov, K. G., Verkhusha, V. V. Optogenetically controlled protein kinases for regulation of cellular signaling. Chemical Society Reviews. 47 (7), 2454-2484 (2018).
- Thermofisher, Inc. Protein gel electrophoresis technical handbook. , Available from: https://www.thermofisher.com/content/dam/LifeTech/global/Forms/PDF/protein-gel-electrophoresis-technical-handbook.pdf (2015).
