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Biology

ऊतक-विशिष्ट चैपरवन इंटरैक्शन के लिए स्क्रीन करने के लिए कैनोरहैब्डिटिस एलिगेंस का उपयोग करना

Published: June 7, 2020 doi: 10.3791/61140
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Life Sciences, Ben-Gurion University of the Negev

Summary

चैपरवन-चैपरोन और चैपरोन-सब्सट्रेट इंटरैक्शन का अध्ययन करने के लिए, हम हल्के उत्परिवर्तन या चैपरोन की अधिक अभिव्यक्ति के संयोजन में आरएनए हस्तक्षेप का उपयोग करके कैनोरहैब्डिटिस एलिगेंस में सिंथेटिक इंटरैक्शन स्क्रीन करते हैं और ऑर्गेनम स्तर पर ऊतक-विशिष्ट प्रोटीन रोग की निगरानी करते हैं।

Abstract

सेलुलर फंक्शन के लिए प्रोटीन और प्रोटीन कॉम्प्लेक्स की सही तह और असेंबली जरूरी है। कोशिकाएं गुणवत्ता नियंत्रण मार्गों को नियोजित करती हैं जो स्वस्थ प्रोटेओम बनाए रखने के लिए क्षतिग्रस्त प्रोटीन को सही, तनहा या खत्म करते हैं, इस प्रकार सेलुलर प्रोटेओस्टेसिस सुनिश्चित करते हैं और आगे प्रोटीन क्षति को रोकते हैं। प्रोटेओस्टेसिस नेटवर्क के भीतर अनावश्यक कार्यों के कारण, बहुकोशिकीय जीव कैनोरहैब्डिटिस एलिगेंस में नॉकडाउन या म्यूटेशन का उपयोग करके पता लगाने योग्य फेनोटाइप के लिए स्क्रीनिंग अधिकांश मामलों में मामूली या कोई फेनोटाइप का पता लगाने में परिणाम होता है। हमने एक विशिष्ट कार्य के लिए आवश्यक चैपरोस की पहचान करने के लिए एक लक्षित स्क्रीनिंग रणनीति विकसित की है और इस प्रकार फेनोटाइप और कार्य के बीच की खाई को पाट दिया है। विशेष रूप से, हम आरएनएआई सिंथेटिक इंटरैक्शन स्क्रीन, नॉक-डाउन चैपरवन अभिव्यक्ति, एक समय में एक चैपरवन का उपयोग करके उपन्यास चैपरवन इंटरैक्शन की निगरानी करते हैं, जानवरों में एक चैपरवन-एन्कोडिंग जीन में उत्परिवर्तन ले जाते हैं या ब्याज की एक चैपरोन को अधिक व्यक्त करते हैं। दो चैपरोनेस को बाधित करके जो व्यक्तिगत रूप से कोई सकल फेनोटाइप प्रस्तुत नहीं करते हैं, हम उन चैपरोनेस की पहचान कर सकते हैं जो दोनों बेफिक्र होने पर एक विशिष्ट फेनोटाइप को बढ़ा या बेनकाब करते हैं। हम प्रदर्शित करते हैं कि यह दृष्टिकोण एक दिए गए फेनोटाइप से जुड़े प्रोटीन या प्रोटीन परिसरों के तह को मिलाने के लिए एक साथ कार्य करने वाले चैपरोन्स के विशिष्ट सेटों की पहचान कर सकता है।

Introduction

कोशिकाएं गुणवत्ता नियंत्रण मशीनों को नियोजित करके प्रोटीन क्षति का सामना करती हैं जो किसी भी क्षतिग्रस्त प्रोटीन की मरम्मत, तनहा या हटाएं1,2। प्रोटीन परिसरों की तह और असेंबली को आणविक चैपरनेस द्वारा समर्थित किया जाता है, जो अत्यधिक संरक्षित प्रोटीन का एक विविध समूह है जो क्षतिग्रस्तप्रोटीन3,4,5,6, 7की मरम्मत या तनहा कर सकता है। क्षतिग्रस्त प्रोटीन को हटाने की मध्यस्थता सर्वव्यापक-प्रोटीसोम सिस्टम (यूपीएस)8 या ऑटोफैगी मशीनरी9 द्वारा चैपरोन्स10, 11,12के सहयोग से की जाती है। प्रोटीन हो्योस्टोस्टेसिस (प्रोटेओस्टेसिस) इसलिए, तह और क्षरण मशीनों से बना गुणवत्ता नियंत्रण नेटवर्क द्वारा बनाए रखा जाता है3,13। हालांकि, वीवो में प्रोटेओस्टेसिस नेटवर्क के विभिन्न घटकों के बीच बातचीत को समझना एक बड़ी चुनौती है। जबकि प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन स्क्रीन शारीरिक बातचीत और चैपरवन कॉम्प्लेक्स14,15पर महत्वपूर्ण जानकारी का योगदान करते हैं, संगठन को समझते हैं और वीवो में ऊतक-विशिष्ट चैपरवन नेटवर्क के भीतर प्रतिपूरक तंत्र की कमी है।

16 , 17,18, 18 , 17 ,18सामान्य या प्रतिपूरक जैविक रास्तों में शामिल जीन के जोड़े के बीच संबंधों की जांच करने के लिए आनुवंशिक बातचीत का उपयोग अक्सर एक शक्तिशाली उपकरण के रूप में कियाजाताहै । इस तरह के संबंधों को उत्परिवर्तन के जोड़े के संयोजन से मापा जा सकता है और दूसरे जीन16में उत्परिवर्तन के कारण होने वाली फेनोटाइपिक गंभीरता पर एक जीन में उत्परिवर्तन के प्रभाव की मात्रा निर्धारित की जा सकती है । जबकि अधिकांश ऐसे संयोजन फेनोटाइप के संदर्भ में कोई प्रभाव नहीं दिखाते हैं, कुछ आनुवंशिक बातचीत या तो बढ़ सकती है या मापा फेनोटाइप की गंभीरता को कम कर सकती है। उत्तेजक उत्परिवर्तन तब देखे जाते हैं जब दोहरे विलोपन उत्परिवर्ती का फेनोटाइप एकल विलोपन म्यूटेंट के संयोजन पर देखे गए अपेक्षित फेनोटाइप की तुलना में अधिक गंभीर होता है, जिसका अर्थ है कि दो जीन समानांतर रास्तों में कार्य करते हैं, एक साथ दिए गए कार्य को प्रभावित करते हैं। इसके विपरीत, म्यूटेशन को समाप्त करने के लिए मनाया जाता है जब डबल विलोपन उत्परिवर्तन का फेनोटाइप एकल विलोपन म्यूटेंट के साथ देखे गए फेनोटाइप की तुलना में कम गंभीर होता है, जिसका अर्थ है कि दोनों जीन एक जटिल के रूप में एक साथ कार्य करते हैं या एक ही मार्ग16,18में भाग लेते हैं। तदनुसार, विविध फेनोटाइप जिनका मात्रा निर्धारित किया जा सकता है, जिनमें व्यापक फेनोटाइप, जैसे घातकता, विकास दर और चिंता का आकार, साथ ही ट्रांसक्रिप्शनल रिपोर्टर्स जैसे विशिष्ट फेनोटाइप का उपयोग आनुवंशिक बातचीत की पहचान करने के लिए किया गया है । उदाहरण के लिए, जोनिकास एट अल ने सैकरोमाइसेस सेर्विसियाई ईआर की बातचीत की जांच करने के लिए एक ईआर स्ट्रेस रिपोर्टर पर भरोसा किया, जो जोड़ी के रूप में जीन विलोपन विश्लेषण का उपयोग करके प्रोटीन प्रतिक्रिया प्रोटेओस्टेसिस नेटवर्क सामने आया19।

आनुवंशिक इंटरैक्शन स्क्रीन में डबल म्यूटेंट20का एक व्यापक सेट उत्पन्न करने के लिए व्यवस्थित रूप से जोड़ीवार विलोपन उत्परिवर्तनों को पार करना शामिल है। हालांकि, पशु मॉडल में, और विशेष रूप से सी एलिगेंसमें, यह बड़े पैमाने पर दृष्टिकोण संभव नहीं है। इसके बजाय, उत्परिवर्ती उपभेदों को आरएनए हस्तक्षेप (आरएनएआई)21का उपयोग करके जीन अभिव्यक्ति को नीचे विनियमित करके उनके आनुवंशिक बातचीत पैटर्न के लिए परीक्षण किया जा सकता है । C. elegans आरएनएआई22, 23पर आधारित स्क्रीन के लिए एक शक्तिशाली प्रणाली है । सी एलिगेंसमें, डबल-फंसे आरएनए (डीएसआरएनए) डिलीवरी बैक्टीरियल फीडिंग द्वारा प्राप्त की जाती है, जिससे डीएसआरएनए अणुओं को कई ऊतकों में फैलता है। इस तरह, पेश किए गए डीएसआरएनए अणु एक त्वरित और सरल प्रक्रिया21के माध्यम से जानवर को प्रभावित करते हैं। इसलिए, आरएनएआई का उपयोग करके एक आनुवंशिक इंटरैक्शन स्क्रीन आरएनएआई पुस्तकालयों24का उपयोग करके जीन या अधिकांश सी एलिगेंस कोडिंग जीन के एक सेट को विनियमित करने के प्रभाव को प्रकट कर सकती है। ऐसी स्क्रीन में, हिट जो ब्याज के उत्परिवर्ती के व्यवहार को प्रभावित करते हैं, लेकिन जंगली प्रकार के तनाव फेनोटाइप के संभावित संशोधकहैं, 25पर नजर रखी जा रही है। यहां, हम सी एलिगेंसमें व्यवस्थित रूप से ऊतक-विशिष्ट चैपरवन इंटरैक्शन को मैप करने के लिए म्यूटेशन और आरएनएआई स्क्रीनिंग का संयोजन लागू करते हैं।

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Protocol

1. आरएनएआई के लिए नेमाटोड ग्रोथ मीडिया प्लेट्स की तैयारी

  1. 1 एल बोतल में, एनएसीएल के 3 ग्राम, बैक्टो-पेप्टोन के 2.5 ग्राम, आगर के 17 ग्राम और 1 एल और ऑटोक्लेव तक आसुत पानी जोड़ें।
  2. 55 डिग्री सेल्सियस करने के लिए ठंडी बोतल।
  3. नेमाटोड ग्रोथ मीडिया (एनजीएम) बनाने के लिए 1 एम केएच2पीओ4,पीएच 6.0, 1 एम सीसीएल 2 के1एमएल, 1 एम एमजीएसओ 4 के1एमएल और 1 एमएल ऑफ कोलेस्ट्रॉल सॉल्यूशन(टेबल 1)जोड़ें।
  4. एनजीएम-आरएनएआई समाधान बनाने के लिए एम्पीसिलिन (100 मिलीग्राम/एमएल) का 1 एमएल और 1 एम आईपीटीजी(टेबल 1)का 0.5 एमएल जोड़ें।
    नोट: आमतौर पर इस्तेमाल किया HT115 (DE3) ई. कोलाई बैक्टीरिया एक IPTG-inducible T7 डीएनए पॉलीमरेज dsRNA-encoding प्लाज्मिड व्यक्त करने के लिए इस्तेमाल किया होते हैं । ये प्लाज्मिड एम्पिसिलिन प्रतिरोध के लिए भी एन्कोड करते हैं।
  5. बोतल को घूमता हुआ गर्म समाधान मिलाएं।
  6. हुड में या बाँझ प्रक्रियाओं का उपयोग करते हुए, प्लेटों में एनजीएम समाधान डालें या एक पेरिस्टाल्टिक पंप का उपयोग करें, समाधान को प्लेटों में बांटें। इस स्क्रीन के लिए 6-वेल, 12-वेल, 40 एमएम या 60 एमएम प्लेट्स का इस्तेमाल करें। आगर को प्लेट की गहराई के बारे में 2/3 भरना चाहिए।
  7. प्लेटों को कमरे के तापमान पर बेंच पर रात भर सूखने दें, प्लेटों को ढककर रखें। आरएनएआई के लिए एनजीएम प्लेटों को एक महीने तक 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित किया जा सकता है।

2. आरएनएआई बैक्टीरिया बढ़ रहा है और प्लेटों बोने

  1. हुड में या बाँझ प्रक्रियाओं का उपयोग करके, एम्पिसिलिन के 1 एमएल (100 मिलीग्राम/एमएल) और 2.5 एमएल टेट्रासाइक्लिन (5 मिलीग्राम/एमएल)(टेबल 1)को पूर्व-ऑटोक्लेवेड 1 एल एलबी समाधान और मिश्रण में जोड़ें।
    नोट: आमतौर पर इस्तेमाल किया HT115 (DE3) ई. कोलाई बैक्टीरिया टेट्रासाइक्लिन प्रतिरोधी हैं ।
  2. हुड में या बाँझ प्रक्रियाओं का उपयोग करके, 2 एमएल-डीप 96-अच्छी तरह से बाँझ प्लेटों में प्रत्येक कुएं में एलबी समाधान के 600 माइक्रोन जोड़ें। मीडिया को वितरित करने के लिए मल्टीचैनल पिपेट का उपयोग करना सबसे अच्छा है।
  3. बाँझ प्रक्रियाओं का उपयोग करना, HT115 (DE3) ई. कोलाई बैक्टीरिया के साथ टीका ओंकता हुआ एक नियंत्रण के रूप में ब्याज या एक खाली प्लाज्मिड के जीन को लक्षित करने वाले डीएसआरएनए-एन्कोडिंग प्लाज्मिड के साथ बदल जाता है। प्लेटों को ढककर रात भर 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। पुस्तकालयों कि dsRNA व्यक्त बैक्टीरियल क्लोन से मिलकर बनता है, भविष्यवाणी की सी elegans जीन के ~ 94% के अनुरूप पहले22,23 का निर्माण किया गया और व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं। यहां उपयोग की जाने वाली चैपरवन लाइब्रेरी का निर्माण डॉ रिचर्ड मोरिमोटो प्रयोगशालाद्वारा 26से किया गया था ।
  4. बाँझ प्रक्रियाओं का उपयोग करना, बीज 75, 150 या 250 माइक्रोन बैक्टीरिया पर क्रमशः 12-वेल, 40 मिमी और 6-वेल या 60 मिमी एनजीएम आरएनएआई प्लेट्स। प्लेट पर टारगेट जीन का नाम स्पष्ट रूप से चिह्नित करें। बैक्टीरिया को आगर की सतह के 30-50% को कवर करना चाहिए और प्लेट के किनारों को नहीं छूना चाहिए।
  5. प्लेटों को कमरे के तापमान पर बेंच पर कम से कम 2 दिनों के लिए सूखने दें, प्लेटों को कवर रखें।
    नोट: प्लेटों को रात भर 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेटेड किया जा सकता है। सुनिश्चित करें कि प्लेटों का उपयोग करने या भंडारण करने से पहले आंतरिक कुएं सूखे हैं। सभी दीर्घकालिक उद्देश्यों (यानी, सुखाने या भंडारण) के लिए प्लेटों को अंधेरे में रखें। सूखे, वरीयता प्राप्त प्लेटों को एक महीने तक 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित किया जा सकता है।

3. भ्रूण के गैर तनावपूर्ण तुल्यकालन

  1. एक नए वरीयता प्राप्त एनजीएम प्लेट में एक अनसिंक्रोनाइज्ड कीड़ा प्लेट से लगभग 100 अंडे स्थानांतरित करने के लिए एक कीड़ा लेने का उपयोग करें।
  2. 15 डिग्री सेल्सियस पर 5 दिनों के लिए जानवरों की खेती, 3.5 दिन 20 डिग्री सेल्सियस या 25 डिग्री सेल्सियस पर 2.5 दिन। जानवरों को अंडा बिछाने के पहले दिन पहुंचना चाहिए।
    नोट: कीड़े आमतौर पर 20 डिग्री सेल्सियस पर खेती कर रहे हैं। हालांकि, विभिन्न चैपरोन उत्परिवर्ती उपभेदों को विशिष्ट खेती के तापमान की आवश्यकता हो सकती है। उदाहरण के लिए, कई तापमान-संवेदनशील उपभेदों की खेती 15 डिग्री सेल्सियस पर की जाती है लेकिन उनके फेनोटाइप को बेनकाब करने के लिए 25 डिग्री सेल्सियस पर स्थानांतरित कर दिया जाता है।
  3. एम9 बफर के 1 एमएल जोड़ें(टेबल 1)धीरे-धीरे और बैक्टीरियल लॉन से दूर। प्लेट को घुमाएं ताकि बफर पूरी तरह से प्लेट को कवर करे। फिर इसे एक तरफ झुकाएं और थाली से तरल निकालकर जानवरों को प्लेट से धो लें।
    नोट: तापमान के प्रति संवेदनशील जानवरों या चैपरोन म्यूटेंट का उपयोग करते समय, जानवरों की खेती के तापमान पर प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाने वाले बफ़र्स को बनाए रखना सबसे अच्छा है।
  4. तीन बार या जब तक सभी जानवरों को प्लेट से धोया न जाए तब तक चरण 3.3 दोहराएं।
  5. एक मानक प्लास्टिक टिप का उपयोग करना, धोया थाली जहां अंडे केंद्रित कर रहे है और एक नए वरीयता प्राप्त NGM प्लेट पर आगर के टुकड़े जगह से आगर के एक वर्ग में कटौती ।
    नोट: ~ 200 अंडे पर्याप्त अंडे बिछाने जानवरों का उत्पादन करने के लिए आवश्यक हैं; बहुत सारे जानवर बैक्टीरिया का भी जल्दी सेवन करते हैं। कम खाद्य स्तर प्रोटेओस्टेसिस27को प्रभावित कर सकते हैं ।
  6. जानवरों को 15 डिग्री सेल्सियस, 3.5 दिन में 20 डिग्री सेल्सियस या 25 डिग्री सेल्सियस पर 2.5 दिन में जानवरों की खेती करें। इस बिंदु पर, प्लेटों को सिंक्रोनाइज्ड अंडे से कवर किया जाना चाहिए।
    नोट: जानवरों को अधिक कठोर सिंक्रोनाइजेशन के लिए एक छोटी अवधि के लिए एक नई प्लेट में स्थानांतरित किया जा सकता है। हालांकि, अंडे बिछाने के शुरुआती चरणों में वयस्कों का उपयोग करना महत्वपूर्ण है क्योंकि जानवर सिंक्रोनाइजेशन को प्रभावित करने वाले अपने गर्भाशय में अंडे बनाए रख सकते हैं।
  7. एम9 बफर के 1 एमएल धीरे-धीरे और बैक्टीरियल लॉन से दूर जोड़ें।
  8. प्लेट को घुमाएं ताकि बफर पूरी तरह से प्लेट को कवर करे। फिर इसे एक तरफ झुकाएं और थाली से तरल निकालकर जानवरों को प्लेट से धो लें।
  9. दोहराएं चरण 3.7 तीन बार या जब तक सभी जानवरों को प्लेट से धोया न जाए।
  10. M9 बफर के 1 मिलीएल जोड़ें और प्लेट से अंडे छोड़ने के लिए एक सेल स्क्रैपर का उपयोग करें।
  11. प्लेटों से अंडे युक्त M9 बफर ले लीजिए।
  12. 2 मिनट के लिए 3,000 x ग्राम पर अंडे युक्त M9 बफर सेंट्रलाइज करें।
  13. सुपरनेट निकालें और 1 एमएल की मात्रा तक पहुंचने के लिए M9 बफर जोड़ें।
  14. अंडे और बैक्टीरिया के किसी भी हिस्से को बाधित करने के लिए अंडे को फिर से खर्च करें।
  15. चरण 3.11-3.13 में वर्णित धोने की प्रक्रिया को पांच बार दोहराएं। अंडे की गोली सफेद दिखाई नी चाहिए। यदि यह अभी भी पीला/भूरा है, तो सफेद गोली प्राप्त होने तक धोएं दोहराएं।
    नोट: अंडे पर रहने वाले बैक्टीरिया DsRNA-व्यक्त बैक्टीरिया को दूषित कर सकते हैं ।
  16. अधिकांश सुपरनैंट निकालें, लगभग 200 μL छोड़ दें। RNAi स्क्रीन के लिए सिंक्रोनाइज्ड अंडे का उपयोग किया जा सकता है।

4. आम फेनोटाइपिक परख

  1. प्रयोगों के दौरान जानवरों की खेती
    1. प्रत्येक RNAi-वरीयता प्राप्त प्लेट में बैक्टीरियल लॉन के करीब ~ 30 अंडे की एक बूंद रखें। संदर्भ के लिए, खाली वेक्टर युक्त (L4440) बैक्टीरिया के साथ वरीयता प्राप्त प्लेटों पर ~ 30 अंडे भी रखें।
    2. एनजीएम आरएनएआई-वरीयता प्राप्त प्लेटों पर आयु-समकालिक जानवरों की खेती करें। प्रयोग की अवधि इस बात पर निर्भर करेगी कि जानवरों की निगरानी किस स्तर पर की जानी है और खेती के तापमान पर। तापमान के प्रति संवेदनशील उत्परिवर्ती जानवरों का उपयोग करते समय खेती के तापमान को समायोजित करें। विकास में देरी उत्परिवर्ती जानवरों का उपयोग करते समय खेती की अवधि को समायोजित करें।
      नोट: जबकि समय भिन्न हो सकता है, एक बार जानवर वयस्कता तक पहुंचने, अंडा बिछाने (और जिसके परिणामस्वरूप तेजी से भोजन की खपत), साथ ही साथ उम्र पर निर्भर प्रोटेओस्टसिस पतन28,परिणामों को प्रभावित कर सकता है । इस प्रकार अंडे बिछाने (वयस्कता के दिन 1) की शुरुआत से पहले जानवरों को स्कोर करने की सिफारिश की जाती है। जंगली प्रकार के जानवर 15 डिग्री सेल्सियस पर 4.5 दिनों के बाद, 3 दिन 20 डिग्री सेल्सियस या 2 दिन 25 डिग्री सेल्सियस पर पहुंचते हैं।
    3. उपयोग किए गए दोहराने की संख्या जीन सेट की जांच के आकार पर निर्भर करेगी। चैपरवन लाइब्रेरी (97 जीन) के लिए, कम से कम चार बार प्रयोग दोहराएं। जनसंख्या का आकार इस्तेमाल की गई परख पर निर्भर करता है। व्यवहार परख में यहां चर्चा की, प्रत्येक दोहराने में प्रयोगात्मक हालत प्रति >15 जानवरों स्कोर । डेटा और सांख्यिकीय विश्लेषण भी दृढ़ता से इस्तेमाल किया परख के प्रकार पर निर्भर करते हैं । यहां चर्चा की परख में डेटा एसईएम के साधन के रूप में प्रस्तुत किया जा सकता ± ।
    4. आरएनएआई-और खाली वेक्टर नियंत्रण-इलाज जानवरों को स्वतंत्र आबादी के रूप में तुलना करें । पी मानों की गणना एक तरफा या दो तरह के एनोवा का उपयोग करके की जा सकती है, जो जांच किए गए परिवर्तनों के आधार पर, अर्थात् अकेले या दोनों को उत्तेजक या समाप्त करना। एक एकल आरएनएआई उपचार बनाम नियंत्रण की जांच करते समय, पी मानों की गणना वन-वे या दो-तरफा मान-व्हिटनी रैंक योग परीक्षण का उपयोग करके की जा सकती है। सांख्यिकीय महत्व के अलावा, फेनोटाइप पर प्रभाव की डिग्री के आधार पर हिट के लिए एक सीमा पर विचार करें।
  2. विकासात्मक गिरफ्तारी/देरी
    1. उम्र-सिंक्रोनाइज्ड जानवरों को चरण 4.1 में तब तक खेती करें जब तक कि खाली वेक्टर युक्त नियंत्रण बैक्टीरिया पर उगाए गए जानवर वयस्कता तक नहीं पहुंच जाते, लेकिन अंडा बिछाने शुरू होने से पहले।
    2. एक स्टीरियोमाइक्रोस्कोप का उपयोग कर जानवरों की निगरानी करें और विकास में देरी वाले जानवरों के प्रतिशत को स्कोर करने के लिए लार्वा और वयस्कों की संख्या की गणना करें। संदर्भ के लिए, खाली वेक्टर युक्त नियंत्रण बैक्टीरिया पर उगाए गए उत्परिवर्ती जानवरों की तुलना करें। एचएसपी-1 या एचएसपी-90 आरएनएआई उपचार के परिणामस्वरूप जंगली प्रकार के जानवरों की विकासात्मक गिरफ्तारी होती है और इसका उपयोग सकारात्मक नियंत्रण के रूप में किया जा सकता है।
    3. समय के साथ विकास में देरी जानवरों के प्रतिशत स्कोर करने के लिए, दोहराने कदम 4.2.2.
      नोट: यदि थाली पर अंडा बिछाने वयस्कों रहे हैं, एक ही लक्ष्य जीन के लिए लेबल एक नया NGM-RNAi थाली के लिए विकास में देरी जानवरों के हस्तांतरण के लिए संतान के साथ भ्रम से बचने के ।
  3. बंध्यता या अंडा बिछाने दोष
    1. जब तक खाली वेक्टर-कंट्रोल बैक्टीरिया पर उगाए जाने वाले जानवर अंडे देना शुरू नहीं करते तब तक उम्र-सिंक्रोनाइज्ड जानवरों को स्टेप 4.1 में उगाएं।
    2. एक स्टीरियोमाइक्रोस्कोप का उपयोग कर जानवरों की निगरानी और उनके गर्भाशय में कोई दिखाई अंडे के साथ जानवरों के प्रतिशत स्कोर । संदर्भ के लिए, खाली वेक्टर नियंत्रण बैक्टीरिया पर उगाए गए उत्परिवर्ती जानवरों की तुलना करें।
    3. वैकल्पिक रूप से, एक स्टीरियोमाइक्रोस्कोप का उपयोग करके जानवरों की निगरानी करें और अंडे से भरे गर्भाशय के साथ जानवरों के प्रतिशत को स्कोर करें, जो ईजी बिछाने दोषपूर्ण (Egl-d) फेनोटाइप29के रूप में परिभाषित किया गया है।
  4. भ्रूण घातकता
    1. जब तक जानवर अंडे देना शुरू नहीं करते तब तक उम्र-सिंक्रोनाइज्ड जानवरों को चरण 4.1 में खेती करें।
    2. एक खाली थाली में ~ 100 अंडे स्थानांतरित करें। गिनती को सरल बनाने के लिए अंडों को पंक्तियों में फैलाएं।
    3. 24-48 घंटे के बाद प्लेट पर अनचचित अंडों का प्रतिशत स्कोर करें। संदर्भ के लिए, खाली वेक्टर-नियंत्रण बैक्टीरिया के साथ इलाज जानवरों के अंडे की तुलना करें।
  5. पक्षाघात परख
    1. दिन 1 वयस्कों के लिए, 4.1 चरण में उम्र-सिंक्रोनाइज्ड जानवरों की खेती करें जब तक कि खाली वेक्टर-कंट्रोल बैक्टीरिया पर उगाए गए जानवर वयस्कता तक नहीं पहुंच जाते लेकिन अंडे बिछाने शुरू होने से पहले।
    2. एक ठीक मार्कर का उपयोग कर एक नियमित एनजीएम आगर प्लेट के पीछे एक लाइन ड्रा।
    3. चिह्नित रेखा पर 5-10 जानवरों को रखें।
    4. एक टाइमर सेट करें और 10 मिनट के लिए प्रतीक्षा करें।
    5. लकवाग्रस्त कीड़े के रूप में लाइन पर शेष जानवरों के प्रतिशत स्कोर । संदर्भ के लिए, खाली वेक्टर नियंत्रण बैक्टीरिया पर उगाए गए उत्परिवर्ती जानवरों की तुलना करें। संयुक्त राष्ट्र-45 आरएनएआई के साथ इलाज किए गए जंगली प्रकार के जानवर गंभीर पक्षाघात फेनोटाइप दिखाते हैं और इसका उपयोग सकारात्मक नियंत्रण के रूप में किया जा सकता है।
      नोट: यह परख गंभीर पक्षाघात के लिए मध्यम दिखा जानवरों पर प्रकाश डाला गया । ऐसे जानवर आमतौर पर आम घुमावदार आकार पेश करने के बजाय सीधे थाली पर झूठ बोलते हैं। इसके अलावा, बैक्टीरिया से साफ एक पैच लकवाग्रस्त कीड़े के सिर के आसपास दिखाई देता है ।
  6. परख की पिटाई
    1. उम्र-सिंक्रोनाइज्ड जानवरों को चरण 4.1 में तब तक खेती करें जब तक कि खाली वेक्टर-कंट्रोल बैक्टीरिया पर उगाए गए जानवर वयस्कता तक नहीं पहुंच जाते, लेकिन अंडा बिछाने शुरू होने से पहले।
    2. एक ९६-अच्छी थाली में जानवरों की खेती के तापमान पर M9 बफर के १०० μL ।
    3. M9 बफर युक्त कुओं में ~ 15 कीड़े, एक प्रति अच्छी तरह से रखें।
    4. जानवरों को 5 मिनट के लिए समायोजित होने दें।
    5. स्टीरियोमाइक्रोस्कोप के तहत प्रत्येक जानवर की जांच करें, 15 एस नीचे गिनती एक टाइमर शुरू करें, और शरीर की संख्या गिनती करें जो प्रत्येक जानवर उस समय में प्रदर्शन करता है। गिने गए मानों को प्रति मिनट शरीर के झुकने के लिए सामान्यीकृत किया जा सकता है। संदर्भ के लिए, खाली वेक्टर नियंत्रण बैक्टीरिया पर उगाए गए उत्परिवर्ती जानवरों की तुलना करें।
      नोट: यह गतिशीलता परख बहुत संवेदनशील है और उपचार के बीच बहुत हल्के मतभेदों का पता लगा सकते हैं । हालांकि, आगर पर तरल और गतिशीलता में गतिशीलता भिन्न हो सकती है।

5. प्रोटीन नॉकडाउन का सत्यापन

  1. प्रासंगिक dsRNA-व्यक्त या खाली वेक्टर युक्त (L4440) बैक्टीरिया के साथ वरीयता प्राप्त 60 मिमी एनजीएम-आरएनएआई प्लेट पर 250-300 सिंक्रोनाइज्ड अंडे रखें।
    नोट: RNAi नॉकडाउन भ्रूण के गुमराह संचय में परिणाम सकता है, भ्रूण की कमी में या विकास की गिरफ्तारी में है कि जीन अभिव्यक्ति को प्रभावित कर सकता है । जानवरों की उम्र का निर्धारण करते समय इस पर विचार किया जाना चाहिए।
  2. दिन 1 वयस्कों के लिए, 15 डिग्री सेल्सियस पर 4.5 दिनों के लिए जानवरों की खेती करें, 3 दिन 20 डिग्री सेल्सियस या 2 दिन 25 डिग्री सेल्सियस पर।
  3. पीबीएस-टी के 200 माइक्रोन के साथ 1.5 एमएल ट्यूब फिल की टोपी में कुल 200 युवा वयस्क जानवरों को चुनें और स्थानांतरित करें।
    नोट: तापमान के प्रति संवेदनशील जानवरों या चैपरोन म्यूटेंट का उपयोग करते समय, जानवरों की खेती के तापमान पर प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाने वाले बफ़र्स को बनाए रखना सबसे अच्छा है।
  4. 1 मिनट के लिए 1,000 x ग्राम पर टोपी को ध्यान से और अपकेंद्रित्र बंद करें।
  5. 1 मिनट के लिए पीबीएस-टी(टेबल 1)और 1,000 एक्स ग्राम पर सेंट्रलाइज के 800 माइक्रोन जोड़ें।
  6. ध्यान से शीर्ष 900 μL निकालें।
  7. तीन बार 5.4-5.6 कदम दोहराएं।
  8. 900 माइक्रोन निकालें, 200 कीड़े युक्त समाधान के 100 माइक्रोन छोड़ दें।
  9. 5x नमूना बफर(तालिका 1)के 25 माइक्रोल जोड़ें।
  10. 1000 आरपीएम पर मिलाते हुए 92 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए नमूनों को गर्म करें। इसके बाद नमूनों को फ्रीज कर -20 डिग्री सेल्सियस पर रखा जा सकता है।
  11. प्रत्येक नमूने के 20 माइक्रोन लोड करें और एक एसडीएस-पेज जेल पर चलाएं।
  12. प्रोटीन की सापेक्ष स्थिरता निर्धारित करने के लिए उपयुक्त एंटीबॉडी का उपयोग करके पश्चिमी दाग विश्लेषण करें।
  13. घनत्व वाले सॉफ्टवेयर का उपयोग करके बैंड की तीव्रता निर्धारित करें, जैसे कि स्वतंत्र रूप से उपलब्ध इमेजजे जेल मॉड्यूल। नियंत्रण नमूने (एस) में मापा उन लोगों के लिए सभी मूल्यों को सामान्य करें।
    नोट: हमारी स्क्रीन में RNAi नॉकडाउन का उद्देश्य एक विशिष्ट chaperone के प्रोटीन के स्तर को कम करने के लिए है/ इस प्रकार, आरएनएआई नॉकडाउन की दक्षता का आकलन करने का सबसे अच्छा तरीका पश्चिमी दाग विश्लेषण द्वारा है। इसके लिए विशिष्ट एंटीबॉडी की आवश्यकता होती है। वैकल्पिक रूप से, क्यूपीसीआर का उपयोग एमआरएनए स्तरों की मात्रा निर्धारित करने के लिए किया जा सकता है।

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Representative Results

UNC-45 में तापमान के प्रति संवेदनशील उत्परिवर्तनों का उपयोग क्रमशः अनुमेय या प्रतिबंधात्मक स्थितियों के तहत उत्तेजक या समाप्त बातचीत के लिए स्क्रीन करने के लिए
मांसपेशी विधानसभा और रखरखाव ऊतक-विशिष्ट चैपरवन इंटरैक्शन का अध्ययन करने के लिए एक प्रभावी प्रणाली प्रदान करते हैं। संकुचन मांसपेशियों की कार्यात्मक इकाई, सारकोमेरे, संरचनात्मक और नियामक प्रोटीन की एक क्रिस्टलीय जैसी व्यवस्था प्रस्तुत करती है। मोटर प्रोटीन मायोसिन की स्थिरता और संकुचन मांसपेशी सारकोर्स के मोटे तंतुओं में इसका समावेश30से चपरोन और यूपीएस घटकों के सहयोग पर निर्भर करता है । ऐसे ही एक चैपरवन का एक उदाहरण संरक्षित और विशेष मायोसिन चैपरवन यूएनसी-45 है जो मुख्य रूप से शरीर की दीवार की मांसपेशी31 , 32,33,34,35में व्यक्त कियाजाताहै। यूएनसी-४५ में म्यूटेशन को सीमें मायोसिन विघटन और गंभीर गतिशीलता दोषों को प्रेरित करने के लिए दिखाया गया है । एलिगेंस31,36. यूएनसी-45 टैंडेम मॉड्यूल एक बहु-साइट डॉकिंग प्लेटफॉर्म37 में इकट्ठा होते हैं जो यूएनसी-45, एचएसपी-90 और एचएसपी-1 के बीच सहयोग को लागू करता है और मायोसिन फिलामेंट असेंबली25,36, 37,38में अन्य चैपरेन्स और सह-चैपरनेस की संभावना है। ज्ञात UNC-45 बातचीत की पुष्टि करने और मांसपेशियों के प्रोटेओस्टेसिस में उपन्यास आनुवंशिक बातचीत की पहचान करने के लिए, हमने सी एलिगेंस तापमान-संवेदनशील यूएनसी-45 म्यूटेशन का उपयोग करके ऊतक-विशिष्ट चैपरवन इंटरैक्शन स्क्रीनिंग19,25के लिए एक संवेदनशील आनुवंशिक पृष्ठभूमि के रूप में एक रणनीति स्थापित की।

सी एलिगेंस यूएनसी-45 (L822F और E781K, क्रमशः e286 और m94 alleles के अनुरूप में एकल अमीनो एसिड प्रतिस्थापन; यूएनसी-45 (टीएस) तापमान पर निर्भर गतिशीलता दोषों और मायोसिन विघटन फेनोटाइप के लिए जिम्मेदार हैं जब प्रभावित जानवरों को प्रतिबंधात्मक परिस्थितियों (>22 डिग्री सेल्सियस) के तहत उगाया जाता है। इसके विपरीत, ये यूएनसी-45 (टीएस) म्यूटेंट अनुमेय तापमान (15 डिग्री सेल्सियस)31पर कोई आंदोलन या मायोसिन संगठन दोष नहीं दिखाते हैं। प्रस्तावित दृष्टिकोण में, पहले लार्वा चरण (एल 1) में आयु-सिंक्रोनाइज्ड अनसी-45 (ई286) जानवरों को आरएनएआई (97 जीन) द्वारा विभिन्न आणविक चैपलिनों से समाप्त कर दिया गया था और फिर अनुमेय परिस्थितियों (15 डिग्री सेल्सियस)(चित्र 1)के तहत गतिशीलता दोषों के लिए निगरानी की गई थी। हमने अपने आनुवंशिक इंटरैक्शन स्क्रीन में यूएनसी-45 और एचएसपी-90 प्रोटीन की ज्ञात बातचीत की पुष्टि की और तीन एचएसपी-90 सह-चैपरनेस, एसटीआई-1, अहसा-1 और डीएएफ-41की पहचान की, क्योंकि विशेष रूप से यूएनसी-45 (टीएस) उत्परिवर्ती जानवरों में सिंथेटिक आंदोलन दोष पैदा करता है लेकिन जंगली प्रकार के जानवरों मेंनहीं 25। हमने इस बात की जांच की कि क्या एसटीआई-1-, अहसा-1- या डीएएफ-41से जुड़े सिंथेटिक फेनोटाइप मायोसिन हैवी चेन ए (मायो-3) की उपसेलर व्यवस्था की निगरानी करके मायोसिन विघटन के कारण स्थापित इम्यूनो-स्टेन तकनीकों का उपयोग करके39थे। जबकि एसटीआई-1, अहसा-1या डीएएफ-41 आरएनएआई के साथ जंगली प्रकार के जानवरों के उपचार ने माईओफ्लामेंट संगठन को प्रभावित नहीं किया, यूएनसी-45 (ई286) उत्परिवर्ती जानवरों में इन जीनों की कमी के परिणामस्वरूप सारकोमिक संरचनाओं और MYO-3 मिसोकलाइजेशन, यहां तक कि अनुमेय परिस्थितियों (15 डिग्री सेल्सियस) में पूरी तरह से व्यवधान उत्पन्न हुआ। यह प्रभाव उन पर तुलनीय था जो प्रतिबंधात्मक तापमान (25 डिग्री सेल्सियस) 25 पर उगाए गए यूएनसी-45 (e286) एकल म्यूटेंट के साथदेखागया था। इन परिणामों की पुष्टि एक और यूएनसी-45(टीएस)-allele, अर्थात् unc-45 (m94) उत्परिवर्ती जानवरों25का उपयोग कर रहे थे ।

यूएनसी-45 को अस्थिर करने वाले चैपरोन्स की पहचान करने के लिए, हमने अगले चैपरोन्स की जांच की जिसने 25 डिग्री सेल्सियस पर यूएनसी-45 (286) जानवरों की गतिशीलता में सुधार किया, जो आरएनएआई द्वारा जीन नॉकडाउन पर निर्भर करता है। जबकि यूएनसी-45 (e286) उत्परिवर्ती जानवरों ने 25 डिग्री सेल्सियस पर गंभीर आंदोलन दोष प्रदर्शित किए, 97 चैपरोस की जांच किए गए चार जीन के खिलाफ आरएनएआई के साथ इलाज किए गए जानवरों की गतिशीलता में काफी सुधार हुआ। यहां भी, परिणाम unc-45 (m94) उत्परिवर्ती जानवरों का उपयोग कर पुष्टि की गई । इस प्रकार, तापमान-संवेदनशील उत्परिवर्तनों का उपयोग स्क्रीन के तापमान के आधार पर, उत्तेजक और समाप्त दोनों स्क्रीन स्थापित करने के लिए अनुमति देता है।

उत्तेजक बातचीत के लिए स्क्रीन करने के लिए एक चैपरोन की ऊतक-विशिष्ट अधिक अभिव्यक्ति का उपयोग करना
हमने स्क्रीनिंग उद्देश्यों के लिए मांसपेशियों के चैपरवन नेटवर्क के हल्के क्षोभ के रूप में एक ही चैपरोन की ऊतक-विशिष्ट अधिक अभिव्यक्ति का उपयोग किया। विशेष रूप से, हमने सी एलिगेंस बॉडी वॉल मांसपेशी (डीएनजे-24एम)में एचएसपी 40 प्रोटीन डीएनएजेबी6 के सी एलिगेंस समरूप को एन्कोडिंग, जंगली प्रकार के डीएनजे-24 को व्यक्त करने वाले जानवरों का उपयोग किया। ऊपर के रूप में, L1 DNJ-24M जानवरों को विभिन्न चैपरनेस के लिए आरएनएआई के साथ इलाज किया गया और गतिशीलता दोषों (20 डिग्री सेल्सियस)(चित्र 1)के लिए निगरानी की गई। जबकि DNJ-24M जानवरों कोई उल्लेखनीय गतिशीलता दोष दिखाया, तीन जीन (४८ chaperone-encoding जीन की जांच की; 6%), अर्थात् एचएसपी-1, rme-8,और dNJ-8, विशेष रूप से DNJ-24M व्यक्त जानवरों की गतिशीलता को प्रभावित किया, लेकिन जंगली प्रकार के जानवरों नहीं । यह ध्यान देने की बात है कि मांसपेशियों (एचएसपी 90एम) में एक अलग-अलग चैपरवन, अर्थात् एचएसपी-90 को व्यक्त करने वाले जानवरों का उपयोग करके हिट की विशिष्टता का परीक्षण करना, एचएसपी-1, आरएमई-8,या डीएनजे-8 आरएनएआई उपचार40पर एचएसपी 90एम मोटिविटी पर कोई प्रभाव नहीं दिखा। एक साथ लिया गया, स्क्रीनिंग प्लेटफॉर्म, चैपरवन नेटवर्क के लिए हल्के क्षोभ को नियोजित करता है, जैसे मेटास्टेबल उत्परिवर्ती प्रोटीन या ऊतक-विशिष्ट ओवर-एक्सप्रेशन की अभिव्यक्ति, जिसके परिणामस्वरूप अत्यधिक विशिष्ट हिट दर (सामान्य रूप से ~ 5%)।

ऊतक-विशिष्ट आनुवंशिक बातचीत के लिए स्क्रीन करने के लिए ऊतक-विशिष्ट आरएनएआई का उपयोग करना
ऊतक-विशिष्ट आरएनएआई-संवेदनशील उपभेदों को जीन के ऊतक-विशिष्ट नॉकडाउन के लिए अनुमति देते हैं, जबकि अभी भी dsRNA वितरण के लिए बैक्टीरियल फीडिंग का उपयोग करते हैं। ये उपभेद आरडीई-1 आर्गोनॉट प्रोटीन के लिए उत्परिवर्ती हैं, जो प्रभावी जीन को मुंह में रखने के लिए आवश्यक आरएनएआई मार्ग में एक प्रमुख घटकहै। हालांकि, ऊतक-विशिष्ट प्रमोटर के नियंत्रण में जंगली प्रकार आरडीई-1 को व्यक्त करने से प्रभावी ऊतक-विशिष्ट जीन नॉकडाउन41,42हो गया। इस प्रकार यह उपकरण ऊतक-विशिष्ट चैपरोन का उपयोग करने के बिना आनुवंशिक इंटरैक्शन स्क्रीन के लिए अनुमति देता है, जैसे यूएनसी-45 या डीएनएजे-24M। उदाहरण के लिए, विकास के दौरान जंगली प्रकार के जानवरों में एचएसपी-6 (एलिएरिन) नॉकडाउन के परिणामस्वरूप एक मजबूत विकासात्मक गिरफ्तारी (आरएनएआई-इलाज जानवरों का 96±1%)। इसके साथ ही, मांसपेशियों में जंगली प्रकार आरडीई-1 को व्यक्त करने वाले तनाव में एचएसपी-6 नॉकडाउन विकासात्मक गिरफ्तारी का कारण नहीं बना, जबकि आंतों की कोशिकाओं में जंगली प्रकार आरडीई-1 को व्यक्त करने के परिणामस्वरूप एक मजबूत विकासात्मक गिरफ्तारी फेनोटाइप (90±3%; चित्रा 2)। इस प्रकार, सामान्य विकास के लिए आंतों की कोशिकाओं में एचएसपी-6 कार्य की आवश्यकता होती है। एचएसपी-6 (mg585) में एक उत्परिवर्तन जो हल्के विकास में देरी का कारण बनता है, इसलिए, उस आंतों-विशिष्ट आरएनएआई तनाव में उत्परिवर्तित जीन को पार करके चैपरवन इंटरैक्शन को बढ़ाने या समाप्त करने और चैपरवन आरएनएआई लाइब्रेरी की स्क्रीनिंग के लिए स्क्रीन करने के लिए उपयोग किया जा सकता है।

आनुवंशिक बातचीत का उपयोग कर तह वातावरण में आयु पर निर्भर परिवर्तन की निगरानी
पशु गतिशीलता में उम्र पर निर्भर गिरावट दिखाते हैं जो सारकोमिक विघटन43,44,45से जुड़ा हुआ है। प्रोटीन फोल्डिंग क्षमता में परिवर्तन सेलुलर प्रोटेओस्टेसिस मशीनरी28के बदले हुए नियमन और संरचना के साथ मेल खाता है, जिसमें यूएनसी-45, सीएचएन-1 और यूएफडी-2 के परिवर्तित स्तर, मांसपेशियों की गुणवत्ता नियंत्रण मशीनरी46के प्रोटीन शामिल हैं। समझौते में, मायोसिन तह और क्षरण वयस्कता47के संक्रमण पर प्रोटेओस्टेटिक क्षमता में परिवर्तन से प्रभावित होते हैं। इसलिए हमने पूछा कि क्या इस तरह के बदलाव से चैपरवन इंटरैक्शन पर असर पड़ सकता है । उदाहरण के लिए, हमने समय के साथ गतिशीलता पर एसटीआई-1, अहसा-1 और डीएएफ-41 नॉकडाउन के प्रभाव की निगरानी की। हमने पाया कि हालांकि एसटीआई-1-, अहसा-1-और डीएएफ-४१-आरएनएआईइलाज जानवरों लार्वा विकास के दौरान कम गतिशीलता दिखाया, गतिशीलता दृढ़ता से unc-45 (टीएस) वयस्क कीड़े में गिरावट आई । इसके अलावा, यूएनसी-45 (टीएस) उत्परिवर्ती जानवरों में MYO-3 संगठन एसटीआई-1, अहसा-1या डीएएफ-41 आरएनएआई के साथ इलाज चौथे लार्वा चरण (एल4) पर जंगली प्रकार के कीड़े के समान था, हालांकि जानवरों के वयस्कता(चित्रा 3)तक पहुंचने के बाद म्यूटेंट ने बाधित सारोमर्स का प्रदर्शन किया। इसके विपरीत, दोनों unc-45 (टीएस) उत्परिवर्ती जानवरों एक खाली वेक्टर नियंत्रण और जंगली प्रकार के जानवरों के साथ इलाज अप्रभावित(चित्रा 3)बने रहे । इस प्रकार, उम्र या पर्यावरणीय स्थितियों के एक समारोह के रूप में प्रोटेओस्टेसिस गतिशीलता27,45,46,48, 49 गंभीर रूप से चैपरवन इंटरैक्शन को प्रभावित कर सकती है।

Figure 1
चित्रा 1: RNAi सिंथेटिक इंटरैक्शन स्क्रीन का सेटअप सी एलिगेंस का उपयोग करके एक जीन में उत्परिवर्तन ले जाने के लिए ब्याज की एक chaperone encoding । (क)लक्षित चैपरवन इंटरैक्शन स्क्रीन के मूल सेटअप का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व। (ख)हिट सत्यापन के लिए एक और चैपरवन उत्परिवर्ती का उपयोग करके आनुवंशिक बातचीत की पुष्टि की आवश्यकता होती है, साथ ही आरएनएआई नॉकडाउन के निर्दिष्ट को मान्य करना होता है। (सी-डी) सरल readouts, जैसे गतिशीलता दोष, क्रमशः पक्षाघात या पिटाई परख का उपयोग कर, उत्तेजक या बातचीत को समाप्त करने के लिए निर्धारित किया जा सकता है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: माइटोकॉन्ड्रियल चैपरोन एचएसपी-6 के ऊतक-विशिष्ट आरएनएआई का उपयोग एक ऊतक में आनुवंशिक बातचीत की जांच करने के लिए किया जा सकता है। जंगली प्रकार की आंत और मांसपेशी विशिष्ट आरएनएआई उपभेदों को एचएसपी-6 आरएनएआई के साथ इलाज किया गया था और(ए)विकासात्मक देरी की गई थी या वयस्कता के पहले दिन(बी)छवियां ली गई थीं । डेटा एसईएम, एन =6± मतलब है । स्केल बार 1 मिमी है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: आरएनएआई के आयु-निर्भर प्रभाव। (A)उम्र के साथ गतिशीलता। जंगली प्रकार या unc-45 (e286) भ्रूण एसटीआई-1, ahsa-1या daf-41 RNA-1-1-RNA-वरीयता प्राप्त प्लेटों पर 15 डिग्री सेल्सियस पर रखा गया था और प्रत्येक विकास के चरण, L1-L4, युवा वयस्क और वयस्कता के दिन 1 पर एक पिटाई परख का उपयोग कर गतिशीलता के लिए रन बनाए । डेटा एसईएम, एन = 15 ± मतलब है। (ख)शरीर की दीवार की मांसपेशी की कॉन्फोकल छवियां। जानवरों के रूप में एक में इलाज किया गया और L4, युवा वयस्क और वयस्कता चरणों के दिन 1 और इम्यूनो-विरोधी MYO-3 एंटीबॉडी के साथ दाग पर तय किया गया । स्केल बार 10 माइक्रोन है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

घोल तैयारी के निर्देश गोदाम
1 एम CaCl2 (1 एल) जोड़ें 147.01 ग्राम सीएसीएल2· 2H2O आरटी में स्टोर
1 एल करने के लिए dH2O जोड़ें
ऑटोक्लेव या फ़िल्टर (0.22 माइक्रोन)
1 एम केएच2पीओ4,पीएच 6.0 (1 एल) जोड़ें 136.09 ग्राम केएच2पीओ4 आरटी में स्टोर
जोड़ें 800 एमएल डीएच2O
घुलने तक चुंबकीय उभारक का उपयोग करके मिलाएं
कोह का उपयोग करके टिट्रेट पीएच
1 एल करने के लिए dH2O जोड़ें
ऑटोक्लेव या फ़िल्टर (0.22 माइक्रोन)
1 एम एमजीएसओ4 (1 एल) जोड़ें 248.58 ग्राम MgSO4·7H2O आरटी में स्टोर
1 एल करने के लिए dH2O जोड़ें
ऑटोक्लेव या फ़िल्टर (0.22 माइक्रोन)
कोलेस्ट्रॉल समाधान (50 एमएल) एक 50 मिलीग्राम फाल्कन ट्यूब के लिए 250 मिलीग्राम कोलेस्ट्रॉल जोड़ें -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें
पूरी तरह से 40 एमएल इथेनॉल में भंग
50 एमएल में इथेनॉल जोड़ें
1 एम आईपीटीजी (50 एमएल) 50 एमएल फाल्कन ट्यूब में 11.9 ग्राम आईपीटीजी (आइसोप्रोपिल-β-डी-थिओगालेक्टोपाइरानोसाइड) जोड़ें -20 डिग्री सेल्सियस पर अंधेरे में स्टोर करें
पूरी तरह से 40 एमएल डीएच2ओ में भंग
50 एमएल में डीएच2ओ जोड़ें
फ़िल्टर (0.22 माइक्रोन), एलिकोट 1mL ट्यूब
एम्पिसिलिन स्टॉक (50 एमएल) एक 50 एमएल फाल्कन ट्यूब में 5 ग्राम एम्पिसिलिन जोड़ें -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें
पूरी तरह से 40 एमएल डीएच2ओ में भंग
50 एमएल में डीएच2ओ जोड़ें
फ़िल्टर (0.22 माइक्रोन), एपपेनडोर्फ ट्यूब में 1 मिलियन एलिकोट वितरित करें
टेट्रासाइक्लिन स्टॉक (50 एमएल) एक 50 मिलीग्राम फाल्कन ट्यूब में 250 मिलीग्राम टेट्रासाइक्लिन जोड़ें -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें
पूरी तरह से 40 एमएल इथेनॉल में भंग
50 एमएल में इथेनॉल जोड़ें
अलीकोट 1 एमएल ट्यूब
M9 बफर (1 एल) जोड़ें 5.8 ग्राम Na2HPO4·7H2O आरटी में स्टोर
3 ग्राम KH2PO4 जोड़ें
5 ग्राम एनएसीएल जोड़ें
जोड़ें 0.25 ग्राम MgSO4·7H2O
1 एल करने के लिए dH2O जोड़ें
फ़िल्टर (0.22 माइक्रोन)
1X पीबीएस-टी (पीएच 7.4) (1 एल) एनएसीएल के 8 ग्राम जोड़ें आरटी में स्टोर
केसीएल के 200 मिलीग्राम जोड़ें
जोड़ें 1.44 ग्रामएनए 2एचपीओ4· 7H2O
जोड़ें 240 मिलीग्राम KH2पीओ4
पूरी तरह से 800 एमएल डीएच2ओ में भंग
टीआईटीट पीएच का उपयोग कर के कोह टीपी पीएच 7.4
जोड़ें 500 μL ट्वीन-20
1 एल करने के लिए dH2O जोड़ें
5x नमूना बफर जोड़ें 6.8 एमएल डीएच2O -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें
जोड़ें 2 एमएल 0.5 M Tris पीएच 6.8
3.2 एमएल ग्लाइसरोल जोड़ें
1.6 एमएल 20% एसडीएस जोड़ें
0.8 एमएल-मर्केप्टोथेनॉल जोड़ें
1% ब्रोमोफेनॉल नीला

तालिका 1: समाधान व्यंजनों

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Discussion

प्रोटेओस्टेसिस नेटवर्क की एक एकीकृत तस्वीर जो दर्शाती है कि यह कैसे संगठित है और विभिन्न मेटाज़ोन कोशिकाओं और ऊतकों में कार्यों की कमी बनी हुई है। इस कमी को दूर करने के लिए, विकास और उम्र बढ़ने के दौरान विशिष्ट ऊतकों में आणविक चैपरनेस जैसे इस नेटवर्क के विभिन्न घटकों की बातचीत के बारे में विशिष्ट जानकारी की आवश्यकता होती है। यहां, हमने दिखाया कि ऊतक-विशिष्ट क्षोभ के उपयोग ने हमें किसी दिए गए ऊतक में चैपरवन नेटवर्क की जांच करने में कैसे सक्षम बनाया। ऊतक-विशिष्ट चैपरोन आनुवंशिक बातचीत का पता लगाने के लिए, तीन अलग-अलग दृष्टिकोणों पर विचार किया गया था। पहले दृष्टिकोण में, यूएनसी-45, एक चैपरवन जो मांसपेशियों की कोशिकाओं में अत्यधिक व्यक्त किया जाता है, का उपयोग फीडिंग-आरएनएआई25के माध्यम से चैपरवन इंटरैक्शन के लिए स्क्रीन करने के लिए किया गया था। जबकि एक विशेष चैपरवन का उपयोग ऊतक-विशिष्टता को समझदार करने की अनुमति देता है, यह केवल उस अत्यधिक केंद्रित उप-नेटवर्क पर रिपोर्ट कर सकता है जिसमें यह योगदान देता है। ध्यान दें कि अधिकांश सी एलिगेंस न्यूरॉन्स फीडिंग-आधारित आरएनएआई डिलीवरी50 के लिए प्रतिरोधी हैं और इस प्रकार न्यूरोनल कोशिकाओं में आनुवंशिक बातचीत की पहचान करने के लिए इस दृष्टिकोण का उपयोग करने के लिए आरएनएआई-संवर्धित तनाव51के साथ जांच किए गए उत्परिवर्ती चैपरोन को पार करने की आवश्यकता होती है। एक दूसरे दृष्टिकोण में, एक ऊतक-विशिष्ट प्रमोटर का उपयोग मांसपेशियों में एक चैपरोन की अधिक अभिव्यक्ति को चलाने के लिए किया जाता था और इस प्रकार विशेष रूप से मांसपेशियों के तह वातावरण40को प्रभावित करता था। हालांकि, एक ही चैपरवन को व्यक्त करना आम तौर पर तह वातावरण के लिए फायदेमंद हो सकता है और इस प्रकार दो चैपरनेस के कारण मुखौटा व्यवधान एक साथ हो सकता है। तीसरा दृष्टिकोण ऊतक-विशिष्ट आरएनएआई नॉकआउट पर भरोसा करता था ताकि एक ऊतक४१में चैपरवन इंटरैक्शन की जांच की जा सके । इस दृष्टिकोण का एक लाभ यह है कि यह न्यूरोनल कोशिकाओं को लक्षित करने की अनुमति देता है जो42खिलाने के माध्यम से आरएनएआई डिलीवरी के लिए प्रतिरोधी हैं। फिर भी, इस दृष्टिकोण के लिए एक हल्के उत्परिवर्ती (हालांकि विशेष नहीं) के उपयोग की आवश्यकता होती है, साथ ही साथ इस उत्परिवर्ती को एक ऊतक-विशिष्ट आरडीई-1 बचाव जीन ले जाने वाले आरडीई-1 शून्य उत्परिवर्ती में पार किया जाना चाहिए। महत्वपूर्ण बात, इन दृष्टिकोणों को जोड़ा जा सकता है ताकि संभावित रूप से एक ऊतक या यहां तक कि एक कोशिका में चैपरवन फ़ंक्शन को मिलाना हो।

गुणवत्ता नियंत्रण मशीनरी प्रोटेओस्टेसिस को परेशान करके कई जीन उत्पादों के कार्य को प्रभावित कर सकती है। गुणवत्ता नियंत्रण नेटवर्क का पता लगाने के लिए आनुवंशिक बातचीत का उपयोग करतेसमययह एक बड़ी चुनौती है । उदाहरण के लिए, बुढ़ापे में एकत्रीकरण-प्रवण प्रोटीन या प्रोटेओस्टेसिस पतन की पुरानी अभिव्यक्ति के परिणामस्वरूप सी एलिगेंस और यीस्ट45, 52,53में कई असंबंधित मेटास्टेबल प्रोटीन की फेनोटाइपिक उत्तेजना हुई। इसके अलावा, स्तनधारी कोशिकाओं में क्लैथ्रिन-मध्यस्थता एंडोसाइटोसिस को प्रोटीन समुच्चय के लिए एचएससी 70 के कार्यात्मक ज़ब्ती पर रोक दिया गया था। फिर भी, यह दिखाया गया कि एंडोसाइटोसिस को Hsc70 ओवर-एक्सप्रेशन द्वारा बचाया जा सकता है, जबकि एकत्रीकरण54, 55नहीं हो सकता था। इसी तरह, हीट शॉक रिस्पांस के नियामकों को उजागर करने के लिए डिज़ाइन की गई ड्रोसोफिला में एक आनुवंशिक स्क्रीन ने उड़ान मांसपेशी ऐक्टिन में एक मिसेंस उत्परिवर्तन की पहचान की जो 16 गर्मी सदमे प्रतिक्रिया56को सक्रिय करती है। एक साथ लिया गया, प्रोटेओस्टेसिस नेटवर्क का क्षोभ मेटास्टेबल प्रोटीन का पर्दाफाश कर सकता है या तनाव को प्रेरित कर सकता है जो परिणाम विशिष्टता को प्रभावित कर सकता है। बहरहाल, आनुवंशिक बातचीत का विश्लेषण अत्यधिक विशिष्ट और कार्यात्मक अंतर्दृष्टि उपज कर सकते हैं । उदाहरण के लिए, एंडोप्लाज्मिक रेटिकुलम में तह करने के लिए आवश्यक खमीर जीन के एपिस्टैटिक विश्लेषणों ने आणविक चपरेन्स के बीच विशिष्ट आनुवंशिक बातचीत की पहचान की, जिसे बाद में19को मान्य किया गया । इसी तरह, दो एकत्रीकरण-प्रवण मॉडलों की विषाक्तता को बढ़ाने वाले चैपरोन्स के लिए एक उत्तेजक स्क्रीन (जैसा कि गतिशीलता द्वारा मापा जाता है) ने 18 चैपरनेस के एक विशिष्ट सबसेट की पहचान की, जिसमें से मानव कोशिकाओं में हंटिंगटिन एकत्रीकरणप्रभावित हुआ 26। यहां, हमने दिखाया कि प्रोटेओस्टेसिस नेटवर्क के विभिन्न क्षोभ विशिष्ट और कार्यात्मक चैपरवन इंटरैक्शन को उजागर कर सकते हैं।

आरएनएआई फीडिंग-आधारित आनुवंशिक इंटरैक्शन स्क्रीन का उपयोग करने का मुख्य लाभ विधि की सापेक्ष सादगी है। यहां तक कि एक सामान्य व्यवहार उत्पादन को नियोजित करना, जैसे कि गतिशीलता, उपन्यास आनुवंशिक बातचीत(चित्रा 3)प्रकट कर सकता है। हालांकि, अभिव्यक्ति नॉकडाउन की परिवर्तनशीलता और आंशिक प्रभाव परिणामों की मजबूती और विशिष्टता को सीमित कर सकते हैं57। इसके अलावा, आनुवंशिक बातचीत शारीरिक बातचीत का संकेत नहीं है और दो जीन के बीच संबंध इस प्रकार अप्रत्यक्ष हो सकता है । बातचीत की प्रकृति की खोज और गैर-विशिष्ट बातचीत को त्यागने में समय लग सकता है57,58,59. यह एक चिंता का विषय है कि स्क्रीन सेटअप और सत्यापन में संबोधित करने की जरूरत है । उदाहरण के लिए, आनुवंशिक स्क्रीनिंग में नल alleles का उपयोग करने के लिए निर्धारित करने के लिए अनुमति देता है कि क्या इन जीन एक दिया जैविक प्रक्रिया में एक ही या अलग रास्ते में कार्य करते हैं । हालांकि, जीन फ़ंक्शन के आंशिक नुकसान का उपयोग करते हुए, तापमान-संवेदनशील एलील्स, या आरएनएआई-निर्भर डाउन-रेगुलेशन अभिव्यक्ति के रूप में, अवशिष्ट गतिविधियों में परिणाम है जो उत्तेजक या फेनोटाइप को समाप्त कर सकते हैं, भले ही जीन समान रूप से या समानांतर रास्तों में कार्य करें59। इस प्रकार, किसी भी बातचीत की प्रकृति के लिए आगे विश्लेषण की आवश्यकता होती है। हालांकि, हाइपोमोर्फिक एलील्स और आरएनएआई का उपयोग करके इंटरप्रेटर की एक विस्तृत श्रृंखला की पहचान कर सकता है, जिसमें एक ही प्रोटीन परिसर या मार्ग में जीन या एक अनावश्यक मार्ग59शामिल हैं। हालांकि संभावित बातचीत का यह बड़ा दायरा आनुवंशिक स्क्रीन में अधिक हिट हो सकता है, यह गैर-विशिष्ट बातचीत का कारण भी बन सकता है, जैसे, उदाहरण के लिए, प्रोटेओस्टेसिस पतन में तापमान-संवेदनशील एलील्स का गैर-विशिष्ट जोखिम45,53।

हिट सत्यापन और गैर-विशिष्ट बातचीत की कई तरीकों से जांच की जा सकती है। हिट की संख्या कम होनी चाहिए। उदाहरण के लिए, एक unc-45 उत्परिवर्ती पृष्ठभूमि में चैपरवन अभिव्यक्ति के डाउन-रेगुलेशन के परिणामस्वरूप हिट (4%) का एक छोटा प्रतिशत हुआ, जिसमें अधिकांश चैपरवन जीन डाउन-रेगुलेशन मोटिविटी पर कोई प्रभाव नहीं दिखा। इसी तरह की दर तब देखी गई जब डीएनजे-24एम ओवर-एक्सप्रेस (6%) जैसा कि ऊपर उल्लेख किया गया है, एकत्रीकरण-प्रवण प्रोटीन के साथ चैपरवन इंटरैक्शन के लिए एक स्क्रीन ने 219 स्क्रीन (8%) के 18 चैपरोन की पहचान की।

कई उत्परिवर्ती एलील्स, ओवर-एक्सप्रेशन लाइन्स या डिजीज मॉडल का इस्तेमाल किया जाना चाहिए। विभिन्न उत्परिवर्ती एलील्स का उपयोग जिनका चैपरोन फ़ंक्शन पर अलग-अलग प्रभाव पड़ता है, साथ ही विभिन्न आनुवंशिक पृष्ठभूमि वाले विभिन्न उपभेदों का समर्थन कर सकते हैं, किसी भी स्क्रीन हिट की विशिष्टता का समर्थन कर सकते हैं। वैकल्पिक रूप से, एक अलग-अलग चैपरोन के उत्परिवर्तन या अधिक अभिव्यक्ति का उपयोग करना जो समान क्षोभ का कारण नहीं बनता है, एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में काम कर सकता है। उदाहरण के लिए, जब एसटीआई-1, अहसा-1या डीएएफ-41 को नीचे किया गया तो यूएनसी-45 (ई286) और यूएनसी-45 (एम94) दोनों ने उत्तेजक व्यवहार दिखाया। इसके अलावा, इसी तरह की बातचीत तब देखी गई जब अहसा-1 (ok3501) हटाने वाले जानवरों को एचएसपी-90 आरएनएआई25के साथ इलाज किया गया।

चैपरवन हिट की पहचान और उनकी ज्ञात बातचीत की जांच की जानी चाहिए। उदाहरण के लिए, यूएनसी-45 उत्तेजक स्क्रीन में पहचाने गए चैपरोन एचएसपी-90 एटीपेस चक्र के लिए आवश्यक चैपरोन का एक अत्यधिक विशिष्ट सेट हैं, जिनमें एक क्लाइंट रिक्रूटर (एसटीआई-1), एक रीमॉडलिंग को-चैपरोन (एएचएसए-1) और एक ग्राहक परिपक्वता सह-चैपरवन (डीएएफ-41) शामिल हैं। वास्तव में, सह-चैपरोन्स का यह सेट एक पूर्ण एचएसपी-90 फोल्डिंग चक्र60बनाता है। इसी तरह, एक DNJ-24M स्क्रीन HSP-1, Hsp40s४०के मुख्य chaperone साथी की पहचान की ।

जानवर की उम्र पर बातचीत में परिवर्तन की भी जांच की जानी चाहिए। उदाहरण के लिए, यूएनसी-45 उत्तेजक स्क्रीन में पहचाने गए चैपरोन ने वयस्कता में गतिशीलता और मायोसिन संगठन को दृढ़ता से प्रभावित किया लेकिन विकास के दौरान मामूली प्रभाव पड़ा। यह वयस्कता28 में प्रोटेओस्टेसिस नेटवर्क में परिवर्तन या मायो-फाइबर फोल्डिंग और रखरखाव के बीच मायोसिन तह आवश्यकताओं में परिवर्तन के कारण हो सकता है।

प्रोटीन के बीच बातचीत की सीधे जांच करने के साथ-साथ कोशिका में उनके स्थानीयकरण की जांच करने के लिए पूरक जैव रासायनिक दृष्टिकोणों का उपयोग करें। उदाहरण के लिए, एचएसपी-90 सह-चैपरोन, एसटीआई-1, एएचएसए-1 और डीएएफ-41, सारकोमर के लिए स्थानीयकृत हैं जहां वे मायोसिन25के साथ बातचीत करते हैं।

सी एलिगेंस गुणवत्ता नियंत्रण की निगरानी के लिए एक अच्छी तरह से स्थापित मेटाज़ोन मॉडल है। इसका उपयोग अक्सर सेल जीव विज्ञान, जैव रासायनिक और आनुवंशिक दृष्टिकोणों के चर टूलकिट का उपयोग करके सेलुलर और ऑर्गेनमल प्रोटेओस्टेसिस की निगरानी करने के लिए किया जाता है। यहां, हमने विकास और उम्र बढ़ने के दौरान जीवित जानवर मेंचैपरवन इंटरैक्शन की निगरानी के लिए आनुवंशिक स्क्रीनिंग दृष्टिकोण और उपलब्ध उपकरण57,58,59,जैसे एक उत्परिवर्तीबैंक,उपलब्ध आरएनएआईपुस्तकालयों 22,23 और ऊतक-विशिष्ट आरएनएआई उपभेदों41,42को नियोजित किया। सरल व्यवहार परख का उपयोग, जैसे गतिशीलता, उपन्यास आनुवंशिक बातचीत का पता लगाने के लिए कई संभावित जीन जोड़े की स्क्रीन को सरल बनाते हैं। यह तब वीवो और इन विट्रो में अपनी संभावित बातचीत का अध्ययन करने के लिए बायोकेमिकल टूल का उपयोग करके चैपरोन स्थानीयकरण और शारीरिक बातचीत का पता लगाने के लिए एक मंच के रूप में काम कर सकता है। यहां वर्णित प्रोटोकॉल का सफलतापूर्वक उपयोग सी एलिगेंस बॉडी वॉल मांसपेशी25,40में उपन्यास चैपरएरोन इंटरैक्शन की पहचान करने के लिए किया गया है ।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

हम कुछ नेमाटोड उपभेदों के लिए एनआईएच नेशनल सेंटर फॉर रिसर्च रिसोर्सेज (एनसीआरआर) द्वारा वित्त पोषित कैनोरहैब्डिटिस जेनेटिक्स सेंटर का शुक्रिया अदा करते हैं। एचएफ एपस्टीन द्वारा विकसित मोनोक्लोनल एंटीबॉडी को एनआईसीएचडी के तत्वावधान में विकसित विकासात्मक अध्ययन हाइब्रिडोमा बैंक से प्राप्त किया गया था और आयोवा विश्वविद्यालय के जीव विज्ञान विभाग द्वारा बनाए रखा गया था। इस शोध को इजराइल साइंस फाउंडेशन (ग्रांट नंबर 278/18) से अनुदान और इजराइल के विज्ञान और प्रौद्योगिकी मंत्रालय और विदेश मामलों और अंतरराष्ट्रीय सहयोग मंत्रालय, जनरल डायरेक्टोरेट फॉर कंट्री प्रमोशन, इटैलियन रिपब्लिक (ग्रांट नंबर 3-14337) से अनुदान द्वारा समर्थन दिया गया था । हम इस पांडुलिपि को तैयार करने में मदद के लिए बेन-जावी प्रयोगशाला के सदस्यों को धन्यवाद देते हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
12-well-plates SPL BA3D16B
40 mm plates Greiner Bio-one 627160
60 mm plates Greiner Bio-one 628102
6-well plates Thermo Scientific 140675
96 well 2 mL 128.0/85mm Greiner Bio-one 780278
Agar Formedium AGA03
Ampicillin Formedium 69-52-3
bromophenol blue Sigma BO126-25G
CaCl2 Merck 1.02382.0500
Camera Qimaging q30548
Cholesterol Amresco 0433-250G
Confocal Leica DM5500
Filter (0.22 µm) Sigma SCGPUO2RE
Fluorescent stereomicroscope Leica MZ165FC
Glycerol Frutarom 2355519000024
IPTG Formedium 367-93-1
KCl Merck 104936
KH2PO4 Merck 1.04873.1000
KOH Bio-Lab 001649029100
MgSO4 Fisher 22189-08-8 Gift from the Morimoto laboratory
Myosin MHC A (MYO-3) antibody Hybridoma Bank 5-6
Na2HPO4·7H2O Sigma s-0751
NaCl Bio-Lab 001903029100
Peptone Merck 61930705001730
Plate pouring pump Integra does it p920
RNAi Chaperone library NA NA
SDS VWR Life Science 0837-500
ß-mercaptoethanol Bio world 41300000-1
stereomicroscope Leica MZ6
Tetracycline Duchefa Biochemie 64-75-5
Tris Bio-Lab 002009239100
Tween-20 Fisher BP337-500

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जीव विज्ञान अंक 160 कैनोरहैब्डिटिस एलिगेंस,चैपरोन जेनेटिक इंटरैक्शन प्रोटेओस्टेसिस आरएनएआई स्क्रीन तापमान-संवेदनशील
ऊतक-विशिष्ट चैपरवन इंटरैक्शन के लिए स्क्रीन करने के लिए <em>कैनोरहैब्डिटिस एलिगेंस</em> का उपयोग करना
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Dror, S., Meidan, T. D., Karady, I., … More

Dror, S., Meidan, T. D., Karady, I., Ben-Zvi, A. Using Caenorhabditis elegans to Screen for Tissue-Specific Chaperone Interactions. J. Vis. Exp. (160), e61140, doi:10.3791/61140 (2020).

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