Summary
シャペロン-シャペロンとシャペロン基質相互作用を研究するために、我々は、軽度の突然変異またはシャペロンの過剰発現と組み合わせてRNA干渉を使用して カエノハブディティス・エレガンス の合成相互作用スクリーンを行い、組織レベルで組織特異的タンパク質機能不全を監視する。
Abstract
細胞機能には、タンパク質およびタンパク質複合体の正しい折り畳みと組み立てが不可欠です。細胞は、損傷したタンパク質を正し、隔離し、または排除する品質管理経路を採用して、健康なプロテオームを維持し、細胞プロテオスタシスを確保し、さらなるタンパク質損傷を防ぎます。プロテオスタシスネットワーク内の冗長な機能のため、多細胞生物 カエノルハブディティス・エレガン スにおけるノックダウンまたはシャペロンコード遺伝子の変異を用いて検出可能な表現型のスクリーニングは、ほとんどの場合、マイナーまたは全く表現型の検出をもたらす。特定の機能に必要なシャペロンを同定し、表現型と機能のギャップを埋める目的でスクリーニング戦略を策定しました。具体的には、RNAi合成相互作用スクリーンを用いた新規シャペロン相互作用、ノックダウンシャペロン発現、一度に1つのシャペロン発現、シャペロンコード遺伝子の変異を運ぶ動物、または目的のシャペロンを過剰発現する動物を監視する。個々にグロス表現型を呈しない2つのシャペロンを破壊することによって、我々は両方が摂動したときに特定の表現型を悪化させるか、または暴露するシャペロンを同定することができる。我々は、このアプローチが、特定の表現型に関連するタンパク質またはタンパク質複合体の折り畳みを調節するために一緒に機能するシャペロンの特定のセットを同定できることを実証する。
Introduction
細胞は、損傷したタンパク質1,2を修復、隔離、除去する品質管理機械を採用することで、タンパク質の損傷に対処する。タンパク質複合体の折りたたみおよび組立は、分子シャペロンによって支持され、損傷したタンパク質3、4、5、6、7を修復または隔離することができる高度に保存されたタンパク質の多様なグループである。損傷したタンパク質の除去は、ユビキチンプロテアソーム系(UPS)8またはオートファジー機械9によってシャペロン10、11、12との協調で媒介される。タンパク質ホメオスタシス(プロテオスタシス)は、従って、折りたたみおよび分解機3,13からなる品質管理ネットワークによって維持される。しかし、生体内のプロテオスタシスネットワークの様々な成分間の相互作用を理解することは大きな課題です。タンパク質とタンパク質の相互作用スクリーンは、物理的相互作用とシャペロン複合体14,15に関する重要な情報を提供する一方で、生体内の組織特異的シャペロンネットワーク内の組織および補償機構を理解することは欠けている。
遺伝的相互作用は、一般的なまたは代償的な生物学的経路16、17、18に関与する遺伝子のペア間の関係を調べるための強力なツールとしてしばしば使用される。このような関係は、2番目の遺伝子16の突然変異によって引き起こされる表向きの重症度に対する1つの遺伝子における突然変異の一対を組み合わせることによって測定することができる。そのような組み合わせのほとんどは表現型の面で効果を示さないが、いくつかの遺伝的相互作用は、測定された表現型の重症度を悪化させるか、または緩和することができる。二重欠失変異体の表現型が単一欠失変異体を組み合わせた際に見られる予想より重篤な場合に、悪化する変異が観察され、2つの遺伝子が並列経路で機能し、一緒に特定の機能に影響を与える。これに対し、二重欠失変異体の表現型が単一欠失変異体に見られる表現型よりも重症でない場合に緩和突然変異が観察され、2つの遺伝子が複合体として作用するか、あるいは同じ経路16,18に関与することを示唆する。したがって、致死性、増殖速度およびブロードサイズなどの広範な表現型、ならびに転写レポーターなどの特定の表現型を含む、定量化できる多様な表現型が、遺伝的相互作用を同定するために使用されてきた。例えば、Jonikasらの研究は、ペアワイズ遺伝子欠失解析を用いて、サッカロマイセスCErevisiae ER展開タンパク質応答プロテオスタシスネットワークの相互作用を調べるためにERストレスレポーターに依存していた19。
遺伝的相互作用画面は、二重変異体20の包括的なセットを生成するために体系的にペアワイズ欠失突然変異を交差することを含む。しかし、動物モデル、特にC.エレガンスでは、この大規模なアプローチは実現不可能です。代わりに、変異株は、RNA干渉(RNAi)21を用いて遺伝子発現を下方調節することによって、それらの遺伝的相互作用パターンについて試験することができる。C. エレガンスは RNAi22、23に基づくスクリーンのための強力なシステムです。C.エレガンスでは、二本鎖RNA(dsRNA)の送達は細菌の供給によって達成され、dsRNA分子が多数の組織に広がった。このようにして、導入されたdsRNA分子は、迅速かつ簡単な手順21を介して動物に影響を与える。したがって、RNAiを用いた遺伝的相互作用スクリーンは、RNAiライブラリ24を用いて遺伝子またはほとんどのC.エレガンスコード遺伝子の一組をダウンレギュリングすることの影響を明らかにすることができる。このような画面では、対象の変異体の挙動に影響を与えるが、野生型株は影響しないヒットは、監視されている表現型の潜在的な修飾子である25.ここでは、変異とRNAiスクリーニングの組み合わせを適用して、C.エレガンスにおける組織特異的シャペロン相互作用を体系的にマッピングする。
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Protocol
1. RNAi用線虫増殖培地プレートの製造
- 1 Lボトルに、NaClの3g、バクトペプトンの2.5g、寒天17g、蒸留水1Lとオートクレーブを加えます。
- 55°Cに冷却ボトル。
- 25 mLの1 M KH2PO4、pH6.0、1 M CaCl2の1 mL、1 M MgSO4の1 mL、コレステロール溶液1 mL(表1)を加え、線虫増殖培地(NGM)を作る。
- 1 mL のアンピシリン (100 mg/mL) と 0.5 mL の 1 M IPTG (表 1) を加えて NGM-RNAi 溶液を作ります。
注:一般的に使用されるHT115(DE3) 大腸菌 は、dsRNAコードプラスミドを発現するために使用されるIPTG誘導性T7 DNAポリメラーゼを含んでいます。これらのプラスミドはまた、アンピシリン耐性をコードする。 - ボトルを渦巻いて温かい溶液を混ぜます。
- ボンネット内または滅菌手順を使用して、NGM溶液をプレートに注ぐか、蠕動ポンプを使用して、溶液をプレートに分配します。この画面には、6ウェル、12ウェル、40 mmまたは60mmプレートを使用してください。寒天は、プレートの深さの約2/3を埋める必要があります。
- プレートを室温でベンチで一晩乾燥させ、プレートを覆い続けます。RNAi用のNGMプレートは、最大1ヶ月間4°Cで保存することができます。
2. RNAi菌の増殖とプレートの播種
- ボンネットまたは滅菌手順を使用して、LB溶液のオートクレーブ1 Lにアンピシリン(100 mg/mL)1 mLとテトラサイクリン2.5 mL(表1)を加えて混合します。
注:一般的に使用されるHT115(DE3) 大腸菌 はテトラサイクリン耐性です。 - フード内または無菌手順を使用して、2 mL-深さ96ウェル滅菌プレートの各ウェルに600 μLのLB溶液を追加します。メディアを分配するには、マルチチャネル パイプを使用するのが最適です。
- 無菌の手順を使用して、HT115(DE3)大腸菌を有する接種ウェルは、対象遺伝子または空のプラスミドを標的とするdsRNAコードプラスミドで形質転換した。プレートを覆い、一晩で37°Cでインキュベートします。dsRNAを発現する細菌クローンからなるライブラリーは、予測されたC.エレガンス遺伝子の約94%に相当し、以前に22、23に構築され、市販されている。ここで使用されるシャペロン図書館は、リチャード・モリモト研究所26によって建設されました。
- 滅菌手順を使用して、種子75、150または250μLの細菌をそれぞれ12ウェル、40mmおよび6ウェルまたは60mmNGM RNAiプレートに入れ。プレート上の標的遺伝子の名前を明確にマークする。細菌は寒天表面の30〜50%をカバーする必要があり、プレートの端に触れるべきではありません。
- プレートを室温でベンチで少なくとも2日間乾燥させ、プレートを覆った状態に保ちます。
注:プレートは一晩で37°Cでインキュベートすることができます。プレートを使用または保管する前に、内側の井戸が乾燥していることを確認してください。すべての長期目的(すなわち、乾燥または貯蔵)のために、プレートを暗闇の中に保ちます。乾燥した、種のプレートは、4 °Cで最大1ヶ月間保存することができます。
3. 胚の非ストレスな同期
- ワームピックを使用して、同期していないワームプレートから新しく播種されたNGMプレートに約100個の卵を移動させます。
- 動物を15°Cで5日間、20°Cで3.5日、25°Cで2.5日栽培します。 動物は産卵の最初の日に達する必要があります。
注:ワームは一般的に20°Cで栽培されています。 しかし、異なるシャペロン変異株は、特定の栽培温度を必要としてもよい。例えば、多くの温度感受性株は15°Cで栽培されているが、その表現型を露出させるために25°Cにシフトする。 - 1 mLのM9バッファー(表1)をゆっくりと加え、細菌の芝生から離します。バッファーがプレートを完全に覆う状態になるように、プレートを回転させます。その後、片側に傾け、プレートから液体を取り除き、プレートから動物を洗い流します。
注:温度感受性動物やシャペロン変異体を使用する場合は、プロトコルで使用されるバッファを動物の栽培温度で維持するのが最善です。 - ステップ3.3を3回、またはすべての動物がプレートから洗い流されるまで繰り返します。
- 標準的なプラスチックチップを使用して、卵が濃縮された洗浄プレートから寒天の正方形をカットし、新しく播種されたNGMプレートの上に寒天の部分を置きます。
注:〜200個の卵は十分な産卵動物を生産するために必要とされます。あまりにも多くの動物があまりにも速く細菌を消費します。低い食品レベルは、プロテオスタシス27に影響を与えることができます。 - 動物を15°Cで5日間、20°Cで3.5日、または25°Cで2.5日栽培する。 この時点で、プレートは同期卵で覆われるべきです。
注:動物は、より厳格な同期のために、短期間、新しいプレートにシフトすることができます。しかし、動物は子宮内の卵を保持して同期に影響を与えることができるので、産卵の初期段階でのみ成人を使用することが重要です。 - 1 mL の M9 バッファーをゆっくりと加え、細菌の芝生から離します。
- バッファーがプレートを完全に覆う状態になるように、プレートを回転させます。その後、片側に傾け、プレートから液体を取り除き、プレートから動物を洗い流します。
- ステップ3.7を3回、またはすべての動物がプレートから洗い流されるまで繰り返します。
- M9バッファーの1 mLを追加し、プレートから卵を解放するためにセルスクレーパーを使用しています。
- プレートから卵を含むM9バッファーを収集します。
- 3,000 x g で卵を含むM9緩衝液を2分間遠心分離する。
- 上清を取り出し、M9バッファを追加して1mLのボリュームに到達します。
- 卵や細菌の塊を混乱させるために卵を再中断します。
- ステップ3.11-3.13に記載の洗浄手順を5回繰り返します。卵ペレットは白く表示されます。黄色/茶色のままの場合は、白いペレットが得られるまで洗浄を繰り返します。
注:卵に残っている細菌は、dsRNA発現細菌を汚染する可能性があります。 - 上清の大部分を取り除き、約200 μLを残します。
4. 一般的な表現法アッセイ
- 実験中の動物の栽培
- 各RNAiシードプレートの細菌の芝生の近くに〜30個の卵を1滴置きます。参考までに、空のベクター含有(L4440)細菌を播種したプレートに30個の卵を置く。
- NGM RNAiシードプレートで年齢同期性動物を栽培します。実験の期間は、動物が監視される段階と栽培の温度に依存します。温度感受性変異動物を使用する場合は、栽培温度を調整します。発達遅滞動物を使用する場合の栽培期間を調整する。
注意:タイミングはさまざまですが、動物が成人に達すると、産卵(および結果として生じる急速な食物消費)、ならびに年齢依存性プロテオスタシス崩壊28が結果に影響を与える可能性があります。したがって、産卵の開始前に動物を採点することをお勧めします (成人の1日目).野生型動物は、15°Cで4.5日後、20°Cで3日または25°Cで2日後にこの段階に達する。 - 繰り返しの回数は、調べた遺伝子セットのサイズによって異なります。シャペロンライブラリー(97遺伝子)については、実験を少なくとも4回繰り返す。母集団の大きさは、使用するアッセイによって異なる。ここで説明した行動アッセイでは、各繰り返しにおいて実験条件ごとに>15匹の動物を採点する。データおよび統計分析も、使用するアッセイの種類によっても大きく左右されます。ここで説明するアッセイのデータは、SEM±手段として提示することができる。
- RNAiと空のベクターコントロール処理動物を独立集団と比較します。P値は、一方向または双方向のANOVAを使用して計算することができ、検査された変化、すなわち単独または両方を悪化または緩和する。単一のRNAi治療と対照を調べる場合、P値は一方向または双方向のマン・ホイットニーランク合計検定を使用して計算することができます。統計的有意性以外に、表現型への影響度に基づいてヒットの閾値を考慮する。
- 発達停止/遅延
- 空のベクター含有対照細菌で成長した動物が成人に達するまで、産卵が始まる前に、ステップ4.1のように年齢同期動物を栽培する。
- 体型顕微鏡を用いて動物を監視し、幼虫と成人の数を数え、発達遅延動物の割合を計算する。参考として、空のベクター含有対照菌上で増殖した変異動物と比較する。 hsp-1 または hsp-90 RNAi治療は、野生型動物の発達停止をもたらし、陽性対照として使用することができる。
- 発達遅延動物の割合を時間の経過とともにスコアするには、ステップ4.2.2を繰り返します。
注:プレート上に産卵成人がいる場合は、子孫との混乱を避けるために、発達遅延動物を同じ標的遺伝子に対して標識された新しいNGM-RNAiプレートに移します。
- 無菌または産卵不良
- 空のベクターコントロール細菌で成長した動物が卵を産み始めるまで、ステップ4.1のように年齢同期性の動物を栽培する。
- 実体顕微鏡を使って動物を監視し、子宮に目に見える卵を持たない動物の割合をスコア付けします。参考として、空のベクターコントロール細菌で増殖した変異動物と比較する。
- あるいは、体型顕微鏡を用いて動物を監視し、卵を満載した子宮で動物の割合をスコア付けし、EGg産損物(Egl-d)表現型29と定義する。
- 胚性致死性
- 動物が卵を産み始めるまで、ステップ4.1のように年齢同期性の動物を栽培する。
- 空のプレートに〜100個の卵を移します。カウントを簡素化するために行に卵を広げます。
- 24-48時間後にプレート上の孵化していない卵の割合をスコア。参考として、空のベクターコントロール細菌で処理された動物の卵と比較する。
- 麻痺アッセイ
- 1日目の成人の場合、空のベクターコントロール細菌で成長した動物が成人期に達するまで、産卵が始まる前に、ステップ4.1のように年齢同期動物を栽培する。
- 細かいマーカーを使用して、通常のNGM寒天プレートの背面に線を引きます。
- マークされたラインに5〜10匹の動物を配置します。
- タイマーを設定し、10分待ちます。
- 麻痺したワームとしてラインに残っている動物の割合をスコア。参考として、空のベクターコントロール細菌で増殖した変異動物と比較する。 非全45 型RNAiで処理された野生型動物は、重度の麻痺表現型を示し、陽性対照として使用することができる。
注:このアッセイは、中程度から重度の麻痺を示す動物を強調しています。このような動物は、通常、共通の湾曲した形状を提示するのではなく、プレート上にまっすぐに横たわります。さらに、細菌を取り除いたパッチが麻痺したワームの頭部の周りに見える。
- スラッシングアッセイ
- 空のベクターコントロール細菌で成長した動物が成人に達するまで、卵子の産卵が始まる前に、ステップ4.1のように年齢同期動物を栽培する。
- 96ウェルプレートに動物の栽培温度でM9バッファの100 μLをピペット。
- M9バッファー含有ウェルに、ウェルごとに15個のワームを入れます。
- 動物は5分間調整しましょう。
- 実体顕微鏡下で各動物を調べ、15sをカウントダウンするタイマーを開始し、その期間内に各動物が行う体の曲げ数をカウントする。カウントされた値は、1 分あたりのボディ ベンドに正規化できます。参考として、空のベクターコントロール細菌で増殖した変異動物と比較する。
注:この運動性アッセイは非常に敏感であり、治療間の非常に穏やかな違いを検出することができます。しかし、液体の運動性と寒天の運動性は異なる場合があります。
5. タンパク質ノックダウンの検証
- 関連するdsRNA発現または空のベクター含有(L4440)細菌を播種した60mmNGM-RNAiプレートに250〜300個の同期卵を置きます。
注:RNAiノックダウンは、胚の不足や遺伝子発現に影響を与える可能性のある発達停止において、胚の異常な蓄積をもたらす可能性があります。これは、検査する動物の年齢を決定する際に考慮されるべきである。 - 1日目の成人の場合、15°Cで4.5日間、20°Cで3日間、または25°Cで2日間栽培する。
- 200 μL の PBS-T で充填された 1.5 mL チューブのキャップに合計 200 匹の若い成虫動物を選んで移します。
注:温度感受性動物やシャペロン変異体を使用する場合は、プロトコルで使用されるバッファを動物の栽培温度で維持するのが最善です。 - キャップを慎重に閉じ、1,000 x g で遠心分離機を 1 分間閉じます。
- 800 μLのPBS-T (表1)と遠心分離機を1,000 x g で1分間加えます。
- 上の900 μLを慎重に取り外します。
- 手順 5.4 ~ 5.6 を 3 回繰り返します。
- 900 μL を取り除き、200 個のワームを含む溶液を 100 μL残します。
- 25 μLの 5x サンプルバッファーを追加します (表 1)。
- 1000 rpmで振りながら、92°Cで10分間サンプルを加熱します。その後、サンプルを凍結し、-20°Cに保つことができます。
- 各サンプルの20 μLをロードし、SDS-PAGEゲルで実行します。
- 適切な抗体を用いてウェスタンブロット分析を行い、タンパク質の相対的安定性を決定する。
- 自由に利用できる ImageJ ゲル モジュールのような密度のソフトウェアを使用してバンドの強度を決定します。すべての値をコントロールサンプルで測定したものに正規化します。
注:私たちのスクリーンでRNAiノックダウンの目的は、特定のシャペロン/コシャペロンのタンパク質レベルを下げることです。したがって、RNAiノックダウンの効率を評価する最良の方法は、ウェスタンブロット分析によるものである。これには特定の抗体が必要です。代わりに、qPCRを使用してmRNAレベルを定量化することもできます。
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Representative Results
UNC-45の温度感受性変異を使用して、許容的または制限的な条件下での相互作用を悪化または緩和するためのスクリーニング
筋肉のアセンブリとメンテナンスは、組織特異的なシャペロン相互作用を研究する効果的なシステムを提供します。収縮性筋肉の機能的単位であるサルコメアは、構造タンパク質と調節タンパク質の結晶状の配置を示す。運動タンパク質ミオシンの安定性と収縮性筋サルコメアの厚いフィラメントへの組み込みは、シャペロンおよびUPS成分30の協力に依存する。そのようなシャペロンの一つの例は、主に体壁筋肉31、32、33、34、35で発現される保存および専門化ミオシンシャペロンUNC-45である。UNC-45の変異は、Cにおけるミオシンの解体および重度の運動性欠陥を誘導することが示されている。エレガンス31、36。UNC-45タンデムモジュールは、マルチサイトドッキングプラットフォーム37に組み立てられ、UNC-45、HSP-90およびHSP-1と、ミオシンフィラメントアセンブリ25、36、37、38の他のシャペロンおよびコシャペロンとのコラボレーションを強制する。既知のUNC-45相互作用を確認し、筋肉プロテオスタシスにおける新しい遺伝的相互作用を同定するために、我々は、組織特異的シャペロン相互作用スクリーニング19、25の感作遺伝的背景としてC.エレガンス温度感受性unc-45突然変異を用いた戦略を確立した。
C. エレガンスUNC-45 (L822F および E781K, e286およびm94対立に対応する) の単一アミノ酸置換;unc-45(ts)影響を受ける動物が制限条件下で増殖する場合(>22°C)、温度依存性運動性欠損およびミオシン解剖性の形を担う。対照的に、これらのunc-45(ts)変異体は、許容温度(15°C)31で動きやミオシン組織の欠陥を示さない。提案されたアプローチでは、最初の幼虫期(L1)における年齢同期型のunc-45(e286)動物をRNAi(97遺伝子)によって異なる分子シャペロンを枯渇させ、次いで、許容条件下での運動性欠陥を監視した(図1)。我々は、我々の遺伝的相互作用スクリーンにおけるUNC-45およびHSP-90タンパク質の既知の相互作用を確認し、特に非45(ts)変異動物では合成運動欠陥を引き起こすが、野生型動物25では起こっていない3つのhsp-90コシャペロン、sti-1、ahsa-1、およびdaf-41を同定した。 続いて、sti-1-、ahsa-1-またはdaf-41-関連する合成フェノタイプが、確立された免疫染色技術39を用いて、ミオシン重鎖A(MYO-3)の細胞内配置をモニタリングすることによって、ミオシンの解体によって引き起こされたかどうかを調べた。 sti-1、ahsa-1またはdaf-41 RNAiによる野生型動物の治療は、ミオフィラメント組織に影響を与えなかったのに対し、unc-45(e286)変異動物におけるこれらの遺伝子の枯渇は、許容条件下(15°C)の下でも肉体構造およびMYO-3ミスカライゼーションの完全な破壊をもたらした。 この効果は、制限温度(25°C)25で成長した単一変異体のunc-45(e286)で見られたものと同等であった。これらの結果は、別のunc-45(ts)-アリール、すなわち、非-45(m94)変異動物25を用いて確認された。
次に、UNC-45を不安定化させるシャペロンを同定するため、RNAiによる遺伝子ノックダウンに頼って 、25°Cでunc-45(286) 動物の運動性を改善したシャペロンをスクリーニングしました。 25°Cでの変異 動物の変異動物は重度の動きの欠陥を示したが、スクリーニングされた97シャペロンのうち4つをコードする遺伝子に対してRNAiで処理された動物の運動性は有意に改善された。ここでも、結果は 、unc-45(m94) 変異動物を用いて確認された。したがって、温度感受性変異を使用すると、画面が実施される温度に応じて、画面の悪化と緩和の両方を確立することができます。
シャペロンの組織特異的過剰発現を使用して、相互作用を悪化させるスクリーニング
次に、単一シャペロンの組織特異的過剰発現を、スクリーニング目的で筋シャペロンネットワークの軽度の摂動として利用した。具体的には、野生型の野生型dnj-24を過剰発現する動物を利用し、C.エレガンス体壁筋(DNJ-24M)におけるHsp40タンパク質DNAJB6のC.エレガンスホモログをコード化した。上記と同様に、L1 DNJ-24M動物は、異なるシャペロンについてRNAiで処理し、運動性欠陥(20°C)を監視した(図1)。DNJ-24M動物は顕著な運動性欠陥を示さなかったが、3つの遺伝子(48のシャペロンコード遺伝子のうち6%)、すなわちhsp-1、rme-8、およびdnj-8は、特にDNJ-24M発現動物の運動性に影響を与えたが、野生型動物には影響しなかった。異なるシャペロンを過剰発現する動物、すなわちHSP-90を用いてヒットの特異性を筋肉(HSP90M)でテストしても、hsp-1、rme-8、またはdnj-8 RNAi処置40の際にHSP90M運動に影響を及ぼさなかったことに注意する。 一緒に、スクリーニングプラットフォームは、メタスタブル変異タンパク質または組織特異的過剰発現の発現のようなシャペロンネットワークへの軽度の摂動を採用し、高比のヒット率(通常〜5%)をもたらした。
組織特異的RNAiを使用して組織特異的な遺伝的相互作用をスクリーニングする
組織特異的なRNAi感受性株は、dsRNA送達のために細菌供給を使用しながら、遺伝子の組織特異的なノックダウンを可能にする。これらの株は、RDE−1アルゴノーテタンパク質に対する変異体であり、有効な遺伝子サイレンシング21に必要なRNAi経路における主要な成分である。しかし、組織特異的プロモーターの制御下で野生型RDE-1を発現すると、組織特異的遺伝子ノックダウン41,42に有効な組織特異的遺伝子が導き出された。このツールは、このように、UNC-45またはDNAJ-24Mのような組織特異的なシャペロンを使用せずに遺伝的相互作用スクリーンを可能にする。例えば、開発中の野生型動物のhsp-6(致命的な)ノックダウンは、強力な発達停止をもたらした(RNAi処理動物の96±1%)。同時に、野生型のRDE-1を発現する筋肉の中の菌株中のhsp-6ノックダウンは発達停止を引き起こさなかったのに対し、腸管細胞に野生型RDE-1を発現すると、強力な発達停止表現型(90±3%)が生じ、その結果として現像が止まった。図2)。したがって、腸管細胞におけるHSP-6機能は正常な発達に必要である。軽度の増殖遅延を引き起こすhsp-6(mg585)の突然変異は、したがって、突然変異した遺伝子を腸特異的RNAi株に交差させ、シャペロンRNAiライブラリーをスクリーニングすることによってシャペロン相互作用を悪化または緩和するためのスクリーニングに使用することができる。
遺伝的相互作用を用いたフォールディング環境における年齢依存性変化のモニタリング
動物は肉腫の組織化43、44、45に関連する運動性の年齢依存性の低下を示す。タンパク質の折りたたみ能力の変化は、細胞プロテオスタシス機械28の調節および組成の変化と一致し、筋肉品質管理機械46のタンパク質であるUNC-45、CHN-1、およびUFD-2の変化したレベルを含む。一致して、ミオシンの折り畳みおよび分解は成人期47への移行におけるタンパク質静力学容量の変化によって影響される。したがって、このような変化がシャペロン相互作用に影響を与える可能性があるかどうかを尋ねました。例えば、sti-1、ahsa-1、daf-41のノックダウンが経時の運動性に及ぼす影響を監視しました。 sti-1-, ahsa-1-およびdaf-41-RNAi治療動物は幼虫の発達中に運動性が低下したが,非カンプ45(ts)成虫では運動性が強く低下することがわかった。さらに、sti-1、ahsa-1またはdaf-41 RNAiで治療された変異動物のMYO-3組織は、第4の幼虫段階(L4)で野生型ワームのそれと類似していたが、突然変異体は動物が成人に達した後にサルコメアを破壊した(図3)。対照的に、空のベクターコントロールで処理された変異動物と野生型動物の両方が影響を受けません(図3)。したがって、年齢または環境条件の関数としてのプロテオスタシスダイナミクス27、45、46、48、49はシャペロン相互作用に重大な影響を与える可能性がある。
図1:目的のシャペロンをコードする遺伝子に変異を運ぶ C.エレガンス を用いたRNAi合成相互作用スクリーンのセットアップ。(A) ターゲットシャペロンインタラクション画面の基本設定の概略図。(B)ヒット検証には、別のシャペロン変異体を用いた遺伝的相互作用の確認と、RNAiノックダウンの指定を検証する必要がある。(C-D)運動性欠陥などの単純な読み出しを定量化して、麻痺またはスラッシングアッセイを使用して、相互作用を悪化または緩和することができます。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:ミトコンドリアシャペロン hsp-6 の組織特異的RNAiは、1つの組織における遺伝的相互作用を調べるために使用することができる。野生型腸および筋肉特異的RNAi株を hsp-6 RNAiで治療し、(A)発育遅延を採点したか、または(B)成人期の初日に画像を撮影した。データは SEM ±平均値、N=6です。スケールバーは1mmです。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:RNAiの年齢依存性の影響(A) 年齢とともに運動性。野生型またはunc-45(e286)胚を15°Cのsti-1、ahsa-1またはdaf-41 RNAi種子プレートに置き、各発達段階、L1-L4、若年成人および成人1日目のスラッシングアッセイを使用して運動性を獲得した。 データは SEM ± N=15 です。(B) 体壁筋の共焦点像動物はAのように扱われ、成人期の成人期および1日目の成人期において固定され、抗MYO-3抗体で免疫染色された。スケールバーは10 μmです。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
| 解決 | 準備手順 | 貯蔵 |
| 1 M カクラス2 (1 L) | 147.01 g CaCl2·2H2Oを追加 | RTで保管 |
| dH2O を 1 L に追加する | ||
| オートクレーブまたはフィルター (0.22 μm) | ||
| 1 M KH2PO4、pH6.0 (1 L) | 136.09 g KH2PO4を追加 | RTで保管 |
| 800 mL dH2Oを追加 | ||
| 溶解するまで磁気撹拌機を使用して混合 | ||
| KOHを使用したpHの活性化 | ||
| dH2O を 1 L に追加する | ||
| オートクレーブまたはフィルター (0.22 μm) | ||
| 1 M MgSO4 (1 L) | 248.58 g MgSO4·7H2Oを追加 | RTで保管 |
| dH2O を 1 L に追加する | ||
| オートクレーブまたはフィルター (0.22 μm) | ||
| コレステロール溶液(50 mL) | 50 mL ファルコンチューブに 250 mg のコレステロールを追加します。 | -20 °Cで保管 |
| 40 mLエタノールに完全に溶解 | ||
| 50 mLにエタノールを加える | ||
| 1 M IPTG (50 mL) | 50 mL ファルコンチューブに11.9 gのIPTG(イソプロピルβ D-チオガラクトピラノシド)を加える | -20 °Cで暗闇の中で保管 |
| 40 mL dH2O に完全に溶解 | ||
| dH2O を 50 mL に追加 | ||
| フィルター (0.22 μm), アリコート 1mL チューブ | ||
| アンピシリンストック(50mL) | 50 mL ファルコンチューブに5gアンピシリンを加える | -20 °Cで保管 |
| 40 mL dH2O に完全に溶解 | ||
| dH2O を 50 mL に追加 | ||
| フィルター(0.22 μm)、1 mLアリコートをエペンドルフチューブに分配 | ||
| テトラサイクリンストック(50mL) | 50 mL ファルコンチューブに250 mgのテトラサイクリンを加える | -20 °Cで保管 |
| 40 mLエタノールに完全に溶解 | ||
| 50 mLにエタノールを加える | ||
| アリコート 1 mL チューブ | ||
| M9 バッファ (1 L) | 5.8 g Na2HPO4·7H2Oを追加 | RTで保管 |
| 3 g KH2PO4 を追加 | ||
| 5 g NaCl を追加 | ||
| 0.25 g MgSO4·7H2Oを追加します。 | ||
| dH2O を 1 L に追加する | ||
| フィルター (0.22 μm) | ||
| 1X PBS-T (pH 7.4) ( 1 L) | NaClの8 gを追加 | RTで保管 |
| KClの200mgを追加 | ||
| 追加 1.44 g Na2HPO4·7H2O | ||
| 240 mg KH2PO 4を追加します。 | ||
| 800 mL dH2O に完全に溶解 | ||
| KOH tp pH 7.4 を使用した pH の活性化 | ||
| 500 μL トゥイーン-20を追加 | ||
| dH2O を 1 L に追加する | ||
| 5x サンプルバッファー | 6.8 mL dH2Oを追加 | -20 °Cで保管 |
| 2 mL 0.5M トリス pH 6.8 を追加 | ||
| 3.2 mLグリセロールを追加 | ||
| 1.6 mL 20% SDSを追加 | ||
| 0.8 mL ß-メルカプトエタノールを加える | ||
| 1%ブロモフェノールブルー |
表 1: ソリューションレシピ
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Discussion
プロテオスタシスネットワークの統合画像は、それがどのように組織化され、異なるメタゾアン細胞および組織で機能するかを反映しています。この欠点に対処するためには、開発や老化の過程で、分子シャペロンなどのこのネットワークの様々な構成要素の相互作用に関する具体的な情報が必要です。ここでは、組織特異的摂動を使用して、特定の組織におけるシャペロンネットワークを調べることがどのように可能であるかを示した。組織特異的シャペロン遺伝的相互作用を探求するために、3つの異なるアプローチが検討された。第1のアプローチでは、筋肉細胞において高発現されるシャペロンであるUNC-45を、摂食RNAi25を介してシャペロン相互作用をスクリーニングするために使用した。特殊なシャペロンの使用は、識別組織特異性を可能にするが、それはそれが貢献するその非常に焦点を当てたサブネットワーク上でのみ報告することができます。ほとんどのC.エレガンスニューロンは、摂食ベースのRNAi送達50に耐性であり、したがって、ニューロン細胞における遺伝的相互作用を同定するためにこのアプローチを使用するには、RNAi増強株51で調べた変異型シャペロンを交配する必要があることに注意してください。第2のアプローチでは、組織特異的プロモーターを用いて、筋肉中のシャペロンの過剰発現を駆動し、したがって筋肉折りたたみ環境40に特異的に影響を与える。しかし、単一のシャペロンを過剰発現させることは、一般的に折りたたみ環境に有益であり、したがって、2つのシャペロンによって引き起こされる破壊を一緒にマスクすることができる。第3のアプローチは、与えられた組織41におけるシャペロン相互作用を調べるために組織特異的RNAiノックダウンに依存していた。このアプローチの1つの利点は、摂食42を介してRNAi送達に耐性がある神経細胞を標的にすることができるということです。それでも、このアプローチでは、軽度の突然変異体(専門化されていないが)の使用と、この突然変異体が組織特異的なrde-1救助遺伝子を運ぶrde-1ヌル突然変異体に交差することが必要である。重要なことに、これらのアプローチは、単一の組織または単一の細胞におけるシャペロン機能を潜在的に調節するように組み合わせることができる。
品質管理機械は、プロテオスタシスを摂動させることによって、多くの遺伝子産物の機能に影響を与える可能性があります。これは、遺伝的相互作用を使用して品質管理ネットワーク18を探索する際の大きな課題です。例えば、凝集しやすいタンパク質の慢性発現または老化におけるプロテオスタシスの崩壊は、C.エレガンスおよび酵母45、52、53における多くの無関係な転移性タンパク質の表現型悪化をもたらした。また、哺乳動物細胞におけるクラトリン媒介性エンドサイトーシスは、タンパク質凝集体に対するHsc70の機能的隔離時に阻害された。しかし、エンドサイトーシスはHsc70過剰発現によって救出され、凝集は54,55ではなかったことが示された。同様に、熱ショック応答の調節因子を明らかにするように設計されたショウジョウバエの遺伝的スクリーンは、熱ショック応答56を構成的に活性化する飛行筋アクチンにおけるミスセンス突然変異を同定した。一緒に取ると、プロテオスタシスネットワークの摂動は、メタスタブルタンパク質を露出させるか、結果特異性に影響を与える可能性のあるストレスを誘発することができます。しかし、遺伝的相互作用を分析することは、高度に特異的で機能的な洞察をもたらすことができます。例えば、小胞体での折り畳みに必要な酵母遺伝子のエピスタティック分析は、その後検証された分子シャペロン間の特異的遺伝的相互作用を同定した。同様に、2つの凝集しやすいモデルの毒性を増強するシャペロンの悪化スクリーン(運動性によって測定される)は、ヒト細胞26におけるハンチンチン凝集に影響を与えた18のシャペロンの特定のサブセットを同定した。ここで、プロテオスタシスネットワークの様々な摂動が、特定の機能的なシャペロン相互作用を明らかにすることができることを示した。
RNAiの摂食ベースの遺伝的相互作用スクリーンを使用する主な利点は、方法の相対的な単純性である。運動性などの一般的な行動出力を採用しても、新しい遺伝的相互作用を明らかにすることができる(図3)。しかし、式のノックダウンの変動性と部分的な影響は、結果57の堅牢性と特異性を制限することができます。さらに、遺伝的相互作用は物理的相互作用を示すものではなく、2つの遺伝子の関係は間接的である可能性があります。相互作用の性質を調べ、非特定の相互作用を破棄すると、時間がかかる場合があります57、58、59。これは、画面設定と検証で対処する必要がある懸念事項です。例えば、遺伝子スクリーニングでヌル対立遺伝子を使用すると、これらの遺伝子が所定の生物学的プロセスにおいて同じまたは異なる経路で機能するかどうかを決定することができます。しかし、遺伝子機能の部分的な喪失を使用して、過敏性対立遺伝子、例えば温度感受性対立遺伝子、またはRNAi依存性の発現のダウンレギュレーションのような、遺伝子が同一または平行経路で作用するかに関係なく、表現型を悪化または緩和することができる残留活動をもたらす。したがって、相互作用の性質は、さらなる分析を必要とします。しかし、態下対立遺伝子およびRNAiを用いて、同一のタンパク質複合体または経路中の遺伝子、または冗長経路59内の遺伝子を含む幅広いインターアクターを同定することができた。この可能な相互作用のより大きな範囲は、遺伝的スクリーンでより多くのヒットをもたらすことができますが、プロテオスタシス崩壊45、53における温度感受性対立遺伝子の非特異的暴露のような非特異的な相互作用を招く可能性もあります。
ヒット検証と非特定の相互作用は、いくつかの方法で調べることができます。ヒット数は少ないはずです。例えば、 非-45 突然変異体の背景におけるシャペロン発現のダウンレギュレーションは、ヒットのわずかな割合(4%)をもたらし、ほとんどのシャペロン遺伝子のダウンレギュレーションは運動性に影響を示さなかった。DNJ-24Mが過剰発現した場合も同様の割合が認められた(6%)。上述したように、凝集しやすいタンパク質とのシャペロン相互作用の画面は、スクリーニングされた219の18のシャペロンを同定した(8%)。
いくつかの変異対立遺伝子、過剰発現線または疾患モデルを使用すべきである。シャペロン機能に異なる影響を与える異なる変異対立遺伝子の使用だけでなく、異なる遺伝的背景を有する異なる株は、任意のスクリーンヒットの特異性をサポートすることができます。あるいは、同様の摂動をもたたない異なるシャペロンの突然変異または過剰発現を使用することは、陰性対照として役立つ。例えば、unc-45(e286)およびunc-45(m94)は、sti-1、ahsa-1またはdaf-41がダウンレギュレーションされた場合、悪化する挙動を示した。 また、ahsa-1(ok3501)欠失変異体を持つ動物がhsp-90 RNAi25で処理された場合にも同様の相互作用が認められた。
シャペロンヒットのアイデンティティとその既知の相互作用を調べる必要があります。例えば、 非45 悪化画面で同定されたシャペロンは、クライアントリクルーター(STI-1)、改造コシャペロン(AHSA-1)、クライアント成熟コシャペロン(DAF-41)をコードするものなど、HSP-90 ATPaseサイクルに必要な非常に特異的なシャペロンのセットです。実際、このコシャペロンのセットは、完全なHSP-90折りたたみサイクル60を形成する。同様に、DNJ-24M画面はHSP-1、Hsp40s40の主要なシャペロンパートナーを識別しました。
動物の寿命にわたる相互作用の変化も調べるべきです。例えば、 非45 悪化スクリーンで同定されたシャペロンは、成人期の運動性およびミオシン組織に強く影響を与えたが、発達中に軽度の効果を有した。これは、成人期28 におけるプロテオスタシスネットワークの変化や、筋繊維の折りたたみとメンテナンスの間のミオシン折りたたみ要件の変化が原因である可能性があります。
相補的な生化学的アプローチを使用して、タンパク質間の相互作用と細胞内でのそれらの局在を直接調べます。例えば、HSP-90コシャペロンは、STI-1、AHSA-1およびDAF-41、それらがミオシン25と相互作用するサルコメアに局在する。
C.エレガンスは、品質管理を監視するための確立されたメタゾアンモデルです。細胞生物学、生化学的および遺伝的アプローチの可変ツールキットを使用して細胞および組織プロテオスタシスを監視するためによく使用されます。ここでは、変異バンクなどの遺伝子スクリーニングアプローチと利用可能なツール57,58,59,,RNAiライブラリー22,23及び組織特異的RNAi株41,42を用いて、発生および老化時の生きている動物におけるシャペロン相互作用をモニタリングする。運動性などの単純な行動アッセイを使用すると、多くの可能な遺伝子ペアの画面を簡素化し、新しい遺伝的相互作用を探求します。これは、生体内およびインビトロでの潜在的相互作用を機械的に研究するために生化学的ツールを使用してシャペロン局在化および物理的相互作用をさらに探求するプラットフォームとして役立ちます。ここで説明するプロトコルは、C. エレガンス体壁筋肉25,40における新規シャペロン相互作用を同定するために使用されています。
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Disclosures
著者らは開示するものは何もない。
Acknowledgments
私たちは、線虫株の一部のために、NIH国立研究資源センター(NCRR)が資金を提供するカエネルハブディティス遺伝学センターに感謝します。H.F. エプスタインによって開発されたモノクローナル抗体は、NICHDの後援の下で開発され、アイオワ大学生物学部によって維持された開発研究ハイブリドーマ銀行から得られました。本研究は、イスラエル科学財団(278/18)、イスラエル科学技術省、外務省、イタリア共和国国振興総局(助成金第3-14337)からの助成金によって支援されました。この原稿の作成に協力を寄せられるよう、Ben-Zvi研究室のメンバーに感謝します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12-well-plates | SPL | BA3D16B | |
| 40 mm plates | Greiner Bio-one | 627160 | |
| 60 mm plates | Greiner Bio-one | 628102 | |
| 6-well plates | Thermo Scientific | 140675 | |
| 96 well 2 mL 128.0/85mm | Greiner Bio-one | 780278 | |
| Agar | Formedium | AGA03 | |
| Ampicillin | Formedium | 69-52-3 | |
| bromophenol blue | Sigma | BO126-25G | |
| CaCl2 | Merck | 1.02382.0500 | |
| Camera | Qimaging | q30548 | |
| Cholesterol | Amresco | 0433-250G | |
| Confocal | Leica | DM5500 | |
| Filter (0.22 µm) | Sigma | SCGPUO2RE | |
| Fluorescent stereomicroscope | Leica | MZ165FC | |
| Glycerol | Frutarom | 2355519000024 | |
| IPTG | Formedium | 367-93-1 | |
| KCl | Merck | 104936 | |
| KH2PO4 | Merck | 1.04873.1000 | |
| KOH | Bio-Lab | 001649029100 | |
| MgSO4 | Fisher | 22189-08-8 | Gift from the Morimoto laboratory |
| Myosin MHC A (MYO-3) antibody | Hybridoma Bank | 5-6 | |
| Na2HPO4·7H2O | Sigma | s-0751 | |
| NaCl | Bio-Lab | 001903029100 | |
| Peptone | Merck | 61930705001730 | |
| Plate pouring pump | Integra | does it p920 | |
| RNAi Chaperone library | NA | NA | |
| SDS | VWR Life Science | 0837-500 | |
| ß-mercaptoethanol | Bio world | 41300000-1 | |
| stereomicroscope | Leica | MZ6 | |
| Tetracycline | Duchefa Biochemie | 64-75-5 | |
| Tris | Bio-Lab | 002009239100 | |
| Tween-20 | Fisher | BP337-500 |
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