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Biology

Utilizzo di Caenorhabditis elegans per lo screening delle interazioni chaperone tessuto-specifiche

Published: June 7, 2020 doi: 10.3791/61140
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Life Sciences, Ben-Gurion University of the Negev

Summary

Per studiare le interazioni chaperone-chaperone e chaperone-substrato, eseguiamo screening di interazione sintetica in Caenorhabditis elegans utilizzando l'interferenza dell'RNA in combinazione con mutazioni lievi o sovraespressione di chaperoni e monitoriamo la disfunzione proteica tessuto-specifica a livello di organismo.

Abstract

Il corretto ripiegamento e assemblaggio di proteine e complessi proteici sono essenziali per la funzione cellulare. Le cellule impiegano percorsi di controllo della qualità che correggono, sequestrano o eliminano le proteine danneggiate per mantenere un proteoma sano, garantendo così la proteostasi cellulare e prevenendo ulteriori danni alle proteine. A causa delle funzioni ridondanti all'interno della rete di proteostasi, lo screening per fenotipi rilevabili utilizzando knockdown o mutazioni in geni chaperone-encoding nell'organismo multicellulare Caenorhabditis elegans porta alla rilevazione di fenotipi minori o nulli nella maggior parte dei casi. Abbiamo sviluppato una strategia di screening mirata per identificare gli accompagnatori necessari per una funzione specifica e quindi colmare il divario tra fenotipo e funzione. In particolare, monitoriamo nuove interazioni chaperone utilizzando schermi di interazione sintetica RNAi, abbattendo l'espressione dell'accompagnatore, un accompagnatore alla volta, in animali portatori di una mutazione in un gene che codifica per l'accompagnatore o sovraesprimendo un accompagnatore di interesse. Interrompendo due chaperoni che individualmente non presentano fenotipo grossolano, possiamo identificare chaperoni che aggravano o espongono un fenotipo specifico quando entrambi sono perturbati. Dimostriamo che questo approccio può identificare insiemi specifici di chaperoni che funzionano insieme per modulare il ripiegamento di una proteina o di complessi proteici associati a un dato fenotipo.

Introduction

Le cellule affrontano il danno proteico impiegando macchinari di controllo qualità che riparano, sequestrano o rimuovono eventuali proteine danneggiate1,2. Il ripiegamento e l'assemblaggio di complessi proteici sono supportati da chaperoni molecolari, un gruppo eterogeneo di proteine altamente conservate che possono riparare o sequestrare le proteine danneggiate3,4,5,6,7. La rimozione delle proteine danneggiate è mediata dal sistema ubiquitina-proteasoma (UPS)8 o dal macchinario autofagico9 in collaborazione con gli accompagnatori10,11,12. L'omeostasi proteica (proteostasi) è, quindi, mantenuta da reti di controllo qualità composte da macchinari di piegatura e degradazione3,13. Tuttavia, comprendere le interazioni tra i vari componenti della rete di proteostasi in vivo è una sfida importante. Mentre gli schermi di interazione proteina-proteina contribuiscono con informazioni importanti sulle interazioni fisiche e sui complessi di chaperone14,15, manca la comprensione dell'organizzazione e dei meccanismi compensatori all'interno delle reti di chaperone tessuto-specifiche in vivo.

Le interazioni genetiche sono spesso utilizzate come un potente strumento per esaminare la relazione tra coppie di geni che sono coinvolti in percorsi biologici comuni o compensatori16,17,18. Tali relazioni possono essere misurate combinando coppie di mutazioni e quantificando l'impatto di una mutazione in un gene sulla gravità fenotipica causata da una mutazione nel secondo gene16. Mentre la maggior parte di tali combinazioni non mostra alcun effetto in termini di fenotipo, alcune interazioni genetiche possono aggravare o alleviare la gravità del fenotipo misurato. Mutazioni aggravanti si osservano quando il fenotipo del mutante a doppia delezione è più grave del fenotipo atteso visto combinando i mutanti a delezione singola, il che implica che i due geni funzionano in percorsi paralleli, influenzando insieme una data funzione. Al contrario, le mutazioni attenuanti si osservano quando il fenotipo del mutante a doppia delezione è meno grave del fenotipo osservato con i mutanti a delezione singola, il che implica che i due geni agiscono insieme come un complesso o partecipano alla stessa via16,18. Di conseguenza, diversi fenotipi che possono essere quantificati, compresi fenotipi ampi, come letalità, tassi di crescita e dimensioni della covata, nonché fenotipi specifici, come i reporter trascrizionali, sono stati utilizzati per identificare le interazioni genetiche. Ad esempio, Jonikas et al. si sono affidati a un reporter dello stress ER per esaminare le interazioni della rete di proteostasi della risposta proteica dispiegata saccharomyces cerevisiae ER utilizzando analisi di delezione genica a coppie19.

Gli screening di interazione genetica comportano l'incrocio sistematico di mutazioni di delezione a coppie per generare un set completo di doppi mutanti20. Tuttavia, nei modelli animali, e in particolare in C. elegans, questo approccio su larga scala non è fattibile. Invece, i ceppi mutanti possono essere testati per i loro modelli di interazione genetica regolando l'espressione genica utilizzando l'interferenza dell'RNA (RNAi)21. C. elegans è un potente sistema per schermi basato su RNAi22,23. In C. elegans, la consegna di RNA a doppio filamento (dsRNA) è ottenuta mediante alimentazione batterica, portando alla diffusione di molecole di dsRNA a numerosi tessuti. In questo modo, le molecole di dsRNA introdotte hanno un impatto sull'animale attraverso una procedura rapida e semplice21. Uno screening di interazione genetica che utilizza RNAi può, quindi, rivelare l'impatto della down-regolazione di un insieme di geni o della maggior parte dei geni codificanti C. elegans utilizzando le librerie RNAi24. In tale schermo, i colpi che influenzano il comportamento del mutante di interesse ma non il ceppo wild type sono potenziali modificatori del fenotipo monitorato25. Qui, applichiamo una combinazione di mutazioni e screening RNAi per mappare sistematicamente le interazioni chaperone tessuto-specifiche in C. elegans.

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Protocol

1. Preparazione di piastre di crescita di nematodi per RNAi

  1. In una bottiglia da 1 L aggiungere 3 g di NaCl, 2,5 g di Bacto-Peptone, 17 g di agar e acqua distillata fino a 1 L e autoclave.
  2. Raffreddare la bottiglia a 55 °C.
  3. Aggiungere 25 mL di 1 M KH2PO4,pH 6,0, 1 mL di 1 M CaCl2,1 mL di 1 M MgSO4e 1 mL di soluzione di colesterolo(Tabella 1)per produrre mezzi di crescita nematodi (NGM).
  4. Aggiungere 1 mL di ampicillina (100 mg/mL) e 0,5 mL di 1 M IPTG(Tabella 1)per produrre la soluzione di NGM-RNAi.
    NOTA: I batteri HT115 (DE3) E. coli comunemente usati contengono una DNA polimerasi T7 inducibile da IPTG utilizzata per esprimere i plasmidi che codificano per il dsRNA. Questi plasmidi codificano anche per la resistenza all'ampicillina.
  5. Mescolare la soluzione calda facendo roteare la bottiglia.
  6. Nel cappuccio o utilizzando procedure sterili, versare la soluzione NGM in piastre o utilizzando una pompa peristaltica, erogare la soluzione in piastre. Utilizzare piastre a 6 pozzi, 12 pozzi, 40 mm o 60 mm per questo schermo. Agar dovrebbe riempire circa 2/3 della profondità della piastra.
  7. Lasciare asciugare le piastre per una notte sul banco a temperatura ambiente, mantenendo le piastre coperte. Le piastre NGM per RNAi possono essere conservate a 4 °C per un massimo di un mese.

2. Crescita dei batteri RNAi e semina delle piastre

  1. Nel cappuccio o utilizzando procedure sterili, aggiungere 1 mL di ampicillina (100 mg/mL) e 2,5 mL di tetraciclina (5 mg/mL) (Tabella 1) a una soluzione e miscela pre-autoclavata da 1 L di LB.
    NOTA: I batteri HT115 (DE3) E. coli comunemente usati sono resistenti alle tetracicline.
  2. Nel cappuccio o utilizzando procedure sterili, aggiungere 600 μL di soluzione LB a ciascun pozzo in piastre sterili da 96 pozzi profonde 2 mL. È meglio usare un pipetto multicanale per erogare il supporto.
  3. Utilizzando procedure sterili, inoculare pozzi con batteri HT115 (DE3) E. coli trasformati con un plasmide che codifica per il dsRNA che prende di mira un gene di interesse o un plasmide vuoto, come controllo. Coprire le piastre e incubare a 37 °C durante la notte. Le librerie costituite da cloni batterici che esprimono dsRNA, corrispondenti a circa il 94% dei geni previsti di C. elegans, sono state precedentemente costruite22,23 e sono disponibili in commercio. La biblioteca di accompagnatori utilizzata qui è stata costruita dal laboratorio del Dr. Richard Morimoto26.
  4. Utilizzando procedure sterili, seminare 75, 150 o 250 μL di batteri sulle piastre NGM RNAi a 12 pozzi, 40 mm e 6 o 60 mm, rispettivamente. Contrassegnare chiaramente il nome del gene bersaglio sulla piastra. I batteri dovrebbero coprire il 30-50% della superficie dell'agar e non dovrebbero toccare i bordi della piastra.
  5. Lasciare asciugare le piastre per almeno 2 giorni sul banco a temperatura ambiente, mantenendo le piastre coperte.
    NOTA: le piastre possono essere incubate a 37 °C durante la notte. Assicurarsi che i pozzi interni siano asciutti prima di utilizzare o conservare le piastre. Per tutti gli scopi a lungo termine (ad es. essiccazione o conservazione) tenere le piastre al buio. I piatti essiccati con semi possono essere conservati a 4 °C per un massimo di un mese.

3. Sincronizzazione non stressante degli embrioni

  1. Usa un worm pick per spostare circa 100 uova da una piastra worm non sincronizzata a una piastra NGM appena seminata.
  2. Coltivare animali per 5 giorni a 15 °C, 3,5 giorni a 20 °C o 2,5 giorni a 25 °C. Gli animali dovrebbero raggiungere il primo giorno di deposizione delle uova.
    NOTA: I vermi sono comunemente coltivati a 20 °C. Tuttavia, diversi ceppi mutanti di chaperone possono richiedere temperature di coltivazione specifiche. Ad esempio, molti ceppi sensibili alla temperatura vengono coltivati a 15 °C ma spostati a 25 °C per esporre il loro fenotipo.
  3. Aggiungere 1 mL di tampone M9 (Tabella 1) lentamente e lontano dal prato batterico. Ruotare la piastra in modo che il buffer copra completamente la piastra. Quindi inclinarlo da un lato e rimuovere il liquido dalla piastra e lavare gli animali dal piatto.
    NOTA: Quando si utilizzano animali sensibili alla temperatura o mutanti chaperone, è meglio mantenere i buffer utilizzati nel protocollo alla temperatura di coltivazione degli animali.
  4. Ripetere il passaggio 3.3 tre volte o fino a quando tutti gli animali non vengono lavati via dal piatto.
  5. Usando una punta di plastica standard, tagliare un quadrato di agar dal piatto lavato dove sono concentrate le uova e posizionare il pezzo di agar su un piatto NGM appena seminato.
    NOTA: sono necessarie ~ 200 uova per produrre abbastanza animali che depongono le uova; troppi animali consumano i batteri troppo rapidamente. Bassi livelli di cibo possono avere un impatto sulla proteostasi27.
  6. Coltivare gli animali per 5 giorni a 15 °C, 3,5 giorni a 20 °C o 2,5 giorni a 25 °C. A questo punto, le piastre dovrebbero essere coperte con uova sincronizzate.
    NOTA: gli animali possono essere spostati su una nuova piastra per una breve durata per una sincronizzazione più rigorosa. Tuttavia, è importante utilizzare solo gli adulti nelle prime fasi della deposizione delle uova poiché gli animali possono trattenere le uova nel loro utero influenzando la sincronizzazione.
  7. Aggiungere 1 mL di tampone M9 lentamente e lontano dal prato batterico.
  8. Ruotare la piastra in modo che il buffer copra completamente la piastra. Quindi inclinarlo da un lato e rimuovere il liquido dalla piastra e lavare gli animali dal piatto.
  9. Ripetere il passaggio 3.7 tre volte o fino a quando tutti gli animali non vengono lavati via dal piatto.
  10. Aggiungere 1 mL di tampone M9 e utilizzare un raschietto cellulare per rilasciare le uova dalla piastra.
  11. Raccogliere il tampone M9 contenente le uova dalle piastre.
  12. Centrifugare il tampone M9 contenente le uova a 3.000 x g per 2 min.
  13. Rimuovere il surnatante e aggiungere il tampone M9 per raggiungere un volume di 1 ml.
  14. Risuscindi le uova per interrompere eventuali pezzi di uova e batteri.
  15. Ripetere la procedura di lavaggio descritta nei passaggi 3.11-3.13 cinque volte. Il pellet d'uovo dovrebbe apparire bianco. Se è ancora giallo/marrone, ripetere il lavaggio fino a ottenere un pellet bianco.
    NOTA: i batteri che rimangono sulle uova possono contaminare i batteri che esprimono dsRNA.
  16. Rimuovere la maggior parte del surnatante, lasciando circa 200 μL. Le uova sincronizzate possono essere utilizzate per gli schermi RNAi.

4. Saggi fenotipici comuni

  1. Coltivazione di animali durante gli esperimenti
    1. Metti una goccia di ~ 30 uova vicino al prato batterico in ogni piatto con semi di RNAi. Per riferimento, posizionare anche ~ 30 uova su piastre seminate con batteri vuoti contenenti vettori (L4440).
    2. Coltivare animali sincronizzati con l'età su piastre con semi NGM RNAi. La durata dell'esperimento dipenderà dalla fase in cui gli animali devono essere monitorati e dalla temperatura di coltivazione. Regolare la temperatura di coltivazione quando si utilizzano animali mutanti sensibili alla temperatura. Regolare la durata della coltivazione quando si utilizzano animali mutanti ritardati nello sviluppo.
      NOTA: Mentre i tempi possono variare, una volta che gli animali raggiungono l'età adulta, la deposizione delle uova (e il conseguente rapido consumo di cibo), così come la proteostosi dipendente dall'età collassano28, potrebbero influire sui risultati. Si raccomanda quindi di segnare gli animali prima dell'inizio della deposizione delle uova (giorno 1 dell'età adulta). Gli animali selvatici raggiungono questo stadio dopo 4,5 giorni a 15 °C, 3 giorni a 20 °C o 2 giorni a 25 °C.
    3. Il numero di ripetizioni utilizzate dipenderà dalle dimensioni del set di geni esaminato. Per la libreria di chaperone (97 geni), ripetere gli esperimenti almeno quattro volte. La dimensione della popolazione dipende dal test utilizzato. Nei saggi comportamentali discussi qui, il punteggio >15 animali per condizione sperimentale in ogni ripetizione. Anche i dati e le analisi statistiche dipendono fortemente dal tipo di test utilizzato. I dati nei saggi discussi qui possono essere presentati come mezzi ± SEM.
    4. Confronta gli animali trattati con controllo RNAi e vettori vuoti come popolazioni indipendenti. I valori P possono essere calcolati utilizzando ANOVA unidire o bidirezionale, a seconda delle modifiche esaminate, vale a dire aggravando o alleviando da soli o entrambi. Quando si esamina un singolo trattamento RNAi rispetto al controllo, i valori P possono essere calcolati utilizzando il test della somma di rango di Mann-Whitney unidirezionale o bidirezionale. Oltre alla significatività statistica, considerare una soglia per gli hit in base al grado di impatto sul fenotipo.
  2. Arresto/ritardo dello sviluppo
    1. Coltivare animali sincronizzati con l'età come nel passaggio 4.1 fino a quando gli animali cresciuti su batteri di controllo contenenti vettori vuoti raggiungono l'età adulta, ma prima che inizi la deposizione delle uova.
    2. Monitora gli animali usando uno stereomicroscopio e conta il numero di larve e adulti per segnare la percentuale di animali ritardati nello sviluppo. Per riferimento, confronta con animali mutanti cresciuti su batteri di controllo contenenti vettori vuoti. Il trattamento con hsp-1 o hsp-90 RNAi provoca l'arresto dello sviluppo di animali selvatici e può essere utilizzato come controllo positivo.
    3. Per segnare la percentuale di animali ritardati nello sviluppo nel tempo, ripetere il passaggio 4.2.2.
      NOTA: Se ci sono adulti che depongono le uova sulla piastra, trasferire gli animali ritardati nello sviluppo in una nuova piastra NGM-RNAi etichettata per lo stesso gene bersaglio per evitare confusione con la progenie.
  3. Sterilità o difetti di deposizione delle uova
    1. Coltiva animali sincronizzati con l'età come nel passaggio 4.1 fino a quando gli animali cresciuti su batteri vuoti di controllo vettoriale iniziano a deportare le uova.
    2. Monitora gli animali usando uno stereomicroscopio e segna la percentuale di animali senza uova visibili nel loro utero. Per riferimento, confronta con animali mutanti cresciuti su batteri vuoti di controllo vettoriale.
    3. In alternativa, monitorare gli animali utilizzando uno stereomicroscopio e segnare la percentuale di animali con un utero pieno di uova, definito come EGg Laying defective (Egl-d) fenotipo29.
  4. Letalità embrionale
    1. Coltiva animali sincronizzati con l'età come nel passaggio 4.1 fino a quando gli animali iniziano a deportare le uova.
    2. Trasferire ~ 100 uova in un piatto vuoto. Distribuire le uova in file per semplificare il conteggio.
    3. Segna la percentuale di uova non schifate sul piatto dopo 24-48 ore. Per riferimento, confrontare con uova di animali trattati con batteri vuoti di controllo del vettore.
  5. Test di paralisi
    1. Per gli adulti del giorno 1, coltiva animali sincronizzati con l'età come nel passaggio 4.1 fino a quando gli animali cresciuti su batteri vuoti di controllo del vettore raggiungono l'età adulta, ma prima che inizi la deposizione delle uova.
    2. Disegna una linea sul retro di una normale piastra di agar NGM usando un pennarello fine.
    3. Posiziona 5-10 animali sulla linea segnata.
    4. Imposta un timer e attendi 10 minuti.
    5. Segna la percentuale di animali rimasti sulla linea come vermi paralizzati. Per riferimento, confronta con animali mutanti cresciuti su batteri vuoti di controllo vettoriale. Gli animali selvatici trattati con unc-45 RNAi mostrano fenotipo di paralisi grave e possono essere usati come controllo positivo.
      NOTA: Questo test evidenzia gli animali che mostrano paralisi da media a grave. Tali animali di solito giacciono dritti sul piatto, piuttosto che presentare la forma curva comune. Inoltre, una macchia ripulita dai batteri è visibile intorno alle teste dei vermi paralizzati.
  6. Test di thrashing
    1. Coltivare animali sincronizzati con l'età come nel passaggio 4.1 fino a quando gli animali cresciuti su batteri vuoti di controllo del vettore raggiungono l'età adulta, ma prima che inizi la deposizione delle uova.
    2. Pipettare 100 μL di tampone M9 alla temperatura di coltivazione degli animali in una piastra a 96 pozzetti.
    3. Posizionare ~ 15 vermi, uno per pozzo, nei pozzi contenenti tampone M9.
    4. Lasciare che gli animali si adattino per 5 minuti.
    5. Esamina ogni animale sotto lo stereomicroscopio, avvia un timer che conta 15 s e conta il numero di curve del corpo che ogni animale esegue in quel lasso di tempo. I valori contati possono essere normalizzati in curve del corpo al minuto. Per riferimento, confronta con animali mutanti cresciuti su batteri vuoti di controllo vettoriale.
      NOTA: Questo test di motilità è molto sensibile e può rilevare differenze molto lievi tra i trattamenti. Tuttavia, la motilità nel liquido e la motilità sull'agar possono differire.

5. Validazione del knockdown proteico

  1. Posizionare 250-300 uova sincronizzate su una piastra NGM-RNAi da 60 mm seminata con i relativi batteri che esprimono dsRNA o contenenti vettori vuoti (L4440).
    NOTA: l'abbattimento dell'RNAi potrebbe comportare un accumulo aberrante di embrioni, una mancanza di embrioni o un arresto dello sviluppo che potrebbe influire sull'espressione genica. Questo dovrebbe essere considerato quando si determina l'età degli animali da esaminare.
  2. Per gli adulti del giorno 1, coltivare animali per 4,5 giorni a 15 °C, 3 giorni a 20 °C o 2 giorni a 25 °C.
  3. Raccogliere e trasferire un totale di 200 giovani animali adulti nel cappuccio di un riempimento del tubo da 1,5 ml con 200 μL di PBS-T.
    NOTA: Quando si utilizzano animali sensibili alla temperatura o mutanti chaperone, è meglio mantenere i buffer utilizzati nel protocollo alla temperatura di coltivazione degli animali.
  4. Chiudere il tappo con attenzione e centrifugare a 1.000 x g per 1 minuto.
  5. Aggiungere 800 μL di PBS-T (Tabella 1) e centrifugare a 1.000 x g per 1 min.
  6. Rimuovere con attenzione i primi 900 μL.
  7. Ripetere i passaggi 5.4-5.6 tre volte.
  8. Rimuovere 900 μL, lasciando 100 μL di soluzione contenente i 200 vermi.
  9. Aggiungere 25 μL di 5x buffer campione (Tabella 1).
  10. Riscaldare i campioni per 10 minuti a 92°C agitando a 1000 giri/min. I campioni possono quindi essere congelati e conservati a -20 °C.
  11. Caricare 20 μL di ciascun campione ed eseguire su un gel SDS-PAGE.
  12. Eseguire l'analisi western blot utilizzando anticorpi appropriati per determinare la stabilità relativa della proteina.
  13. Determinare l'intensità delle bande utilizzando un software densitometrico, come il modulo gel ImageJ disponibile gratuitamente. Normalizzare tutti i valori a quelli misurati nei campioni di controllo.
    NOTA: Lo scopo del knockdown RNAi nei nostri schermi è quello di abbassare i livelli proteici di uno specifico chaperone / co-chaperone. Pertanto, il modo migliore per valutare l'efficienza del knockdown RNAi è l'analisi western blot. Ciò richiede anticorpi specifici. In alternativa, la qPCR può essere utilizzata per quantificare i livelli di mRNA.

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Representative Results

Utilizzo di mutazioni sensibili alla temperatura in UNC-45 per lo screening delle interazioni aggravanti o attenuanti in condizioni permissive o restrittive, rispettivamente
L'assemblaggio e la manutenzione muscolare offrono un sistema efficace per studiare le interazioni chaperone tessuto-specifiche. L'unità funzionale dei muscoli contrattili, il sarcomero, presenta una disposizione cristallina di proteine strutturali e regolatrici. La stabilità della proteina motoria miosina e la sua incorporazione nei filamenti spessi dei sarcomeri muscolari contrattili dipende dalla cooperazione di chaperoni e componenti UPS30. Un esempio di uno di questi chaperone è il miosina chaperone UNC-45 conservato e specializzato che è espresso principalmente nel muscolo della parete corporea31,32,33,34,35. È stato dimostrato che le mutazioni in UNC-45 inducono la disorganizzazione della miosina e gravi difetti della motilità in C. elegans31,36. I moduli tandem UNC-45 si assemblano in una piattaforma di attracco multi-sito37 che impone la collaborazione tra UNC-45, HSP-90 e HSP-1 e probabilmente altri chaperoni e co-chaperoni nell'assemblaggio del filamento di miosina25,36,37,38. Per confermare le interazioni note di UNC-45 e identificare nuove interazioni genetiche nella proteostasi muscolare, abbiamo stabilito una strategia utilizzando le mutazioni unc-45 sensibili alla temperatura di C. elegans come background genetico sensibilizzato per lo screening dell'interazione chaperone tessuto-specifica19,25.

Sostituzioni di singoli amminoacidi in C. elegans UNC-45 (L822F ed E781K, corrispondenti rispettivamente agli alleli e286 e m94; unc-45(ts)) sono responsabili dei difetti di motilità dipendenti dalla temperatura e dei fenotipi di disorganizzazione della miosina quando gli animali affetti sono allevati in condizioni restrittive (>22 °C). Al contrario, questi mutanti unc-45 (ts) non mostrano difetti di movimento o di organizzazione della miosina alla temperatura permissiva (15 ° C)31. Nell'approccio proposto, gli animali unc-45(e286) sincronizzati per età al primo stadio larvale (L1) sono stati impoveriti di diversi chaperoni molecolari da RNAi (97 geni) e quindi monitorati per difetti di motilità in condizioni permissive (15 °C) (Figura 1). Abbiamo confermato l'interazione nota delle proteine UNC-45 e HSP-90 nel nostro screening delle interazioni genetiche e identificato tre co-chaperoni hsp-90, sti-1, ahsa-1 e daf-41, come specificamente causa di un difetto di movimento sintetico negli animali mutanti unc-45 (ts) ma non negli animali selvatici25. Abbiamo continuato esaminando se i fenotipi sintetici associati a sti-1-, ahsa-1- o daf-41-fossero causati dalla disorganizzazione della miosina monitorando la disposizione subcellulare della catena pesante della miosina A (MYO-3), utilizzando tecniche di immuno-colorazione stabilite39. Mentre il trattamento di animali selvatici con sti-1, ahsa-1 o daf-41 RNAi non ha influenzato l'organizzazione del miofilamento, l'esaurimento di questi geni negli animali mutanti unc-45 (e286) ha provocato la completa interruzione delle strutture sarcomeriche e la mislocalizzazione di MYO-3, anche in condizioni permissive (15 ° C). Questo effetto è stato paragonabile a quello osservato con unc-45(e286) mutanti singoli cresciuti alla temperatura restrittiva (25 °C)25. Questi risultati sono stati confermati utilizzando un altro allele unc-45(ts),vale a dire unc-45(m94) animali mutanti25.

Per identificare gli accompagnatori che destabilizzano l'UNC-45, abbiamo poi esaminato gli accompagnatori che hanno migliorato la motilità degli animali unc-45 (286) a 25 ° C, basandosi sull'abbattimento genico da parte dell'RNAi. Mentre gli animali mutanti unc-45(e286) mostravano gravi difetti di movimento a 25 °C, la motilità degli animali trattati con RNAi contro i geni che codificano quattro dei 97 chaperoni sottoposti a screening è stata significativamente migliorata. Anche in questo caso, i risultati sono stati confermati utilizzando animali mutanti unc-45 (m94). Pertanto, l'uso di mutazioni sensibili alla temperatura consente di stabilire sia schermi aggravanti che allevianti, a seconda della temperatura alla quale viene condotto lo schermo.

Utilizzo di sovraespressione tessuto-specifica di un accompagnatore per lo screening delle interazioni aggravanti
Successivamente abbiamo utilizzato la sovraespressione tessuto-specifica di un singolo chaperone come una lieve perturbazione della rete di chaperone muscolare a scopo di screening. In particolare, abbiamo utilizzato animali che sovra-esprimono il tipo selvatico dnj-24, codificando l'omologo C. elegans della proteina Hsp40 DNAJB6 nel muscolo della parete corporea di C. elegans (DNJ-24M). Come sopra, gli animali L1 DNJ-24M sono stati trattati con RNAi per diversi accompagnatori e monitorati per difetti di motilità (20 °C) (Figura 1). Mentre gli animali DNJ-24M non hanno mostrato difetti di motilità degni di nota, tre geni (dei 48 geni chaperone-encoding esaminati; 6%), vale a dire hsp-1, rme-8e dnj-8, hanno influenzato in particolare la motilità degli animali che esprimono DNJ-24M ma non degli animali selvatici. È da notare che testare la specificità dei colpi usando animali che sovra-esprimono un chaperone diverso, vale a dire HSP-90, nel muscolo (HSP90M), non ha mostrato alcun effetto sulla motilità HSP90M sul trattamento hsp-1, rme-8o dnj-8 RNAi40. Nel complesso, la piattaforma di screening, impiegando lievi perturbamenti alla rete di chaperoni, come l'espressione di proteine mutanti metastabili o la sovraespressione tessuto-specifica, ha determinato un tasso di hit altamente specifico (normalmente ~ 5%).

Utilizzo di RNAi tessuto-specifico per lo screening delle interazioni genetiche tessuto-specifiche
I ceppi sensibili all'RNAi specifici per i tessuti consentono l'abbattimento dei geni specifici del tessuto mentre utilizzano ancora l'alimentazione batterica per la consegna del dsRNA. Questi ceppi sono mutanti per la proteina argonauta RDE-1, un componente importante nella via RNAi necessaria per un efficace silenziamentogenico 21. Tuttavia, l'espressione di RDE-1 di tipo selvaggio sotto il controllo di un promotore tessuto-specifico ha portato a un efficace abbattimento del gene tessuto-specifico41,42. Questo strumento consente quindi screening di interazione genetica senza l'utilizzo di chaperoni tessuto-specifici, come UNC-45 o DNAJ-24M. Ad esempio, l'abbattimento di hsp-6 (mortalina) negli animali selvatici durante lo sviluppo ha provocato un forte arresto dello sviluppo (96±1% degli animali trattati con RNAi). Allo stesso tempo, il knockdown di hsp-6 in un ceppo che esprime rde-1 di tipo selvaggio nel muscolo non ha causato l'arresto dello sviluppo, mentre l'espressione di RDE-1 di tipo selvaggio nelle cellule intestinali ha provocato un forte fenotipo di arresto dello sviluppo (90±3%; Figura 2). Pertanto, la funzione HSP-6 nelle cellule intestinali è necessaria per il normale sviluppo. Una mutazione in hsp-6 (mg585) che causa un lieve ritardo della crescita può, quindi, essere utilizzata per lo screening per aggravare o alleviare le interazioni chaperone incrociando quel gene mutato in un ceppo RNAi intestinale specifico e lo screening della libreria RNAi chaperone.

Monitoraggio dei cambiamenti dipendenti dall'età nell'ambiente di ripiegamento utilizzando interazioni genetiche
Gli animali mostrano un declino della motilità dipendente dall'età che è associato alla disorganizzazione sarcomerica43,44,45. I cambiamenti nella capacità di ripiegamento delle proteine coincidono con l'alterazione della regolazione e della composizione del meccanismo di proteostasi cellulare28, compresi i livelli alterati di UNC-45, CHN-1 e UFD-2, proteine del meccanismo di controllo della qualità muscolare46. D'accordo, il ripiegamento e la degradazione della miosina sono influenzati da alterazioni della capacità proteostatica al passaggio all'età adulta47. Pertanto, abbiamo chiesto se tali cambiamenti potrebbero avere un impatto sulle interazioni con gli accompagnatori. Ad esempio, abbiamo monitorato l'impatto del knockdown di sti-1, ahsa-1 e daf-41 sulla motilità nel tempo. Abbiamo scoperto che sebbene gli animali trattati con sti-1 -, ahsa-1- e daf-41-RNAi mostravano una ridotta motilità durante lo sviluppo larvale, la motilità diminuiva fortemente nei vermi adulti unc-45 (ts). Inoltre, l'organizzazione myo-3 in animali mutanti unc-45 (ts) trattati con sti-1, ahsa-1 o daf-41 RNAi era simile a quella dei vermi selvatici al quarto stadio larvale (L4), sebbene i mutanti mostravano sarcomeri interrotti dopo che gli animali raggiunsero l'età adulta (Figura 3). Al contrario, sia gli animali mutanti unc-45 (ts) trattati con un controllo vettoriale vuoto che gli animali selvatici sono rimasti inalterati (Figura 3). Pertanto, le dinamiche della proteostasi in funzione dell'età o delle condizioni ambientali27,45,46,48,49 potrebbero avere un impatto critico sulle interazioni dello chaperone.

Figure 1
Figura 1: Configurazione di schermi di interazione sintetica RNAi utilizzando C. elegans portatore di una mutazione in un gene che codifica per un chaperone di interesse. (A) Rappresentazione schematica della configurazione di base delle schermate di interazione chaperone mirate. (B) La convalida dell'hit richiede la conferma dell'interazione genetica utilizzando un altro mutante chaperone, nonché la convalida della specifica del knockdown dell'RNAi. (C-D) Semplici correzioni, come i difetti di motilità, possono essere quantificate per determinare interazioni aggravanti o allevianti, utilizzando rispettivamente saggi di paralisi o thrashing. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2: L'RNAi tessuto-specifico dello chaperone mitocondriale hsp-6 può essere utilizzato per esaminare le interazioni genetiche in un tessuto. I ceppi di RNAi intestinali e muscolari di tipo selvaggio sono stati trattati con hsp-6 RNAi e(A)è stato segnato un ritardo dello sviluppo o(B)sono state scattate immagini il primo giorno dell'età adulta. I dati sono ± SEM, N=6. La barra della scala è di 1 mm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3: Effetti dipendenti dall'età dell'RNAi. (A) Motilità con l'età. Embrioni di tipo selvatico o unc-45(e286) sono stati posti su piastre con semi di RNAi sti-1, ahsa-1 o daf-41 a 15 °C e valutati per la motilità utilizzando un test di thrashing in ogni fase dello sviluppo, L1-L4, giovane adulto e giorno 1 dell'età adulta. I dati sono ± SEM, N=15. (B) Immagini confocali del muscolo della parete corporea. Gli animali sono stati trattati come in A e fissati agli stadi L4, giovane adulto e giorno 1 dell'età adulta e immuno-colorati con anticorpi anti-MYO-3. La barra della scala è di 10 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Soluzione Istruzioni per la preparazione Immagazzinamento
1 M CaCl2 (1 L) Aggiungere 147.01 g CaCl2·2H2O Negozio presso RT
Aggiungere dH2O a 1 L
Autoclave o filtro (0,22 μm)
1 M KH2PO4, pH 6.0 (1 L) Aggiungere 136,09 g KH2PO4 Negozio presso RT
Aggiungere 800 mL dH2O
Mescolare con agitatore magnetico fino a quando non si scioglie
Titolare pH con KOH
Aggiungere dH2O a 1 L
Autoclave o filtro (0,22 μm)
1 M MgSO4 (1 L) Aggiungere 248.58 g MgSO4·7H2O Negozio presso RT
Aggiungere dH2O a 1 L
Autoclave o filtro (0,22 μm)
Soluzione di colesterolo (50 ml) Aggiungere 250 mg di colesterolo a un tubo Falcon da 50 ml Conservare a -20 °C
Sciogliere completamente in 40 ml di etanolo
Aggiungere etanolo a 50 ml
1 M IPTG (50 mL) Aggiungere 11,9 g di IPTG (isopropil-β-D-tiogalattosiranoside) a un tubo Falcon da 50 ml Conservare al buio a -20 °C
Sciogliere completamente in 40 mL dH2O
Aggiungere dH2O a 50 mL
Filtro (0,22 μm), aliquote 1mL tubi
Brodo di ampicillina (50 ml) Aggiungere 5 g di ampicillina a un tubo Falcon da 50 ml Conservare a -20 °C
Sciogliere completamente in 40 mL dH2O
Aggiungere dH2O a 50 mL
Filtro (0,22 μm), distribuire 1 mL di aliquota in tubi Eppendorf
Stock di tetracicline (50 ml) Aggiungere 250 mg di tetraciclina a un tubo Falcon da 50 ml Conservare a -20 °C
Sciogliere completamente in 40 ml di etanolo
Aggiungere etanolo a 50 ml
Aliquot 1 mL tubi
Tampone M9 (1 L) Aggiungere 5.8 g Na2HPO4·7H2O Negozio presso RT
Aggiungere 3 g kh2PO4
Aggiungere 5 g nacl
Aggiungere 0,25 g MgSO4·7H2O
Aggiungere dH2O a 1 L
Filtro (0,22 μm)
1X PBS-T (pH 7,4) ( 1 L) Aggiungere 8 g di NaCl Negozio presso RT
Aggiungere 200 mg di KCl
Aggiungere 1,44 g Na2HPO4·7H2O
Aggiungere 240 mg KH2PO4
Sciogliere completamente in 800 mL dH2O
Titolare pH con KOH tp pH 7.4
Aggiungere 500 μL Tween-20
Aggiungere dH2O a 1 L
5x buffer di campionamento Aggiungere 6,8 mL dH2O Conservare a -20 °C
Aggiungere 2 mL 0.5M Tris pH 6.8
Aggiungere 3,2 ml di glicerolo
Aggiungi 1,6 ml 20% SDS
Aggiungere 0,8 ml di ß-mercaptoetanolo
1% blu bromofenolo

Tabella 1: Ricette di soluzioni

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Discussion

Rimane carente un quadro integrato della rete di proteostasi che rifletta come è organizzata e funziona in diverse cellule e tessuti metazoici. Per affrontare questa carenza, sono necessarie informazioni specifiche sulle interazioni di vari componenti di questa rete, come gli accompagnatori molecolari, in tessuti specifici durante il corso dello sviluppo e dell'invecchiamento. Qui, abbiamo mostrato come l'uso di perturbazioni tessuto-specifiche ci ha permesso di esaminare la rete di chaperone in un determinato tessuto. Per esplorare le interazioni genetiche dell'accompagnatore tessuto-specifico, sono stati presi in considerazione tre diversi approcci. Nel primo approccio, UNC-45, un chaperone che è altamente espresso nelle cellule muscolari, è stato utilizzato per lo screening delle interazioni chaperone tramite alimentazione-RNAi25. Mentre l'uso di un chaperone specializzato consente di discernere la specificità dei tessuti, può solo riferire su quella sotto-rete altamente focalizzata a cui contribuisce. Si noti che la maggior parte dei neuroni di C. elegans sono resistenti alla consegna RNAi50 basata sull'alimentazione e quindi l'utilizzo di questo approccio per identificare le interazioni genetiche nelle cellule neuronali richiede l'incrocio dello chaperone mutante esaminato con un ceppo51potenziato da RNAi. In un secondo approccio, un promotore tessuto-specifico è stato utilizzato per guidare la sovraespressione di un chaperone nel muscolo e quindi influenzare specificamente l'ambiente di piegatura muscolare40. Tuttavia, l'eccessiva espressione di un singolo accompagnatore potrebbe essere generalmente vantaggiosa per l'ambiente pieghevole e quindi mascherare l'interruzione causata dai due accompagnatori insieme. Il terzo approccio si basava sul knockdown RNAi tessuto-specifico per esaminare le interazioni dello chaperone in un dato tessuto41. Un vantaggio di questo approccio è che consente di colpire le cellule neuronali resistenti alla consegna di RNAi tramite l'alimentazione42. Tuttavia, questo approccio richiede l'uso di un mutante lieve (anche se non specializzato), così come che questo mutante sia incrociato in un mutante nullo rde-1 che trasporta un gene di salvataggio rde-1 specifico del tessuto. È importante sottolineare che questi approcci possono essere combinati in modo da modulare potenzialmente la funzione dell'chaperone in un singolo tessuto o anche in una singola cellula.

Il macchinario per il controllo della qualità può influire sulla funzione di molti prodotti genici perturbando la proteostasi. Questa è una grande sfida quando si utilizzano le interazioni genetiche per esplorare la rete di controllo della qualità18. Ad esempio, l'espressione cronica di proteine inclini all'aggregazione o il collasso della proteostasi nell'invecchiamento hanno provocato un aggravamento fenotipico di molte proteine metastabili non correlate in C. elegans e lievito45,52,53. Inoltre, l'endocitosi mediata dalla clatrina nelle cellule di mammifero è stata inibita dal sequestro funzionale di Hsc70 agli aggregati proteici. Tuttavia, è stato dimostrato che l'endocitosi potrebbe essere salvata dalla sovraespressione di Hsc70, mentre l'aggregazione non potrebbe54,55. Allo stesso modo, uno screening genetico in Drosophila progettato per scoprire i regolatori della risposta allo shock termico ha identificato una mutazione missenso nell'actina muscolare di volo che ha attivato costitutivamente la risposta allo shock termico56. Nel loro insieme, la perturbazione della rete di proteostasi può esporre proteine metastabili o indurre stress che possono influire sulla specificità del risultato. Tuttavia, l'analisi delle interazioni genetiche può fornire informazioni altamente specifiche e funzionali. Ad esempio, le analisi epistatiche dei geni del lievito necessari per il ripiegamento nel reticolo endoplasmatico hanno identificato specifiche interazioni genetiche tra chaperoni molecolari che sono state successivamente convalidate19. Allo stesso modo, uno screening aggravante per chaperoni che aumentano la tossicità di due modelli inclini all'aggregazione (misurati dalla motilità) ha identificato un sottoinsieme specifico di 18 chaperoni, ortologhi dei quali ha avuto un impatto sull'aggregazione di Huntingtina nelle cellule umane26. Qui, abbiamo dimostrato che varie perturbazioni della rete di proteostasi possono scoprire interazioni chaperone specifiche e funzionali.

Il vantaggio principale dell'utilizzo di screening di interazione genetica basati sull'alimentazione RNAi è la relativa semplicità del metodo. Anche impiegando un output comportamentale generale, come la motilità, può rivelare nuove interazioni genetiche (Figura 3). Tuttavia, la variabilità e gli effetti parziali dell'abbattimento dell'espressione possono limitare la robustezza e la specificità dei risultati57. Inoltre, le interazioni genetiche non sono indicative di interazioni fisiche e la relazione tra due geni potrebbe quindi essere indiretta. Esplorare la natura delle interazioni e scartare le interazioni non specifiche può richiedere molto tempo57,58,59. Questa è una preoccupazione che deve essere affrontata nella configurazione e nella convalida dello schermo. Ad esempio, l'uso di alleli nulli nello screening genetico consente di determinare se questi geni funzionano nello stesso o in percorsi distinti in un determinato processo biologico. Tuttavia, utilizzando la perdita parziale della funzione genica, gli alleli ipomorfici, come gli alleli sensibili alla temperatura o la down-regolazione dell'espressione RNAi-dipendente, si traduce in attività residue che possono produrre fenotipi aggravanti o allevianti, indipendentemente dal fatto che i geni agiscano nello stesso o in percorsi paralleli59. Pertanto, la natura di qualsiasi interazione richiede ulteriori analisi. Tuttavia, l'uso di alleli ipomorfici e RNAi potrebbe identificare una vasta gamma di interattori, compresi i geni nello stesso complesso proteico o via o in una via ridondante59. Mentre questo più ampio ambito di possibili interazioni può produrre più colpi in uno schermo genetico, può anche portare a interazioni non specifiche, come, ad esempio, l'esposizione non specifica di alleli sensibili alla temperatura nel collasso della proteostasi45,53.

La convalida degli hit e le interazioni non specifiche possono essere esaminate in diversi modi. Il numero di hit dovrebbe essere basso. Ad esempio, la down-regulation dell'espressione dell'chaperone in uno sfondo mutante unc-45 ha provocato una piccola percentuale di colpi (4%), con la maggior parte della down-regulation del gene chaperone che non mostra alcun effetto sulla motilità. Un tasso simile è stato osservato quando DNJ-24M era sovra-espresso (6%). Come notato sopra, uno screening per le interazioni chaperone con proteine inclini all'aggregazione ha identificato 18 chaperoni su 219 sottoposti a screening (8%).

Devono essere utilizzati diversi alleli mutanti, linee di sovraespressione o modelli di malattia. L'uso di diversi alleli mutanti che hanno impatti diversi sulla funzione dell'accompagnatore, così come diversi ceppi con diversi background genetici, può supportare la specificità di qualsiasi screen hits. In alternativa, l'uso della mutazione o della sovraespressione di un chaperone diverso che non porta a perturbamenti simili può servire come controllo negativo. Ad esempio, sia unc-45(e286) che unc-45(m94) hanno mostrato un comportamento aggravante quando sti-1, ahsa-1 o daf-41 erano sotto-regolati. Inoltre, un'interazione simile è stata osservata quando gli animali portatori del mutante di delezione ahsa-1 (ok3501) sono stati trattati con hsp-90 RNAi25.

L'identità dei colpi dell'accompagnatore e le loro interazioni note dovrebbero essere esaminate. Ad esempio, gli chaperoni identificati in uno schermo aggravante unc-45 sono un insieme altamente specifico di chaperone richiesti per il ciclo ATPasi HSP-90, compresi quelli che codificano un reclutatore cliente (STI-1), un co-chaperone rimodellante (AHSA-1) e un co-chaperone di maturazione del cliente (DAF-41). In effetti, questo set di co-chaperoni forma un ciclo di piegatura HSP-90 completo60. Allo stesso modo, uno schermo DNJ-24M ha identificato HSP-1, il principale partner chaperone di Hsp40s40.

Dovrebbero essere esaminati anche i cambiamenti nelle interazioni nel corso della vita dell'animale. Ad esempio, gli accompagnatori identificati nello schermo aggravante unc-45 hanno avuto un forte impatto sulla motilità e sull'organizzazione della miosina in età adulta, ma hanno avuto un effetto più lieve durante lo sviluppo. Ciò potrebbe essere dovuto a cambiamenti nella rete di proteostasi nell'età adulta28 o a cambiamenti nei requisiti di piegatura della miosina tra il ripiegamento della miofibra e la manutenzione.

Utilizzare approcci biochimici complementari per esaminare direttamente le interazioni tra le proteine, nonché la loro localizzazione nella cellula. Ad esempio, i co-chaperoni HSP-90, STI-1, AHSA-1 e DAF-41, sono localizzati nel sarcomero dove interagiscono con la miosina25.

C. elegans è un modello metazoo consolidato per il monitoraggio del controllo di qualità. Viene spesso utilizzato per monitorare la proteostasi cellulare e organismica utilizzando un toolkit variabile di biologia cellulare, approcci biochimici e genetici. Qui, abbiamo impiegato approcci di screening genetico e strumenti disponibili57,58,59,come una banca mutante, librerie RNAi disponibili22,23 e ceppi RNAi tessuto-specifici41, 42,per monitorare le interazioni chaperone in un animale vivente durante lo sviluppo e l'invecchiamento. L'uso di semplici saggi comportamentali, come la motilità, semplifica lo screening di molte possibili coppie di geni per esplorare nuove interazioni genetiche. Questo può quindi servire come piattaforma per esplorare ulteriormente la localizzazione dell'accompagnatore e le interazioni fisiche utilizzando strumenti biochimici per studiare meccanicamente le loro potenziali interazioni in vivo e in vitro. Il protocollo qui descritto è stato utilizzato con successo per identificare nuove interazioni chaperone nel muscolo della parete corporea di C. elegans 25,40.

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Disclosures

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Acknowledgments

Ringraziamo il Caenorhabditis Genetics Center, finanziato dal NIH National Center for Research Resources (NCRR), per alcuni dei ceppi di nematodi. Gli anticorpi monoclonali sviluppati da H.F. Epstein sono stati ottenuti dallo Developmental Studies Hybridoma Bank sviluppato sotto gli auspici del NICHD e mantenuto dal Dipartimento di Biologia dell'Università dell'Iowa. Questa ricerca è stata sostenuta da una sovvenzione della Israel Science Foundation (sovvenzione n. 278/18) e da una sovvenzione del Ministero israeliano della Scienza e della Tecnologia, e del Ministero degli Affari Esteri e della Cooperazione Internazionale, Direzione Generale per la Promozione del Paese, Repubblica Italiana (sovvenzione n. 3-14337). Ringraziamo i membri del laboratorio Ben-Zvi per l'aiuto nella preparazione di questo manoscritto.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
12-well-plates SPL BA3D16B
40 mm plates Greiner Bio-one 627160
60 mm plates Greiner Bio-one 628102
6-well plates Thermo Scientific 140675
96 well 2 mL 128.0/85mm Greiner Bio-one 780278
Agar Formedium AGA03
Ampicillin Formedium 69-52-3
bromophenol blue Sigma BO126-25G
CaCl2 Merck 1.02382.0500
Camera Qimaging q30548
Cholesterol Amresco 0433-250G
Confocal Leica DM5500
Filter (0.22 µm) Sigma SCGPUO2RE
Fluorescent stereomicroscope Leica MZ165FC
Glycerol Frutarom 2355519000024
IPTG Formedium 367-93-1
KCl Merck 104936
KH2PO4 Merck 1.04873.1000
KOH Bio-Lab 001649029100
MgSO4 Fisher 22189-08-8 Gift from the Morimoto laboratory
Myosin MHC A (MYO-3) antibody Hybridoma Bank 5-6
Na2HPO4·7H2O Sigma s-0751
NaCl Bio-Lab 001903029100
Peptone Merck 61930705001730
Plate pouring pump Integra does it p920
RNAi Chaperone library NA NA
SDS VWR Life Science 0837-500
ß-mercaptoethanol Bio world 41300000-1
stereomicroscope Leica MZ6
Tetracycline Duchefa Biochemie 64-75-5
Tris Bio-Lab 002009239100
Tween-20 Fisher BP337-500

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References

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Biologia Numero 160 Caenorhabditis elegans chaperone interazioni genetiche proteostasi RNAi schermo sensibile alla temperatura
Utilizzo di <em>Caenorhabditis elegans</em> per lo screening delle interazioni chaperone tessuto-specifiche
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Dror, S., Meidan, T. D., Karady, I., … More

Dror, S., Meidan, T. D., Karady, I., Ben-Zvi, A. Using Caenorhabditis elegans to Screen for Tissue-Specific Chaperone Interactions. J. Vis. Exp. (160), e61140, doi:10.3791/61140 (2020).

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