Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Использование Caenorhabditis elegans для скрининга тканеспецифических взаимодействий шаперонов

Published: June 7, 2020 doi: 10.3791/61140
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Life Sciences, Ben-Gurion University of the Negev

Summary

Для изучения взаимодействия шаперон-шаперон и шаперон-субстрат мы проводим синтетические экраны взаимодействия у Caenorhabditis elegans с использованием РНК-интерференции в сочетании с легкими мутациями или чрезмерной экспрессией шаперонов и контролируем тканеспецифическую белковую дисфункцию на уровне организма.

Abstract

Правильное сворачивание и сборка белков и белковых комплексов необходимы для клеточной функции. Клетки используют пути контроля качества, которые корректируют, изолируют или устраняют поврежденные белки для поддержания здорового протеома, тем самым обеспечивая клеточный протеостаз и предотвращая дальнейшее повреждение белка. Из-за избыточных функций в сети протеостаза скрининг на обнаруживаемые фенотипы с использованием нокдауна или мутаций в генах, кодирующих шапероны, в многоклеточном организме Caenorhabditis elegans приводит к обнаружению незначительных фенотипов или их отсутствия в большинстве случаев. Мы разработали стратегию целевого скрининга для выявления шаперонов, необходимых для конкретной функции, и, таким образом, преодоления разрыва между фенотипом и функцией. В частности, мы отслеживаем новые взаимодействия шаперонов с использованием экранов синтетического взаимодействия RNAi, сбивая экспрессию шаперона, по одному шаперону за раз, у животных, несущих мутацию в гене, кодируемом шапероном, или чрезмерно экспрессирующих интересующий шаперон. Разрушая два шаперона, которые по отдельности не представляют грубого фенотипа, мы можем идентифицировать шапероны, которые усугубляют или подвергают воздействию определенный фенотип, когда оба возмущены. Мы демонстрируем, что этот подход может идентифицировать конкретные наборы шаперонов, которые функционируют вместе, модулируя сворачивание белка или белковых комплексов, связанных с данным фенотипом.

Introduction

Клетки справляются с повреждением белка, используя механизмы контроля качества, которые восстанавливают, изолируют или удаляют любые поврежденные белки1,2. Сворачивание и сборка белковых комплексов поддерживаются молекулярными шаперонами, разнообразной группой высокосохраняемых белков, которые могут восстанавливать или секвестрировать поврежденные белки3,4,5,6,7. Удаление поврежденных белков опосредовано убиквитин-протеасомной системой (UPS)8 или механизмом аутофагии9 в сотрудничестве с шаперонами10,11,12. Таким образом, белковый гомеостаз (протеостаз) поддерживается сетями контроля качества, состоящими из механизмов сворачивания и деградации3,13. Однако понимание взаимодействия между различными компонентами сети протеостаза in vivo является серьезной проблемой. В то время как экраны белково-белкового взаимодействия вносят важную информацию о физических взаимодействиях и шапероновых комплексах14,15,понимание организации и компенсаторных механизмов в тканеспецифических шапероновых сетях in vivo отсутствует.

Генетические взаимодействия часто используются в качестве мощного инструмента для изучения отношений между парами генов, которые участвуют в общих или компенсаторных биологических путях16,17,18. Такие отношения могут быть измерены путем объединения пар мутаций и количественной оценки влияния мутации в одном гене на фенотипическую тяжесть, вызванную мутацией во втором гене16. Хотя большинство таких комбинаций не показывают никакого эффекта с точки зрения фенотипа, некоторые генетические взаимодействия могут либо усугубить, либо облегчить тяжесть измеренного фенотипа. Усугубляющие мутации наблюдаются, когда фенотип мутанта с двойной делецией более серьезен, чем ожидаемый фенотип, наблюдаемый при объединении мутантов с одинаровой делецией, подразумевая, что два гена функционируют параллельными путями, вместе влияя на данную функцию. Напротив, смягчающие мутации наблюдаются, когда фенотип мутанта с двойной делецией менее серьезен, чем фенотип, наблюдаемый с мутантами с одинаровой делецией, подразумевая, что два гена действуют вместе как комплекс или участвуют в одном и том же пути16,18. Соответственно, для идентификации генетических взаимодействий использовались различные фенотипы, которые могут быть количественно определены, включая широкие фенотипы, такие как летальность, скорость роста и размер расплода, а также конкретные фенотипы, такие как транскрипционные репортеры. Например, Jonikas et al. полагались на репортера стресса ER для изучения взаимодействий Saccharomyces cerevisiae ER развернутой сети протеостаза белкового ответа с использованием парного анализа делеции генов19.

Скрининг генетического взаимодействия включает в себя систематическое скрещивание парных мутаций делеции для создания всеобъемлющего набора двойных мутантов20. Однако на животных моделях, и особенно у C. elegans,такой крупномасштабный подход неосуществим. Вместо этого мутантные штаммы могут быть проверены на их генетические паттерны взаимодействия путем снижения экспрессии генов с использованием РНК-интерференции (РНКи)21. C. elegans представляет собой мощную систему для экранов на основе РНКи22,23. У C. elegansдоставка двухцепочечной РНК (дцРНК) достигается путем бактериального питания, что приводит к распространению молекул дцРНК на многочисленные ткани. Таким образом, введенные молекулы дцРНК воздействовляют на животное с помощью быстрой и простой процедуры21. Таким образом, скрининг генетического взаимодействия с использованием РНК Может выявить влияние понижения регуляции набора генов или большинства генов C. elegans, кодирующих с использованием библиотек РНКи24. На таком экране удары, которые влияют на поведение интересующего мутанта, но не на штамм дикого типа, являются потенциальными модификаторами фенотипа, за которым ведется наблюдение25. Здесь мы применяем комбинацию мутаций и скрининга РНКи для систематического картирования тканеспецифических взаимодействий шаперонов у C. elegans.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Подготовка пластин среды роста нематод для РНКи

  1. К флакону объемом 1 л добавить 3 г NaCl, 2,5 г бакто-пептона, 17 г агара и дистиллированную воду до 1 л и автоклав.
  2. Охладите бутылку до 55 °C.
  3. Добавьте 25 мл 1 М КХ2ПО4,рН 6,0, 1 мл 1 М CaCl2, 1 мл 1 М МгСО4и 1 мл раствора холестерина(таблица 1)для образования среды роста нематод (НГМ).
  4. Добавьте 1 мл ампициллина (100 мг/мл) и 0,5 мл 1 М IPTG(таблица 1)для получения раствора NGM-RNAi.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Обычно используемые бактерии HT115(DE3) E. coli содержат ИПТГ-индуцируемую ДНК-полимеразу Т7, используемую для экспрессии плазмид, кодирующих дцРНК. Эти плазмиды также кодируют сопротивление ампициллину.
  5. Смешайте теплый раствор, закручивая бутылку.
  6. В вытяжке или с помощью стерильных процедур разлить раствор NGM в тарелки или с помощью перистальтического насоса дозировать раствор в пластины. Используйте для этого экрана пластины 6,12, 40 мм или 60 мм. Агар должен заполнять около 2/3 глубины пластины.
  7. Дайте тарелкам высохнуть ночью на скамейке при комнатной температуре, держа тарелки закрытыми. Пластины NGM для RNAi могут храниться при 4 °C до месяца.

2. Выращивание бактерий РНКи и посев пластин

  1. В капюшон или с помощью стерильных процедур добавляют 1 мл ампициллина (100 мг/мл) и 2,5 мл тетрациклина (5 мг/мл)(таблица 1)к предварительно автоклавированной 1 л раствора LB и смешивают.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Обычно используемые бактерии HT115(DE3) E. coli устойчивы к тетрациклине.
  2. В вытяжке или с помощью стерильных процедур добавляют 600 мкл раствора LB в каждую скважину в стерильных пластинах глубиной 96 мл. Лучше всего использовать многоканальный пипетку для дозирования носителя.
  3. Используя стерильные процедуры, инокулируют скважины бактериями HT115(DE3) E. coli, преобразованными плазмидой, кодирующей дцРНК, нацеленной на интересующий ген или пустую плазмиду, в качестве контроля. Накройте пластины крышкой и высиживайте при 37 °C в течение ночи. Библиотеки, состоящие из бактериальных клонов, экспрессирующих дцРНК, соответствующие ~94% предсказанным генам C. elegans, были ранее построены22,23 и являются коммерчески доступными. Библиотека сопровождающих, используемая здесь, была построена лабораторией доктора Ричарда Моримото26.
  4. Используя стерильные процедуры, вымещайте 75, 150 или 250 мкл бактерий на 12-скважинные, 40 мм и 6-скважинные или 60 мм NGM РНКи пластины соответственно. Четко отметьте название гена-мишени на пластине. Бактерии должны покрывать 30-50% поверхности агара и не должны касаться краев пластины.
  5. Дайте тарелкам высохнуть не менее 2 дней на скамейке при комнатной температуре, держа пластины закрытыми.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Пластины можно инкубировали при 37 °C в течение ночи. Убедитесь, что внутренние колодцы сухие перед использованием или хранением пластин. Для всех долгосрочных целей (например, сушки или хранения) держите пластины в темноте. Высушенные, посеянные пластины можно хранить при 4 °C до месяца.

3. Нестрессовая синхронизация эмбрионов

  1. Используйте червячную кирку, чтобы переместить около 100 яиц из несинхронизированной червячной пластины на недавно засеянную пластину NGM.
  2. Культивируйте животных в течение 5 дней при 15 °C, 3,5 дней при 20 °C или 2,5 дней при 25 °C. Животные должны достичь первого дня яйцекладки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Черви обычно культивируются при 20 °C. Однако различные мутантные штаммы шаперонов могут потребовать определенных температур культивирования. Например, многие чувствительные к температуре штаммы культивируются при 15 °C, но смещаются до 25 °C, чтобы выявить их фенотип.
  3. Добавляйте 1 мл буфера M9(таблица 1)медленно и вдали от бактериального газона. Поверните пластину так, чтобы буфер полностью закрывался пластиной. Затем наклоните его в одну сторону, выньте жидкость с тарелки и смойте животных с тарелки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: При использовании чувствительных к температуре животных или мутантов-шаперонов лучше всего поддерживать буферы, используемые в протоколе, на температуре выращивания животных.
  4. Повторите шаг 3.3 три раза или до тех пор, пока все животные не будут смыты с тарелки.
  5. Используя стандартный пластиковый наконечник, вырежьте квадрат агара из вымытой тарелки, где сосредоточены яйца, и поместите кусок агара на недавно засеянный лист NGM.
    ПРИМЕЧАНИЕ: ~ 200 яиц необходимы для производства достаточного количества яйцекладушек животных; слишком много животных потребляют бактерии слишком быстро. Низкий уровень пищи может повлиять на протеостаз27.
  6. Культивируйте животных в течение 5 дней при 15 °C, 3,5 дней при 20 °C или 2,5 дней при 25 °C. В этот момент тарелки должны быть покрыты синхронизированными яйцами.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Животные могут быть перенесены на новую пластину на короткий срок для более строгой синхронизации. Тем не менее, важно использовать взрослых только на ранних стадиях яйцекладки, так как животные могут удерживать яйца в матке, влияя на синхронизацию.
  7. Добавляйте 1 мл буфера M9 медленно и вдали от бактериального газона.
  8. Поверните пластину так, чтобы буфер полностью закрывался пластиной. Затем наклоните его в одну сторону, выньте жидкость с тарелки и смойте животных с тарелки.
  9. Повторите шаг 3,7 три раза или до тех пор, пока все животные не будут смыты с тарелки.
  10. Добавьте 1 мл буфера M9 и используйте скребок для клеток, чтобы освободить яйца от пластины.
  11. Соберите буфер M9, содержащий яйца, с пластин.
  12. Центрифугировать буфер М9, содержащий яйца по 3000 х г в течение 2 мин.
  13. Удалите супернатант и добавьте буфер M9, чтобы достичь объема 1 мл.
  14. Повторно суспендировать яйца, чтобы разрушить любые куски яиц и бактерий.
  15. Повторите процедуру промывания, описанную в шагах 3.11-3.13 пять раз. Яичная гранула должна выглядеть белой. Если он все еще желтый/коричневый, повторяйте стирку до тех пор, пока не будет получена белая гранула.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Бактерии, которые остаются на яйцах, могут загрязнять бактерии, экспрессивающие дцРНК.
  16. Удалите большую часть супернатанта, оставив около 200 мкл. Синхронизированные яйца можно использовать для экранов РНКи.

4. Общие фенотипические анализы

  1. Выращивание животных во время экспериментов
    1. Поместите каплю ~ 30 яиц близко к бактериальному газону в каждую пластину, засеянная РНКи. Для справки также поместите ~30 яиц на тарелки, засеянные пустыми вектор-содержащими (L4440) бактериями.
    2. Культивируйте синхронизированных по возрасту животных на пластинах, посеянных NGM RNAi. Продолжительность эксперимента будет зависеть от стадии, на которой животные должны находиться под наблюдением, и температуры выращивания. Отрегулируйте температуру выращивания при использовании чувствительных к температуре животных-мутантов. Отрегулируйте продолжительность культивирования при использовании мутантных животных с задержкой развития.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Хотя сроки могут варьироваться, как только животные достигают зрелого возраста, яйцекладка (и, как следствие, быстрое потребление пищи), а также возрастной коллапс протеостиса28могут повлиять на результаты. При этом рекомендуется забивать животных до начала яйцекладки (1 день взрослой жизни). Животные дикого типа достигают этой стадии через 4,5 дня при 15 °C, 3 дня при 20 °C или 2 дня при 25 °C.
    3. Количество используемых повторов будет зависеть от размера исследуемого набора генов. Для библиотеки шаперонов (97 генов) повторите эксперименты не менее четырех раз. Размер популяции зависит от используемого анализа. В поведенческих анализах, обсуждаемых здесь, оценка >15 животных на экспериментальное состояние в каждом повторе. Данные и статистический анализ также сильно зависят от типа используемого анализа. Данные в анализах, обсуждаемых здесь, могут быть представлены как средства ± SEM.
    4. Сравните РНК- и пустых животных, обработанных борьбой с переносчиками, как независимые популяции. Значения P могут быть рассчитаны с использованием одностороннего или двустороннего ANOVA, в зависимости от исследуемых изменений, а именно усугубляющих или смягчающих по отдельности или и то, и другое. При изучении одного лечения РНКи по сравнению с контролем значения P могут быть рассчитаны с использованием одностороннего или двустороннего теста на сумму ранга Манна-Уитни. Помимо статистической значимости, рассмотрим порог для попаданий, основанный на степени воздействия на фенотип.
  2. Остановка/задержка развития
    1. Культивируйте синхронизированных по возрасту животных, как на этапе 4.1, до тех пор, пока животные, выращенные на пустых векторсодержащих контрольных бактериях, не достигнут зрелости, но до начала откладки яиц.
    2. Контролируйте животных с помощью стереомикроскопа и подсчитывайте количество личинок и взрослых особей, чтобы оценить процент животных с задержкой развития. Для справки сравните с мутантными животными, выращенными на пустых векторсодержащих контрольных бактериях. Лечение hsp-1 или hsp-90 RNAi приводит к остановке развития животных дикого типа и может быть использовано в качестве положительного контроля.
    3. Чтобы набрать процент животных с задержкой развития с течением времени, повторите шаг 4.2.2.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если на пластине есть взрослые особи, откладывающий яйца, перенесите животных с задержкой развития на новую пластину NGM-RNAi, помеченную для того же гена-мишени, чтобы избежать путаницы с потомством.
  3. Стерильность или дефекты яйцекладки
    1. Культивируйте синхронизированных по возрасту животных, как на этапе 4.1, пока животные, выращенные на пустых бактериях-переносчиках, не начнут откладывать яйца.
    2. На мониторе животных с помощью стереомикроскопа и набирайте процент животных без видимых яиц в матке. Для справки сравните с мутантными животными, выращенными на пустых бактериях- переносчиках.
    3. В качестве альтернативы, наблюдайте за животными с помощью стереомикроскопа и набирайте процент животных с маткой, полной яиц, определяемой как EGg Laying дефектный (Egl-d) фенотип29.
  4. Эмбриональная летальность
    1. Культивируйте синхронизированных по возрасту животных, как на шаге 4.1, пока животные не начнут откладывать яйца.
    2. Переложите ~100 яиц в пустую тарелку. Разложите яйца рядами, чтобы упростить подсчет.
    3. Набери процент невыхлаченных яиц на тарелке через 24-48 часов. Для справки сравните с яйцами животных, обработанных пустыми бактериями-переносчиками.
  5. Анализ паралича
    1. Для взрослых особей 1-го дня культивируйте синхронизированных по возрасту животных, как на этапе 4.1, пока животные, выращенные на пустых бактериях борьбы с переносчиками, не достигнут зрелости, но до начала откладки яиц.
    2. Нарисуйте линию на обратной стороне обычной агаровой пластины NGM с помощью тонкого маркера.
    3. Поместите 5-10 животных на обозначенную линию.
    4. Установите таймер и подождите 10 минут.
    5. Набери процент животных, оставшихся на линии, как парализованных червей. Для справки сравните с мутантными животными, выращенными на пустых бактериях- переносчиках. Животные дикого типа, получавших unc-45 RNAi, демонстрируют тяжелый фенотип паралича и могут использоваться в качестве положительного контроля.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот анализ выделяет животных, демонстрирующих средний и тяжелый паралич. Такие животные обычно лежат прямо на тарелке, а не представляют общую изогнутую форму. Более того, пятно, очищенное от бактерий, видно вокруг голов парализованных червей.
  6. Трэшинг-анализ
    1. Культивируйте синхронизированных по возрасту животных, как на этапе 4.1, до тех пор, пока животные, выращенные на пустых бактериях-переносчиках, не достигнут зрелости, но до начала откладывания яиц.
    2. Пипетка 100 мкл буфера M9 при температуре выращивания животных в 96-скважинную пластину.
    3. Поместите ~15 червей, по одному на скважину, в буферные скважины M9.
    4. Дайте животным приспособиться в течение 5 минут.
    5. Осмотрите каждое животное под стереомикроскопом, запустите таймер, отсчитывая 15 с, и подсчитайте количество изгибов тела, которые каждое животное выполняет за этот промежуток времени. Подсчитанные значения могут быть нормализованы до изгибов тела в минуту. Для справки сравните с мутантными животными, выращенными на пустых бактериях- переносчиках.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот анализ моторики очень чувствителен и может обнаружить очень мягкие различия между методами лечения. Однако подвижность в жидкости и подвижность на агарре могут отличаться.

5. Валидация нокдауна белка

  1. Поместите 250-300 синхронизированных яйцеклеток на 60-миллиметровую NGM-РНКи пластину, засеяв соответствующую дцРНК-экспрессивную или пустую вектор-содержащую (L4440) бактерии.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Нокдаун RNAi может привести к аберрантным накоплениям эмбрионов, отсутствию эмбрионов или остановке развития, что может повлиять на экспрессию генов. Это следует учитывать при определении возраста обследуемых животных.
  2. Для взрослых особей 1-го дня культивируйте животных в течение 4,5 дней при 15 °C, 3 дня при 20 °C или 2 дней при 25 °C.
  3. Выберите и переведите в общей сложности 200 молодых взрослых животных в колпачок 1,5 мл заполненной трубки 200 мкл PBS-T.
    ПРИМЕЧАНИЕ: При использовании чувствительных к температуре животных или мутантов-шаперонов лучше всего поддерживать буферы, используемые в протоколе, на температуре выращивания животных.
  4. Осторожно закройте колпачок и центрифугировать при 1000 х г в течение 1 мин.
  5. Добавьте 800 мкл PBS-T(таблица 1)и центрифугу по 1000 х г в течение 1 мин.
  6. Аккуратно удалите верхнюю часть 900 мкл.
  7. Повторите шаги 5.4-5.6 три раза.
  8. Удалить 900 мкл, оставив 100 мкл раствора, содержащего 200 червей.
  9. Добавьте 25 мкл 5-кратного буфера образцов(таблица 1).
  10. Нагревать образцы в течение 10 мин при 92°C при встряхивании при 1000 об/мин. Затем образцы могут быть заморожены и сохранены при -20 °C.
  11. Загрузите 20 мкл каждого образца и запустите на геле SDS-PAGE.
  12. Выполните анализ вестерн-блота с использованием соответствующих антител для определения относительной стабильности белка.
  13. Определите интенсивность полос с помощью денситометрического программного обеспечения, такого как свободно доступный гель-модуль ImageJ. Нормализуйте все значения до значений, измеренных в контрольном образце (выборочных образцах).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Целью нокдауна RNAi на наших экранах является снижение уровня белка определенного шаперона / ко-шаперона. Таким образом, лучший способ оценить эффективность нокдауна РНКи — это анализ вестерн-блот. Для этого требуются специфические антитела. С другой стороны, qPCR может быть использован для количественной оценки уровней мРНК.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Использование чувствительных к температуре мутаций в UNC-45 для скрининга на обострение или облегчение взаимодействий в разрешительных или ограничительных условиях, соответственно
Сборка и поддержание мышц предлагают эффективную систему для изучения тканеспецифических взаимодействий шаперонов. Функциональная единица сократительных мышц, саркомер, представляет собой кристаллическое расположение структурных и регуляторных белков. Стабильность моторного белка миозина и его включение в толстые нити сократительных мышечных саркомер зависит от взаимодействия шаперонов и компонентов ИПС30. Примером одного из таких шаперонов является консервированный и специализированный миозин шаперон UNC-45, который в основном экспрессируется в мышцах стенки тела31,32,33,34,35. Было показано, что мутации в UNC-45 вызывают дезорганизацию миозина и серьезные дефекты моторики при С. элеганс31,36. Тандемные модули UNC-45 собираются в многосайтовую стыковочную платформу37, которая обеспечивает сотрудничество между UNC-45, HSP-90 и HSP-1 и, вероятно, другими шаперонами и со-шаперонами в сборке миозиновой нити25,36,37,38. Чтобы подтвердить известные взаимодействия UNC-45 и идентифицировать новые генетические взаимодействия в мышечном протеостазе, мы разработали стратегию, использующая чувствительные к температуре мутации C. elegans unc-45 в качестве сенсибилизированного генетического фона для скрининга тканеспецифического взаимодействия шаперонов19,25.

Одиночные аминокислотные замены в C. elegans UNC-45 (L822F и E781K), соответствующие аллелям e286 и m94 соответственно; unc-45(ts)) ответственны за температурно-зависимые дефекты моторики и фенотипы дезорганизации миозина при выращивании пораженных животных в ограничительных условиях (>22 °C). Напротив, эти мутанты unc-45(ts) не показывают дефектов движения или организации миозина при разрешительной температуре (15 °C)31. В предложенном подходе возрастно синхронизированных unc-45(e286) животных на первой личиночной стадии (L1) истощали различными молекулярными шаперонами РНКи (97 генов), а затем контролировали на наличие дефектов подвижности в разрешительных условиях (15 °C)(рисунок 1). Мы подтвердили известное взаимодействие белков UNC-45 и HSP-90 в нашем скрининге генетических взаимодействий и идентифицировали три со-шаперона hsp-90, sti-1, ahsa-1 и daf-41,как специфически вызывающие синтетический дефект движения у unc-45 (ts) мутантных животных, но не у животных дикого типа25. Мы продолжили изучение того, были ли синтетические фенотипы, связанные со sti-1-, ahsa-1 или daf-41-ассоциированными,дезорганизацией миозина путем мониторинга субклеточного расположения тяжелой цепи миозина A (MYO-3), используя установленные методы иммунокрасления39. В то время как лечение животных дикого типа sti-1, ahsa-1 или daf-41 RNAi не влияло на организацию миофиламента, истощение этих генов у мутантных животных unc-45(e286) приводило к полному нарушению саркомерных структур и неправильной локализации MYO-3 даже в разрешительных условиях (15 °C). Этот эффект был сопоставим с тем, что наблюдалось с одиночными мутантами unc-45(e286), выращенными при ограничительной температуре (25 °C)25. Эти результаты были подтверждены с помощью другого unc-45(ts)-аллеля,а именно unc-45(m94) мутантных животных25.

Чтобы идентифицировать шапероны, которые дестабилизируют UNC-45, мы затем проверили наличие шаперонов, которые улучшили подвижность животных unc-45 (286) при 25 ° C, полагаясь на нокдаун генов RNAi. В то время как животные-мутанты unc-45(e286) демонстрировали серьезные дефекты движения при 25 °C, подвижность животных, получавших РНКИ, по отношению к генам, кодировавшим четыре из 97 обследованных шаперонов, была значительно улучшена. Здесь также результаты были подтверждены с использованием животных-мутантов unc-45 (m94). Таким образом, использование термочувствительных мутаций позволяет устанавливать как отягчающие, так и смягчающие экраны, в зависимости от температуры, при которой проводится скрининг.

Использование тканеспецифической чрезмерной экспрессии шаперона для скрининга на обострение взаимодействий
Затем мы использовали тканеспецифическую чрезмерную экспрессию одного шаперона в качестве легкого возмущения мышечной шапероной сети для целей скрининга. В частности, мы использовали животных, чрезмерно экспрессирующих дикий тип dnj-24,кодирующих гомолог C. elegans белка Hsp40 DNAJB6 в мышце стенки тела C. elegans (DNJ-24M). Как и выше, животных L1 DNJ-24M обрабатывали РНКи для различных шаперонов и контролировали на наличие дефектов подвижности (20 °C)(рисунок 1). В то время как животные DNJ-24M не показали заметных дефектов подвижности, три гена (из 48 изученных генов, кодирующих шаперон; 6%), а именно hsp-1, rme-8и dnj-8, конкретно повлияли на подвижность животных, экспрессирующих DNJ-24M, но не животных дикого типа. Следует отметить, что тестирование специфичности ударов с использованием животных, чрезмерно экспрессирующих другой шаперон, а именно HSP-90, в мышцах (HSP90M), не показало влияния на подвижность HSP90M при лечении HSP-1, rme-8или dnj-8 RNAi40. Взятые вместе, скрининговая платформа, использующая мягкие возмущения в сети шаперонов, такие как экспрессия метастабильных мутантных белков или тканеспецифическая чрезмерная экспрессия, привела к высокоспецифичной частоте попадания (обычно ~ 5%).

Использование тканеспецифических РНК-файлов для скрининга тканеспецифических генетических взаимодействий
Тканеспецифические РНКи-чувствительные штаммы позволяют тканеспецифическим нокдауну генов, все еще используя бактериальную подачу для доставки дцРНК. Эти штаммы являются мутантными для белка RDE-1 argonaute, основного компонента в пути RNAi, необходимого для эффективного глушения генов21. Однако экспрессия RDE-1 дикого типа под контролем тканеспецифического промотора привела к эффективному тканеспецифическому нокдауну генов41,42. Таким образом, этот инструмент позволяет проводить скрининги генетического взаимодействия без использования тканеспецифических шаперонов, таких как UNC-45 или DNAJ-24M. Например, нокдаун hsp-6 (mortalin) у животных дикого типа во время развития привел к сильной остановке развития (96±1% животных, получавших РНКи). В то же время нокдаун hsp-6 в штамме, экспрессиившем RDE-1 дикого типа в мышцах, не вызывал остановки развития, тогда как экспрессия RDE-1 дикого типа в клетках кишечника приводила к сильному фенотипу остановки развития (90±3%; Рисунок 2). Таким образом, функция HSP-6 в клетках кишечника необходима для нормального развития. Таким образом, мутация в hsp-6 (mg585), которая вызывает умеренную задержку роста, может быть использована для скрининга на обострение или облегчение взаимодействия шаперонов путем скрещивания этого мутировавого гена в специфический для кишечника штамм RNAi и скрининга библиотеки RNAi шаперона.

Мониторинг возрастных изменений в складчатой среде с использованием генетических взаимодействий
У животных наблюдается возрастно-зависимый спад моторики, что связано с саркомергической дезорганизацией43,44,45. Изменения в способности к сворачиванию белка совпадают с измененной регуляцией и составом клеточного механизма протеостаза28,включая измененные уровни UNC-45, CHN-1 и UFD-2, белков механизма контроля качества мышц46. В согласии, на сворачивание и деградацию миозина влияют изменения протеостатической способности при переходе к взрослой жизни47. Поэтому мы задались вопросом, могут ли такие изменения повлиять на взаимодействие сопровождающих. Например, мы наблюдали за влиянием нокдауна STI-1, AHSA-1 и DAF-41 на подвижность с течением времени. Мы обнаружили, что, хотя животные, получавших sti-1-, ahsa-1и daf-41-RNAi,показали снижение подвижности во время развития личинок, моторика сильно снизилась у взрослых червей unc-45 (ts). Кроме того, организация MYO-3 у животных-мутантов unc-45(ts), получавших Sti-1, ahsa-1 или daf-41 RNAi, была похожа на организацию червей дикого типа на четвертой личиночной стадии (L4), хотя мутанты демонстрировали нарушенные саркомеры после того, как животные достигли совершеннолетия(рисунок 3). Напротив, как животные-мутанты unc-45(ts), обработанные пустой борьбой с переносчиками, так и животные дикого типа остались незатронутыми(рисунок 3). Таким образом, динамика протеостаза в функции возраста или условий окружающей среды27,45,46,48,49 может критически влиять на взаимодействия шаперонов.

Figure 1
Рисунок 1: Настройка экранов синтетического взаимодействия RNAi с использованием C. elegans, несущих мутацию в гене, кодируемом интересующего шаперона. (A) Схематическое представление базовой настройки целевых экранов взаимодействия шаперонов. (B) Проверка попадания требует подтверждения генетического взаимодействия с использованием другого шаперон-мутанта, а также проверки указания нокдауна РНКи. (С-Д) Простые показания, такие как дефекты подвижности, могут быть количественно определены для определения усугубляющих или смягчающих взаимодействий, с использованием паралича или анализа треска, соответственно. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 2
Рисунок 2: Тканеспецифический РНКИ митохондриального шаперона hsp-6 может быть использован для изучения генетических взаимодействий в одной ткани. Штаммы РНК, специфичные для кишечника и мышц дикого типа, обрабатывали РНКи-6 и (А)оценивали задержку развития или(В)делали изображения в первый день взрослой жизни. Данные являются средними ± SEM, N=6. Шкала составляет 1 мм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 3
Рисунок 3: Возрастно-зависимые эффекты РНКи. (A) Моторика с возрастом. Эмбрионы дикого типа или unc-45(e286) помещали на пластины, посеянные sti-1, ahsa-1 или daf-41 RNAi при 15 °C и оценивали на подвижность с использованием анализа на каждой стадии развития, L1-L4, молодого взрослого человека и 1-го дня взрослой жизни. Данные являются средними ± SEM, N=15. (B) Конфокальные изображения мышц стенки тела. Животных лечили как в А и фиксировали на L4, молодом взрослом и дне 1 взрослой жизни и иммуно окрашивали антителами против MYO-3. Шкала составляет 10 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Решение Инструкция по подготовке Хранение
1 м CaCl2 (1 л) Добавьте 147,01 г CaCl2·2H2O Магазин на RT
Добавьте dH2O к 1 л
Автоклав или фильтр (0,22 мкм)
1 МKH 2PO4, pH 6.0 (1 л) Добавить 136,09 г KH2PO4 Магазин на RT
Добавить 800 мл dH2O
Перемешать с помощью магнитной мешалки до растворения
Титруйте pH с помощью KOH
Добавьте dH2O к 1 л
Автоклав или фильтр (0,22 мкм)
1 М МгСО4 (1 л) Добавьте 248,58 г MgSO4·7H2O Магазин на RT
Добавьте dH2O к 1 л
Автоклав или фильтр (0,22 мкм)
Раствор холестерина (50 мл) Добавьте 250 мг холестерина в 50 мл трубки Falcon Хранить при -20 °C
Полностью растворить в 40 мл этанола
Добавьте этанол в 50 мл
1 M IPTG (50 мл) Добавьте 11,9 г IPTG (изопропил-β-D-тиогалакопиранозид) в 50 мл трубки Falcon Хранить в темноте при -20 °C
Полностью растворяется в 40 мл dH2O
Добавьте dH2O к 50 мл
Фильтр (0,22 мкм), аликвотные трубки 1мл
Запас ампициллина (50 мл) Добавьте 5 г ампициллина в 50 мл тюбика Falcon Хранить при -20 °C
Полностью растворяется в 40 мл dH2O
Добавьте dH2O к 50 мл
Фильтр (0,22 мкм), распределите 1 мл аликвоты в трубки Эппендорфа
Запас тетрациклина (50 мл) Добавьте 250 мг тетрациклина в 50 мл трубки Falcon Хранить при -20 °C
Полностью растворить в 40 мл этанола
Добавьте этанол в 50 мл
Трубки Аликвот 1 мл
Буфер M9 (1 л) Добавьте 5,8 г Na2HPO4·7H2O Магазин на RT
Добавить 3 г KH2PO4
Добавить 5 г NaCl
Добавьте 0,25 г MgSO4·7H2O
Добавьте dH2O к 1 л
Фильтр (0.22 мкм)
1X PBS-T (pH 7.4) ( 1 л) Добавить 8 г NaCl Магазин на RT
Добавьте 200 мг KCl
Добавьте 1,44 г Na2HPO4·7H2O
Добавить 240 мг KH2PO4
Полностью растворяется в 800 мл dH2O
Титруйте pH с использованием KOH tp pH 7,4
Добавить 500 мкл анимации-20
Добавьте dH2O к 1 л
5x буфер образцов Добавить 6,8 мл dH2O Хранить при -20 °C
Добавить 2 мл 0,5 М Tris pH 6,8
Добавьте 3,2 мл глицерина
Добавить 1,6 мл 20% SDS
Добавить 0,8 мл ß-меркаптоэтанола
1% бромфенол синий

Таблица 1: Рецепты решений

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Интегрированная картина сети протеостаза, отражающая, как она организована и функционирует в различных метазойных клетках и тканях, по-прежнему отсутствует. Для устранения этого недостатка требуется конкретная информация о взаимодействиях различных компонентов этой сети, таких как молекулярные шапероны, в конкретных тканях в ходе развития и старения. Здесь мы показали, как использование тканеспецифических возмущений позволило нам исследовать сеть шаперонов в данной ткани. Для изучения тканеспецифических генетических взаимодействий шаперонов были рассмотрены три различных подхода. В первом подходе UNC-45, шаперон, который высоко экспрессируется в мышечных клетках, использовался для скрининга взаимодействий шаперонов через питание-RNAi25. Хотя использование специализированного шаперона позволяет различать тканевую специфичность, он может сообщать только о той высоко сфокусированной подсети, в которую он вносит свой вклад. Обратите внимание, что большинство нейронов C. elegans устойчивы к доставке50 RNAi на основе питания и, таким образом, использование этого подхода для идентификации генетических взаимодействий в нейрональных клетках требует скрещивания мутантного шаперона, исследованного с RNAi-усиленным штаммом51. Во втором подходе тканеспецифический промотор использовался для управления чрезмерной экспрессией шаперона в мышцах и, таким образом, специфически влиял на среду складывания мышц40. Тем не менее, чрезмерное выражение одного шаперона может быть в целом полезным для складной среды и, таким образом, маскировать разрушение, вызванное двумя шаперонами вместе. Третий подход основывался на тканеспецифическом нокдауне RNAi для изучения взаимодействий шаперонов в данной ткани41. Одним из преимуществ этого подхода является то, что он позволяет нацеливаться на нейронные клетки, устойчивые к доставке РНКи через подачу42. Тем не менее, этот подход требует использования мягкого мутанта (хотя и не специализированного), а также того, чтобы этот мутант был скрещен в нулевой мутант rde-1, несущий тканеспецифический ген спасения rde-1. Важно отметить, что эти подходы могут быть объединены таким образом, чтобы потенциально модулировать функцию шаперона в одной ткани или даже в одной клетке.

Механизм контроля качества может влиять на функцию многих генных продуктов, наражая протеостаз. Это является серьезной проблемой при использовании генетических взаимодействий для изучения сети контроля качества18. Например, хроническая экспрессия белков, склонных к агрегации, или коллапс протеостаза при старении приводили к фенотипической усугублению многих несвязанных метастабильных белков у C. elegans и дрожжей45,52,53. Кроме того, клатрин-опосредованный эндоцитоз в клетках млекопитающих ингибировался при функциональном связывании Hsc70 с белковыми агрегатами. Тем не менее, было показано, что эндоцитоз может быть спасен чрезмерной экспрессией Hsc70, в то время как агрегация не может54,55. Аналогичным образом, генетический скрининг у дрозофилы, предназначенный для выявления регуляторов реакции теплового шока, идентифицировал мутацию неправильного изменения в актине мышц полета, которая конститутивно активировала реакцию теплового шока56. Взятые вместе, возмущение сети протеостаза может подвергать метастабильные белки или вызывать стресс, который может повлиять на специфичность результата. Тем не менее, анализ генетических взаимодействий может дать очень специфическое и функциональное понимание. Например, эпистатический анализ генов дрожжей, необходимых для сворачивания в эндоплазматическом стикулуме, выявил специфические генетические взаимодействия между молекулярными шаперонами, которые впоследствии былиподтверждены 19. Аналогичным образом, отягчающий скрининг для шаперонов, которые усиливают токсичность двух моделей, склонных к агрегации (измеряемых подвижностью), идентифицировал специфическое подмножество из 18 шаперонов, ортологи которых повлияли на агрегацию гентингтина в клетках человека26. Здесь мы показали, что различные возмущения сети протеостаза могут раскрывать специфические и функциональные взаимодействия шаперонов.

Основным преимуществом использования экранов генетического взаимодействия на основе кормления РНКи является относительная простота метода. Даже использование общего поведенческого результата, такого как подвижность, может выявить новые генетические взаимодействия(рисунок 3). Однако изменчивость и частичные эффекты нокдауна экспрессии могут ограничивать достоверность и специфичность результатов57. Более того, генетические взаимодействия не свидетельствуют о физических взаимодействиях, и, таким образом, связь между двумя генами может быть косвенной. Изучение природы взаимодействий и отбрасывание неспецифических взаимодействий может занятьмного времени 57,58,59. Это проблема, которую необходимо решить при настройке и проверке экрана. Например, использование нулевых аллелей в генетическом скрининге позволяет определить, функционируют ли эти гены в одних и тех же или разных путях в данном биологическом процессе. Однако использование частичной потери функции генов, гипоморфных аллелей, таких как чувствительные к температуре аллели, или РНКAi-зависимой понижающей регуляции экспрессии, приводит к остаточной активности, которая может дать усугубляющие или облегчающие фенотипы, независимо от того, действуют ли гены в том же или в параллельных путях59. Таким образом, характер любого взаимодействия требует дальнейшего анализа. Однако использование гипоморфных аллелей и РНК может идентифицировать широкий спектр интеракторов, включая гены в том же белковом комплексе или пути или в избыточном пути59. Хотя этот больший объем возможных взаимодействий может дать больше попаданий в генетический экран, он также может привести к неспецифическим взаимодействиям, таким как, например, неспецифическое воздействие чувствительных к температуре аллелей при коллапсе протеостаза45,53.

Проверка попаданий и неспецифические взаимодействия могут быть изучены несколькими способами. Количество попаданий должно быть низким. Например, снижение регуляции экспрессии шаперонов в мутантном фоне unc-45 привело к небольшому проценту попаданий (4%), при этом большинство понижающих регуляций гена шаперона не показывают никакого влияния на подвижность. Аналогичная скорость наблюдалась, когда DNJ-24M был чрезмерно выражен (6%). Как отмечалось выше, скрининг взаимодействия шаперонов с белками, склонными к агрегации, выявил 18 шаперонов из 219 обследованных (8%).

Следует использовать несколько мутантных аллелей, линий чрезмерной экспрессии или моделей заболеваний. Использование различных мутантных аллелей, которые по-разному влияют на функцию шаперона, а также различных штаммов с разным генетическим фоном, может поддерживать специфичность любых экранных попаданий. В качестве альтернативы, использование мутации или чрезмерной экспрессии другого шаперона, которая не приводит к подобному возмущению, может служить отрицательным контролем. Например, как unc-45(e286), так и unc-45(m94) демонстрировали отягчающее поведение, когда sti-1, ahsa-1 или daf-41 регулировались. Более того, подобное взаимодействие наблюдалось, когда животных, несущих мутант делеции ahsa-1(ok3501), лечили hsp-90 RNAi25.

Следует изучить идентичность ударов сопровождающих и их известные взаимодействия. Например, шапероны, идентифицированные на отягчающей экране unc-45, представляют собой очень специфический набор шаперонов, необходимых для цикла АТФазы HSP-90, включая кодирующие рекрутера клиента (STI-1), ко-шаперон ремоделирования (AHSA-1) и ко-шаперон созревания клиента (DAF-41). Фактически, этот набор со-шаперонов образует полный цикл складывания HSP-9060. Аналогичным образом, экран DNJ-24M идентифицировал HSP-1, основного партнера Hsp40s40.

Изменения во взаимодействиях на протяжении всей жизни животного также должны быть изучены. Например, шапероны, идентифицированные в unc-45, сильно влияли на моторику и организацию миозина во взрослом возрасте, но имели более мягкий эффект во время развития. Это может быть связано с изменениями в сети протеостаза в возрасте28 лет или с изменениями в требованиях к сворачиванию миозина между сворачиванию миоволокна и поддержанием.

Используйте комплементарные биохимические подходы для непосредственного изучения взаимодействий между белками, а также их локализации в клетке. Например, ко-шапероны HSP-90, STI-1, AHSA-1 и DAF-41, локализованы в саркомере, где они взаимодействуют с миозином25.

C. elegans является хорошо заядлой метазойной моделью для мониторинга контроля качества. Он часто используется для мониторинга клеточного и организмного протеостаза с использованием переменного инструментария клеточной биологии, биохимического и генетического подходов. Здесь мы использовали подходы к генетическому скринингу и доступные инструменты57,58,59,такие как банк мутантов, доступные библиотеки RNAi22,23 и тканеспецифические штаммы RNAi41,42,для мониторинга взаимодействия шаперонов у живого животного во время развития и старения. Использование простых поведенческих анализов, таких как подвижность, упрощает экран многих возможных пар генов для изучения новых генетических взаимодействий. Затем это может служить платформой для дальнейшего изучения локализации шаперонов и физических взаимодействий с использованием биохимических инструментов для механистического изучения их потенциальных взаимодействий in vivo и in vitro. Протокол, описанный здесь, был успешно использован для идентификации новых взаимодействий шаперонов в мышцах стенки тела C. elegans 25,40.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторам нечего раскрывать.

Acknowledgments

Мы благодарим Генетический центр Caenorhabditis, финансируемый Национальным центром исследовательских ресурсов NIH (NCRR), за некоторые штаммы нематод. Моноклональные антитела, разработанные Х.Ф. Эпштейном, были получены из Банка исследований развития Hybridoma, разработанного под эгидой NICHD и поддерживаемого кафедрой биологии Университета Айовы. Это исследование было поддержано грантом Израильского научного фонда (грант No 278/18) и грантом Министерства науки и технологий Израиля и Министерства иностранных дел и международного сотрудничества, Главного управления по продвижению стран, Итальянская Республика (грант No 3-14337). Благодарим сотрудников лаборатории Бен-Цви за помощь в подготовке этой рукописи.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
12-well-plates SPL BA3D16B
40 mm plates Greiner Bio-one 627160
60 mm plates Greiner Bio-one 628102
6-well plates Thermo Scientific 140675
96 well 2 mL 128.0/85mm Greiner Bio-one 780278
Agar Formedium AGA03
Ampicillin Formedium 69-52-3
bromophenol blue Sigma BO126-25G
CaCl2 Merck 1.02382.0500
Camera Qimaging q30548
Cholesterol Amresco 0433-250G
Confocal Leica DM5500
Filter (0.22 µm) Sigma SCGPUO2RE
Fluorescent stereomicroscope Leica MZ165FC
Glycerol Frutarom 2355519000024
IPTG Formedium 367-93-1
KCl Merck 104936
KH2PO4 Merck 1.04873.1000
KOH Bio-Lab 001649029100
MgSO4 Fisher 22189-08-8 Gift from the Morimoto laboratory
Myosin MHC A (MYO-3) antibody Hybridoma Bank 5-6
Na2HPO4·7H2O Sigma s-0751
NaCl Bio-Lab 001903029100
Peptone Merck 61930705001730
Plate pouring pump Integra does it p920
RNAi Chaperone library NA NA
SDS VWR Life Science 0837-500
ß-mercaptoethanol Bio world 41300000-1
stereomicroscope Leica MZ6
Tetracycline Duchefa Biochemie 64-75-5
Tris Bio-Lab 002009239100
Tween-20 Fisher BP337-500

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gomez-Pastor, R., Burchfiel, E. T., Thiele, D. J. Regulation of heat shock transcription factors and their roles in physiology and disease. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 19 (1), 4-19 (2018).
  2. Dubnikov, T., Ben-Gedalya, T., Cohen, E. Protein quality control in health and disease. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 9 (3), (2017).
  3. Bar-Lavan, Y., Shemesh, N., Ben-Zvi, A. Chaperone families and interactions in metazoa. Essays in Biochemistry. 60 (2), 237-253 (2016).
  4. Schopf, F. H., Biebl, M. M., Buchner, J. The HSP90 chaperone machinery. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (6), 345-360 (2017).
  5. Carra, S., et al. The growing world of small heat shock proteins: from structure to functions. Cell Stress Chaperones. 22 (4), 601-611 (2017).
  6. Rosenzweig, R., Nillegoda, N. B., Mayer, M. P., Bukau, B. The Hsp70 chaperone network. Nature Reviews Molecular Cell Biology. , (2019).
  7. Gestaut, D., Limatola, A., Joachimiak, L., Frydman, J. The ATP-powered gymnastics of TRiC/CCT: an asymmetric protein folding machine with a symmetric origin story. Current Opinion in Structural Biology. 55, 50-58 (2019).
  8. Bett, J. S. Proteostasis regulation by the ubiquitin system. Essays in Biochemistry. 60 (2), 143-151 (2016).
  9. Jackson, M. P., Hewitt, E. W. Cellular proteostasis: degradation of misfolded proteins by lysosomes. Essays in Biochemistry. 60 (2), 173-180 (2016).
  10. Kettern, N., Dreiseidler, M., Tawo, R., Hohfeld, J. Chaperone-assisted degradation: multiple paths to destruction. Biological Chemistry. 391 (5), 481-489 (2010).
  11. Cuervo, A. M., Wong, E. Chaperone-mediated autophagy: roles in disease and aging. Cell Research. 24 (1), 92-104 (2014).
  12. Kevei, E., Pokrzywa, W., Hoppe, T. Repair or destruction-an intimate liaison between ubiquitin ligases and molecular chaperones in proteostasis. FEBS Letters. 591 (17), 2616-2635 (2017).
  13. O'Brien, D., van Oosten-Hawle, P. Regulation of cell-non-autonomous proteostasis in metazoans. Essays in Biochemistry. 60 (2), 133-142 (2016).
  14. Taipale, M., et al. Quantitative analysis of HSP90-client interactions reveals principles of substrate recognition. Cell. 150 (5), 987-1001 (2012).
  15. Taipale, M., et al. A quantitative chaperone interaction network reveals the architecture of cellular protein homeostasis pathways. Cell. 158 (2), 434-448 (2014).
  16. Baryshnikova, A., Costanzo, M., Myers, C. L., Andrews, B., Boone, C. Genetic interaction networks: toward an understanding of heritability. Annual Review of Genomics and Human Genetics. 14, 111-133 (2013).
  17. Costanzo, M., et al. Global Genetic Networks and the Genotype-to-Phenotype Relationship. Cell. 177 (1), 85-100 (2019).
  18. Domingo, J., Baeza-Centurion, P., Lehner, B. The Causes and Consequences of Genetic Interactions (Epistasis). Annual Review of Genomics and Human Genetics. 20, 433-460 (2019).
  19. Jonikas, M. C., et al. Comprehensive characterization of genes required for protein folding in the endoplasmic reticulum. Science. 323 (5922), 1693-1697 (2009).
  20. Schuldiner, M., et al. Exploration of the function and organization of the yeast early secretory pathway through an epistatic miniarray profile. Cell. 123 (3), 507-519 (2005).
  21. Billi, A. C., Fischer, S. E., Kim, J. K. Endogenous RNAi pathways in C. elegans. WormBook. , 1-49 (2014).
  22. Kamath, R. S., et al. Systematic functional analysis of the Caenorhabditis elegans genome using RNAi. Nature. 421 (6920), 231-237 (2003).
  23. Rual, J. F., et al. Toward improving Caenorhabditis elegans phenome mapping with an ORFeome-based RNAi library. Genome Research. 14 (10), 2162-2168 (2004).
  24. Lehner, B., Crombie, C., Tischler, J., Fortunato, A., Fraser, A. G. Systematic mapping of genetic interactions in Caenorhabditis elegans identifies common modifiers of diverse signaling pathways. Nature Genetics. 38 (8), 896-903 (2006).
  25. Frumkin, A., et al. Challenging muscle homeostasis uncovers novel chaperone interactions in Caenorhabditis elegans. Frontiers in Molecular Biosciences. 1, 21 (2014).
  26. Brehme, M., et al. A chaperome subnetwork safeguards proteostasis in aging and neurodegenerative disease. Cell Reports. 9 (3), 1135-1150 (2014).
  27. Shpigel, N., Shemesh, N., Kishner, M., Ben-Zvi, A. Dietary restriction and gonadal signaling differentially regulate post-development quality control functions in Caenorhabditis elegans. Aging Cell. 18 (2), 12891 (2019).
  28. Shai, N., Shemesh, N., Ben-Zvi, A. Remodeling of proteostasis upon transition to adulthood is linked to reproduction onset. Current Genomics. 15 (2), 122-129 (2014).
  29. Trent, C., Tsuing, N., Horvitz, H. R. Egg-laying defective mutants of the nematode Caenorhabditis elegans. Genetics. 104 (4), 619-647 (1983).
  30. Pokrzywa, W., Hoppe, T. Chaperoning myosin assembly in muscle formation and aging. Worm. 2 (3), 25644 (2013).
  31. Barral, J. M., Bauer, C. C., Ortiz, I., Epstein, H. F. Unc-45 mutations in Caenorhabditis elegans implicate a CRO1/She4p-like domain in myosin assembly. Journal of Cell Biology. 143 (5), 1215-1225 (1998).
  32. Venolia, L., Ao, W., Kim, S., Kim, C., Pilgrim, D. unc-45 gene of Caenorhabditis elegans encodes a muscle-specific tetratricopeptide repeat-containing protein. Cell Motility and the Cytoskeleton. 42 (3), 163-177 (1999).
  33. Hoppe, T., et al. Regulation of the myosin-directed chaperone UNC-45 by a novel E3/E4-multiubiquitylation complex in C. elegans. Cell. 118 (3), 337-349 (2004).
  34. Etard, C., et al. The UCS factor Steif/Unc-45b interacts with the heat shock protein Hsp90a during myofibrillogenesis. Developmental Biology. 308 (1), 133-143 (2007).
  35. Wohlgemuth, S. L., Crawford, B. D., Pilgrim, D. B. The myosin co-chaperone UNC-45 is required for skeletal and cardiac muscle function in zebrafish. Developmental Biology. 303 (2), 483-492 (2007).
  36. Barral, J. M., Hutagalung, A. H., Brinker, A., Hartl, F. U., Epstein, H. F. Role of the myosin assembly protein UNC-45 as a molecular chaperone for myosin. Science. 295 (5555), 669-671 (2002).
  37. Gazda, L., et al. The myosin chaperone UNC-45 is organized in tandem modules to support myofilament formation in C. elegans. Cell. 152 (1-2), 183-195 (2013).
  38. Gaiser, A. M., Kaiser, C. J., Haslbeck, V., Richter, K. Downregulation of the Hsp90 system causes defects in muscle cells of Caenorhabditis elegans. PLoS One. 6 (9), 25485 (2011).
  39. Karady, I., et al. Using Caenorhabditis elegans as a model system to study protein homeostasis in a multicellular organism. Journal of Visualized Experiments. (82), e50840 (2013).
  40. Bar-Lavan, Y., et al. A Differentiation Transcription Factor Establishes Muscle-Specific Proteostasis in Caenorhabditis elegans. PLoS Genetics. 12 (12), 1006531 (2016).
  41. Qadota, H., et al. Establishment of a tissue-specific RNAi system in C. elegans. Gene. 400 (1-2), 166-173 (2007).
  42. Firnhaber, C., Hammarlund, M. Neuron-specific feeding RNAi in C. elegans and its use in a screen for essential genes required for GABA neuron function. PLoS Genet. 9 (11), 1003921 (2013).
  43. Fisher, A. L. Of worms and women: sarcopenia and its role in disability and mortality. Journal of the American Geriatrics Society. 52 (7), 1185-1190 (2004).
  44. Herndon, L. A., et al. Stochastic and genetic factors influence tissue-specific decline in ageing C. elegans. Nature. 419 (6909), 808-814 (2002).
  45. Ben-Zvi, A., Miller, E. A., Morimoto, R. I. Collapse of proteostasis represents an early molecular event in Caenorhabditis elegans aging. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (35), 14914-14919 (2009).
  46. Janiesch, P. C., et al. The ubiquitin-selective chaperone CDC-48/p97 links myosin assembly to human myopathy. Nature Cell Biology. 9 (4), 379-390 (2007).
  47. Shemesh, N., Shai, N., Ben-Zvi, A. Germline stem cell arrest inhibits the collapse of somatic proteostasis early in Caenorhabditis elegans adulthood. Aging Cell. 12 (5), 814-822 (2013).
  48. Vilchez, D., et al. RPN-6 determines C. elegans longevity under proteotoxic stress conditions. Nature. 489 (7415), 263-268 (2012).
  49. Liu, G., Rogers, J., Murphy, C. T., Rongo, C. EGF signalling activates the ubiquitin proteasome system to modulate C. elegans lifespan. EMBO Journal. 30 (15), 2990-3003 (2011).
  50. Asikainen, S., Vartiainen, S., Lakso, M., Nass, R., Wong, G. Selective sensitivity of Caenorhabditis elegans neurons to RNA interference. Neuroreport. 16 (18), 1995-1999 (2005).
  51. Calixto, A., Chelur, D., Topalidou, I., Chen, X., Chalfie, M. Enhanced neuronal RNAi in C. elegans using SID-1. Nature Methods. 7 (7), 554-559 (2010).
  52. Eremenko, E., Ben-Zvi, A., Morozova-Roche, L. A., Raveh, D. Aggregation of human S100A8 and S100A9 amyloidogenic proteins perturbs proteostasis in a yeast model. PLoS One. 8 (3), 58218 (2013).
  53. Gidalevitz, T., Ben-Zvi, A., Ho, K. H., Brignull, H. R., Morimoto, R. I. Progressive disruption of cellular protein folding in models of polyglutamine diseases. Science. 311 (5766), 1471-1474 (2006).
  54. Yu, A., et al. Tau protein aggregates inhibit the protein-folding and vesicular trafficking arms of the cellular proteostasis network. Journal of Biological Chemistry. , (2019).
  55. Yu, A., et al. Protein aggregation can inhibit clathrin-mediated endocytosis by chaperone competition. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (15), 1481-1490 (2014).
  56. Parker-Thornburg, J., Bonner, J. J. Mutations that induce the heat shock response of Drosophila. Cell. 51 (5), 763-772 (1987).
  57. Boutros, M., Ahringer, J. The art and design of genetic screens: RNA interference. Nature Reviews Genetics. 9 (7), 554-566 (2008).
  58. Jorgensen, E. M., Mango, S. E. The art and design of genetic screens: caenorhabditis elegans. Nature Reviews Genetics. 3 (5), 356-369 (2002).
  59. Wang, Z., Sherwood, D. R. Dissection of genetic pathways in C. elegans. Methods in Cell Biology. 106, 113-157 (2011).
  60. Rohl, A., Rohrberg, J., Buchner, J. The chaperone Hsp90: changing partners for demanding clients. Trends in Biochemical Sciences. 38 (5), 253-262 (2013).

Tags

Биология Выпуск 160 Caenorhabditis elegans шаперон генетические взаимодействия протеостаз RNAi экран чувствительный к температуре
Использование <em>Caenorhabditis elegans</em> для скрининга тканеспецифических взаимодействий шаперонов
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Dror, S., Meidan, T. D., Karady, I., … More

Dror, S., Meidan, T. D., Karady, I., Ben-Zvi, A. Using Caenorhabditis elegans to Screen for Tissue-Specific Chaperone Interactions. J. Vis. Exp. (160), e61140, doi:10.3791/61140 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter