Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

التوليد القابل للتحجيم من العضيات الدماغية الناضجة من الخلايا الجذعية البشرية المتعددة القدرات والتوصيف عن طريق المناعة

Published: June 13, 2020 doi: 10.3791/61143
Automatic Translation
1,2, 1, 1, 1, 1,2,3, 4, 4, 4, 2, 1
1iBB - Institute for Bioengineering and Biosciences and Department of Bioengineering, Instituto Superior Técnico, Universidade de Lisboa, 2Instituto de Medicina Molecular João Lobo Antunes, Faculdade de Medicina, Universidade de Lisboa, 3The Discoveries Centre for Regenerative and Precision Medicine, Lisbon Campus, Universidade de Lisboa, 4PBS Biotech, Inc, Camarillo, CA, USA

Summary

يصف هذا البروتوكول نظامًا ديناميكيًا لثقافة إنتاج مجاميع حجم متحكم فيها للخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات وزيادة تحفيز التمايز في الأعضاء الدماغية في ظل ظروف محددة كيميائيًا وخالية من التغذية باستخدام مفاعل حيوي أحادي الاستخدام.

Abstract

المخيخ يلعب دورا حاسما في الحفاظ على التوازن والتنسيق الحركي, وخلل وظيفي في الخلايا العصبية المخية المختلفة يمكن أن تؤدي إلى خلل cerebellar. معظم المعرفة الحالية حول الأنماط الظاهرية العصبية المرتبطة بالأمراض تستند إلى أنسجة ما بعد الوفاة ، مما يجعل فهم تطور المرض وتطوره صعبًا. كما استخدمت النماذج الحيوانية وخطوط الخلايا الخالدة كنماذج للاضطرابات العصبية. ومع ذلك ، فإنها لا تُكَلِم تماماً بمرض الإنسان. لدى الخلايا الجذعية المتعددة القدرات التي يسببها الإنسان إمكانات كبيرة في نمذجة الأمراض وتوفر مصدراً قيماً للنُهج التجديدية. في السنوات الأخيرة، جيل organoids الدماغي من iPSCs المستمدة من المريض تحسين آفاق النمذجة الأمراض العصبية. ومع ذلك، لا توجد بروتوكولات تنتج أعداداً كبيرة من الأعضاء وغلة عالية من الخلايا العصبية الناضجة في أنظمة الثقافة ثلاثية الأبعاد. البروتوكول المقدم هو نهج جديد لتوليد قابلة للتكرار وقابلة للتطوير من الأجهزة العضوية المشتقة من iPSC البشرية في ظل ظروف محددة كيميائيا باستخدام المفاعلات الحيوية القابلة للتطوير للاستخدام الواحد ، والتي تكتسب فيها الأجهزة هوية cerebellar. وتتميز organoids ولدت من خلال التعبير عن علامات محددة على حد سواء مرنا ومستوى البروتين. تحليل مجموعات محددة من البروتينات يسمح بالكشف عن مختلف مجموعات الخلايا المخية، التي توطين مهم لتقييم بنية organoid. يستخدم البكتات العضية والمزيد من الكبت المناعي لشرائح الأعضاء لتقييم وجود مجموعات محددة من خلايا المخيخ وتنظيمها المكاني.

Introduction

يمثل ظهور الخلايا الجذعية البشرية المتعددة القدرات (PSCs) أداة ممتازة للطب التجديدي وطراز الأمراض ، لأن هذه الخلايا يمكن أن تختلف في معظم أنساب الخلايا في جسم الإنسان1،2. منذ اكتشافها، PSC التمايز باستخدام نهج متنوعة وقد أفيد عن نموذج الأمراض المختلفة، بما في ذلك الاضطرابات العصبية3،4،5،6.

وفي الآونة الأخيرة، وردت تقارير عن ثقافات ثلاثية الأبعاد مستمدة من الهياكل الدماغية البشرية التي تشبه الهياكل الدماغية البشرية؛ وتسمى هذه organoids الدماغ3،7،8. ويتيح توليد هذه الهياكل من كل من اللجان الصحية الصحية الصحية الصحية والصحية الخاصة بالمريض فرصة قيّمة لوضع نماذج للتنمية البشرية والاضطرابات العصبية النمائية. ومع ذلك، من الصعب تطبيق الأساليب المستخدمة لتوليد هذه الهياكل الدماغية منظمة تنظيما جيدا لإنتاجها على نطاق واسع. لإنتاج الهياكل التي هي كبيرة بما يكفي لتكليل تكوين الأنسجة دون نخر داخل العضوية، بروتوكولات تعتمد على الالتزام العصبي الأولي في ظروف ثابتة، تليها التغليف في الهيدروجيل والثقافة اللاحقة في النظم الديناميكية3. غير أن هذه النهوج قد تحد من إمكانية زيادة الإنتاج العضوي. على الرغم من الجهود التي بذلت لتوجيه التمايز PSC لمناطق محددة من الجهاز العصبي المركزي, بما في ذلك القشرية, سترياتال, منتصف القرنين, والخلايا العصبية الحبل الشوكي9,,10,,11,12, لا يزال يشكل تحدياً توليد مناطق معينة في الدماغ في ظروف ديناميكية. على وجه الخصوص, جيل الخلايا العصبية cerebellar ناضجة في هياكل 3D لم يتم وصفها بعد. موغوروما وآخرون رائدة في توليد الظروف الثقافية التي تُستخيخ تطور المخ القريب المبكر13، وأبلغ مؤخراً عن بروتوكول يسمح للخلايا الجذعية الجنينية البشرية بتوليد بنية مستقطبة تذكرنا بأول يخسم المخيخ7في الثلث الأول من الحمل . ومع ذلك، فإن نضوج الخلايا العصبية cerebellar في الدراسات المبلغ عنها يتطلب تفكك organoids، وفرز السلف cerebellar، وزراعة نقّة مع الخلايا المغذية في نظام ثقافة أحادية الطبقة7،14،15،16. ولذلك، فإن الجيل القابل للتكرار من الأعضاء cerebellar المطلوبة للأمراض النمذجة في ظل ظروف محددة لا يزال تحديا المرتبطة الثقافة وتغذية من مصادر التغير.

يقدم هذا البروتوكول ظروف الثقافة المثلى للتوسع ثلاثي الأبعاد والتمايز الفعال للأجهزة الخاصة بشرية في الخلايا العصبية cerebellar باستخدام المفاعلات الحيوية ذات العجلات الرأسية ذات الاستخدام الواحد (انظر جدول المواد للمواصفات)، وتسمى فيما يلي المفاعلات الحيوية. وقد تم تجهيز bioreactors مع المكره الرأسي الكبير، والتي في تركيبة مع أسفل على شكل حرف U، وتوفير توزيع القص أكثر تجانسا داخل السفينة، والسماح لطيف، خلط موحد وتعليق الجسيمات مع انخفاض سرعات الانفعالات17. مع هذا النظام، يمكن الحصول على مجاميع الخلايا التي تسيطر عليها الشكل والحجم، وهو أمر مهم لتمايز أكثر تجانسا وكفاءة. وعلاوة على ذلك، يمكن توليد عدد أكبر من الأعضاء المشتقة من iPSC بطريقة أقل جاهدية.

السمة الرئيسية للعضوية، والتي هي هياكل متعددة الخلايا 3D التي تتشكل عادة من الخلايا الجذعية، هو التنظيم الذاتي لأنواع الخلايا المختلفة التي تشكل أشكال محددة مثل تلك التي ينظر إليها في morphogenesis الإنسان18،19،20. ولذلك، مورفولوجيا الجهاز هو معيار مهم لتقييمها أثناء عملية التفريق. والتبريد من organoids والمزيد من المناعة من شرائح organoid مع مجموعة محددة من الأجسام المضادة تسمح للتصور المكاني للعلامات الجزيئية لتحليل انتشار الخلايا ، والتمايز ، والهوية السكانية الخلية ، و المبرمج. مع هذا البروتوكول ، عن طريق الكبتات العضية التي تحتوي على المناعة ، لوحظ التزام عصبي أولي فعال من قبلاليوم السابع للتمايز. أثناء التمايز، لوحظ عدد من مجموعات الخلايا ذات الهوية الدماغية. بعد 35 يوما في هذا النظام الديناميكي، وsyepithelium cerebellar ينظم على طول محور picobasal، مع طبقة apical من السلفاروس المتكاثرة والخلايا العصبية ما بعد الحركة. خلال عملية النضج، من أيام 35-90 من التمايز، يمكن رؤية أنواع متميزة من الخلايا العصبية cerebellar، بما في ذلك خلايا بوركينجي (كالبيندين+)، الخلايا الحبيبية (PAX6+/ MAP2+) ، خلايا غولجي (Neurogranin+) ، خلايا فرشاة أحادي القطب (TBR2+) ، والخلايا العصبية العميقة الإسقاط النوية cerebellar (TBR1+). أيضا، لوحظت كمية غير مُهَمِّة من موت الخلايا في الأعضاء المُنشأة في المخيخ بعد 90 يوماً في الثقافة.

في هذا النظام، تنضج الأجهزة المشتقة من iPSC البشرية إلى خلايا عصبية مختلفة من المخيخ والبقاء على قيد الحياة لمدة تصل إلى 3 أشهر دون الحاجة إلى الانفصام وتربية الحيوانات المغذية، مما يوفر مصدرًا للخلايا العصبية الدماغية البشرية لنم نمستر المرض.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Passaging وصيانة iPSCs الإنسان في ثقافة أحادية الطبقات

  1. إعداد اللوحات
    1. ذوبان مصفوفة غشاء الطابق السفلي (انظر جدول المواد)المخزون في 4 درجة مئوية وإعداد 60 ميكرولتر aliquots. تجميد aliquots في -20 درجة مئوية.
    2. لمعطف آبار لوحة 6 بئر، ذوبان aliquot واحد من مصفوفة غشاء الطابق السفلي على الجليد. مرة واحدة إذابة إضافة 60 μL إلى 6 مل من DMEM-F12. إعادة بناء بلطف عن طريق الأنابيب صعودا وهبوطا.
    3. إضافة 1 مل من مصفوفة غشاء الطابق السفلي المخفف حل لكل بئر من 6 لوحة جيدا واحتضان في RT لمدة 1 ساعة على الأقل قبل passaging أو تخزينها في 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى 1 أسبوع.
  2. تمرير مستعمرات iPSC مع EDTA
    1. الحفاظ على iPSCs في ثقافة أحادية الطبقات في 6 لوحات جيدا في الحاضنة في 37 درجة مئوية، رطوبة 95٪ و 5٪ CO2.
      ملاحظة: في هذا البروتوكول، تم استخدام ثلاثة خطوط iPSC الإنسان متميزة: F002.1A.1321، خط iPSC episomal الإنسان (iPSC6.2)22، وحصل تجاريا iPS-DF6-9-9-9T.B (انظر جدول المواد).
    2. قبل passaging، احتضان اللوحات المخزنة (الخطوة 1.1) في درجة حرارة الغرفة (RT) لمدة 15 دقيقة وإعداد mTesR1 المتوسطة(الجدول 1).
    3. التعرق الحل من لوحة باستخدام ماصة المصلية وعلى الفور إضافة 0.5 مل من mTeSR1 المتوسطة لكل بئر.
    4. التعرق المتوسط المستهلك من البئر الذي يحتوي على iPSCs وغسل مرة واحدة باستخدام 1 مل من 0.5 mM EDTA في البئر.
    5. أضف 1 مل من 0.5 mM EDTA إلى كل بئر واحتضان في RT لمدة 5 دقائق.
    6. EDTA التعرق وإزالة الخلايا من الآبار عن طريق إضافة بلطف mTeSR1 المتوسطة و pipetting المستعمرات باستخدام p1000 micropipette. جمع الخلايا في أنبوب مخروطي.
      ملاحظة: لا خلايا الماصات صعودا وهبوطا أكثر من 3x.
    7. إضافة 1 مل من تعليق الخلية (المخفف 1:4) إلى كل بئر بحيث يحتوي كل بئر 1.5 مل من المتوسط بعد إضافة تعليق الخلية. إعادة الخلايا إلى الحاضنة في 5٪ CO2، 37 درجة مئوية.
    8. استبدال المتوسط الذي يقضيه يوميا والمرور كل 3 أيام عندما يتحقق التقاء 75٪-80٪.

2- بذرات مراكز iPSCs البشرية في المُتَفَدِر البيولوجي

  1. iPSCs احتضان نمت كما monolayers في mTeSR1 تكملها 10 μM من المانع روك Y-27632 (ROCKi). إضافة 1 مل من المتوسطة المكملة لكل بئر من 6 بئر لوحة الأنسجة وحضن لمدة 1 ساعة في 37 درجة مئوية، رطوبة 95٪ ، و 5٪ CO2.
    ملاحظة: يستخدم ROCKi لحماية iPSCs منفصلة من المبرمج23.
  2. بعد 1 ح من الحضانة، التعرق المتوسطة المستهلكة من كل بئر وغسل 1x مع 1 مل من 1× برنامج تلفزيوني في البئر.
  3. إضافة 1 مل من المتوسطة مفرزة الخلية (انظر جدول المواد)إلى كل بئر من 6 بئر لوحة واحتضان في 37 درجة مئوية لمدة 7 دقائق حتى الخلايا تنفصل بسهولة عن الآبار مع اهتزاز لطيف.
  4. الماصات الخلية مفرزة المتوسطة صعودا وهبوطا مع p1000 micropipette حتى الخلايا فصل وانفصال في خلايا واحدة. إضافة 2 مل من خلية كاملة ثقافة المتوسطة لكل بئر إلى تعطيل الهضم الأنزيمي والميصة الخلايا بلطف في أنبوب مخروطي معقمة.
  5. جهاز طرد مركزي في 210 × ز لمدة 3 دقائق وإزالة فائقة.
  6. Resuspend بيليه الخلية في المتوسطة الثقافة (أي mTeSR1 تكملها 10 μM من ROCKi) وعد iPSCs مع قياس الهيموسيت باستخدام الصبغة الزرقاء trypan.
  7. البذور 15 × 106 خلايا مفردة في مفاعل حيوي (الحد الأقصى لحجم 100 مل) مع 60 مل من mTeSR1 تكملها 10 ميكرومتر من ROCKi في كثافة الخلايا النهائية من 250،000 الخلايا / مل.
  8. أدخل الوعاء الذي يحتوي على وحدات iPSCs في وحدة القاعدة العالمية الموضوعة في الحاضنة عند 37 درجة مئوية، ورطوبة 95٪، و 5٪ CO2.
    ملاحظة: يتم الاحتفاظ بتحريك المُثيرات الحيوية لمدة 24 ساعة عن طريق تعيين التحكم الشامل في وحدة الأساس إلى 27 دورة في الدقيقة لتعزيز تجميع iPSC.

3- التمايز ونضج المجاميع المشتقة من iPSC البشرية في الأعضاء الدماغية

  1. تعريف يوم بذر الخلية المفردة كـ يوم 0.
  2. في اليوم الأول، جمع 1 مل من المجاميع iPSC عينة باستخدام ماصات المصلية. الحفاظ على مفاعل حيوي تحت الانفعالات كما كان من قبل عن طريق وضع وحدة قاعدة عالمية مع مفاعل حيوي يحتوي على المجاميع في تدفق معقمة قبل جمع العينة. لوحة تعليق الخلية في مرفق منخفضة جدا 24 لوحة جيدا. تحقق من تكوين المجاميع المشتقة من iPSC.
  3. الحصول على الصور مع المجهر البصري باستخدام التكبير الكلي من 40x أو 100x لقياس القطر الكلي.
  4. قياس مساحة المجاميع في كل صورة باستخدام برنامج فيجي.
    1. اختر "تحليل | تعيين القياسات" من شريط القوائم وانقر على "المنطقة" و "موافق".
    2. اختر "ملف | فتح" من شريط القوائم لفتح ملف صورة مخزنة. حدد أداة تحديد الخط المعروضة في شريط الأدوات وقم بإنشاء خط مستقيم فوق شريط المقياس المعروض في الصورة. اختر "تحليل | تعيين مقياس" من شريط القوائم.
    3. في "مسافة معروفة"إضافة فسحة شريط مقياس الصورة في μm. تعريف"وحدة الطول"كما μm. انقر على "العالمية" للحفاظ على الإعدادات و "موافق". حدد التحديد البيضاوي في شريط الأدوات.
    4. لكل تجميع رسم المنطقة مع الأداة البيضاوية. اختر "تحليل | قياس". حساب قطرها على أساس المساحة المقاسة، مع الأخذ في الاعتبار أن المجاميع هي تقريبا كروية باستخدام
      Equation 1
      مع A كمساحة من المجموع.
  5. عندما يكون متوسط قطر المجاميع 100 ميكرومتر، استبدل 80٪ من المتوسط المستهلك بmTeSR1 الطازجة بدون ROCKi. عندما تصل المجاميع 200-250 ميكرومتر في القطر، استبدال جميع المتوسط المستهلك مع gfCDM(الجدول 1)، والسماح للعضية تستقر في الجزء السفلي من مفاعل حيوي.
    ملاحظة: إذا تجاوز متوسط القطر الإجمالي 350 ميكرومتر لا تبدأ بروتوكول التمايز. كرر البذر من الخلايا المفردة. عموما، يستغرق حوالي 1 يوم لمجموع للوصول إلى متوسط قطرها 100 ميكرومتر.
  6. إدراج مفاعل حيوي يحتوي على المجاميع في وحدة قاعدة عالمية وضعت في الحاضنة في 37 درجة مئوية، رطوبة 95٪ و 5٪ CO2.
  7. تقليل التحريض على مفاعل حيوي إلى 25 دورة في الدقيقة.
  8. في اليوم الثاني، كرر الخطوات 3.2 و3.3 و3.4 لتقييم القطر الإجمالي. إضافة 30 ميكرولتر من FGF2 (التركيز النهائي، 50 نانوغرام/مل) و60 ميكرولتر من SB431542 (التركيز النهائي، 10 ميكرومتر) إلى 60 مل من gfCDM تمايز المتوسطة(الجدول 1). استبدال كل المتوسط المستهلك من مفاعل حيوي مع gfCDM المكملة. كرر الخطوة 3.6.
    ملاحظة: SB431542 أمر بالغ الأهمية لمنع التمايز الميندوديرم، مما يحفز التمايز العصبي24. FGF2 يستخدم لتعزيز الإبادة الجماعية للأنسجة العصبية25.
  9. في اليوم الخامس، كرر الخطوات 3.2 و3.3 و3.4 و3.8.
    ملاحظة: يجب زيادة الحجم الإجمالي أثناء بروتوكول التمييز. ومع ذلك، فإن القطر لا يكون إلا حرجة عندما يبدأ التمايز، لأن هذه المعلمة يمكن أن تؤثر على فعالية التمايز.
  10. في اليوم 7، كرر الخطوات 3.2 و3.3 و3.4. تخفيف FGF2 و SB431542 إلى 2/3: إضافة 20 ميكرولتر FGF2 و 40 ميكرولتر من SB431542 إلى 60 مل من gfCDM تمايز المتوسطة. استبدال جميع المتوسطات المستهلكة من مفاعل حيوي مع gfCDM المكملة. كرر الخطوة 3.6 وزيادة التحريض على مفاعل حيوي إلى 30 دورة في الدقيقة.
  11. في يوم 14 كرر الخطوات 3.2 و 3.3 و 3.4. إضافة 60 ميكرولتر من FGF19 (التركيز النهائي، 100 نانوغرام/مل) إلى 60 مل من gfCDM تمايز المتوسطة. استبدال كل المتوسطة المستهلكة من مفاعل حيوي مع gfCDM تستكمل مع FGF19. كرر الخطوة 3.6.
    ملاحظة: FGF19 يستخدم لتعزيز الاستقطاب من هياكل منتصف hindbrain26.
  12. في اليوم 18، كرر الخطوات 3.2 و3.3 و3.4 و3.11.
  13. في يوم 21 كرر الخطوات 3.2 و 3.3 و 3.4. استبدال كل المتوسط المستهلك من مفاعل حيوي مع المتوسطة اصبية كاملة(الجدول 1). كرر الخطوة 3.6.
    ملاحظة: Neurobasal المتوسطة هي وسيلة القاعدية المستخدمة للحفاظ على الخلايا العصبية في داخل الجهاز7.
  14. في يوم 28 كرر الخطوات 3.2 و 3.3 و 3.4. إضافة 180 ميكرولتر من SDF1 (التركيز النهائي، 300 نانوغرام/مل) إلى 60 مل من الوسط العصبي الكامل. استبدال جميع المتوسطة المستهلكة من مفاعل حيوي مع المتوسطة والأعصاب كاملة تستكمل مع SDF1. كرر الخطوة 3.6.
    ملاحظة: يستخدم SDF1 لتسهيل تنظيم طبقات الخلايا المتميزة27.
  15. في يوم 35 كرر الخطوات 3.2 و 3.3 و 3.4. استبدال كل المتوسط المستهلك من مفاعل حيوي مع كامل BrainPhys المتوسطة(الجدول 1). كرر الخطوة 3.6.
    ملاحظة: BrainPhys هو وسط الخلايا العصبية التي تدعم الخلايا العصبية النشطة متشابك28.
  16. استبدال 1/3 من الحجم الكلي كل 3 أيام مع كامل BrainPhys المتوسطة حتى اليوم 90 من التمايز.

4. إعداد العضيات للكبري والكيمياء المناعية

  1. جمع العضيات للمناعة
    1. جمع 1 مل من عينة من متوسطة تحتوي على organoids مع ماصة المصلية من مفاعل حيوي إلى أنبوب مخروطي 15 مل.
      ملاحظة: ينبغي جمع العضيات العضوية في نقاط زمنية مختلفة لتقييم فعالية التمايز، بما في ذلك الأيام 7 و14 و21 و35 و56 و70 و80 و90.
    2. إزالة افرا وغسل مرة واحدة مع 1 مل من 1× برنامج تلفزيوني.
      ملاحظة: لا الطرد المركزي الأجهزة. دع الأعضاء تستقر في قاع الأنبوب عن طريق الجاذبية.
    3. إزالة فائقة وإضافة 1 مل من 4٪ شبهformaldehyde (PFA). احتضان في 4 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. إزالة PFA المستهلكة وإضافة 1 مل من 1× برنامج تلفزيوني.
    4. تخزين organoids في 1 مل من 1× برنامج تلفزيوني في 4 درجة مئوية حتى معالجة للتبريد.
      ملاحظة: تخزين organoids في برنامج تلفزيوني 1X لمدة لا تزيد عن 1 أسبوع بعد التثبيت.
  2. إعداد العضيات للتبريد
    1. إزالة افرا من organoids المخزنة. إضافة 1 مل من 15٪ السكروز (ث / الخامس، المخفف في 1× برنامج تلفزيوني)، مزيج جيد عن طريق دوامة لطيف، واحتضان بين عشية وضحاها في 4 °C.
    2. إعداد حل من 15٪ السكروز/7.5٪ الجيلاتين(الجدول 2)والحفاظ على 37 درجة مئوية أثناء التحضير لتجنب الجيلاتين لترسيخ.
    3. إزالة محلول السكروز 15٪ ، إضافة 1 مل من 15 ٪ سكروز / 7.5 ٪ الجيلاتين إلى organoids ، ومزيج بسرعة عن طريق دوامة لطيف. احتضان في 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
    4. إضافة 15% السكروز/7.5% حل الجيلاتين إلى حاوية بلاستيكية تصل إلى نصف حجمها. انتظر التصلب في RT.
    5. بعد حضانة 1 ساعة، ضع بعناية قطرة السكروز/الجيلاتين التي تحتوي على العضيات على الجيلاتين المتوطد مع ماصة باستور. اترك لترسخ في RT لمدة 15 دقيقة. تأكد من تجنب تشكيل فقاعة.
    6. مكان 15٪ السكروز/7.5٪ الجيلاتين على رأس organoids حتى يتم تعبئة الحاوية. انتظر حتى التوطد الكامل في RT.
    7. بعد التصلب، احتضان 20 دقيقة في 4 درجة مئوية.
    8. قطع الجيلاتين إلى مكعب يحتوي على organoids في المركز وإصلاح مكعب الجيلاتين على قطعة من الورق المقوى مع قطرة من مركب O.C.T.
    9. ضع 250 مل من الليسبنتان في كوب 500 مل وملء حاوية مناسبة مع النيتروجين السائل. باستخدام ملقط وقفازات سميكة، ضع بعناية الكأس التي تحتوي على ال isopentane على سطح النيتروجين السائل وتبريد ال isopentane إلى -80 درجة مئوية.
    10. عندما يتم الوصول إلى -80 درجة مئوية، ضع مكعب الجيلاتين في الكوب الذي يحتوي على اليسوبنتان حتى يتجمد، مع الحفاظ على درجة الحرارة عند -80 درجة مئوية. اعتمادا على حجم المكعب، قد يستغرق 1-2 دقيقة.
      ملاحظة: تجنب درجات الحرارة أقل من -80 درجة مئوية أو الإفراط في تجميد الوقت، لأنه قد يسبب تكسير المكعب.
    11. عندما المجمدة، بسرعة تخزين مكعب الجيلاتين في -80 درجة مئوية وتخزينها حتى التبريد.
  3. اباكات من العضيات
    1. قم بتشغيل التبريد وحدد كلاً من العينة (OT) ودرجات حرارة cryochamber (CT) عند -25 درجة مئوية.
    2. عندما تستقر كلتا درجات الحرارة، قم بإصلاح مكعب الجيلاتين الذي يحتوي على الأعضاء على العينة باستخدام مركب O.C.T.
    3. تحديد سمك القسم عند 12 ميكرومتر.
    4. قطع المكعب وجمع 3-4 شرائح على شرائح المجهر التصاق (انظر جدول المواد).
    5. يُخزن عند -20 درجة مئوية حتى الاستخدام.
  4. مناعة شرائح الأعضاء
    1. ضع شرائح المجهر التي تحتوي على أقسام أعضاءية في جرة القذف مع 50 مل من PBS 1x مسبقًا ، وعقد ما يصل إلى 10 شرائح من الخلف إلى الخلف.
      ملاحظة: يجب أن تكون جميع الأجزاء العضوية مغمورة بالسائل.
    2. احتضان لمدة 45 دقيقة في 37 درجة مئوية ل degelatinize الشرائح.
    3. غسل 1x مع 50 مل من 1× برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق في RT: نقل الشرائح إلى جرة القذف التي تحتوي على 1× برنامج تلفزيوني جديد.
    4. نقل الشرائح إلى جرة القذف التي تحتوي على 50 مل من الجليسين الطازجة(الجدول 2)واحتضان لمدة 10 دقيقة في RT.
    5. نقل الشرائح إلى جرة القذف التي تحتوي على 50 مل من 0.1٪ تريتون(الجدول 2)و permeabilize لمدة 10 دقيقة في RT.
    6. غسل مع 1× برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق 2x.
    7. إعداد طبق مناعة مع ورقة 3 مم غارقة في 1× برنامج تلفزيوني. الشرائح الجافة مع نسيج في جميع أنحاء شرائح ووضعها على ورقة 3 ملم. مع ماصة باستور، تغطية السطح كله من الشرائح مع حل حظر(الجدول 2)مع ~ 0.5 مل لكل شريحة. احتضان لمدة 30 دقيقة في RT.
    8. إزالة حل حظر الزائدة وتجفيف الشرائح مع الأنسجة في جميع أنحاء شرائح. مكان 50 ميكرولتر من الأجسام المضادة الأولية (الجدول 3) المخفف في محلول الحجب على الأقسام والغطاء مع الأغطية. ضع الشرائح في طبق مناعي تم إعداده مسبقًا. احتضان ليلة وضحاها في 4 °C.
    9. نقل الشرائح إلى جرة القذف مع 50 مل من TBST(الجدول 2)،والسماح للأغطية تقع، وغسل مع TBST لمدة 5 دقائق 3x.
    10. ضع 50 ميكرولتر من الجسم المضاد الثانوي المخفف في محلول الحجب على الأقسام واغطيه بالأغطية. ضع الشرائح في طبق المناعة المعد مسبقًا. احتضان لمدة 30 دقيقة في RT، محمية من الضوء.
    11. نقل الشرائح إلى جرة copling مرة أخرى وغسل مع 50 مل من TBST لمدة 5 دقائق 3x.
    12. جفف الشرائح بمنسجة حول الشرائح ووضع الشرائح في طبق مناعي تم إعداده مسبقًا. أضف 0.5 مل من محلول DAPI على السطح الكامل للشرائح مع ماصة باستور. احتضان لمدة 5 دقائق في RT.
    13. كرر الخطوة 4.4.9.
    14. جفف الشرائح بعناية مع نسيج. إضافة 50 μL من تصاعد متوسطة قطرة قطرة على طول الشريحة ومن ثم خفض بعناية غطاء على كل شريحة، والانحناء قليلا لتجنب فقاعات.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

وقد بدأ البروتوكول عن طريق تعزيز تجميع الخلايا باستخدام 0.1 لتر المفاعلات الحيوية (الشكل 1A). تم إجراء التلقيح في الخلايا المفردة من iPSCs ، مع 250،000 خلية / مل بذر في 60 مل من المتوسط مع سرعة الانفعالات من 27 دورة في الدقيقة. تم تعريف هذا اليوم 0. بعد 24 ح، شكلت الخلايا بكفاءة المجاميع على شكل كروي (اليوم 1، الشكل 1B)،وكان مورفولوجيا جيدا حتى اليوم 5، مع زيادة تدريجية في الحجم، مما يدل على درجة عالية من التجانس في المورفولوجيا والحجم الكلي مع مرور الوقت. (الشكل 1B). كما كشف تحليل كمي عن طريق المجهر التوزيع الطبيعي للأحجام الإجمالية حسب اليوم 1 (الشكل 1C). حجم الإجمالي هو معلمة مادية هامة قادرة على دفع الخلايا للتمييز نحو مختلف أنساب29،30. لهذا السبب، استنادا إلى الحجم الإجمالي المبلغ عنها في الدراسات السابقة للحث على كفاءة العصبية31،,32 والتزام cerebellar21،تم الحفاظ على المجاميع المتولدة في mTeSR1 المتوسطة في 25 دورة في الدقيقة حتى وصلت إلى القطر المطلوب قبل البدء في التمايز (~ 200 ميكرومتر). وفي اليوم الثاني، كان متوسط القطر 221.0 ± 54.4 ميكرومتر (متوسط ± SD) لخط الخلايا F002.1A.13 و212.1 ± 42.1 ميكرومتر لخط الخلية iPSC6.2. على هذا النحو، حققت كلا خطوط الخلية الحجم التجميعي الأمثل في هذه النقطة الزمنية (الشكل 1C).

تحديد اليوم الذي تم فيه إجراء البذر من iPSCs كما اليوم 0، في اليوم 2، بعد تحقيق القطر الكلي المطلوب، تم إحداث الالتزام العصبي باستخدام في وقت واحد SB431542، FGF2، والأنسولين، وتعزيز التمايز العصبي، فضلا عن الحث المعتدل اللازمة لنمط منتصف ندبراس. بعد ذلك، تمت إضافة FGF19 و SDF1 إلى الثقافة في اليومين 14 و 28 على التوالي، لتعزيز جيل من السلف cerebellar مختلفة. في الأيام الأولى من الحث العصبي، تم استخدام سرعة دوران 25 دورة في الدقيقة، والتي تم زيادتها إلى 30 دورة في الدقيقة بعد 7 أيام لتجنب تراكم وتكتل المجاميع أكبر(الشكل 2A). خلال التمايز، أظهرت العضيات ظهار أكثر وضوحا مماثلة لهياكل تشبه الأنبوب العصبي مع الفضاء الإنارة(الشكل 2B). بالإضافة إلى ذلك، أظهر تقييم توزيع القطر العضوي توزيع حجم متجانس خلال الالتزام cerebellar الأولي حتى اليوم 14(الشكل 2B).

يدعم تحليل الفلوروسين المناعي أن الالتزام العصبي الفعال للعضيات المشتقة من iPSC يتحقق بالفعل بحلول اليوم السابع من التمايز بعد إضافة FGF2 و SB431542. وكشفت شعيرات organoids العديد من الهياكل تذكرنا أنبوب العصبي تلطيخ لPAX6 وSESTIN، مع معظم الخلايا داخل organoids التعبير عن علامة السلف NESTIN في أيام 7 و 14 من التمايز(الشكل 2C). بعد ذلك، FGF19 و SDF1 تعزيز جيل طبقات السلف المتكاثرة باستمرار (PAX6+) وتحقق تمايز الخلايا العصبية كفاءة، كما يتضح من التعبير عن TUJ1، فئة الخلايا العصبية المحددة الثالث بيتا tubulin، من قبل أيام 21 و 35(الشكل 2C). وبالإضافة إلى ذلك، لوحظ أيضا تمايز cerebellar كفاءة بعد 21 يوما في 0.1 L فولكس فاجن المفاعلات الحيوية، والتي أظهرتها وجود اثنين من مجموعات الخلايا المختلفة: ذريات الخلايا الحبيبية (BARLH1+ الخلايا، الشكل 3A)،وSrekinje الخلية السلف (OLIG2+ الخلايا، الشكل 3B). بعد 35 يوما في الثقافة، يبدو أن مجموعات الخلايا المختلفة داخل الأعضاء المنظمة في طبقات متميزة. وقد لوحظت مختلف الهياكل المسطحة البيضاوية داخل organoids مع BARHL1+ dorsal cerebellar السلف كطبقة مستمرة على الجانب السطحي من organoid (الشكل 3C،D) وSX2+ في المنطقة البارزة من هذه الهياكل البيضاوية(الشكل 3D). وبالإضافة إلى ذلك، يبدو TUJ1+ الخلايا العصبية حديثي الولادة في الهجرة نحو السطح، وإعادة المحاذاة شعاعي على السطح الخارجي للعضوي (الشكل 3E).

بعد توليد السلف cerebellar، تم تشجيع مزيد من النضج باستخدام BrainPhys المتوسطة28 تكملها العوامل العصبية BDNF وGDNF. تم استخدام تلطيخ الفلوروسين المناعي من الاكتشافات البكانية العضوية للكشف عن أنواع فرعية متميزة من الخلايا العصبية cerebellar. تم الكشف عن خلايا بوركينجي، الخلايا العصبية GABAergic التعبير عن calbindin البروتين الكالسيوم ملزمة (CALB، الشكل 3F)،في organoids cerebellar بعد بروتوكول النضج. وبالإضافة إلى ذلك، تم تحديد آخر نوع الخلايا العصبية cerebellar الرئيسية، والخلايا الحبيبية، باعتبارها مجموعة فرعية من الخلايا coexpressing PAX6 و MAP2 (الشكل 3G). ومن المثير للاهتمام، تم الاحتفاظ بمجموعة من PAX6+ السلفاين الذين لا يعبرون عن MAP2 حتى 80 يوما من التمايز. كما تم الكشف عن أنواع أخرى من الخلايا العصبية cerebellar, بما في ذلك خلايا فرشاة أحادية القطب التعبير عن TBR2 (الشكل 3H), والخلايا العصبية إسقاط cerebellar العميق التعبير عن TBR1 (الشكل 3I). بالإضافة إلى التمايز الفعال cerebellar والنضج، هذا النظام ثقافة ديناميكية 3D باستخدام برنامج تلفزيوني 0.1 L فولكس فاجن bioreactors سمح organoids أن تبقى قابلة للحياة لمدة تصل إلى 90 يوما، دون موت الخلية كبيرة ونخر(الشكل 3J).

Figure 1
الشكل 1: توليد مجاميع يتم التحكم في حجمها باستخدام المفاعلات الحيوية القابلة للتحجيم. (أ)ملامح التصميم من مفاعل حيوي. (ب) التصوير الضوئي Brightfield تظهر المجاميع من اثنين من خطوط مختلفة iPSC في أيام 1 و 2 و 5. شريط مقياس = 100 μm. (C)توزيع حجم المجاميع العائمة من خطوط iPSC مختلفة في المفاعلات الحيوية. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: توليد أجهزة نفخية مشتقة من iPSC باستخدام 0.1 لتر من المفاعلات الحيوية. (أ)التمثيل التخطيطي لإجراء الثقافة للحث على التفريق بين iPSCs إلى organoids cerebellar. تم زرع الخلايا بكثافة 250,000 خلية/مل واستخدمت سرعة تحريض 27 دورة في الدقيقة لتعزيز تجميع الخلايا. خلال الأيام الأولى من التمايز، تم الحفاظ على المجاميع بسرعة تحريضية قدرها 25 دورة في الدقيقة. بعد ذلك ، لتجنب تراكم المجاميع الأكبر ، تم زيادة سرعة التحريض إلى 30 دورة في الدقيقة. (B) توصيف شكل وحجم الجهاز. تظهر الصور الضوئية برايتونفيلد الأجهزة العضوية المشتقة من iPSC أثناء تمايز المخيخ في المفاعلات الحيوية VW 0.1 L. شريط مقياس = 100 μm. توزيع أقطار الأعضاء يدل على أن الثقافة حافظت على أحجام أعضاءية متجانسة على طول بروتوكول التمايز. (C) الحث العصبية الفعالة في organoids المشتقة من iPSC. الفلور المناعية لرقم النسجين، PAX6، و TUJ1 أثناء تمايز المخيخ. شريط مقياس = 50 ميكرومتر. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: تمايز الدماغي ونضجه بكفاءة في العضيات المشتقة من iPSC البشرية. (أ-هـ) التزام فعال cerebellar. تحليل المناعة لعلامات BARHL1 و SOX2 و OLIG2 و NCAD و TUJ1 عند النقاط الزمنية المشار إليها لبروتوكول تمايز cerebellar. (F-I) نضوج فعال من أجهزة العضية cerebellar المشتقة من الإنسان. علم المناعة الذي يظهر أنواع مختلفة من الخلايا العصبية المخيّرة، بما في ذلك خلايا بوركينجي (CALB، F)، وخلايا الحبيبية (PAX6 و MAP2، G)، وخلايا الفرشاة أحادية القطب (TBR2)، والنوى العميقة الإسقاطات الخلايا العصبية (TBR1). (J) قابلية الخلية العالية للحياة بعد نضوج cerebellar. وأظهرت حية / ميتة (calcein-AM، الأخضر وأوديد بروبديوم، أحمر) تلطيخ organoids قابلية عالية للخلايا وديمومة لا دليل على المناطق النخرية بعد 80 يوما في المفاعلات الحيوية. شريط مقياس = 50 ميكرومتر. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

إعداد وسائل الإعلام mTeSR1
الحجم النهائي: 500 مل		 1. ذوبان mTeSR1 5× الملحق في درجة حرارة الغرفة (RT) أو عند 4 درجة مئوية بين عشية وضحاها ومزيج مع المتوسطة القاعدية
2. تخزين كامل mTeSR1 المتوسطة في 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى 2 أسابيع أو إعداد 40 مل aliquots وتخزينها في -20 درجة مئوية
3. ما قبل دافئ mTeSR1 كاملة في RT قبل الاستخدام
gfCDM (عامل النمو خالية من عامل كيميائيا المتوسطة المحددة)
الحجم النهائي: 60 مل		 30 مل لحم F12
30 مل IMDM
600 ميكرولتر محدد كيميائياً تركيز الدهون (1 ٪ v / v)
2.4 ميكرولتر أحادية اليوجليسيرول (450 ميكرومتر)
30 ميكرولتر أبو-transferrin (محلول الأسهم في 30 ملغ / مل في الماء، والتركيز النهائي: 15 ميكروغرام / مل)
300 ملغ من تبلور تنقيتها BSA (5 ملغ / مل)
42 ميكرولتر الأنسولين (تركيز المخزون في 10 ملغ / مل، التركيز النهائي: 7 ميكروغرام / مل)
300 ميكرولتر P /S (0.5٪ v/v، 50 U/ml البنسلين/50 ميكروغرام/مل ستريبتوميسين)
الباس العصبي
الحجم النهائي: 60 مل		 60 مل من المتوسط العصبي
600 ميكرولتر N2 الملحق
600 ميكرولتر جلوتاماكس الأول
300 ميكرولتر في الثانية (0.5 ٪ v/v).
العقل الكامل للدماغ
الحجم النهائي: 60 مل		 60 مل من فيزياء الدماغ
1.2 مل NeuroCult SM1 الملحق العصبي
600 ميكرولتر N2 الملحق
12 ميكرولتر BDNF (التركيز النهائي: 20 نانوغرام /مل)
12 ميكرولتر GDNF (التركيز النهائي: 20 نانوغرام / مل)
300 ميكرولتر ديبوتيريل-cAMP (تركيز المخزون: 100 ملغم / مل في الماء، والتركيز النهائي: 1 مل م)
42 ميكرولتر حمض الاسكوربيك (تركيز المخزون: 50 ميكروغرام / مل في الماء، التركيز النهائي: 200 ن م)
حلول المخزون من عوامل النمو والجزيئات الصغيرة عامل نمو الخلايا الليفية الأساسية (bFGF/FGF2)
تركيز المخزون: 100 ميكروغرام/مل		 1. إعادة تشكيل في 5 M تريس، درجة الH 7.6، بتركيز 10 ملغ / مل
2- تخفيفها بنسبة 0.1 في المائة من إجمالي نسبة الانبعاثات الإجمالية في برنامج PBS (V/v) إلى تركيز نهائي للمخزون 100 ميكروغرام/مل
العامل 1 المشتق من الخلايا اللوغاريتمية (SDF1)
تركيز المخزون: 100 ميكروغرام/مل		 1. إعادة تشكيل في الماء بتركيز 10 ملغ / مل
2- تخفيفها بنسبة 0.1 في المائة من إجمالي نسبة الانبعاثات الإجمالية (V/v) في برنامج PBS إلى تركيز نهائي للمخزون 100 ميكروغرام/مل.
عامل التغذية العصبية المستمد من الدماغ (BDNF)
تركيز المخزون: 100 ميكروغرام/مل
عامل التغذية العصبية المستمد من الخلايا الدغلية (GDNF)
تركيز المخزون: 100 ميكروغرام/مل
عامل النمو الليفي 19 (FGF19)
تركيز المخزون: 100 ميكروغرام/مل		 1. إعادة تكوين في 5 mM فوسفات الصوديوم، وhH 7.4، بتركيز 10 ملغ / مل
2- تخفيفها بنسبة 0.1 في المائة من إجمالي نسبة الانبعاثات الإجمالية في برنامج PBS (V/v) إلى تركيز نهائي للمخزون 100 ميكروغرام/مل
روك المانع Y-27632
تركيز المخزون: 10mM		 إعادة تشكيل في DMSO بتركيز 10 mM.
SB431542
تركيز المخزون: 10mM
الانسولين
تركيز المخزون: 10 ملغ / مل		 1. إعادة تشكيل 10 ملغ من الأنسولين في 300 ميكرولتر من 10 mM NaOH
2. بعناية إضافة 1 M NaOH حتى يصبح الحل واضح شفاف
3. تعبئة ل 1 مل مع الماء المعقم.

الجدول 1: حلول المخزون وإعداد وسائل الإعلام. المدرجة هي جميع المكونات والأحجام المستخدمة في إعداد وسائل الإعلام للصيانة بروتوكول iPSCs والتمايز ، فضلا عن حلول المخزون من عوامل النمو والجزيئات الصغيرة. بالنسبة لحلول المخزون، يتم سرد كل تركيزات الأسهم وبروتوكولات إعادة التشكيل.

جيلاتين/سكروز
التركيز النهائي: 7.5٪/15٪ ث / ث		 1. تزن 15 غرام من السكروز و 7.5 غرام من الجيلاتين في زجاجة شوت معقمة وتخلط جيدا
2. قبل الدافئة برنامج تلفزيوني 1× في 65 درجة مئوية
3. إضافة برنامج تلفزيوني 1 تدفئة مسبقا× إلى الوزن النهائي من 100 غرام ومزيج جيد
4. ضع زجاجة شوت في لوحة تدفئة عند 65 درجة مئوية وارتجف حتى يذوب الجيلاتين
5. احتضان في 37 درجة مئوية حتى يستقر الحل
جليكاين
التركيز النهائي: 0.1 M		 إضافة 0.37 ج جليكين إلى 50 مل من برنامج تلفزيوني 1× الطازجة.
تريتون الحل
التركيز النهائي: 0.1 ٪ ث / الخامس		 1. إعداد 10 ٪ تريتون X - 100 الأسهم : 5 غرام من تريتون X - 100 في 50 مل من برنامج تلفزيوني 1×
2. إضافة 0.5 مل من الأسهم تريتون X-100 إلى 50 مل من برنامج تلفزيوني 1×.
TBST
20 mM تريس-HCl pH 8.0، 150 mM NaCl، 0.05 ٪ ث / v Tween-20		 20 مل تريس 1 M
30 مل ناكل 5 م
5 مل توين-20 (10% مخزون: 5 غرام من Tween-20 في 50 مل ماء)
تعبئة إلى 1 لتر مع الماء.
حظر الحل إضافة 5 مل من مصل الأبقار الجنين (FBS, التركيز النهائي: 10 % v/v) إلى 50 مل من TBST.
حل DAPI إضافة 15 ميكرولتر من محلول DAPI (1 ملغم /مل) إلى 10 مل من المياه المُتفَضَّلة
ميول 1. إضافة 2.4 غرام من الـ"موريول" إلى 6 غ من الغليسيرول واهتزاز لمدة ساعة في لوحة مُدفأة مسبقاً عند 50 درجة مئوية
2. إضافة 6 مل من الماء المقطر ويهز لمدة 2 ساعة
3. إضافة 12 مل من تريس 200 مل (pH 8.5) ويهز لمدة 10 دقائق
4. الطرد المركزي في 5000 × غرام لمدة 15 دقيقة
5. Aliquot وتخزينها في -20 درجة مئوية.

الجدول 2: حلول لإعداد العضيات للتبريد والكبت بالمناعة. يتم سرد جميع المكونات والأحجام المستخدمة لإعداد الحلول المستخدمة في إعداد العضيات لتكرير البكتين والمناعة.

جسم الأنواع المضيفة التخفيف
بارهل1 الارنب 1/500
كالبيندين الارنب 1/500
MAP2 الماوس 1/1000
N-CADHERIN الماوس 1/1000
نستين الماوس 1/400
OLIG2 الارنب 1/500
PAX6 الارنب 1/400
SOX2 الماوس 1/200
TBR1 الارنب 1/200
TBR2 الارنب 1/200
TUJ1 الماوس 1/1000

الجدول 3: الأجسام المضادة الأولية. يتم سرد الأجسام المضادة الأولية، واستنساخ، والتخفيف الأمثل المستخدمة في كبت المناعة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

وقد أدت الحاجة إلى أعداد كبيرة من الخلايا وكذلك الظروف الثقافية المحددة لتوليد أنواع محددة من الخلايا لفحص الأدوية وتطبيقات الطب التجديدي إلى تطوير نظم ثقافة قابلة للتطوير. في السنوات الأخيرة, وقد أبلغت عدة مجموعات جيل قابلة للتطوير من السلف العصبية والخلايا العصبية الوظيفية32,33,34, توفير تقدم كبير في تطوير نماذج جديدة للاضطرابات العصبية. ومع ذلك، فإن تلخيص بعض الأحداث الحرجة للتنمية الجنينية لا تزال تفتقر، والحفاظ على الخلايا العصبية الوظيفية ولدت في تعليق لفترات طويلة من الزمن لم يتحقق بعد34. يتم تقديمها هنا هو نظام ثقافة ثلاثية الأبعاد ديناميكي قادر على توليد أجهزة يورانية مشتقة من iPSC مع هوية cerebellar ، وزيادة تعزيز النضج في الخلايا العصبية cerebellar الوظيفية تحت ظروف محددة كيميائيا وخالية من التغذية في الثقافة الديناميكية.

قبل البدء في تمايز cerebellar، فمن الأهمية بمكان للحفاظ على نوعية iPSCs الإنسان. وهكذا، وبغية عدم المساس بالتمايز، ينبغي ألاّ يتم أكثر من ثلاثة مقاطع من مراكز التحلل من الذوبان إلى تلقيح مفاعلات مفاعلات أحيائية. 10- ومن الخطوات الهامة في بروتوكول التمييز تقييم الحجم الإجمالي. حجم الإجمالي له دور حاسم في تحفيز التمايز نحو نسب خلية محددة29. وإلى جانب ذلك، هناك حد أدنى للحجم الذي يبدو أن تفضل التمايز35. كما ذكرت بالفعل، فإن القطر التجميعي الأمثل المشتق من iPSC لتعزيز الالتزام العصبي الفعال31و32 وتمايز cerebellar21 هو قطر 200 ميكرومتر.

بالإضافة إلى ذلك ، في هذا البروتوكول الديناميكي ، فإن سرعة التحريض المستخدمة في الأيام الأولى من الثقافة أمر بالغ الأهمية للتحكم في القطر الكلي والحث العصبي. وقد بدأت هذه الثقافة عند 27 دورة في الدقيقة، وهو ما يكفي لتعزيز تجميع مجموعات الـ iPSCs وتجنب تكوين مجاميع أكبر (ينبغي تجنب الأقطار التي تزيد عن 350 ميكرومتر). ويمكن زيادة الانفعالات المستخدمة لتعزيز تجميع الخلايا بعد البذر خلية واحدة إلى 30 دورة في الدقيقة دون التأثير على جدوى الخلية؛ ومع ذلك، من المتوقع أن تنتج سرعات الانفعالات الأعلى مجاميع أصغر. اعتمادا على خط iPSC، 24 ساعة بعد بذر الخلايا باستخدام 27 دورة في الدقيقة، ومن المتوقع اثنين من سيناريوهات مختلفة: المجاميع تشكل أقطار أصغر الحالية (< 200 μm) أو وصلت إلى مجموعة من الأحجام بين 200-300 ميكرومتر. إذا كانت المجاميع أكبر من 350 ميكرومتر في 24 ساعة بعد بذر الخلايا، لا ينبغي إجراء التمايز، وينبغي تكرار بذر الخلية، لأن كفاءة التمايز ستكون منخفضة جدا. إذا كانت المجاميع أصغر من 200 ميكرومتر، ينبغي استبدال المتوسط المستهلك بوسيلة صيانة iPSC، وخفض سرعة الانفعالات إلى 25 دورة في الدقيقة. مع هذا تعديل, توقع قطر إجماليّة أن يزيد من يوم 1 إلى يوم 2, على الأرجح واجبة إلى الدمج من تجميعات فرديّة يشجّع بال ينخفض في التقلّل في التقلّيج سرعة. في حالة المجاميع ذات الأحجام بين 200-300 ميكرومتر، يجب استبدال الوسط المستهلك بوسيلة تمايز متوسطة، وينبغي البدء في الحث العصبي مع FGF2 بعد يومين في الثقافة. عند هذه النقطة، ينبغي أيضا أن تكون سرعة التحريض خفضت قليلا لمنع موت الخلايا المفرطة، لأن الخلايا هي أكثر حساسية للإجهاد القص في وجود وسيط التمايز. بالإضافة إلى ذلك، يمكن تحليل تجانس السكان باستخدام معامل الاختلاف (CV)، الذي يقيس التباين بربط الانحراف المعياري مع متوسط القطرات الإجمالية، وفقًا للمعادلة

Equation 2

في أي δ يمثل الانحراف المعياري من القطر الكلي μ هو متوسط القطر. في هذا النظام الديناميكي، كان متوسط السيرة الذاتية الملاحظة 12.5 ± 3.3٪ (متوسط ± SD) لخط الخلايا F002.1A.13 و 19.0 ± 0.37٪ لخط الخلية iPSC6.2 في اليوم 2. وهكذا ، في هذا النظام ، ينبغي توقع عدد سكان حجم متجانس مع السيرة الذاتية أقل من 0.2 (< 20٪ من الاختلاف). وبعد 7 أيام من التمايز، تراوح متوسط القطر الإجمالي بين 300 و360 ميكرومتر، وارتفعت سرعة الانفعالات إلى 30 دورة في الدقيقة لمنع المجاميع من الاستقرار في الجزء السفلي من المحرك الحيوي 0.1 لتر من فولكس فاجن.

وقد تم مؤخرا الإبلاغ عن التمييز بين الأعضاء cerebellar حتى اليوم 35 وتحليل الحجم الكلي في ظروف ثابتة21. وأظهر المؤلفون أن المجاميع ثلاثية الأبعاد التي تشكلت وحافظت عليها في لوحات (على سبيل المثال، Aggrewell) حتى اليوم 7 من التمايز كانت متجانسة في الحجم والشكل21. ومع ذلك ، بعد نقل المجاميع إلى مرفق منخفض للغاية 6 لوحات ثقافة جيدا ، وبدأت المجاميع لتتنوع في الحجم والمورفولوجيا21. في اليوم 35 في ظروف ثابتة، وصلت بعض المجاميع 3D 1،000 ميكرون لخطوط الخلايا المختلفة، مما يحد من انتشار المواد الغذائية والأكسجين. في المقابل، باستخدام ظروفنا الديناميكية، لم تصل المجاميع إلى أكثر من 800 ميكرومتر في القطر في اليوم 35، مع تحسين نقل الكتلة بسبب الانفعالات المستمرة للوسط التي تروج لها العجلة الرأسية. وعلاوة على ذلك، تم الحفاظ على الأحجام الإجمالية حتى نهاية عملية النضج، والتي تبين قطرها الإجمالي 646.6 ± 104.2 ميكرومتر في اليوم 90، أطول ثقافة أجريت في 0.1 لتر VW المفاعلات الحيوية.

تم تحريض cerebellar كفاءة من خلال إضافة متتابعة من SB431542، FGF2، FGF19، و SDF1 في هذا النظام الديناميكي 3D. يبدأ البروتوكول مع مزيج من SB431542، وهو تحول عامل النمو بيتا (TGF-ß) مستقبلات مانع أن يمنع التمايز mesendodermal، وFGF2، الذي له تأثير كبير في الdal من الأنسجة العصبية25. ولذلك، فإن إضافة هذين الجزيئين خلال الأيام الأولى من الثقافة أمر ضروري لتعزيز تمايز الخلايا إلى منتصف الظهر، وهو الإقليم الذي يؤدي إلى الأنسجة المخيّرة. بعد التعريفي الأولي إلى أنسجة منتصف hindbrain، فمن الضروري أن تضيف FGF19 لتعزيز جيل عفوي من هياكل منتصف hindbrain مع قطبية الظهر البطني، فضلا عن توليد السلف cerebellar مختلفة36،26. يسهل SDF1 تنظيم طبقات متميزة من السلف cerebellar، كما رأينا في مرحلة النمو التي يحدث في تكوين الأوعية العصبية cerebellar27. حتى اليوم 35، يمكن لهذه الجزيئات تعزيز تنظيم organoids cerebellar التي يمكن أن تُعيد تطور المخيخ البشري، الذي يتوافق مع المخيخ في الثلث الأول من الحمل. بعد تنظيم السلف cerebellar في طبقات مختلفة، تم استخدام وسيلة الخلايا العصبية تعريف لتعزيز نضوجهم28. ويمكن أيضا أن يتم اختبار وسائل الإعلام الأخرى المستخدمة للحفاظ على الخلايا العصبية، ولكن من المتوقع انخفاض الكفاءة. وهكذا ، في هذا البروتوكول ، تم استخدام BrainPhys لتعزيز تمايز الخلايا التي تلتزم cerebellar إلى الخلايا العصبية cerebellar ، لأنه تم الإبلاغ عن تقليد أفضل البيئة العصبية الصحية ودعم النشاط العصبي الفسيولوجي للخلايا العصبية المولدة28.

باستخدام هذه الظروف الديناميكية، يمكن تحقيق نشر أكثر كفاءة من المواد الغذائية والأكسجين، وعوامل النمو. ومع ذلك، ترتبط بعض القيود مع التحريض المستخدمة في بروتوكول التمييز. يمكن إدخال بعض الإجهاد القص من قبل عملية الانفعالات، والتي يمكن أن تؤثر على البقاء على قيد الحياة، والانتشار، والتمايز من الخلايا. لذلك، أثناء خطوة النضج، التي تكون الخلايا أكثر حساسية، يجب أن تكون الثقافة مراقبة بعناية.

وقد تم بالفعل الإبلاغ عن التفريق بين organoids cerebellar تذكرنا تطور المخنط الجنيني البشري7. ومع ذلك، فإن المزيد من نضوج هذه الأعضاء الدماغية الجنينية في الخلايا العصبية المخية باستخدام الثقافات ثلاثية الأبعاد لا يزال يمثل تحدياً. لم يتحقق توليد الخلايا العصبية الوظيفية cerebellar إلا عن طريق coculturing مع الخلايا الحبيبية من مصادر مختلفة4,7,15. وقد نجح هذا البروتوكول في تحسين التزام الـ cerebellar من مراكز iPSCs البشرية؛ بالإضافة إلى ذلك، هذا هو البروتوكول الأول للتمايز بين الخلايا العصبية cerebellar مختلفة في نظام ثقافة 3D دون coculturing مع الخلايا المغذية. على وجه التحديد، يمكن إنتاج أنواع الخلايا التالية في نظام ثقافتنا الديناميكي: خلايا بوركينجي (كالبيندين+) ، الخلايا الحبيبية (PAX6+/ MAP2+) ، خلايا فرشاة أحادية القطب (TBR2+) ، وخلايا إسقاط النوى العميقة (TBR1+) ، والتي تم الحفاظ عليها في التعليق لمدة 3 أشهر.

يمثل الجيل القابل للتوسعة من الأعضاء الدماغية أداة قيمة لدراسة التطور الجنيني للمخيخ والمسارات المرضية التي ينطوي عليها انحطاط هذا الجهاز. وعلاوة على ذلك، يمكن إجراء فحص عالي الإنتاجية للجزيئات التي تستعيد وظيفة cerebellar باستخدام الأجهزة التي تم الحصول عليها باستخدام هذا النظام القابل للتطوير. عموما، هذه الطريقة يلبي حاجة غير ملباة لبروتوكول قابلة للتطوير لتوليد organoids cerebellar عالية الجودة التي قد تكون مهمة لمجموعة متنوعة من التطبيقات الطبية الحيوية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

المؤلفين YH وSJ هم من موظفي برنامج تلفزيوني للتكنولوجيا الحيوية. الكاتب BL هو الرئيس التنفيذي والمؤسس المشارك لشركة PBS Biotech ، وشركة شارك هؤلاء المؤلفون المتعاونون في تطوير المفاعلات الحيوية المستخدمة في المخطوطة. وهذا لا يغير من التزام المؤلفين بجميع سياسات المجلة بشأن تبادل البيانات والمواد. ويعلن جميع المؤلفين الآخرين عدم وجود تضارب في المصالح.

Acknowledgments

وقد دعم هذا العمل Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT)، البرتغال (UIDB/04565/2020 من خلال Programa Operacional Regional de Lisboa 2020, Project N. 007317, PD/BD/105773/2014 إلى T.P.S و PD/BD/128376/2017 إلى D.E.S.N.)، وهي مشاريع يشارك في تمويلها فيدر (POR Lisboa 2020-Programa Operacional Regional de Lisboa PORTUGAL 2020) وFCT من خلال منحة PAC-PRECISE LISBOA-01-0145-FEDER-016394 وCEREBEX جيل من Organoids Cerebellar للأبحاث Ataxia منحة لشبونة-01-0145-فيدر-029298. كما تم تلقي التمويل من برنامج الاتحاد الأوروبي للبحوث والابتكار في أفق 2020، تحت رقم اتفاقية المنح 739572 - مركز الاكتشافات للطب التجديدي والدقة H2020-واسع الانتشار-01-2016-2017.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3MM paper WHA3030861 Merck
Accutase A6964 - 500mL Sigma cell detachment medium
Anti-BARHL1 Antibody HPA004809 Atlas Antibodies
Anti-Calbindin D-28k Antibody CB28 Millipore
Anti-MAP2 Antibody M4403 Sigma
Anti-N-Cadherin Antibody 610921 BD Transduction
Anti-NESTIN Antibody MAB1259-SP R&D
Anti-OLIG2 Antibody MABN50 Millipore
Anti-PAX6 Antibody PRB-278P Covance
Anti-SOX2 Antibody MAB2018 R&D
Anti-TBR1 Antibody AB2261 Millipore
Anti-TBR2 Antibody ab183991 Abcam
Anti-TUJ1 Antibody 801213 Biolegend
Apo-transferrin T1147 Sigma
BrainPhys Neuronal Medium N2-A & SM1 Kit 5793 - 500mL Stem cell tecnhnologies
Chemically defined lipid concentrate 11905031 ThermoFisher
Coverslips 24x60mm 631-1575 VWR
Crystallization-purified BSA 5470 Sigma
DAPI 10236276001 Sigma
Dibutyryl cAMP SC- 201567B -500mg Frilabo
DMEM-F12 32500-035 ThermoFisher
Fetal bovine serum A3840001 ThermoFisher
Gelatin from bovine skin G9391 Sigma
Glass Copling Jar E94 ThermoFisher
Glutamax I 10566-016 ThermoFisher
Glycine MB014001 NZYtech
Ham’s F12 21765029 ThermoFisher
Human Episomal iPSC Line A18945 ThermoFisher iPSC6.2
IMDM 12440046 ThermoFisher
Insulin 91077C Sigma
iPS DF6-9-9T.B WiCell
Iso-pentane PHR1661-2ML Sigma
L-Ascorbic acid A-92902 Sigma
Matrigel 354230 Corning basement membrane matrix
Monothioglycerol M6154 Sigma
Mowiol 475904 Millipore mounting medium
mTeSR1 85850 -500ml Stem cell technologies
N2 supplement 17502048 ThermoFisher
Neurobasal 12348017 ThermoFisher
Paraformaldehyde 158127 Sigma
PBS-0.1 Single-Use Vessel SKU: IA-0.1-D-001 PBS Biotech
PBS-MINI MagDrive Base Unit SKU: IA-UNI-B-501 PBS Biotech
Recombinant human BDNF 450-02 Peprotech
Recombinant human bFGF/FGF2 100-18B Peprotech
Recombinant human FGF19 100-32 Peprotech
Recombinant human GDNF 450-10 Peprotech
Recombinant human SDF1 300-28A Peprotech
ROCK inhibitor Y-27632 72302 Stem cell technologies
SB431542 S4317 Sigma
Sucrose S7903 Sigma
SuperFrost Microscope slides 12372098 ThermoFisher adhesion microscope slides
Tissue-Tek O.C.T. Compound 25608-930 VWR
Tris-HCL 1M T3038-1L Sigma
Triton X-100 9002-93-1 Sigma
Tween-20 P1379 Sigma
UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0 15575020 ThermoFisher

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Takahashi, K., et al. Induction of Pluripotent Stem Cells from Adult Human Fibroblasts by Defined Factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
  2. Thomson, J. A. Embryonic Stem Cell Lines Derived from Human Blastocysts. Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).
  3. Lancaster, M. A., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).
  4. Ishida, Y., et al. Vulnerability of Purkinje Cells Generated from Spinocerebellar Ataxia Type 6 Patient-Derived iPSCs. Cell Reports. 17 (6), 1482-1490 (2016).
  5. Liu, Y., Zhang, S. C. Human stem cells as a model of motoneuron development and diseases. Annals of the New York Academy of Sciences. 1198, 192-200 (2010).
  6. Mariani, J., Coppola, G., Pelphrey, K. A., Howe, J. R., Vaccarino, F. M. FOXG1-Dependent Dysregulation of GABA/ Glutamate Neuron Differentiation in Autism Spectrum Disorders. Cell. 162 (2), 375-390 (2015).
  7. Muguruma, K., Nishiyama, A., Kawakami, H., Hashimoto, K., Sasai, Y. Self-Organization of Polarized Cerebellar Tissue in 3D Culture of Human Pluripotent Stem Cells. Cell Reports. 10 (4), 537-550 (2015).
  8. Qian, X., et al. Generation of human brain region-specific organoids using a miniaturized spinning bioreactor. Nature Protocols. 13 (3), 565-580 (2018).
  9. Aubry, L., et al. Striatal progenitors derived from human ES cells mature into DARPP32 neurons in vitro and in quinolinic acid-lesioned rats. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (43), 16707-16712 (2008).
  10. Gunhanlar, N., et al. A simplified protocol for differentiation of electrophysiologically mature neuronal networks from human induced pluripotent stem cells. Molecular Psychiatry. 23 (5), 1336-1344 (2018).
  11. Hu, B. Y., Zhang, S. C. Differentiation of spinal motor neurons from pluripotent human stem cells. Nature Protocols. 4 (9), 1295-1304 (2009).
  12. Jo, J., et al. Midbrain-like Organoids from Human Pluripotent Stem Cells Contain Functional Dopaminergic and Neuromelanin-Producing Neurons. Cell Stem Cell. 19 (2), 248-257 (2016).
  13. Muguruma, K., et al. Ontogeny-recapitulating generation and tissue integration of ES cell-derived Purkinje cells. Nature Neurosciences. 13 (10), 1171-1180 (2010).
  14. Watson, L. M., Wong, M. M. K., Vowles, J., Cowley, S. A., Becker, E. B. E. A Simplified Method for Generating Purkinje Cells from Human-Induced Pluripotent Stem Cells. The Cerebellum. 17 (4), 419-427 (2018).
  15. Wang, S., et al. Differentiation of human induced pluripotent stem cells to mature functional Purkinje neurons. Science Reports. 5, 9232 (2015).
  16. Tao, O., et al. Efficient generation of mature cerebellar Purkinje cells from mouse embryonic stem cells. Journal of Neuroscience Research. 88 (2), 234-247 (2010).
  17. Croughan, M. S., Giroux, D., Fang, D., Lee, B. Novel Single-Use Bioreactors for Scale-Up of Anchorage-Dependent Cell Manufacturing for Cell Therapies. Stem Cell Manufacturing. , 105-139 (2016).
  18. Simunovic, M., Brivanlou, A. H. Embryoids, organoids and gastruloids: new approaches to understanding embryogenesis. Development. 144 (6), 976-985 (2017).
  19. Lou, Y. R., Leung, A. W. Next generation organoids for biomedical research and applications. Biotechnology Advances. 36 (1), 132-149 (2018).
  20. Silva, T. P., et al. Design Principles for Pluripotent Stem Cell-Derived Organoid Engineering. Stem Cells International. 2019, 1-17 (2019).
  21. Silva, T. P., et al. Maturation of human pluripotent stem cell-derived cerebellar neurons in the absence of co-culture. Frontiers of Bioengineering and Biotechnology. , (2020).
  22. Burridge, P. W., et al. A universal system for highly efficient cardiac differentiation of human induced pluripotent stem cells that eliminates interline variability. PLoS One. 6 (4), 18293 (2011).
  23. Watanabe, K., et al. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 25 (6), 681-686 (2007).
  24. Smith, J. R., et al. Inhibition of Activin/Nodal signaling promotes specification of human embryonic stem cells into neuroectoderm. Developmental Biology. 313 (1), 107-117 (2008).
  25. Yaguchi, Y., et al. Fibroblast growth factor (FGF) gene expression in the developing cerebellum suggests multiple roles for FGF signaling during cerebellar morphogenesis and development. Developmental Dynamics. 238 (8), 2058-2072 (2008).
  26. Fischer, T., et al. Fgf15-mediated control of neurogenic and proneural gene expression regulates dorsal midbrain neurogenesis. Developmental Biology. 350 (2), 496-510 (2011).
  27. Bagri, A., et al. The chemokine SDF1 regulates migration of dentate granule cells. Development. 129 (18), 4249-4260 (2002).
  28. Bardy, C., et al. Neuronal medium that supports basic synaptic functions and activity of human neurons in vitro. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (20), 2725-2734 (2015).
  29. Bauwens, C. L., et al. Control of Human Embryonic Stem Cell Colony and Aggregate Size Heterogeneity Influences Differentiation Trajectories. Stem Cells. 26 (9), 2300-2310 (2008).
  30. Bratt-Leal, A. M., Carpenedo, R. L., McDevitt, T. C. Engineering the embryoid body microenvironment to direct embryonic stem cell differentiation. Biotechnology Progress. 25 (1), 43-51 (2009).
  31. Miranda, C. C., et al. Spatial and temporal control of cell aggregation efficiently directs human pluripotent stem cells towards neural commitment. Biotechnology Journal. 10 (10), 1612-1624 (2015).
  32. Miranda, C. C., Fernandes, T. G., Diogo, M. M., Cabral, J. M. S. Scaling up a chemically-defined aggregate-based suspension culture system for neural commitment of human pluripotent stem cells. Biotechnology Journal. 11 (12), 1628-1638 (2016).
  33. Bardy, J., et al. Microcarrier Suspension Cultures for High-Density Expansion and Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells to Neural Progenitor Cells. Tissue Engineering Part C Methods. 19 (2), 166-180 (2013).
  34. Rigamonti, A., et al. Large-Scale Production of Mature Neurons from Human Pluripotent Stem Cells in a Three-Dimensional Suspension Culture System. Stem Cell Reports. 6 (6), 993-1008 (2016).
  35. Arora, N., et al. A process engineering approach to increase organoid yield. Development. 144 (6), 1128-1136 (2017).
  36. Gimeno, L., Martinez, S. Expression of chick Fgf19 and mouse Fgf15 orthologs is regulated in the developing brain by Fgf8 and Shh. Developmental Dynamics. 236 (8), 2285-2297 (2007).

Tags

الهندسة الحيوية، العدد 160، الخلايا الجذعية متعددة القدرات التي يسببها الإنسان، تمايز المخيخ، النظام الديناميكي، ظروف الثقافة المحددة، والتبريد، والمناعة
التوليد القابل للتحجيم من العضيات الدماغية الناضجة من الخلايا الجذعية البشرية المتعددة القدرات والتوصيف عن طريق المناعة
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Silva, T. P., Fernandes, T. G.,… More

Silva, T. P., Fernandes, T. G., Nogueira, D. E. S., Rodrigues, C. A. V., Bekman, E. P., Hashimura, Y., Jung, S., Lee, B., Carmo-Fonseca, M., Cabral, J. M. S. Scalable Generation of Mature Cerebellar Organoids from Human Pluripotent Stem Cells and Characterization by Immunostaining. J. Vis. Exp. (160), e61143, doi:10.3791/61143 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter