Summary
该协议描述了一个动态培养系统,用于利用一种一种用途的生物反应器,产生控制大小的人类多能干细胞,进一步刺激在化学定义和免饲料条件下小脑器官的分化。
Abstract
小脑在维持平衡和运动协调中起着至关重要的作用,不同小脑神经元的功能缺陷可以触发小脑功能障碍。目前关于疾病相关神经元表型的知识大部分基于死后组织,这使得对疾病进展和发育的理解变得困难。动物模型和不朽的细胞系也被用作神经退行性疾病的模型。然而,他们不能完全概括人类疾病。人类诱导多能干细胞(iPSCs)在疾病建模方面潜力巨大,为再生方法提供了宝贵的来源。近年来,来自患者衍生的 iPSC 的脑器官的生成改善了神经退行性疾病建模的前景。然而,在三D培养系统中,缺乏产生大量器官和高产成熟神经元的协议。所提出的协议是使用可扩展的一次使用生物反应器在化学定义条件下可重复和可扩展生成人类 iPSC 衍生器官的新方法,其中有机体获得小脑特性。生成的器官的特点是在mRNA和蛋白质水平上表达特定的标记。对特定蛋白质组的分析可以检测不同的小脑细胞群,其定位对于组织结构的评价非常重要。器官冷冻和进一步免疫污染器官切片用于评估特定小脑细胞群的存在及其空间组织。
Introduction
人类多能干细胞(PSCs)的出现是再生医学和疾病建模的极佳工具,因为这些细胞可以分化成人体1、2的多数细胞系。自从他们发现以来,PSC分化使用不同的方法被报告为不同的疾病建模,包括神经退行性疾病3,4,5,6。,4,5,6
最近,有报道说,3D培养物来自类似于人类大脑结构的PSC;这些被称为大脑器官3,7,8。,83,这些结构的生成来自健康和患者特定的PSC提供了一个宝贵的机会来模拟人类发展和神经发育障碍。然而,用于生成这些组织良好的脑结构的方法很难应用于其大规模生产。为了产生足够大的结构,以重述组织形态,而不在器官内坏死,协议依赖于在静态条件下的初始神经承诺,然后封装在水凝胶和随后的培养在动态系统3。然而,这种办法可能限制器官生产的潜在扩大。尽管已经努力将PSC分化到中枢神经系统的特定区域,包括皮质、神经、中脑,和脊髓神经元9、10、11、12,,10但动态条件下的特定大脑区域的生成仍然是一个挑战。11,12特别是,3D结构中成熟的小脑神经元的生成尚未描述。Muguruma等人开创了培养条件的产生,重新概括了早期小脑发育13,最近报告了一个方案,允许人类胚胎干细胞产生一个极化结构,让人联想到头三个月小脑7。然而,在报告研究中,小脑神经元的成熟需要器官分离,小脑祖细胞的排序,并在,单层培养系统7、14、15、16,14中与馈养细胞15共同培养。因此,在定义的条件下,用于疾病建模所需的小脑器官的可重复生成仍然是与培养和馈送源变异相关的挑战。
该协议提供了使用一用垂直轮生物反应器(参见规格材料表),即使用一种使用垂直轮生物反应器将人类PSC有效分化成小脑神经元Table of Materials的最佳培养条件,以下简称生物反应器。生物反应器配有大型垂直叶轮,与U形底部结合,在容器内提供更均匀的剪切分布,允许温和、均匀的混合和颗粒悬浮,降低搅拌速度17。有了这个系统,可以获得形状和大小控制的细胞聚合体,这对更均匀、更高效的分化非常重要。此外,更多的 iPSC 衍生器官可以以不太费力的方式生成。
器官的主要特征是通常由干细胞形成的3D多细胞结构,是不同细胞类型的自组织,形成特定形状,如人类形态18、19、20,19,中所看到的形状。因此,有机形态是分化过程中需要评价的重要标准。使用一组特定抗体对器官进行冷冻和进一步免疫渗透,使分子标记在空间上可视化,以分析细胞增殖、分化、细胞种群特性和凋亡。有了这个协议,通过免疫控制器官冷冻,在分化的第7天观察到了一个初始有效的神经承诺。在分化过程中,观察到几个具有小脑特征的细胞群。在这个动态系统中35天后,小脑神经皮皮沿着一个轴线组织,有一个增殖的祖细胞和基本定位的后层神经元。在成熟过程中,从第35~90天的分化,可以看到不同类型的小脑神经元,包括Purkinje细胞(卡尔宾丁+),颗粒细胞(PAX6+/MAP2+),高尔基细胞(神经粒蛋白+),单极刷细胞(TBR2+),和深小脑核投影+神经元(TBR1+)。+此外,在培养的90天后,在生成的小脑器官中观察到不重要的细胞死亡量。
在这个系统中,人类 iPSC 衍生的器官成熟成不同的小脑神经元,存活长达 3 个月,无需分离和喂食共培养,为疾病建模提供了人类小脑神经元的来源。
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Protocol
1. 在单层文化中传传和维护人类 iPSC
- 板材的制备
- 在4°C下 解冻基底膜基质(见材料表)库存,制备60μL等分。将等分在-20°C下冷冻。
- 要覆盖6孔板的孔,在冰上解冻地下室膜基质的一个等分。解冻后,将 DMEM-F12 的 60 μL 添加到 6 mL。通过上下移液轻轻重新暂停。
- 将 1 mL 稀释的地下膜基质溶液添加到 6 孔板的每个孔中,并在 RT 中孵育至少 1 小时,然后以 4°C 进行传通或储存长达 1 周。
- 与 Edta 的 iPSC 殖民地的传递
- 在 37 °C、95% 湿度和 5% CO2下,在孵化器中的 6 个孔板中保持单层培养中的 iPSC。
注:在该协议中,使用了三条不同的人类 iPSC 线:F002.1A.1321、人类表皮 iPSC 线路 (iPSC6.2)22以及商业获得的 iPS-DF6-9-9T.B( 参见材料表)。 - 在传世前,在室温 (RT) 下孵育存储板(步骤 1.1)15 分钟,并准备 mTesR1 介质(表 1)。
- 使用血清移液器从板中吸出溶液,并立即向每个井添加 0.5 mL 的 mTeSR1 介质。
- 从含有 iPSC 的井中吸出已用介质,每井使用 1 mL 0.5 mM EDTA 洗涤一次。
- 将 1 mL 的 0.5 mM EDTA 添加到每一个井中,并在 RT 中孵育 5 分钟。
- 通过轻轻添加 mTeSR1 介质并使用 P1000 微管移液菌落,吸气 EDTA 并从孔中去除细胞。将细胞收集在圆锥管中。
注:不要移液细胞向上和向下超过3倍。 - 在每个井中加入1 mL的细胞悬浮液(稀释的1:4),使每一个井在加入细胞悬浮液后含有1.5 mL的介质。将细胞在5%CO2,37°C下返回培养箱。2
- 当达到 75% -80% 的汇合时,每 3 天更换一次已花的介质和通道。
- 在 37 °C、95% 湿度和 5% CO2下,在孵化器中的 6 个孔板中保持单层培养中的 iPSC。
2. 在生物反应器中播种人类 iPSC
- 孵育在mTeSR1中作为单层生长的iPSCs,辅以10μM的ROC抑制剂Y-27632(ROCKi)。从6井组织培养板向每井加入1 mL的补充剂介质,在37°C、95%的湿度和5%的CO2下孵育1小时。
注:ROCKi用于保护分离的iPSCs免受凋亡23。 - 孵育1小时后,从每井中吸出花期介质,用每井1 mL的1×PBS洗涤1倍。
- 将1 mL的细胞分离介质( 见材料表)添加到6孔板的每个孔中,并在37°C下孵育7分钟,直到细胞通过轻轻的摇动轻松从孔中分离。
- 用P1000微移子上下移液细胞分离介质,直到细胞分离并分离成单个细胞。将2 mL的完整细胞培养培养素添加到每孔中,以灭活酶消化,将细胞轻轻移液到无菌锥形管中。
- 在210×3分钟,取出上g一代。
- 在培养基中重新发送细胞颗粒(即 mTeSR1 辅以 10 μM 的 ROCKi),并使用 trypan 蓝色染料用血细胞计计数 iPC。
- 15 × 106 个 细胞在生物反应器中(最大体积为 100 mL),60 mTeSR1,在最终细胞密度为 250,000 细胞/mL 时辅以 10 μM 的 ROCKi。
- 将含有 iPC 的容器插入置于 37 °C、95% 湿度和 5% CO 2 的通用基单元中。
注:通过将通用基单元控制设置为 27 rpm,将生物反应器搅拌保持 24 小时,以促进 iPSC 聚合。
3. 小脑器官中人类 iPSC 衍生集料的分化和成熟
- 将单细胞种子的日定义为第 0 天。
- 第 1 天,使用血清移液器收集 1 mL 的 iPSC 聚合样品。在采集样品之前,将通用基单元与含有集料的生物反应器放在无菌流中,将生物反应器保持与以前一样在搅拌下。将电池悬浮板放在超低附件 24 井板中。检查 iPSC 派生的聚合是否形成。
- 使用光学显微镜使用 40 倍或 100 倍的总放大倍率测量聚合直径,获取图像。
- 使用 FIJI 软件测量每个图像中的聚合区域。
- 选择 "分析 | 设置测量" 从菜单栏,然后单击"区域"和"确定"。
- 选择"文件 | 从菜单栏中打开"以打开存储的图像文件。选择工具栏中显示的线条选择工具,并在图像中显示的缩放栏上创建直线。选择"分析 | 从菜单栏中设置比例"。
- 在 "已知距离"中,以 μm 为单位添加图像比例条的扩展。将 "长度单位"定义为 μm 。点击 [全局] 以维护设置和 [确定].在 工具栏中选择 "椭圆形选择"。
- 对于每个聚合,使用椭圆形工具描绘区域。选择"分析 | 测量".计算其直径基于测量面积,考虑到聚合是大约球形使用
A 作为聚合的区域。
- 当集料的平均直径为 100 μm 时,将 80% 的已用介质替换为不带 ROCKi 的新鲜 mTeSR1。当集料直径达到200~250μm时,用g方可换的介质(表1),让器官在生物反应器底部沉淀。
注:如果平均聚合直径超过 350 μm,请勿启动分化协议。重复单细胞的种子。通常,集料大约需要 1 天才能达到 100 μm 的平均直径。 - 将含有集料的生物反应器插入置于37°C、95%湿度和5%CO 2的培养箱中的通用基单元中。
- 将生物反应器搅拌降低至 25 rpm。
- 第 2 天,重复步骤 3.2、3.3 和 3.4 以评估聚合直径。将 30 μL 的 FGF2(最终浓度,50 纳克/mL)和 60 μL 的 SB431542(最终浓度,10 μM)添加到 60 mL 的 gfCDM 分化介质(表 1.用补充的 gfCDM 更换生物反应器中所有已用的介质。重复步骤 3.6。
注:SB431542是抑制中分分化的关键,诱导神经分化24。FGF2用于促进神经皮内组织25的结化。 - 第 5 天,重复步骤 3.2、3.3、3.4 和 3.8。
注:在差异化协议期间,聚合大小应增加。但是,直径只有在开始区分时才至关重要,因为此参数可能会影响分化的有效性。 - 第 7 天,重复步骤 3.2、3.3 和 3.4。将 FGF2 和 SB431542 稀释至 2/3:加入 20 μL 的 FGF2 和 40 μL 的 SB431542 至 60 mL 的 gfCDM 分化介质。用补充的 gfCDM 更换生物反应器中所有已用的介质。重复步骤 3.6,将生物反应器搅拌量提高至 30 rpm。
- 第 14 天,重复步骤 3.2、3.3 和 3.4。加入60μL的FGF19(最终浓度,100纳克/mL)到60 mL的g方可分型介质。用与FGF19补充的 gfCDM 更换生物反应器中所有已用的介质。重复步骤 3.6。
注:FGF19用于促进中后脑结构26的两极分化。 - 第 18 天,重复步骤 3.2、3.3、3.4 和 3.11。
- 第 21 天,重复步骤 3.2、3.3 和 3.4。用完整的神经基质替换生物反应器上所有已用的介质(表1)。重复步骤 3.6。
注:神经基础介质是一种基础介质,用于维持器官7内的神经元细胞种群。 - 第 28 天,重复步骤 3.2、3.3 和 3.4。加入180μL的SDF1(最终浓度,300纳克/mL)到60mL的完整神经基础介质。用完整的神经基础介质替换生物反应器中所有已用的介质,并辅以SDF1。重复步骤 3.6。
注:SDF1 用于促进组织不同的单元层27。 - 第 35 天,重复步骤 3.2、3.3 和 3.4。用完整的脑物理介质替换生物反应器中所有已用的介质(表1)。重复步骤 3.6。
注:脑物理是一种神经元介质,支持突触活性神经元28。 - 每3天用完整的 BrainPhys 介质替换总体积的 1/3,直到第 90 天分化。
4. 冷冻和免疫组织化学器官的制备
- 免疫污素器官的收集
- 收集含有有机物的1 mL样品,用血清移液器从生物反应器到15 mL锥形管。
注:应在不同时间点收集有机体,以评估分化的功效,包括天数7、14、21、35、56、70、80和90。 - 拆下上一液,用 1 mL 的 1 ×洗一次。
注:请勿使器官离心。让器官在管子底部通过重力沉淀。 - 去除上经剂并添加 1 mL 的 4% 甲醛 (PFA)。在4°C孵育30分钟。删除已花的 PFA 并添加 1 mL 的 1× PBS。
- 将有机体储存在1 mL的1×PBS中,在4°C下,直到处理冷冻。
注:在固定后不超过1周,将器官存放在1xPBS中。
- 收集含有有机物的1 mL样品,用血清移液器从生物反应器到15 mL锥形管。
- 冷冻器官的制备
- 从储存的器官中去除上一液。加入1 mL的15%蔗糖(w/v,稀释在1× PBS),通过轻轻的旋转混合良好,并在4°C孵育过夜。
- 制备15%蔗糖/7.5%明胶溶液(表2),在制备过程中保持37°C,以避免明胶凝固。
- 去除 15% 蔗糖溶液,将 1 mL 的 15% 蔗糖/7.5% 明胶加入有机体,通过轻柔的涡旋快速混合。在37°C下孵育1小时。
- 将 15% 蔗糖/7.5% 明胶溶液加入到其体积的一半的塑料容器中。等待 RT 的凝固。
- 孵育1小时后,小心地将含有有机液的蔗糖/明胶滴放在凝固明胶上,并加有巴斯德移液器。离开在RT凝固约15分钟。确保避免气泡形成。
- 将 15% 蔗糖/7.5% 明胶放在有机体顶部,直到容器充满。等待 RT 完全凝固。
- 凝固后,在4°C下孵育20分钟。
- 将明胶切成含有中心有机物的立方体,用一滴O.C.T.化合物将明胶立方体固定在一块纸板上。
- 将 250 mL 的异丙烷放在 500 mL 杯中,并加注适当的容器中。。使用钳子和厚手套,小心地将含有异丙烷的杯子放在液氮表面,将异丙烷冷却至-80°C。
- 当达到 -80 °C 时,将明胶立方体放入含有异丙烷的杯子中,直到其冻结,使温度保持 -80°C。 根据立方体的大小,可能需要 1~2 分钟。
注:避免温度低于-80°C或过度冻结时间,因为它可能会导致立方体开裂。 - 冷冻时,迅速将明胶立方体储存在-80°C,并储存至冷冻。
- 器官的冷冻
- 打开低温恒温器,在 -25 °C 下定义试样 (OT) 和低温 (CT) 温度。
- 当两个温度稳定下来时,使用O.T.化合物固定含有有机.C的明胶立方体。
- 在 12 μm 下定义截面厚度。
- 切割立方体,在粘附显微镜幻灯片上收集 3~4 片( 参见材料表)。
- 储存在-20°C,直到使用。
- 有机体切片的免疫污染
- 将包含器官部分的显微镜幻灯片放在一个带 50 mL 预预热 1x PBS 的轴罐中,可背对背放置多达 10 张幻灯片。
注:所有器官部分应用液体浸入水中。 - 在37°C下孵育45分钟,使幻灯片脱热化。
- 在 RT 上用 50 mL 的 1× Pbs 清洗 1x 5 分钟:将幻灯片转移到包含新鲜 1× PBS 的罐子中。
- 将幻灯片转移到含有 50 mL 新鲜准备的甘氨酸 (表2) 的玻璃罐中,并在 RT 孵育 10 分钟。
- 将幻灯片转移到包含 0.1% 三吨 50 mL 的玻璃罐 (表 2),并在 RT 渗透 10 分钟。
- 用 1× PBS 清洗 5 分钟 2 倍。
- 用浸泡在1个PBS中的3毫米纸准备×盘。将切片周围有纸巾干燥,并放在 3 毫米纸上。使用巴氏移液器,用阻塞溶液(表2)覆盖幻灯片的整个表面,每张幻灯片为±0.5 mL。在 Rt 孵育 30 分钟。
- 去除多余的阻块溶液,用切片周围的纸巾擦干幻灯片。将原抗体的50μL(表3)稀释在阻断溶液中,在各部分上用盖玻片覆盖。将切片放在先前准备的免疫抹盘中。在4°C孵育过夜。
- 将幻灯片转移到具有 50 mST 的带孔罐(表 2),让盖玻片落下,用 TBST 洗涤 5 分钟 3 倍。
- 将稀释在阻断溶液中的 50 μL 放在截面上,并盖上盖玻片。将切片放在先前准备的免疫抹菜中。在RT孵育30分钟,防止光线。
- 将幻灯片再次转移到一个带孔的罐子中,用 50 mL 的 TBST 洗涤 5 分钟 3 倍。
- 将幻灯片与切片周围的纸巾擦干,然后将切片放在先前准备的免疫抹布中。使用巴氏移液器在幻灯片的整个表面上添加 0.5 mL 的 DAPI 溶液。在 Rt 孵育 5 分钟。
- 重复步骤 4.4.9。
- 用纸巾小心地擦干滑梯。沿幻灯片滴加 50 μL 的安装介质,然后小心地将盖玻片放到每张幻灯片上,稍微弯曲,以避免气泡。
- 将包含器官部分的显微镜幻灯片放在一个带 50 mL 预预热 1x PBS 的轴罐中,可背对背放置多达 10 张幻灯片。
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Representative Results
该协议是通过使用0.1 L生物反应器促进细胞聚合(图1A)启动的。对 iPSC 进行单细胞接种,在 60 mL 的培养中播种 250,000 个细胞/mL,搅拌速度为 27 rpm。这被定义为第 0 天。24小时后,细胞有效形成球形状聚集体(第1天,图1B),形态学一直保持良好,直到第5天,大小逐渐增加,表明随着时间的推移,在聚合形态和大小方面具有高度的同质性。(图1B)。显微镜的定量分析还显示,第1天(图1C)中,总体大小的正态分布。聚合大小是一个重要的物理参数,能够促使细胞分化到不同的血统29,30。29,因此,基于先前研究报告的用于诱导有效神经31、32,和小脑承诺的聚合大小,生成的集料以mTeSR1介质保持25转/分,直到在开始分化(±200 μm)之前达到所需的直径。第 2 天,F002.1A.13 细胞系的平均直径为 221.0 ± 54.4 μm(平均 ± SD),iPSC6.2 细胞系的平均直径为 212.1 ± 42.1 μm。因此,两个单元线在此时间点达到最佳聚合大小(图1C)。
将 iPSCs 的种子播种时间定义为第 0 天,在第 2 天达到所需的聚合直径后,同时使用 SB431542、FGF2 和胰岛素诱导神经承诺,促进神经分泌分化,以及中脑模式所需的中度结节化。之后,FGF19和SDF1分别在第14天和第28天被添加到培养中,以促进不同小脑祖细胞的生成。在神经感应的第一天,使用25 rpm的转速,在7天后增加到30转/时,以避免更大的聚合的积累和聚集(图2A)。在分化过程中,器官表现出更明显的上皮化,类似于具有发光空间的神经管状结构(图2B)。此外,对器官直径分布的评估表明,在最初的小脑承诺期间,直到第14天(图2B),其大小分布是均匀的。
免疫荧光分析支持,在加入FGF2和SB431542后,iPSC衍生器官的高效神经承诺已经通过第7天分化实现。器官的低温揭示了许多结构,让人联想到PAX6和SIN的神经管染色,器官内大多数细胞在分化的第7天和14天表达祖先标记S NESTIN(图2C)。之后,FGF19和SDF1促进了持续增殖祖先层的生成(PAX6+),实现了有效的神经元分化,如TUJ1,神经元特异性III类β-图普林的表达,第21天和第35天(图2C)。此外,在0.1 L VW生物反应器中,21天后也观察到了有效的小脑分化,两种不同的细胞群的存在证明了这一点:颗粒细胞祖细胞(BARLH1+ 细胞,图3A)和Purkinje细胞祖细胞(OLIG2+细胞,+图3B)。在培养35天后,器官内不同的细胞群似乎被组织成不同的层。在这些椭圆形结构的发光区域中,用BARHL1+后脑祖体+作为器官表面侧的连续层(图3C、D)和SOX2+观察到器官内的各种扁平椭圆形结构(图3D)。D+此外,TUJ1=新生神经元似乎向表面迁移,重新建立器官外表面的径向对齐(图3E)。
小脑祖细胞生成后,利用脑因子介质28补充神经营养因子BDNF和GDNF促进进一步成熟。用于检测小脑神经元的不同亚型的免疫荧光染色。Purkinje细胞,GABAergic神经元表达钙结合蛋白钙丁(CALB,图3F),在成熟协议后在小脑器官中检测到。此外,另一个主要的脑神经元类型,颗粒细胞,被确定为细胞共同表达PAX6和PAPA2的子集(图3G)。有趣的是, 一个 PAX6+祖先池不表达 MAP2 被保留到 80 天的分化。还检测到其他类型的小脑神经元,包括表达TBR2的单极刷细胞(图3H)和表达TBR1的深小脑核投影神经元(图3I)。除了有效的小脑分化和成熟,这个3D动态培养系统使用PBS 0.1 L VW生物反应器允许器官保持生存长达90天,没有严重的细胞死亡和坏死(图3J)。
图1:使用可扩展生物反应器生成尺寸控制聚合。(A) 生物反应器的设计特点。(B) 亮场光微相显示第 1 天、第 2 天和 5 天两条不同 iPSC 线的聚合。比例线 = 100 μm。(C) 生物反应器中不同 iPSC 线的浮料的大小分布。 请单击此处查看此图的较大版本。
图2:使用0.1 L生物反应器生成人类 iPSC 衍生器官。(A) 培养程序的示意图,诱导 iPSC 分化到小脑器官。细胞以250,000个细胞/mL的密度播种,搅拌速度为27 rpm,用于促进细胞聚集。在分化的第一天,集料保持在 25 rpm 的搅拌速度。之后,为了避免较大的集料的积累,搅拌速度增加到30转/分钟。(B) 器官形状和大小的特征.亮场光微图显示 iPSC 衍生的器官在 0.1 L VW 生物反应器中小脑分化期间。比例线 = 100 μm。器官直径的分布表明,培养沿分化协议保持均匀的有机体大小。(C) 在 iPSC 衍生器官中有效神经感应。在小脑分化期间,NESTIN、PAX6 和 TUJ1 的免疫荧光。比例线 = 50 μm。 请单击此处查看此图的较大版本。
图3:人类 iPSC 衍生器官的高效小脑分化和成熟。(A-E)高效的小脑承诺。BARHL1、SOX2、OLIG2、NCAD 和 TUJ1 标记的免疫污染分析,在小脑分化协议的指示时间点进行。(F-I)人类 iPSC 衍生小脑器官的高效成熟。显示不同类型的小脑神经元的免疫荧光,包括Purkinje细胞(CALB,F)、颗粒细胞(PAX6和PAPA2,G)、单极刷细胞(TBR2)和深小脑核投影神经元(TBR1)。(J) 小脑成熟后细胞高生存能力。活/死(钙素-AM,绿色和碘化,红色)有机物染色显示高细胞生存能力,没有证据表明在生物反应器80天后坏死区。比例线 = 50 μm。 请单击此处查看此图的较大版本。
媒体准备 |
mtesr1 最终体积:500 mL |
1. 在室温 (RT) 或 4 °C 下过夜,与基础介质混合,在室温 (RT) 下解冻 mTeSR1 5×补充 2. 在 4 °C 下储存完整的 mTeSR1 介质长达 2 周,或准备 40 mL 等分,储存在 -20 °C 3. 使用前在 RT 预热完整 mTesR1 |
gfCDM(无生长因子化学定义介质) 最终体积:60 mL |
30 mL 火腿的 F12 30 mL Imdm 600 μL 化学定义的脂质浓缩物(1 % v/v) 2.4 μL 单体甘油 (450 μM) 30 μL 阿波-转移素(水中30毫克/mL的库存溶液,最终浓度:15微克/mL) 300毫克结晶纯化BSA(5毫克/千升) 42 μL胰岛素(库存浓度为10毫克/千升,最终浓度:7微克/mL) 300 μL P/S (0.5% v/v, 50 U/ml 青霉素/50 μg/ml 链霉素) |
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神经基础 最终体积:60 mL |
60 mL 的神经基础介质 600 μL N2 补充 600μL 谷氨酸 I 300 μL P/S (0.5 % v/v)。 |
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完整的脑物理 最终体积:60 mL |
60mL 脑物理 1.2 mL 神经细胞SM1神经元补充 600 μL N2 补充 12 μL BDNF (最终浓度: 20 纳克/mL) 12 μL GDNF (最终浓度: 20 纳克/mL) 300 μL 丁比二-cAMP(水中库存浓度:100毫克/千升,最终浓度:1 mM) 42 μL抗坏血酸(水中库存浓度:50μg/mL,最终浓度:200 nM) |
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生长因子和小分子的库存解决方案 |
基本成纤维细胞生长因子(bFGF/FGF2) 库存浓度:100 μg/mL |
1. 在浓度为 10 mg/mL 时在 5 mM Tris 中重组,pH 7.6 2. 在 PBS (v/v) 中用 0.1% BSA 稀释至最终库存浓度 100 μg/mL |
斯特罗马尔细胞衍生因子 1 (SDF1) 库存浓度:100 μg/mL |
1. 在浓度为10毫克/mL的水中重建 2. 在PBS中用0.1%BSA(v/v)稀释至100μg/mL的最终库存浓度。 |
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脑源性神经营养因子(BDNF) 库存浓度:100 μg/mL |
||
胶质细胞衍生神经营养因子(GDNF) 库存浓度:100 μg/mL |
||
成纤维细胞生长因子 19 (FGF19) 库存浓度:100 μg/mL |
1. 在浓度为10毫克/千升时,在5mM磷酸钠中重组,pH7.4 2. 在 PBS (v/v) 中用 0.1% BSA 稀释至最终库存浓度 100 μg/mL |
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ROCK 抑制剂 Y-27632 库存浓度:10mM |
在浓度为 10 mM 的 DMSO 中重建。 | |
SB431542 库存浓度:10mM |
||
胰岛素 库存浓度:10毫克/千升 |
1. 在 300 μL 的 10 mM Naoh 中重组 10 毫克胰岛素 2. 小心添加 1 M NaOH,直到溶液变得透明 3. 用无菌水填充至1 mL。 |
表1:库存解决方案和介质制备。 列出的是用于为 iPSC 维护和分化协议准备介质的所有组件和体积,以及生长因子和小分子的库存解决方案。对于库存解决方案,列出了所有库存集中度和重组协议。
明胶/蔗糖 最终浓度: 7.5%/15% w/w |
1. 在无菌肖特玻璃瓶中称重 15 克蔗糖和 7.5 克明胶,混合良好 2. 在 65 °C 下× PBS 1 3. 将预热 PBS 1×到 100 g 的最终重量,混合良好 4. 将肖特玻璃瓶在 65°C 的加热板中,摇动直到明胶熔化 5. 在37°C下孵育,直到溶液稳定下来 |
甘 氨 酸 最终浓度: 0.1 M |
加入0.37克甘氨酸至50 mL新鲜准备的PBS 1×。 |
特里顿解决方案 最终浓度: 0.1 % w/v |
1. 准备 10 % Triton X-100 库存:5 g 的 Triton X-100 在 50 mL 的 PBS 1× 2. 将 0.5 mL 的 Triton X-100 库存添加到 50 mL 的 PBS 1×。 |
Tbst 20 mM Tris-HCl pH 8.0, 150 mM NaCl, 0.05 % w/v Tween-20 |
20 mL 三轮车 1 M 30 mL NaCl 5 M 5 mL Tween-20 (10% 库存: 5 g Tween-20 在 50 mL 水中) 用水填充至1L。 |
阻止解决方案 | 加入5 mL的胎儿牛血清(FBS,最终浓度:10% v/v)至50 mL的TBST。 |
达皮解决方案 | 将 15 μL 的 DAPI 库存溶液(1 mg/mL)加入到 10 mL 的脱跷水中 |
莫维奥尔 | 1. 将 2.4 g Mowiol 加入 6 g 甘油中,在 50°C 的预热板中摇动 1 小时 2. 加入6 mL的蒸馏水,摇动2小时 3. 加入 12 mL 的 Tris 200 mM (pH 8.5),摇动 10 分钟 4. 在 5,000 ×下离心 15 分钟 5. 等分,储存在-20°C。 |
表2:用于冷冻和免疫的器官制备解决方案。 所列的组件和体积,用于制备用于制备用于冷冻和免疫污素的器官的溶液。
抗体 | 宿主物种 | 稀释 |
巴尔1 | 兔 | 1/500 |
卡尔宾丁 | 兔 | 1/500 |
地图2 | 鼠标 | 1/1000 |
N - 卡德赫林 | 鼠标 | 1/1000 |
巢 蛋白 | 鼠标 | 1/400 |
奥利格2 | 兔 | 1/500 |
帕克斯 6 | 兔 | 1/400 |
SOX2 | 鼠标 | 1/200 |
Tbr1 | 兔 | 1/200 |
Tbr2 | 兔 | 1/200 |
TUJ1 | 鼠标 | 1/1000 |
表3:原抗体。 列出了用于免疫污化的初级抗体、克隆和优化稀释剂。
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Discussion
需要大量的细胞数量以及定义的培养条件来生成特定的细胞类型,用于药物筛选和再生医学应用,这一直在推动可扩展培养系统的发展。近年来,几组报告了可扩展的神经祖代和功能神经元32、33、34等34,为神经退行性疾病新模型的发展提供了重大进展。32,然而,胚胎发育的一些关键事件的回顾仍然缺乏,长期维持在悬浮过程中产生的功能神经元尚未达到34。这里展示的是一个动态的3D培养系统,能够生成具有小脑标识的 iPSC 衍生神经器官,并在动态培养条件下,在化学定义和无馈线条件下进一步促进功能小脑神经元的成熟。
在开始小脑分化之前,保持人类 iPSC 的质量至关重要。因此,为了不损害分化,从解冻到生物反应器接种,不应执行超过三段的 iPSC。差异化协议的一个重要步骤是评估聚合大小。聚合大小在诱导特定细胞系29的分化方面起着关键作用。除此之外,还有一个最小尺寸阈值,似乎有利于分化35。正如已经报告,最佳的 iPSC 衍生聚合直径,以促进有效的神经承诺31,32和小脑分化21是一个 +200 μm 直径.
此外,在这个动态协议中,培养最初几天使用的搅拌速度对于控制聚合直径和神经感应至关重要。培养从 27 rpm 开始,这足以促进 iPSC 聚合并避免形成更大的聚合(应避免直径超过 350 μm)。单细胞播种后用于促进细胞聚集的搅拌可增加到30转/分,不影响细胞生存能力;然而,更高的搅拌速度预计将产生较小的集料。根据 iPSC 生产线,使用 27 rpm 进行细胞播种后 24 小时,预计有两种不同的场景:形成的集料直径较小(<200 μm),或达到 200–300 μm 之间的尺寸范围。如果在细胞播种后24小时聚集体大于350μm,则不应进行分化,并且应重复细胞播种,因为分化的效率将非常低。如果聚集体小于 200 μm,则使用 iPSC 维护介质更换使用使用介质,搅拌速度降低到 25 rpm。通过这一调整,预计总和直径会从第 1 天增加到第 2 天,这可能是由于搅拌速度降低而促进的单个集料的合并。如果聚合体的大小在 200~300 μm 之间,则所用介质应替换为分化介质,并且应在培养培养中 2 天后开始使用 FGF2 的神经感应。此时,搅拌速度也应该稍微降低,以防止细胞过度死亡,因为细胞在分化介质的存在下对剪切应力更敏感。此外,使用变异系数(CV)可以分析总体同质性,该系数根据方程将标准差与聚合直径平均值关联,从而测量变异性
其中 δ 表示总和直径的标准偏差 ,μ 平均直径。在此动态系统中,观察到的平均 CV 为 12.5 ± F002.1A.13 细胞系为 3.3%(平均 ± SD),第 2 天为 19.0 ± iPSC6.2 细胞系为 0.37%。因此,在此系统中,应预期 CV 低于 0.2(变化的 20%)的均匀大小总体。经过7天的分化,平均集料直径范围从300~360μm,搅拌速度增加到30转/分,以防止集料在0.1L VW生物反应器底部沉淀。
小脑器官分化,直到第35天和分析在静态条件下的总量大小最近报告21。作者显示,在板(如Aggrewell)中形成并维持的3D聚合体,直到第7天分化的大小和形状21均匀。然而,在将集料转移到超低附着6孔培养板后,集料的大小和形态开始变化21。在第35天静态条件下,一些3D聚合达到1000μm不同的细胞系,这限制了营养物质和氧气的扩散。相比之下,使用我们的动态条件,在第 35 天之前,集料的直径不超过 800 μm,由于垂直轮推动的介质不断搅拌,质量转移得到改善。此外,总尺寸一直保持到成熟过程结束,90 日时,总直径为 646.6 ± 104.2 μm,是 0.1 L VW 生物反应器中执行的最长培养量。
在这个3D动态系统中,SB431542、FGF2、FGF19和SDF1连续增加,导致小脑感应效率高。该协议从SB431542(一种抑制中分体分化的转化生长因子β(TGF-+)受体阻滞剂和FGF2的组合开始,它对神经皮组织25的细胞化有主要影响。因此,在培养的第一天添加这两个分子对于促进细胞分化到中后脑至关重要,中后脑是产生小脑组织的领土。初始诱导到中后脑组织后,有必要添加FGF19,以促进具有后腹极性中后脑结构的自发生成,以及产生不同的小脑祖体36、26。,26SDF1促进组织不同层的小脑祖细胞,如小脑神经发生27的发育阶段所见。直到第35天,这些分子可以促进小脑器官的组织,可以重述人类小脑发育,这相当于头三个月小脑。在将小脑祖细胞组织成不同层后,使用一种定义的神经元介质来促进它们的成熟28。用于维持神经元细胞的其他介质也可以进行测试,但预计效率会降低。因此,在这个协议中,BrainPhys被用来促进小脑细胞分化到小脑神经元,因为它被报道更好地模仿健康的神经元环境,并支持生成神经元28的神经生理活动。
利用这些动态条件,可以更有效地传播营养物质、氧气和生长因子。但是,一些限制与差异化协议中使用的激动有关。搅拌过程可以引入一些剪切应力,从而影响细胞的生存、增殖和分化。因此,在细胞更敏感的成熟步骤中,必须仔细监测培养。
小脑器官的分化让人联想到人类胚胎小脑发育,已经报告7。然而,这些胚胎小脑器官进一步成熟到小脑神经元使用3D培养仍然是一个挑战。功能小脑神经元的生成只能通过与来自各种来源的颗粒细胞4,7,15,7的颗粒细胞进行共培养才能实现。该协议成功地放大了人类 iPSC 的脑小月承诺;此外,这是3D培养系统中不同小脑神经元分化的第一个方案,无需与馈送细胞进行共培养。具体来说,以下细胞类型可以在我们的动态培养系统中产生:Purkinje细胞(钙蛋白®),颗粒细胞(PAX6+/MAP2+),单极刷细胞(TBR2+),和深小脑核投影神经元(TBR1+),这些细胞在悬浮状态中维持了3个月。
小脑器官的可伸缩生成是研究小脑胚胎发育和该器官退化所涉及的病理途径的宝贵工具。此外,使用通过这种可扩展系统获得的器官,可以对恢复小脑功能的分子进行高通量筛选。总体而言,此方法满足了对生成高质量小脑器官的未满足协议的需求,这些协议对于各种生物医学应用可能非常重要。
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Disclosures
作者 YH 和 SJ 是 PBS 生物技术公司的员工。作者 BL 是 PBS 生物技术公司的首席执行官和联合创始人。这些合作作者参与了手稿中使用的生物反应器的开发。这不会改变作者对期刊关于共享数据和材料的所有政策的遵守。所有其他作者声明没有利益冲突。
Acknowledgments
这项工作得到了葡萄牙国家电信协会(FCT)的支持(UIDB/04565/2020通过Lisboa区域项目2020,项目N.007317, PD/BD/105773/2014 至 T.P.S 和 PD/BD/128376/2017 到 D.E.S.N.),项目由 FEDER (POR Lisboa 2020 – 项目区域行动区域葡萄牙 2 和 FCT 通过授予 PAC - 精确 LISBOA - 01 - 0145 - Feder - 016394 和 CEREBEX 生成小脑有机体为 Ataxia 研究授予 LISBOA -01-0145-FEDER-029298。还根据赠款协议第739572号——再生和精密医学发现中心H2020-2020-01-2016-2017年,从欧洲联盟的Horizon 2020研究和创新方案获得资金。
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
3MM paper | WHA3030861 | Merck | |
Accutase | A6964 - 500mL | Sigma | cell detachment medium |
Anti-BARHL1 Antibody | HPA004809 | Atlas Antibodies | |
Anti-Calbindin D-28k Antibody | CB28 | Millipore | |
Anti-MAP2 Antibody | M4403 | Sigma | |
Anti-N-Cadherin Antibody | 610921 | BD Transduction | |
Anti-NESTIN Antibody | MAB1259-SP | R&D | |
Anti-OLIG2 Antibody | MABN50 | Millipore | |
Anti-PAX6 Antibody | PRB-278P | Covance | |
Anti-SOX2 Antibody | MAB2018 | R&D | |
Anti-TBR1 Antibody | AB2261 | Millipore | |
Anti-TBR2 Antibody | ab183991 | Abcam | |
Anti-TUJ1 Antibody | 801213 | Biolegend | |
Apo-transferrin | T1147 | Sigma | |
BrainPhys Neuronal Medium N2-A & SM1 Kit | 5793 - 500mL | Stem cell tecnhnologies | |
Chemically defined lipid concentrate | 11905031 | ThermoFisher | |
Coverslips 24x60mm | 631-1575 | VWR | |
Crystallization-purified BSA | 5470 | Sigma | |
DAPI | 10236276001 | Sigma | |
Dibutyryl cAMP | SC- 201567B -500mg | Frilabo | |
DMEM-F12 | 32500-035 | ThermoFisher | |
Fetal bovine serum | A3840001 | ThermoFisher | |
Gelatin from bovine skin | G9391 | Sigma | |
Glass Copling Jar | E94 | ThermoFisher | |
Glutamax I | 10566-016 | ThermoFisher | |
Glycine | MB014001 | NZYtech | |
Ham’s F12 | 21765029 | ThermoFisher | |
Human Episomal iPSC Line | A18945 | ThermoFisher | iPSC6.2 |
IMDM | 12440046 | ThermoFisher | |
Insulin | 91077C | Sigma | |
iPS DF6-9-9T.B | WiCell | ||
Iso-pentane | PHR1661-2ML | Sigma | |
L-Ascorbic acid | A-92902 | Sigma | |
Matrigel | 354230 | Corning | basement membrane matrix |
Monothioglycerol | M6154 | Sigma | |
Mowiol | 475904 | Millipore | mounting medium |
mTeSR1 | 85850 -500ml | Stem cell technologies | |
N2 supplement | 17502048 | ThermoFisher | |
Neurobasal | 12348017 | ThermoFisher | |
Paraformaldehyde | 158127 | Sigma | |
PBS-0.1 Single-Use Vessel | SKU: IA-0.1-D-001 | PBS Biotech | |
PBS-MINI MagDrive Base Unit | SKU: IA-UNI-B-501 | PBS Biotech | |
Recombinant human BDNF | 450-02 | Peprotech | |
Recombinant human bFGF/FGF2 | 100-18B | Peprotech | |
Recombinant human FGF19 | 100-32 | Peprotech | |
Recombinant human GDNF | 450-10 | Peprotech | |
Recombinant human SDF1 | 300-28A | Peprotech | |
ROCK inhibitor Y-27632 | 72302 | Stem cell technologies | |
SB431542 | S4317 | Sigma | |
Sucrose | S7903 | Sigma | |
SuperFrost Microscope slides | 12372098 | ThermoFisher | adhesion microscope slides |
Tissue-Tek O.C.T. Compound | 25608-930 | VWR | |
Tris-HCL 1M | T3038-1L | Sigma | |
Triton X-100 | 9002-93-1 | Sigma | |
Tween-20 | P1379 | Sigma | |
UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0 | 15575020 | ThermoFisher |
References
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