Summary
Ce protocole décrit un système de culture dynamique pour produire des agrégats de taille contrôlée des cellules souches pluripotentes humaines et stimuler davantage la différenciation des organoïdes cérébellaires dans des conditions chimiquement définies et sans alimentation à l’aide d’un bioréacteur à usage unique.
Abstract
Le cervelet joue un rôle critique dans le maintien de l’équilibre et de la coordination motrice, et un défaut fonctionnel dans différents neurones cérébellaires peut déclencher un dysfonctionnement cérébelleux. La plupart des connaissances actuelles sur les phénotypes neuronaux liés à la maladie sont basées sur des tissus post mortem, ce qui rend difficile la compréhension de la progression et du développement de la maladie. Des modèles animaux et des lignées cellulaires immortalisées ont également été utilisés comme modèles pour les troubles neurodégénératifs. Cependant, ils ne récapitulent pas complètement la maladie humaine. Les cellules souches pluripotentes induites par l’homme (iPSC) ont un grand potentiel pour la modélisation des maladies et fournissent une source précieuse pour les approches régénératrices. Ces dernières années, la génération d’organoïdes cérébraux à partir d’iPSC dérivés du patient a amélioré les perspectives de modélisation des maladies neurodégénératives. Cependant, les protocoles qui produisent un grand nombre d’organoïdes et un rendement élevé de neurones matures dans les systèmes de culture 3D font défaut. Le protocole présenté est une nouvelle approche pour la production reproductible et évolutive d’organoïdes humains dérivés de l’iPSC dans des conditions chimiquement définies à l’aide de bioréacteurs évolutifs à usage unique, dans lesquels les organoïdes acquièrent l’identité cétebelaire. Les organoïdes générés sont caractérisés par l’expression de marqueurs spécifiques à la fois au niveau de l’ARNm et des protéines. L’analyse de groupes spécifiques de protéines permet la détection de différentes populations de cellules cérebelaires, dont la localisation est importante pour l’évaluation de la structure organoïde. La cryosection organoïde et l’immunostaining supplémentaire des tranches organoïdes sont utilisés pour évaluer la présence de populations spécifiques de cellules cérebelaires et leur organisation spatiale.
Introduction
L’émergence de cellules souches pluripotentes humaines (CSP) représente un excellent outil pour la médecine régénérative et la modélisation des maladies, parce que ces cellules peuvent être différenciées dans la plupart des lignées cellulaires du corps humain1,2. Depuis leur découverte, la différenciation psc utilisant diverses approches a été rapportée pour modéliser différentes maladies, y compris les désordres neurodégénératifs3,4,5,6.
Récemment, il y a eu des rapports des cultures 3D dérivées des PSC ressemblant aux structures cérébrales humaines ; ceux-ci sont appelés organoïdes du cerveau3,7,8. La génération de ces structures à partir de CSP sains et spécifiques aux patients offre une occasion précieuse de modéliser le développement humain et les troubles neurodéveloppementaux. Cependant, les méthodes utilisées pour générer ces structures cérébrales bien organisées sont difficiles à appliquer pour leur production à grande échelle. Pour produire des structures suffisamment grandes pour récapituler la morphogenèse tissulaire sans nécrose à l’intérieur des organoïdes, les protocoles s’appuient sur l’engagement neuronal initial dans des conditions statiques, suivi de l’encapsulation dans les hydrogels et de la culture subséquente dans les systèmes dynamiques3. Toutefois, de telles approches peuvent limiter l’augmentation potentielle de la production d’organoïdes. Même si des efforts ont été faits pour diriger la différenciation psc à des régions spécifiques du système nerveux central, y compris cortical, striatal, midbrain, et les neurones de la moelle épinière9,10,11,12, la génération de régions spécifiques du cerveau dans des conditions dynamiques est toujours un défi. En particulier, la génération de neurones cérebelaires matures dans les structures 3D n’a pas encore été décrite. Muguruma et coll. ont été les pionniers de la génération de conditions culturelles qui récapitulent le développement cérébellaire précoce13 et ont récemment signalé un protocole qui permet aux cellules souches embryonnaires humaines de générer une structure polarisée rappelant le cervelet du premier trimestre7. Cependant, la maturation des neurones cérébellaires dans les études rapportées nécessite la dissociation des organoïdes, le tri des progéniteurs cérébellaires, et la coculture avec des cellules d’alimentation dans un système de culture monocouche7,14,15,16. Par conséquent, la génération reproductible des organoïdes cérébellaires désirés pour la modélisation de la maladie dans des conditions définies est toujours un défi associé à la culture et à la variabilité des sources d’alimentation.
Ce protocole présente des conditions de culture optimales pour l’expansion 3D et une différenciation efficace des CSP humains en neurones cérébellaires à l’aide de bioréacteurs à roue verticale à usage unique (voir tableau des matériaux pour les spécifications), ci-après appelé bioréacteurs. Les bioréacteurs sont équipés d’un grand rotor vertical, qui, en combinaison avec un fond en forme de U, fournissent une distribution de cisaillement plus homogène à l’intérieur du récipient, permettant un mélange doux et uniforme et la suspension des particules avec des vitesses d’agitation réduites17. Avec ce système, des agrégats cellulaires contrôlés par la forme et la taille peuvent être obtenus, ce qui est important pour une différenciation plus homogène et plus efficace. En outre, un plus grand nombre d’organoïdes dérivés de l’iPSC peuvent être générés d’une manière moins laborieuse.
La principale caractéristique des organoïdes, qui sont des structures multicellulaires 3D habituellement formées à partir de cellules souches, est l’auto-organisation de différents types de cellules qui forme des formes spécifiques comme celles observées dans la morphogenèse humaine18,19,20. Par conséquent, la morphologie organoïde est un critère important à évaluer au cours du processus de différenciation. La cryosection des organoïdes et l’immunostaining supplémentaire des tranches d’organoïdes avec un ensemble spécifique d’anticorps permettent la visualisation spatiale des marqueurs moléculaires pour analyser la prolifération cellulaire, la différenciation, l’identité de la population cellulaire et l’apoptose. Avec ce protocole, par cryosections organoïdes immunostaining, un engagement neuronal efficace initial est observé par le7ème jour de différenciation. Au cours de la différenciation, plusieurs populations cellulaires avec l’identité cérebelaire sont observées. Après 35 jours dans ce système dynamique, le neuroépithélium cérébellaire s’organise le long d’un axe apicobasal, avec une couche apicale de progéniteurs proliférants et de neurones postmitotiques basally situés. Au cours du processus de maturation, à partir des jours 35 à 90 de différenciation, des types distincts de neurones cérébellaires peuvent être vus, y compris les cellules Purkinje (Calbindin+), les cellules de granule (PAX6+/MAP2+), les cellules Golgi (Neurogranin+), les cellules de brosse unipolaires (TBR2+), et les neurones profonds de projection de noyaux cérébraux (TBR1+). En outre, une quantité non significative de mort cellulaire est observée dans les organoïdes cérébellaires générés après 90 jours dans la culture.
Dans ce système, les organoïdes humains dérivés de l’iPSC mûrissent en différents neurones cérébellaires et survivent jusqu’à 3 mois sans avoir besoin de dissociation et de coculture de mangeoire, fournissant une source de neurones cérebelaires humains pour la modélisation des maladies.
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Protocol
1. Passage et entretien des iPSCs humains dans la culture monocouche
- Préparation des plaques
- Décongeler la matrice membranaire du sous-sol (voir tableau des matériaux)à 4 °C et préparer 60 aliquots μL. Congeler les aliquots à -20 °C.
- Pour recouvrir les puits d’une plaque de 6 puits, décongeler un aliquot de la matrice de membrane du sous-sol sur la glace. Une fois décongelé, ajouter 60 μL à 6 mL de DMEM-F12. Resuspendez doucement en faisant des pipes de haut en bas.
- Ajouter 1 mL de solution diluée de matrice de membrane de sous-sol à chaque puits d’une plaque de 6 puits et incuber à RT pendant au moins 1 h avant de passer ou de stocker à 4 °C pendant jusqu’à 1 semaine.
- Passage des colonies iPSC avec EDTA
- Maintenir les iPSC dans la culture monocouche dans 6 plaques de puits dans l’incubateur à 37 °C, 95% d’humidité et 5% de CO2.
REMARQUE : Dans ce protocole, trois lignes iPSC humaines distinctes ont été utilisées : F002.1A.1321, ligne iPSC épisomale humaine (iPSC6.2)22, et iPS-DF6-9-9T.B obtenue commercialement (voir tableau des matériaux). - Avant de passer, incuber les plaques stockées (étape 1.1) à température ambiante (RT) pendant 15 min et préparer le milieu mTesR1 (tableau 1).
- Apirate la solution de la plaque à l’aide d’une pipette sérologique et ajouter immédiatement 0,5 mL de milieu mTeSR1 à chaque puits.
- Apirate le milieu usé du puits contenant des iPSC et laver une fois à l’aide de 1 mL de 0,5 mM EDTA par puits.
- Ajouter 1 mL de 0,5 mM EDTA à chaque puits et incuber à RT pendant 5 min.
- Aspirate EDTA et retirer les cellules des puits en ajoutant doucement le milieu mTeSR1 et en canalisant les colonies à l’aide d’une micropipette P1000. Recueillir les cellules dans un tube conique.
REMARQUE : Ne pas pipette cellules de haut en bas de plus de 3x. - Ajoutez 1 mL de suspension cellulaire (dilué 1:4) à chaque puits de sorte que chaque puits contient 1,5 mL de milieu après l’ajout de la suspension cellulaire. Retourner les cellules à l’incubateur à 5% CO2, 37 °C.
- Remplacez le milieu dépensé tous les jours et passez tous les 3 jours lorsque la confluence de 75 à 80 %.
- Maintenir les iPSC dans la culture monocouche dans 6 plaques de puits dans l’incubateur à 37 °C, 95% d’humidité et 5% de CO2.
2. Semis d’iPSCs humains dans le bioréacteur
- Incuber les iPSC cultivés sous forme de monocouches dans mTeSR1 complétés par 10 μM d’inhibiteur de rock Y-27632 (ROCKi). Ajouter 1 mL de milieu complété à chaque puits à partir d’une plaque de culture tissulaire de 6 puits et incuber pendant 1 h à 37 °C, 95% d’humidité et 5% de CO2.
REMARQUE : ROCKi est utilisé pour protéger les iPSC dissociés de l’apoptose23. - Après 1 h d’incubation, apirate le milieu usé de chaque puits et laver 1x avec 1 mL de 1× PBS par puits.
- Ajouter 1 mL du milieu de détachement cellulaire (voir tableau des matériaux)à chaque puits d’une plaque de 6 puits et incuber à 37 °C pendant 7 min jusqu’à ce que les cellules se détachent facilement des puits avec une secousse douce.
- Pipette le milieu de détachement cellulaire de haut en bas avec une micropipette P1000 jusqu’à ce que les cellules se détachent et se dissocient en cellules uniques. Ajouter 2 ml de milieu de culture cellulaire complète à chaque puits pour inactiver la digestion enzymatique et pipette les cellules doucement dans un tube conique stérile.
- Centrifugeuse à 210 × g pendant 3 min et retirer le supernatant.
- Resuspendez le granulé cellulaire dans le milieu de culture (c.-à-d. mTeSR1 complété par 10 μM de ROCKi) et comptez les iPSC avec un hémocytomètre à l’aide de colorant bleu trypan.
- Graine 15 × 106 cellules individuelles dans le bioréacteur (volume maximum de 100 mL) avec 60 mL de mTeSR1 complété par 10 μM de ROCKi à une densité cellulaire finale de 250 000 cellules/mL.
- Insérez le récipient contenant les iPSC dans l’unité de base universelle placée dans l’incubateur à 37 °C, 95 % d’humidité et 5 % de CO2.
REMARQUE : L’agitation du bioréacteur est maintenue pendant 24 h en fixant le contrôle universel de l’unité de base à 27 tr/min pour promouvoir l’agrégation iPSC.
3. Différenciation et maturation des agrégats humains dérivés d’iPSC dans les organoïdes cérébellaires
- Définissez le jour de l’ensemencement à cellule unique comme jour 0.
- Le premier jour, prélever 1 mL de l’échantillon d’agrégats iPSC à l’aide d’une pipette sérologique. Maintenir le bioréacteur sous agitation comme auparavant en plaçant l’unité de base universelle avec le bioréacteur contenant les agrégats dans un flux stérile avant la collecte de l’échantillon. Plaquez la suspension cellulaire dans une plaque de puits à très basse fixation 24. Vérifiez que les agrégats dérivés d’iPSC sont formés.
- Acquérir des images avec un microscope optique à l’aide d’un grossissement total de 40x ou 100x pour mesurer le diamètre total.
- Mesurer la zone des agrégats dans chaque image à l’aide du logiciel FIJI.
- Sélectionnez "Analyser | Définissez les mesures" à partir de la barre de menu et cliquez sur "Area" et "OK« .
- Sélectionner "Fichier | Ouvrez" à partir de la barre de menu pour ouvrir un fichier image stocké. Sélectionnez l’outil de sélection de lignes présenté dans la barre d’outils et créez une ligne droite sur la barre d’échelle présentée dans l’image. Sélectionnez "Analyser | Définir l’échelle" à partir de la barre de menus.
- Dans " Distance connue« , ajoutez l’étendue de la barre d’échelle de l’image en μm. Définirl'« unité de longueur» comme μm. Cliquez sur "Global" pour maintenir les réglages et "OK« . Sélectionnez Sélection ovale dans la barre d’outils.
- Pour chaque agrégat délimitez la zone avec l’outil ovale. Sélectionnez "Analyser | Mesure« . Calculer leur diamètre en fonction de la superficie mesurée, étant donné que les agrégats sont approximativement sphériques
avec A comme zone de l’agrégat.
- Lorsque le diamètre moyen des agrégats est de 100 μm, remplacer 80 % du milieu dépensé par du mTeSR1 frais sans ROCKi. Lorsque les agrégats atteignent 200–250 μm de diamètre, remplacez tous les milieux usés par du gfCDM (tableau 1),en laissant les organoïdes s’installer au fond du bioréacteur.
REMARQUE : Si le diamètre total moyen dépasse 350 μm, ne démarrez pas le protocole de différenciation. Répétez l’ensemencement de cellules individuelles. En général, il faut environ 1 jour pour que l’agrégat atteigne un diamètre moyen de 100 μm. - Insérez le bioréacteur contenant les agrégats dans l’unité de base universelle placée dans l’incubateur à 37 °C, 95% d’humidité et 5% de CO2.
- Diminuer l’agitation bioréacteur à 25 tr/min.
- Le jour 2, répétez les étapes 3.2, 3.3 et 3.4 pour évaluer le diamètre global. Ajouter 30 μL de FGF2 (concentration finale, 50 ng/mL) et 60 μL de SB431542 (concentration finale, 10 μM) à 60 mL de milieu de différenciation gfCDM (tableau 1). Remplacez tous les milieux dépensés du bioréacteur par le gfCDM complété. Répétez l’étape 3.6.
NOTE: SB431542 est crucial pour inhiber la différenciation mésendodermique, induisant la différenciation neuronale24. FGF2 est utilisé pour promouvoir la caudalisation du tissu neuroepithelial25. - Le jour 5, répétez les étapes 3.2, 3.3, 3.4 et 3.8.
REMARQUE : La taille globale doit augmenter au cours du protocole de différenciation. Cependant, le diamètre n’est critique que lorsque la différenciation commence, car ce paramètre pourrait influencer l’efficacité de la différenciation. - Le jour 7, répétez les étapes 3.2, 3.3 et 3.4. Diluer FGF2 et SB431542 à 2/3 : Ajouter 20 μL de FGF2 et 40 μL de SB431542 à 60 mL de milieu de différenciation gfCDM. Remplacer tous les milieux dépensés du bioréacteur par un gfCDM complété. Répétez l’étape 3.6 et augmentez l’agitation bioréacteur à 30 tr/min.
- Le jour 14, répétez les étapes 3.2, 3.3 et 3.4. Ajouter 60 μL de FGF19 (concentration finale, 100 ng/mL) à 60 mL de milieu de différenciation gfCDM. Remplacer tous les milieux dépensés du bioréacteur par gfCDM complété par FGF19. Répétez l’étape 3.6.
REMARQUE : Le FGF19 est utilisé pour promouvoir la polarisation des structures du cerveaumoyen-arrière 26. - Le jour 18, répétez les étapes 3.2, 3.3, 3.4 et 3.11.
- Le jour 21, répétez les étapes 3.2, 3.3 et 3.4. Remplacer tous les milieux passés du bioréacteur par un milieu neurobasal complet (Tableau 1). Répétez l’étape 3.6.
REMARQUE : Le milieu neurobasal est un milieu basal utilisé pour maintenir la population de cellules neuronales dans l’organoïde7. - Le jour 28, répétez les étapes 3.2, 3.3 et 3.4. Ajouter 180 μL de SDF1 (concentration finale, 300 ng/mL) à 60 mL de milieu neurobasal complet. Remplacez tous les milieux dépensés du bioréacteur par un milieu neurobasal complet complété par SDF1. Répétez l’étape 3.6.
REMARQUE : SDF1 est utilisé pour faciliter l’organisation de couches cellulaires distinctes27. - Le jour 35, répétez les étapes 3.2, 3.3 et 3.4. Remplacer tous les milieux passés du bioréacteur par un milieu BrainPhys complet (Tableau 1). Répétez l’étape 3.6.
REMARQUE : BrainPhys est un milieu neuronal qui soutient les neurones synaptiquement actifs28. - Remplacez 1/3 du volume total tous les 3 jours par un milieu BrainPhys complet jusqu’au jour 90 de la différenciation.
4. Préparation d’organoïdes pour la cryosection et l’immunohistorique
- Collection d’organoïdes pour l’immunostaining
- Recueillir 1 ml d’échantillon d’organoïdes contenant des aliments moyens à l’aide d’une pipette sérologique du bioréacteur à un tube conique de 15 mL.
REMARQUE : Les Organoïdes doivent être recueillis à différents délais pour évaluer l’efficacité de la différenciation, y compris les jours 7, 14, 21, 35, 56, 70, 80 et 90. - Retirer le supernatant et laver une fois avec 1 mL de 1× PBS.
REMARQUE : Ne centrifugez pas les organoïdes. Laissez les organoïdes s’installer au fond du tube par gravité. - Retirer le supernatant et ajouter 1 mL de 4% de paraformaldéhyde (PFA). Incuber à 4 °C pendant 30 min. Retirez la PFA dépensée et ajoutez 1 mL de 1 × PBS.
- Conserver les organoïdes dans 1 mL de 1× PBS à 4 °C jusqu’au traitement de la cryosection.
REMARQUE : Conservez les organoïdes dans 1x PBS pendant au plus 1 semaine après la fixation.
- Recueillir 1 ml d’échantillon d’organoïdes contenant des aliments moyens à l’aide d’une pipette sérologique du bioréacteur à un tube conique de 15 mL.
- Préparation d’organoïdes pour la cryosection
- Retirez le supernatant des organoïdes stockés. Ajouter 1 mL de saccharose à 15 % (w/v, dilué en 1 × PBS), bien mélanger par un tourbillon doux et incuber pendant la nuit à 4 °C.
- Préparer une solution de 15 % de gélatine de saccharose/7,5 %(tableau 2)et maintenir à 37 °C pendant la préparation pour éviter la gélatine pour se solidifier.
- Retirer la solution de saccharose de 15 %, ajouter 1 mL de 15 % de gélatine de saccharose/7,5 % aux organoïdes, et mélanger rapidement par tourbillonnement doux. Incuber à 37 °C pendant 1 h.
- Ajouter 15 % de solution de gélatine au saccharose/7,5 % dans un contenant en plastique jusqu’à la moitié de son volume. Attendez la solidification à RT.
- Après une incubation de 1 h, déposer soigneusement une goutte de saccharose/gélatine contenant les organoïdes sur la gélatine solidifiée à l’aide d’une pipette Pasteur. Laisser se solidifier à RT pendant environ 15 min. Assurez-vous d’éviter la formation de bulles.
- Déposer 15 % de gélatine de saccharose/7,5 % sur les organoïdes jusqu’à ce que le contenant soit rempli. Attendez une solidification complète chez RT.
- Après solidification, incuber 20 min à 4 °C.
- Couper la gélatine dans un cube contenant les organoïdes au centre et fixer le cube de gélatine sur un morceau de carton avec une goutte de composé O.C.T.
- Placer 250 ml d’isopentane dans une tasse de 500 ml et remplir un contenant approprié d’azote liquide. À l’aide de forceps et de gants épais, placez soigneusement la tasse contenant de l’isopentane à la surface de l’azote liquide et refroidissez l’isopentane à -80 °C.
- Lorsque -80 °C est atteint, placez le cube de gélatine dans la tasse contenant de l’isopentane jusqu’à ce qu’il gèle, en maintenant la température à -80 °C. Selon la taille du cube, il peut prendre 1 à 2 min.
REMARQUE : Évitez les températures inférieures à -80 °C ou le temps de congélation excessif, car cela pourrait provoquer une fissuration du cube. - Une fois congelé, conserver rapidement le cube de gélatine à -80 °C et conserver jusqu’à ce que la cryosection.
- Cryosection des organoïdes
- Allumez le cryostat et définissez à la fois les températures du spécimen (OT) et de la cryochamber (CT) à -25 °C.
- Lorsque les deux températures se stabilisent, fixer le cube de gélatine contenant les organoïdes sur le spécimen à l’aide de composé O.C.T.
- Définir l’épaisseur de la section à 12 μm.
- Couper le cube et recueillir 3 à 4 tranches sur des lames de microscope d’adhérence (voir tableau des matériaux).
- Conserver à -20 °C jusqu’à l’utilisation.
- Immunostaining des tranches d’organoïdes
- Placez les lames de microscope contenant des sections organoïdes dans un bocal de copling avec 50 ml de PBS préguerre, tenant jusqu’à 10 diapositives dos à dos.
REMARQUE : Toutes les sections organoïdes doivent être submergées de liquide. - Incuber pendant 45 min à 37 °C pour dégélater les diapositives.
- Laver 1x avec 50 ml de 1× PBS pendant 5 min à RT: Transférer les diapositives dans un bocal de copling contenant 1× PBS frais.
- Transférer les lames dans un bocal de copling contenant 50 ml de glycine fraîchement préparée (tableau 2) et incuber pendant 10 min à RT.
- Transférer les diapositives dans un bocal de copling contenant 50 ml de triton de 0,1 %(tableau 2) et perméabiliser pendant 10 min à RT.
- Laver avec 1× PBS pendant 5 min 2x.
- Préparer le plat immunostaining avec du papier de 3 mm trempé dans 1× PBS. Sécher les lames avec un mouchoir tout autour des tranches et les placer sur du papier de 3 mm. Avec une pipette Pasteur, recouvrez toute la surface des lames d’une solution de blocage (tableau 2) avec ~0,5 mL par diapositive. Incuber pendant 30 min à RT.
- Retirez l’excès de solution de blocage et séchez les lames avec un tissu tout autour des tranches. Placer 50 μL de l’anticorps primaire (tableau 3) dilué dans la solution de blocage sur les sections et couvrir avec les couvercles. Placer les tranches dans un plat d’immunostaining préalablement préparé. Incuber toute la nuit à 4 °C.
- Transférer les diapositives dans un bocal de copling avec 50 ml de TBST (tableau 2), laisser tomber les couvercles, et laver avec TBST pendant 5 min 3x.
- Placer 50 μL de l’anticorps secondaire dilué dans la solution de blocage sur les sections et couvrir avec les couvercles. Placez les tranches dans le plat immunostaining préalablement préparé. Incuber pendant 30 min à RT, à l’abri de la lumière.
- Transférer les diapositives dans un bocal de copling à nouveau et laver avec 50 ml de TBST pendant 5 min 3x.
- Séchez les lames avec un tissu tout autour des tranches et placez les tranches dans un plat immunostaining préalablement préparé. Ajouter 0,5 mL de solution DAPI sur toute la surface des lames avec une pipette Pasteur. Incuber pendant 5 min à RT.
- Répétez l’étape 4.4.9.
- Sécher soigneusement les lames avec un tissu. Ajouter 50 μL de montage moyen goutte par goutte le long de la diapositive, puis abaisser soigneusement un couvercle sur chaque diapositive, légèrement le plier pour éviter les bulles.
- Placez les lames de microscope contenant des sections organoïdes dans un bocal de copling avec 50 ml de PBS préguerre, tenant jusqu’à 10 diapositives dos à dos.
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Representative Results
Le protocole a été initié en favorisant l’agrégation cellulaire à l’aide des bioréacteurs de 0,1 L (figure 1A). L’inoculation à cellule unique des iPSC a été effectuée, avec 250 000 cellules/mL ensemencées dans 60 mL de milieu avec une vitesse d’agitation de 27 tr/min. Cela a été défini comme le jour 0. Après 24 h, les cellules ont formé efficacement des agrégats en forme de sphéroïde (jour 1, figure 1B),et la morphologie a été bien entretenue jusqu’au jour 5, avec une augmentation progressive de la taille, démontrant un degré élevé d’homogénéité dans la morphologie et la taille globales au fil du temps. (Figure 1B). Une analyse quantitative par microscopie a également révélé une distribution normale des tailles agrégées par jour 1 (Figure 1C). La taille globale est un paramètre physique important capable d’inciter les cellules à se différencier vers différentes lignées29,30. Pour cette raison, sur la base de la taille globale rapportée dans les études précédentes pour induire un engagement neuronal efficace31,32 et cérebelaire21, les agrégats générés ont été maintenus dans le milieu mTeSR1 à 25 tr/min jusqu’à ce qu’ils atteignent le diamètre désiré avant de commencer la différenciation (~200 μm). Au deuxième jour, le diamètre moyen était de 221,0 ± 54,4 μm (moyenne ± SD) pour la ligne cellulaire F002.1A.13 et de 212,1 ± 42,1 μm pour la lignée cellulaire iPSC6.2. À ce titre, les deux lignées cellulaires ont atteint la taille agrégée optimale à ce point de temps (figure 1C).
Définissant le jour où l’ensemencement des iPSC a été effectué comme jour 0, au jour 2, après avoir atteint le diamètre agrégé souhaité, l’engagement neuronal a été induit en utilisant simultanément SB431542, FGF2, et l’insuline, favorisant la différenciation neuroectodermique, aussi bien qu’une caudalisation modérée nécessaire pour le modèle de mi-arrièrebrain. Par la suite, FGF19 et SDF1 ont été ajoutés à la culture aux jours 14 et 28, respectivement, pour promouvoir la génération de différents ancêtres cérebelaires. Pendant les premiers jours de l’induction neuronale, une vitesse de rotation de 25 tr/min a été utilisée, qui a été augmentée à 30 tr/min après 7 jours pour éviter l’accumulation et l’agglutination de plus grands agrégats (figure 2A). Au cours de la différenciation, les organoïdes ont montré une épithéliation plus prononcée semblable aux structures de tube neural-comme avec l’espace luminal (Figure 2B). En outre, l’évaluation de la distribution du diamètre organoïde a démontré une répartition homogène de la taille au cours de l’engagement cérébellaire initial jusqu’au jour 14 (figure 2B).
L’analyse d’immunofluorescence soutient qu’un engagement neuronal efficace des organoïdes dérivés de l’iPSC est déjà atteint au 7e jour de la différenciation après l’ajout de FGF2 et SB431542. Les cryosections des organoïdes ont révélé de nombreuses structures rappelant la coloration du tube neural pour PAX6 et NESTIN, la plupart des cellules dans les organoïdes exprimant le marqueur progénieur NESTIN aux jours 7 et 14 de la différenciation (Figure 2C). Par la suite, FGF19 et SDF1 ont favorisé la génération de couches progénitrices proliférantes en permanence (PAX6+) et une différenciation neuronale efficace a été réalisée, comme en témoigne l’expression de TUJ1, la bêta-tubuline de classe III spécifique aux neurones, par les jours 21 et 35 (figure 2C). En outre, une différenciation cérebelaire efficace a également été observée après 21 jours dans les bioréacteurs VW de 0,1 L, démontrés par la présence de deux populations cellulaires différentes : les progéniteurs de cellules de granule (BARLH1+ cellules, figure 3A),et les progéniteurs de cellules Purkinje (OLIG2+ cellules, figure 3B). Après 35 jours de culture, différentes populations cellulaires dans les organoïdes semblaient être organisées en couches distinctes. Diverses structures ovales plates à l’intérieur des organoïdes ont été observées avec barhl1+ progéniteurs cérebelaires dorsaux comme couche continue sur le côté superficiel de l’organoïde (Figure 3C,D) et SOX2+ dans la région luminale de ces structures ovales (Figure 3D). En outre, les neurones tuj1+ nouveau-nés semblaient migrer vers la surface, rétablissant l’alignement radial sur la surface externe de l’organoïde (figure 3E).
Après la génération des progéniteurs cérebelaires, la maturation a été favorisée utilisant le milieu de BrainPhys28 complété avec des facteurs neurotrophiques BDNF et GDNF. La coloration d’immunofluorescence des cryosections organoïdes a été employée pour détecter les sous-types distincts des neurones cérébellaires. Les cellules purkinje, les neurones GABAergic exprimant la calbindine de protéine de calcium-liaison (CALB, figure 3F),ont été détectés dans les organoïdes cérébellaires après le protocole de maturation. En outre, un autre type neuronal cérébellaire majeur, les cellules granuleuses, a été identifié comme un sous-ensemble de cellules coexprimant PAX6 et MAP2 (Figure 3G). Fait intéressant, un pool de PAX6+ progéniteurs n’exprimant pas MAP2 a été maintenu jusqu’à 80 jours de différenciation. D’autres types de neurones cérébellaires ont également été détectés, y compris les cellules de brosse unipolaires exprimant TBR2 (Figure 3H), et les neurones de projection de noyaux cérebelaires profonds exprimant TBR1 (Figure 3I). En plus d’une différenciation et d’une maturation cérebelaires efficaces, ce système de culture dynamique 3D utilisant les bioréacteurs PBS 0.1 L VW a permis aux organoïdes de rester viables jusqu’à 90 jours, sans décès cellulaire significatif et nécrose (Figure 3J).
Figure 1 : Génération d’agrégats à taille contrôlée à l’aide de bioréacteurs évolutifs. (A) Caractéristiques de conception du bioréacteur. (B) Photomicrographe Brightfield montrant des agrégats de deux lignes iPSC différentes les jours 1, 2 et 5. Barre d’échelle = 100 μm. (C) La répartition de la taille des agrégats flottants provenant de différentes lignes d’iPSC dans les bioréacteurs. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2 : Génération d’organoïdes humains dérivés de l’iPSC à l’aide de bioréacteurs de 0,1 L. (A) Représentation schématique de la procédure de culture pour induire la différenciation des iPSC aux organoïdes cérébellaires. Les cellules ont été ensemencées à une densité de 250 000 cellules/mL et une vitesse d’agitation de 27 tr/min a été utilisée pour favoriser l’agrégation cellulaire. Pendant les premiers jours de différenciation, les agrégats ont été maintenus à une vitesse d’agitation de 25 tr/min. Par la suite, pour éviter l’accumulation de plus grands agrégats, la vitesse d’agitation a été augmentée à 30 tr/min. (B) Caractérisation de la forme et de la taille des organoïdes. Photomicrographes brightfield montrant des organoïdes dérivés d’iPSC pendant la différenciation cérebelaire dans les bioréacteurs VW de 0,1 L. Barre d’échelle = 100 μm. La distribution des diamètres organoïdes démontre que la culture a maintenu des tailles homogènes d’organoïdes le long du protocole de différenciation. (C) Induction neuronale efficace dans les organoïdes dérivés d’iPSC. Immunofluorescence pour NESTIN, PAX6 et TUJ1 lors de la différenciation cérebelaire. Barre d’échelle = 50 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3 : Différenciation et maturation cérebelaires efficaces dans les organoïdes humains dérivés de l’iPSC. (A-E) Engagement cérébelleux efficace. Analyse d’immunostaining pour les marqueurs BARHL1, SOX2, OLIG2, NCAD, et TUJ1 aux points de temps indiqués du protocole de différenciation cérebelaire. (F-I) Maturation efficace des organoïdes cérébellaires humains dérivés de l’iPSC. Immunofluorescence montrant différents types de neurones cérebelaires, y compris les cellules Purkinje (CALB, F), les cellules granuleuses (PAX6 et MAP2, G), les cellules de brosse unipolaire (TBR2), et les neurones de projections de noyaux cérebelaires profonds (TBR1). (J) Viabilité cellulaire élevée après maturation cérebelaire. La coloration vivante/morte (calcéin-AM, vert et propidium iodure, rouge) des organoïdes a montré la viabilité élevée de cellules et aucune évidence des secteurs nécrotiques après 80 jours dans les bioréacteurs. Barre d’échelle = 50 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
| Préparation des médias |
mTeSR1 Volume final: 500 mL |
1. Décongeler mTeSR1 5× supplément à température ambiante (RT) ou à 4 °C pendant la nuit et mélanger avec milieu basal 2. Conserver le milieu mTeSR1 complet à 4 °C jusqu’à 2 semaines ou préparer 40 mL aliquots et conserver à -20 °C 3. MTeSR1 complet préchauffé chez RT avant utilisation |
|
gfCDM (milieu défini chimiquement sans facteur de croissance) Volume final: 60 mL |
F12 de 30 mL Ham IMDM de 30 mL Concentré lipidique 600 μL défini chimiquement (1 % v/v) Monothioglycérol de 2,4 μL (450 μM) 30 μL apo-transferrine (solution de stock à 30 mg/mL dans l’eau, concentration finale: 15 μg/mL) 300 mg de BSA purifié à la cristallisation (5 mg/mL) 42 μL d’insuline (concentration de stock à 10 mg/mL, concentration finale : 7 μg/mL) 300 μL P/S (0,5 % v/v, 50 U/ml de pénicilline/50 μg/ml de streptomycine) |
|
|
Neurobasal Volume final: 60 mL |
60 mL de milieu neurobasal Supplément de 600 μL N2 600 μL Glutamax I 300 μL P/S (0,5 % v/v). |
|
|
BrainPhys complet Volume final: 60 mL |
60mL de BrainPhys Supplément neuronal NeuroCult SM1 de 1,2 mL Supplément 600 μL N2 12 μL BDNF (concentration finale : 20 ng/mL) 12 μL GDNF (concentration finale : 20 ng/mL) 300 μL Dibutyryl-cAMP (concentration de stock : 100 mg/mL dans l’eau, concentration finale : 1 mM) 42 μL d’acide ascorbique (concentration de stock : 50 μg/mL dans l’eau, concentration finale : 200 nM) |
|
| Solutions de stock de facteurs de croissance et de petites molécules |
Facteur de croissance fibroblastique de base (bFGF/FGF2) Concentration de stock: 100 μg/mL |
1. Reconstituer en tris de 5 mM, pH 7,6, à une concentration de 10 mg/mL 2. Diluer avec 0,1 % de BSA dans pbs (v/v) à une concentration finale de stock de 100 μg/mL |
|
Facteur 1 dérivé de cellules stromales (SDF1) Concentration de stock: 100 μg/mL |
1. Reconstituer dans l’eau à une concentration de 10 mg/mL 2. Diluer avec 0,1 % BSA (v/v) dans pbs à une concentration finale de stock de 100 μg/mL. |
|
|
Facteur neurotrophique dérivé du cerveau (BDNF) Concentration de stock: 100 μg/mL |
||
|
Facteur neurotrophique dérivé de cellules gliales (GDNF) Concentration de stock: 100 μg/mL |
||
|
Facteur de croissance fibroblastique 19 (FGF19) Concentration de stock: 100 μg/mL |
1. Reconstituer en phosphate de sodium de 5 mM, pH 7,4, à une concentration de 10 mg/mL 2. Diluer avec 0,1 % de BSA dans pbs (v/v) à une concentration finale de stock de 100 μg/mL |
|
|
Inhibiteur de ROCHE Y-27632 Concentration de stock: 10mM |
Reconstituer en DMSO à une concentration de 10 mM. | |
|
SB431542 Concentration de stock: 10mM |
||
|
Insuline Concentration de stock: 10 mg/mL |
1. Reconstituer 10 mg d’insuline dans 300 μL de 10 mM NaOH 2. Ajouter soigneusement 1 M NaOH jusqu’à ce que la solution devienne claire et transparente 3. Remplir à 1 mL avec de l’eau stérile. |
Tableau 1 : Solutions de stock et préparation des médias. Sont répertoriés tous les composants et les volumes utilisés pour préparer les supports pour le protocole de maintenance et de différenciation des iPSC, ainsi que des solutions de stock de facteurs de croissance et de petites molécules. Pour les solutions de stock, toutes les concentrations de stock et les protocoles de reconstitution sont répertoriés.
|
Gélatine/Saccharose Concentration finale: 7,5%/15% w/w |
1. Peser 15 g de saccharose et 7,5 g de gélatine dans une bouteille stérile en verre Schott et bien mélanger 2. Préchauffer le PBS 1× à 65 °C 3. Ajouter pbs pré-réchauffé 1× à un poids final de 100 g et bien mélanger 4. Placer la bouteille en verre Schott dans une plaque chauffante à 65 °C et secouer jusqu’à ce que la gélatine fonde 5. Incuber à 37 °C jusqu’à ce que la solution se stabilise |
|
Glycine Concentration finale: 0,1 M |
Ajouter 0,37 g de glycine à 50 mL de PBS 1× fraîchement préparés. |
|
Solution Triton Concentration finale: 0,1 % w/v |
1. Préparer un stock de 10 % de Triton X-100 : 5 g de Triton X-100 en 50 mL de PBS 1× 2. Ajouter 0,5 mL de stock Triton X-100 à 50 mL de PBS 1×. |
|
TBST 20 mM Tris-HCl pH 8.0, 150 mM NaCl, 0.05 % w/v Tween-20 |
20 mL Tris 1 M 30 mL NaCl 5 M 5 mL Tween-20 (10 % de stock : 5 g de Tween-20 dans 50 mL d’eau) Remplir à 1 L avec de l’eau. |
| Solution de blocage | Ajouter 5 mL de sérum bovin fœtal (FBS, concentration finale: 10 % v/v) à 50 mL de TBST. |
| Solution DAPI | Ajouter 15 μL de solution de stock DAPI (1 mg/mL) à 10 mL d’eau destilée |
| Mowiol | 1. Ajouter 2,4 g de Mowiol à 6 g de glycérol et secouer pendant 1 h dans une plaque préchauffée à 50 °C 2. Ajouter 6 mL d’eau distillée et secouer pendant 2 h 3. Ajouter 12 mL de Tris 200 mM (pH 8,5) et secouer pendant 10 min 4. Centrifugeuse à 5 000 × g pendant 15 min 5. Aliquot et conserver à -20 °C. |
Tableau 2 : Solutions pour la préparation d’organoïdes pour la cryosection et l’immunostaining. Sont répertoriés tous les composants et les volumes utilisés pour préparer les solutions utilisées dans la préparation des organoïdes pour la cryosection et l’immunostaining.
| Anticorps | Espèces hôtes | Dilution |
| BARHL1 | Lapin | 1/500 |
| CALBINDIN | Lapin | 1/500 |
| MAP2 | Souris | 1/1000 |
| N-CADHERIN | Souris | 1/1000 |
| NESTIN | Souris | 1/400 |
| OLIG2 | Lapin | 1/500 |
| PAX6 | Lapin | 1/400 |
| SOX2 | Souris | 1/200 |
| TBR1 | Lapin | 1/200 |
| TBR2 | Lapin | 1/200 |
| TUJ1 | Souris | 1/1000 |
Tableau 3 : Anticorps primaires. Les anticorps primaires, les clones et les dilutions optimisées utilisés pour l’immunostaining sont répertoriés.
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Discussion
La nécessité d’un grand nombre de cellules ainsi que de conditions de culture définies pour générer des types de cellules spécifiques pour le dépistage des médicaments et les applications de médecine régénérative a été le moteur du développement de systèmes de culture évolutive. Ces dernières années, plusieurs groupes ont signalé la génération évolutive de progéniteurs neuronaux et de neurones fonctionnels32,33,34, fournissant des progrès significatifs dans le développement de nouveaux modèles pour les troubles neurodégénératifs. Néanmoins, la récapitulation de certains événements critiques du développement embryonnaire fait encore défaut, et le maintien des neurones fonctionnels générés en suspension pendant de longues périodes de temps n’a pas encore été atteint34. Présenté ici est un système dynamique de culture 3D capable de générer des organoïdes neuronaux dérivés de l’iPSC avec l’identité cérebelaire, et de promouvoir davantage la maturation dans les neurones cerebelaires fonctionnels dans des conditions chimiquement définies et sans alimentation dans la culture dynamique.
Avant de commencer la différenciation cérebelaire, il est essentiel de maintenir la qualité des iPSCs humains. Ainsi, afin de ne pas compromettre la différenciation, pas plus de trois passages d’iPSCs ne devraient être effectués de dégel à l’inoculation bioréacteur. Une étape importante dans le protocole de différenciation est d’évaluer la taille globale. La taille globale a un rôle essentiel dans l’induction de la différenciation vers une lignée cellulaire spécifique29. En outre, il ya un seuil de taille minimale qui semble favoriser la différenciation35. Comme déjà indiqué, le diamètre agrégé optimal dérivé d’iPSC pour promouvoir un engagement neuronal efficace31,32 et la différenciation cérebelaire21 est un diamètre d’environ 200 μm.
En outre, dans ce protocole dynamique, la vitesse d’agitation utilisée dans les premiers jours de la culture est cruciale pour contrôler le diamètre global et l’induction neuronale. La culture a commencé à 27 tr/min, ce qui est suffisant pour favoriser l’agrégation des iPSC et pour éviter la formation de plus grands agrégats (diamètres supérieurs à 350 μm). L’agitation utilisée pour favoriser l’agrégation cellulaire après l’ensemencement d’une seule cellule pourrait être augmentée à 30 tr/min sans affecter la viabilité cellulaire; toutefois, on s’attend à ce que des vitesses d’agitation plus élevées produisent de plus petits agrégats. Selon la ligne iPSC, 24 h après l’ensemencement cellulaire à l’aide de 27 tr/min, deux scénarios différents sont attendus : les agrégats formés présentent des diamètres plus petits (<200 μm) ou ont atteint une gamme de tailles comprises entre 200–300 μm. Si les agrégats sont supérieurs à 350 μm à 24 h après l’ensemencement des cellules, la différenciation ne doit pas être effectuée, et l’ensemencement cellulaire doit être répété, parce que l’efficacité de la différenciation sera très faible. Si les agrégats sont inférieurs à 200 μm, le milieu usé doit être remplacé par un support d’entretien iPSC et la vitesse d’agitation réduite à 25 tr/min. Avec cet ajustement, le diamètre global devrait augmenter du jour 1 au jour 2, probablement en raison de la fusion des agrégats individuels favorisé par la diminution de la vitesse d’agitation. Dans le cas d’agrégats de tailles comprises entre 200 et 300 μm, le milieu dépensé doit être remplacé par un milieu de différenciation, et l’induction neuronale par FGF2 doit être commencée après 2 jours en culture. À ce stade, la vitesse d’agitation devrait également être légèrement réduite pour prévenir la mort excessive des cellules, parce que les cellules sont plus sensibles au stress de cisaillement en présence de milieu de différenciation. En outre, l’homogénéité de la population pourrait être analysée à l’aide du coefficient de variation (CV), qui mesure la variabilité en corrélant l’écart type avec la moyenne des diamètres agrégés, selon l’équation
dans lequel δ représente l’écart type du diamètre global et μ est le diamètre moyen. Dans ce système dynamique, le CV moyen observé était de 12,5 ± 3,3 % (moyenne ± SD) pour la ligne cellulaire F002.1A.13 et de 19,0 ± 0,37 % pour la ligne cellulaire iPSC6.2 au jour 2. Ainsi, dans ce système, il faut s’attendre à une population de taille homogène dont le CV est inférieur à 0,2 (< 20 % de la variation). Après 7 jours de différenciation, le diamètre total moyen variait de 300 à 360 μm, et la vitesse d’agitation a été augmentée à 30 tr/min pour empêcher les agrégats de se déposer au bas du bioréacteur VW de 0,1 L.
La différenciation des organoïdes cérébellaires jusqu’au jour 35 et l’analyse de la taille globale dans des conditions statiques ont été récemment rapportées21. Les auteurs ont montré que les agrégats 3D formés et maintenus dans les plaques (p. ex., Aggrewell) jusqu’au jour 7 de la différenciation étaient homogènes dans la taille et la forme21. Cependant, après le transfert des agrégats à l’attachement ultra-faible 6 plaques de culture de puits, les agrégats ont commencé à varier en taille et morphologie21. Au 35e jour, dans des conditions statiques, certains agrégats 3D atteignaient 1 000 μm pour différentes lignées cellulaires, ce qui limitait la diffusion des nutriments et de l’oxygène. En revanche, en utilisant nos conditions dynamiques, les agrégats n’ont pas atteint plus de 800 μm de diamètre au jour 35, avec un transfert de masse amélioré en raison de l’agitation constante du milieu promu par la roue verticale. En outre, les tailles agrégées ont été maintenues jusqu’à la fin du processus de maturation, montrant un diamètre global de 646,6 ± 104,2 μm par jour 90, la culture la plus longue réalisée dans les bioréacteurs VW de 0,1 L.
L’induction cérebelaire efficace a été induite par l’addition séquentielle de SB431542, FGF2, FGF19, et SDF1 dans ce système dynamique 3D. Le protocole commence par la combinaison de SB431542, qui est un facteur de croissance transformateur bêta (TGF-ß)-bloqueur des récepteurs qui inhibe la différenciation mesendodermal, et FGF2, qui a un effet majeur dans la caudalisation du tissu neuroepithelial25. Par conséquent, l’ajout de ces deux molécules au cours des premiers jours de la culture est essentiel pour favoriser la différenciation cellulaire au milieu du cerveau, le territoire qui donne naissance au tissu cérébellaire. Après l’induction initiale au tissu mi-arrière-cerveau, il est nécessaire d’ajouter FGF19 pour promouvoir la génération spontanée de structures mi-arrière-cerveau avec la polarité dorsale-ventrale, ainsi que la génération de différents progéniteurs cérébellaires36,26. SDF1 facilite l’organisation de couches distinctes de progéniteurs cérébellaires, comme on le voit au stade de développement dans lequel la neurogenèse cérébellaire se produit27. Jusqu’au jour 35, ces molécules peuvent favoriser l’organisation d’organoïdes cérébellaires qui peuvent récapituler le développement cérebelaire humain, qui correspond au cervelet du premier trimestre. Après l’organisation des progéniteurs cérébellaires en différentes couches, un milieu neuronal défini a été utilisé pour promouvoir leur maturation28. D’autres supports utilisés pour maintenir les cellules neuronales pourraient également être testés, mais des gains d’efficacité sont prévus. Ainsi, dans ce protocole, BrainPhys a été utilisé pour promouvoir la différenciation des cellules cérébellaires en neurones cérébellaires, parce qu’il a été rapporté pour mieux imiter l’environnement neuronal sain et pour soutenir l’activité neurophysiologique des neurones générés28.
En utilisant ces conditions dynamiques, une diffusion plus efficace des nutriments, de l’oxygène et des facteurs de croissance peut être réalisée. Cependant, certaines limitations sont associées à l’agitation utilisée dans le protocole de différenciation. Un certain stress de cisaillement peut être introduit par le processus d’agitation, qui peut affecter la survie, la prolifération, et la différenciation des cellules. Par conséquent, pendant l’étape de maturation, dans laquelle les cellules sont plus sensibles, la culture doit être soigneusement surveillée.
La différenciation des organoïdes cérébellaires rappelant le développement cérebelaire embryonnaire humain a déjà été rapportée7. Cependant, la maturation plus poussée de ces organoïdes cérébellaires embryonnaires dans les neurones cérébellaires utilisant des cultures 3D reste un défi. La génération de neurones cérebelaires fonctionnels n’a été réalisée qu’en coculant avec des cellules granuleuses de diverses sources4,7,15. Ce protocole a réussi à mettre à l’avant l’engagement cérebelaire des iPSCs humains; en outre, c’est le premier protocole pour la différenciation des différents neurones cérebelaires dans un système de culture 3D sans coculturer avec les cellules d’alimentation. Plus précisément, les types de cellules suivants peuvent être produits dans notre système de culture dynamique : cellules Purkinje (Calbindin+), cellules de granule (PAX6+/MAP2+), cellules de brosse unipolaires (TBR2+), et neurones profonds de projection de noyaux cérebelaires (TBR1+), qui ont été maintenus en suspension aussi longtemps que 3 mois.
La génération évolutive d’organoïdes cérébellaires représente un outil précieux pour étudier le développement embryonnaire du cervelet et les voies pathologiques impliquées dans la dégénérescence de cet organe. En outre, le dépistage à haut débit pour les molécules qui restaurent la fonction cérebelaire peut être effectué à l’aide d’organoïdes obtenus avec ce système évolutif. Dans l’ensemble, cette méthode répond à un besoin non satisfait d’un protocole évolutif pour la génération d’organoïdes cérébellaires de haute qualité qui peuvent être importants pour une variété d’applications biomédicales.
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Disclosures
Les auteurs YH et SJ sont employés de PBS Biotech. L’auteur BL est PDG et co-fondateur de PBS Biotech, Inc. Ces auteurs collaborateurs ont participé au développement des bioréacteurs utilisés dans le manuscrit. Cela ne modifie pas l’adhésion des auteurs à toutes les politiques de la revue sur le partage de données et de documents. Tous les autres auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT), Portugal (UIDB/04565/2020 par l’intermédiaire de Programa Operacional Regional de Lisboa 2020, Projet N. 007317, PD/BD/105773/2014 à T.P.S et PD/BD/128376/2017 à D.E.S.N.), projets cofinancés par FEDER (POR Lisboa 2020—Programa Operacional Regional de Lisboa PORTUGAL 2020—Programa Operacional Regional de Lisboa PORTUGAL 2020) et FCT par le biais de la subvention PAC-PRECIS LISBOA-01-0145-FEDER-016394 et CEREBEX Génération d’Organoïdes cérébellaires pour la subvention de recherche sur l’ataxie LISBOA-0145-FEDER-029298. Le financement a également été reçu du Programme de recherche et d’innovation Horizon 2020 de l’Union européenne, dans le cadre de l’Accord de subvention 739572— The Discoveries Centre for Regenerative and Precision Medicine H2020-WIDESPREAD-01-2016-2017.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3MM paper | WHA3030861 | Merck | |
| Accutase | A6964 - 500mL | Sigma | cell detachment medium |
| Anti-BARHL1 Antibody | HPA004809 | Atlas Antibodies | |
| Anti-Calbindin D-28k Antibody | CB28 | Millipore | |
| Anti-MAP2 Antibody | M4403 | Sigma | |
| Anti-N-Cadherin Antibody | 610921 | BD Transduction | |
| Anti-NESTIN Antibody | MAB1259-SP | R&D | |
| Anti-OLIG2 Antibody | MABN50 | Millipore | |
| Anti-PAX6 Antibody | PRB-278P | Covance | |
| Anti-SOX2 Antibody | MAB2018 | R&D | |
| Anti-TBR1 Antibody | AB2261 | Millipore | |
| Anti-TBR2 Antibody | ab183991 | Abcam | |
| Anti-TUJ1 Antibody | 801213 | Biolegend | |
| Apo-transferrin | T1147 | Sigma | |
| BrainPhys Neuronal Medium N2-A & SM1 Kit | 5793 - 500mL | Stem cell tecnhnologies | |
| Chemically defined lipid concentrate | 11905031 | ThermoFisher | |
| Coverslips 24x60mm | 631-1575 | VWR | |
| Crystallization-purified BSA | 5470 | Sigma | |
| DAPI | 10236276001 | Sigma | |
| Dibutyryl cAMP | SC- 201567B -500mg | Frilabo | |
| DMEM-F12 | 32500-035 | ThermoFisher | |
| Fetal bovine serum | A3840001 | ThermoFisher | |
| Gelatin from bovine skin | G9391 | Sigma | |
| Glass Copling Jar | E94 | ThermoFisher | |
| Glutamax I | 10566-016 | ThermoFisher | |
| Glycine | MB014001 | NZYtech | |
| Ham’s F12 | 21765029 | ThermoFisher | |
| Human Episomal iPSC Line | A18945 | ThermoFisher | iPSC6.2 |
| IMDM | 12440046 | ThermoFisher | |
| Insulin | 91077C | Sigma | |
| iPS DF6-9-9T.B | WiCell | ||
| Iso-pentane | PHR1661-2ML | Sigma | |
| L-Ascorbic acid | A-92902 | Sigma | |
| Matrigel | 354230 | Corning | basement membrane matrix |
| Monothioglycerol | M6154 | Sigma | |
| Mowiol | 475904 | Millipore | mounting medium |
| mTeSR1 | 85850 -500ml | Stem cell technologies | |
| N2 supplement | 17502048 | ThermoFisher | |
| Neurobasal | 12348017 | ThermoFisher | |
| Paraformaldehyde | 158127 | Sigma | |
| PBS-0.1 Single-Use Vessel | SKU: IA-0.1-D-001 | PBS Biotech | |
| PBS-MINI MagDrive Base Unit | SKU: IA-UNI-B-501 | PBS Biotech | |
| Recombinant human BDNF | 450-02 | Peprotech | |
| Recombinant human bFGF/FGF2 | 100-18B | Peprotech | |
| Recombinant human FGF19 | 100-32 | Peprotech | |
| Recombinant human GDNF | 450-10 | Peprotech | |
| Recombinant human SDF1 | 300-28A | Peprotech | |
| ROCK inhibitor Y-27632 | 72302 | Stem cell technologies | |
| SB431542 | S4317 | Sigma | |
| Sucrose | S7903 | Sigma | |
| SuperFrost Microscope slides | 12372098 | ThermoFisher | adhesion microscope slides |
| Tissue-Tek O.C.T. Compound | 25608-930 | VWR | |
| Tris-HCL 1M | T3038-1L | Sigma | |
| Triton X-100 | 9002-93-1 | Sigma | |
| Tween-20 | P1379 | Sigma | |
| UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0 | 15575020 | ThermoFisher |
References
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