Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Масштабируемое поколение зрелых мозжечковых органоидов из плюрипотентных стволовых клеток человека и характеристика иммуностимулированием

Published: June 13, 2020 doi: 10.3791/61143
Automatic Translation
1,2, 1, 1, 1, 1,2,3, 4, 4, 4, 2, 1
1iBB - Institute for Bioengineering and Biosciences and Department of Bioengineering, Instituto Superior Técnico, Universidade de Lisboa, 2Instituto de Medicina Molecular João Lobo Antunes, Faculdade de Medicina, Universidade de Lisboa, 3The Discoveries Centre for Regenerative and Precision Medicine, Lisbon Campus, Universidade de Lisboa, 4PBS Biotech, Inc, Camarillo, CA, USA

Summary

Этот протокол описывает динамическую культурную систему для производства контролируемых агрегатов размеров человеческих плюрипотентных стволовых клеток и дальнейшего стимулирования дифференциации мозжечковых органоидов в условиях, свободных от химических и фидерных, с использованием одноразового биореактора.

Abstract

Мозжечок играет важную роль в поддержании баланса и двигательной координации, а функциональный дефект в различных мозжечковых нейронах может вызвать мозжечковую дисфункцию. Большинство современных знаний о связанных с болезнями фенотипах нейронов основано на посмертных тканях, что затрудняет понимание прогрессирования и развития болезни. Модели животных и увековеченные клеточные линии также используются в качестве моделей для нейродегенеративных расстройств. Тем не менее, они не в полной мере повторить болезни человека. Индуцированные человеком плюрипотентные стволовые клетки (iPSCs) имеют большой потенциал для моделирования заболеваний и являются ценным источником регенеративных подходов. В последние годы генерация церебральных органоидов из iPSCs, полученных пациентом, улучшила перспективы моделирования нейродегенеративных заболеваний. Тем не менее, протоколы, которые производят большое количество органоидов и высокий выход зрелых нейронов в системах 3D культуры отсутствуют. Представленный протокол представляет если представить новый подход к воспроизводимому и масштабируемому поколению органоидов, полученных человеком iPSC, в химически определенных условиях с использованием масштабируемых одноразових биореакторов, в которых органоиды приобретают мозжечковую идентичность. Генерируемые органоиды характеризуются экспрессией специфических маркеров как на уровне мРНК, так и на уровне белка. Анализ конкретных групп белков позволяет выявлять различные популяции мозжечковых клеток, локализация которых важна для оценки органоидной структуры. Органоидная криозирование и дальнейшее иммуностеление органоидных ломтиков используются для оценки присутствия конкретных популяций мозжечковых клеток и их пространственной организации.

Introduction

Появление плюрипотентных стволовых клеток человека (PSCs) представляет собой отличный инструмент для регенеративной медицины и моделирования заболеваний, потому что эти клетки могут быть дифференцированы в большинстве клеточных линийчеловеческого тела 1,2. С момента своего открытия, PSC дифференциации с использованием различных подходов, как сообщается, модели различных заболеваний, в том числе нейродегенеративных расстройств3,,4,,5,,6.

В последнее время появились сообщения о 3D-культурах, полученных из ПХК, напоминающих мозговые структуры человека; они называются органоидами мозга3,,7,,8. Поколение этих структур как из здоровых, так и для конкретных пациентов ПКС предоставляет ценную возможность для моделирования развития человека и расстройств нервного развития. Однако методы, используемые для создания этих хорошо организованных мозговых структур, трудно применить для их крупномасштабного производства. Для получения структур, которые достаточно велики, чтобы резюмировать морфогенез тканей без некроза внутри органоидов, протоколы полагаются на первоначальные нейронные обязательства в статических условиях, а затем инкапсуляции в гидрогелях и последующей культуры в динамическихсистемах 3. Однако такие подходы могут ограничить потенциальное масштабирование органоидного производства. Несмотря на то, что были предприняты усилия, чтобы направить дифференциацию PSC к определенным регионам центральной нервной системы, в том числе корковых, стриатальных, среднего мозга инейронов спинного мозга 9,10,11,12, генерация конкретных областей мозга в динамических условиях по-прежнему является проблемой. В частности, еще предстоит описать генерацию зрелых мозжечковых нейронов в 3D-структурах. Muguruma и др. впервые поколения культурных условий, которые recapitulate раннегомозжечка развития 13 и недавно сообщил протокол, который позволяет для человека эмбриональных стволовых клеток для создания поляризованной структуры напоминает первый триместр мозжечка7. Тем не менее, созревание мозжечковых нейронов в зарегистрированных исследованиях требует диссоциации органоидов, сортировки мозжечковых прародителей, и совместной культуры с клетками подачи всистеме культуры монослой 7,14,15,16. Таким образом, воспроизводимое поколение желаемых мозжечковых органоидов для моделирования заболеваний в определенных условиях по-прежнему является проблемой, связанной с культурой и изменчивостью источника подачи.

Этот протокол представляет оптимальные культурные условия для 3D-расширения и эффективной дифференциации человеческих ПКС на мозжечковые нейроны с использованием одноразовых вертикальных биореакторов колес (см. таблицу материалов для спецификаций), далее называемых биореакторами. Биореакторы оснащены большим вертикальным импеллером, который в сочетании с U-образным дном обеспечивает более однородное распределение снора внутри сосуда, позволяя нежному, равномерному смешиванию и подвеске частиц с уменьшенной скоростьювозбуждения 17. С помощью этой системы можно получить агрегаты клеток, контролируемые размером, что важно для более однородной и эффективной дифференциации. Кроме того, большее число органоидов, полученных из iPSC, может быть сгенерировано менее трудоемким образом.

Главной особенностью органоидов, которые являются 3D многоклеточные структуры обычно образуются из стволовых клеток, является самоорганизации различных типов клеток, которые образуют конкретные формы, как те, которыевидели в человеческих морфогенеза 18,19,20. Таким образом, органоидная морфология является важным критерием, который должен быть оценен в процессе дифференциации. Криозирование органоидов и дальнейшее иммуностентирование органоидных ломтиков с определенным набором антител позволяют пространственной визуализации молекулярных маркеров анализировать пролиферацию клеток, дифференциацию, идентичность популяции клеток и апоптоз. С помощью этого протокола, путем иммуностения органоидных cryosections, первоначальный эффективный нейронной приверженности наблюдается на7-й день дифференциации. Во время дифференциации наблюдается несколько популяций клеток с мозжечковой идентичностью. После 35 дней в этой динамической системе, мозжечковый нейроэпителий организуется вдоль апикобазальной оси, с апическим слоем размножающихся прародителей и базально расположенных постмитотических нейронов. Во время процесса созревания, с 35-90 дней дифференциации, различные типы мозжечковых нейронов можно увидеть, в том числе клетки Пуркинье (Calbindin+), гранулевые клетки (PAX6+/MAP2), Golgi клетки (Нейрогранин),однополярные клетки кисти (TBR2+), и глубокие мозжечковые ядра проекционныхнейронов(TBR1). Кроме того, незначительное количество клеточной смерти наблюдается в генерируемых мозжечковых органоидов после 90 дней в культуре.

В этой системе органоиды, полученные человеком iPSC, созревают в различные мозжечковые нейроны и выживают до 3 месяцев без необходимости диссоциации и кормушки кокультуры, обеспечивая источник мозжечковых нейронов человека для моделирования заболеваний.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Пассирование и техническое обслуживание человеческих iPSCs в культуре монослойных

  1. Приготовление тарелок
    1. Оттепель мембранной матрицы подвала (см.Таблица материалов) запас при 4 градусов по Цельсию и подготовить 60 йл aliquots. Заморозить aliquots при -20 градусов по Цельсию.
    2. Чтобы покрыть колодцы 6 хорошо пластины, оттепель один aliquot из подвала мембраны матрицы на льду. После размораживания добавьте от 60 мл до 6 мл DMEM-F12. Аккуратно resuspend путем трубопроводов вверх и вниз.
    3. Добавьте 1 мл разбавленного мембранного матричного раствора в каждую колодец из 6 хорошо пластины и инкубировать на RT, по крайней мере 1 ч до прохода или хранить при 4 кк до 1 недели.
  2. Пропуск колоний iPSC с помощью EDTA
    1. Поддержание iPSCs в культуре монослой в 6 пластинах в инкубаторе при 37 градусах Цельсия, 95% влажности и 5% CO2.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В этом протоколе были использованы три отдельные линии iPSC человека: F002.1A.1321, линия iPSC человека (iPSC6.2)22, и коммерчески полученная iPS-DF6-9-9T.B (см. таблицу материалов).
    2. Перед проходом инкубировать сохраненные пластины (шаг 1.1) при комнатной температуре (RT) в течение 15 минут и подготовить mTesR1 среды (Таблица 1).
    3. Аспирировать раствор из пластины с помощью серологического пипетки и сразу же добавить 0,5 мл mTeSR1 среды к каждой хорошо.
    4. Аспирировать оттябатый носитель из хорошо содержащего iPSCs и мыть один раз с помощью 1 мл 0,5 мМ EDTA на колодец.
    5. Добавьте 1 мл 0,5 мМ EDTA к каждой колодец и инкубировать на RT в течение 5 мин.
    6. Аспират EDTA и удалить клетки из скважин, аккуратно добавив mTeSR1 среды и трубопроводов колоний с помощью P1000 микропипец. Соберите клетки в конической трубке.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Не пипетки клетки вверх и вниз более чем в 3x.
    7. Добавьте 1 мл клеточной суспензии (разбавленной 1:4) к каждой хорошо, так что каждая хорошо содержит 1,5 мл среды после добавления подвески клетки. Возвращение ячеек в инкубатор при 5% CO2, 37 градусов по Цельсию.
    8. Замените израсходованную среду ежедневно и проход каждые 3 дня, когда достигается 75%-80% слияния.

2. Посев человеческих iPSCs в биореакторе

  1. Инкубировать iPSCs, выращенные в качестве монослой в mTeSR1 дополняется 10 МКМ ингибитора ROCK Y-27632 (ROCKi). Добавьте 1 мл дополненной среды к каждому хорошо из 6 хорошо пластины культуры ткани и инкубировать в течение 1 ч при 37 градусов по Цельсию, 95% влажности, и 5% CO2.
    ПРИМЕЧАНИЕ: ROCKi используется для защиты диссоциированных iPSCs от апоптоза23.
  2. После 1 ч инкубации, аспирировать провел среды из каждой хорошо и мыть 1x с 1 мл 1× PBS на колодец.
  3. Добавьте 1 мл среды отслоения клеток (см. Таблицу материалов)к каждому колодец 6 хорошо пластины и инкубировать при 37 градусов по Цельсию в течение 7 мин, пока клетки легко отделиться от колодцев с нежной тряски.
  4. Pipette клеточного отслоения среды вверх и вниз с P1000 микропипетты, пока клетки отсоединиться и разобщиться на одиночные клетки. Добавьте 2 мл полной клеточной культуры среды к каждому хорошо, чтобы инактивировать энзиматическое пищеварение и пипетки клетки осторожно в стерильной конической трубки.
  5. Центрифуга при 210 × г в течение 3 мин и удалить супернатант.
  6. Повторное использование клеточных гранул в среде культуры (т.е. mTeSR1, дополненное 10 МКМ ROCKi) и подсчитайте iPSCs с гемоцитометром с помощью трипан-голубого красителя.
  7. Семя 15 × 106 одиночных клеток в биореакторе (максимальный объем 100 мл) с 60 мл mTeSR1 дополнено 10 МКМ ROCKi при конечной плотности клеток 250 000 клеток/мл.
  8. Вставьте сосуд, содержащий iPSCs, в универсальный базовый блок, помещенный в инкубатор при 37 градусах Цельсия, влажности 95% и 5% CO2.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Биореактор перемешивания поддерживается в течение 24 ч, установив универсальный базовый блок управления до 27 об / мин для содействия агрегации iPSC.

3. Дифференциация и созревание агрегатов, полученных человеком iPSC, в мозжечковых органоидах

  1. Определите день посева одной клетки как день 0.
  2. На 1 день соберите 1 мл образца агрегатов iPSC с помощью серологического пипетки. Поддерживайте биореактор под агитацией, как и прежде, помещая универсальный базовый блок с биореактором, содержащим агрегаты в стерильном потоке перед сбором образца. Плита клеточной подвески в ультра-низком крепление 24 хорошо пластины. Убедитесь, что формируются агрегаты, полученные из iPSC.
  3. Приобретайте изображения с помощью оптического микроскопа, используя общее увеличение 40x или 100x для измерения совокупного диаметра.
  4. Измерьте область агрегатов на каждом изображении с помощью программного обеспечения FIJI.
    1. Выберите "Анализ Установите измерения "из бара меню и нажмите на "Area" и "OK".
    2. Выбрать" Файл Откройте" из бара меню, чтобы открыть сохраненный файл изображения. Выберите инструмент выбора строки, представленный в баре инструментов, и создайте прямую линию над строкой масштаба, представленной на изображении. Выберите" Анализ Установите шкалу" из бара меню.
    3. В "Известноерасстояние" добавить просторы масштаба бар изображения в мкм. Определите"Единицу длины"как мкм. Нажмите накнопку"Глобальный", чтобы сохранить настройки и"OK". Выберите Овальный выбор в баре инструментов.
    4. Для каждого агрегата разграничить область овальным инструментом. Выберите" Анализ Мера". Рассчитайте их диаметр на основе измеренной площади, учитывая, что агрегаты примерно сферические
      Equation 1
      с A в качестве области агрегата.
  5. Когда средний диаметр агрегатов составляет 100 мкм, замените 80% отраченной среды свежим mTeSR1 без ROCKi. Когда агрегаты достигают 200–250 мкм в диаметре, замените всю оттяженную среду на gfCDM(таблица 1), позволяяорганоидам осесть в нижней части биореактора.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если средний совокупный диаметр превышает 350 мкм, не начинайте протокол дифференциации. Повторите посев одиночных клеток. Как правило, это занимает около 1 дня для совокупности, чтобы достичь среднего диаметра 100 мкм.
  6. Вставьте биореактор, содержащий агрегаты, в универсальный базовый блок, помещенный в инкубатор при 37 градусах Цельсия, 95% влажности и 5% CO2.
  7. Снижение биореакторной агитации до 25 об/мин.
  8. На второй день повторите шаги 3.2, 3.3 и 3.4 для оценки совокупного диаметра. Добавьте 30 МКЛ FGF2 (окончательная концентрация, 50 нг/мл) и 60 мкл SB431542 (окончательная концентрация, 10 МКМ) до 60 мл среды дифференциации gfCDM(таблица 1). Замените всю оттяготую среду из биореактора на дополненный gfCDM. Повторите шаг 3.6.
    ПРИМЕЧАНИЕ: SB431542 имеет решающее значение для ингибирования мезендодермальной дифференциации, вызывая нейроннуюдифференциацию 24. FGF2 используется для содействия каудализации нейроэпителиальной ткани25.
  9. На 5-й день повторите шаги 3.2, 3.3, 3.4 и 3.8.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Совокупный размер должен увеличиваться во время протокола дифференциации. Тем не менее, диаметр имеет решающее значение только тогда, когда начинается дифференциация, потому что этот параметр может повлиять на эффективность дифференциации.
  10. На 7-й день повторите шаги 3.2, 3.3 и 3.4. Разбавить FGF2 и SB431542 до 2/3: Добавить 20 МКЛ FGF2 и 40 МКЛ SB431542 до 60 мл gfCDM дифференциации среды. Замените всю оттяготую среду из биореактора на дополненный gfCDM. Повторите шаг 3.6 и увеличьте возбуждение биореактора до 30 об/мин.
  11. На 14-й день повторите шаги 3.2, 3.3 и 3.4. Добавьте 60 мл FGF19 (окончательная концентрация, 100 нг/мл) до 60 мл среды дифференциации gfCDM. Замените всю оттяготую среду из биореактора на gfCDM, дополненную FGF19. Повторите шаг 3.6.
    ПРИМЕЧАНИЕ: FGF19 используется для содействия поляризации структур среднего заднего мозга26.
  12. На 18-й день повторите шаги 3.2, 3.3, 3.4 и 3.11.
  13. На 21-й день повторите шаги 3.2, 3.3 и 3.4. Замените всю оттягченную среду биореактора полной нейробазальной средой(таблица 1). Повторите шаг 3.6.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Нейробазальная среда является базальной средой, используемой для поддержания популяции нейронных клеток ворганоиде 7.
  14. На 28-й день повторите шаги 3.2, 3.3 и 3.4. Добавьте 180 МЛ SDF1 (окончательная концентрация, 300 нг/мл) до 60 мл полной нейробазальной среды. Замените всю оттяготую среду биореактора полной нейробазальной средой, дополненной SDF1. Повторите шаг 3.6.
    ПРИМЕЧАНИЕ: SDF1 используется для облегчения организации различных слоев клеток27.
  15. На 35-й день повторите шаги 3.2, 3.3 и 3.4. Замените всю оттяготую среду из биореактора на полную среду BrainPhys(таблица 1). Повторите шаг 3.6.
    ПРИМЕЧАНИЕ: BrainPhys является нейрональной среды, которая поддерживает синаптически активных нейронов28.
  16. Заменить 1/3 от общего объема каждые 3 дня с полным BrainPhys среды до дня 90 дифференциации.

4. Подготовка органоидов для криозирования и иммуногистохимии

  1. Сбор органоидов для иммуностимулирования
    1. Соберите 1 мл образца среды, содержащей органоиды с серологическим пипеткой от биореактора до конической трубки 15 мл.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Органоиды должны быть собраны в разные моменты времени для оценки эффективности дифференциации, в том числе дней 7, 14, 21, 35, 56, 70, 80 и 90.
    2. Удалить супернатант и мыть один раз с 1 мл 1× PBS.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Не центрифугировать органоиды. Пусть органоиды оседают на дне трубки под действием силы тяжести.
    3. Удалите супернатант и добавьте 1 мл 4% параформальдегида (PFA). Инкубировать при 4 градусов по Цельсию в течение 30 мин. Удалите оттраченную PFA и добавьте 1 мл 1× PBS.
    4. Храните органоиды в 1 мл 1× при 4 градусов по Цельсию до обработки для криозирования.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Храните органоиды в 1x PBS в течение не более 1 недели после фиксации.
  2. Подготовка органоидов для криозирования
    1. Удалите супернатант из хранимых органоидов. Добавить 1 мл 15% сахарозы (w/v, разбавленной в 1× PBS), хорошо перемешать нежным закрученного, и инкубировать на ночь при 4 градусов по Цельсию.
    2. Приготовьте раствор 15% сахарозы/7,5% желатина(таблица 2)и поддерживайте при 37 градусах цельсия во время приготовления, чтобы избежать затвердеть желатина.
    3. Удалите 15% раствор сахарозы, добавьте 1 мл 15% сахарозы/7,5% желатина в органоиды и быстро перемешайте с помощью нежного закрученного. Инкубационный при 37 градусов по Цельсию в течение 1 ч.
    4. Добавьте 15% раствора сахарозы/7,5% желатина в пластиковый контейнер до половины его объема. Дождись затвердевания в RT.
    5. После инкубации 1 ч осторожно поместите сахарозу/желатиновую каплю, содержащую органоиды, на затвердеевого желатина с пипеткой Pasteur. Оставьте затвердевать на RT около 15 минут. Убедитесь в том, чтобы избежать образования пузырьков.
    6. Поместите 15% сахарозы/7,5% желатина поверх органоидов до тех пор, пока контейнер не будет заполнен. Дождись полной затвердевания на RT.
    7. После затвердевания инкубировать 20 мин при 4 градусов по Цельсию.
    8. Разрежьте желатин на кубик, содержащий органоиды в центре, и зафиксните кубик желатина на куске картона каплей соединения O.C.T.
    9. Поместите 250 мл изопентанов в чашку 500 мл и заполните соответствующий контейнер жидким азотом. Используя типсы и толстые перчатки, аккуратно поместите чашку, содержащую изопентан, на поверхность жидкого азота и охладьте изопентан до -80 градусов по Цельсию.
    10. Когда -80 градусов по Цельсию достигнут, поместите кубик желатина в чашку, содержащую изопентан, пока он не замерзнет, сохраняя температуру на уровне -80 градусов по Цельсию. В зависимости от размера куба, это может занять 1-2 мин.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте температуры ниже -80 градусов по Цельсию или чрезмерного времени замораживания, потому что это может привести к растрескиванию куба.
    11. При заморозке быстро храните кубик желатина при -80 градусов по Цельсию и храните до криозирования.
  3. Криозирование органоидов
    1. Включите криостат и определите температуру как образца (OT), так и криокамбера (КТ) при температуре -25 градусов по Цельсию.
    2. Когда обе температуры стабилизируются, зафиксните кубик желатина, содержащий органоиды на образце, используя соединение O.C.T.
    3. Определите толщину секции на уровне 12 мкм.
    4. Вырезать куб и собирать 3-4 ломтика на слайдах адгезионные микроскопы (см. Таблицу материалов).
    5. Хранить при -20 градусов по Цельсию до использования.
  4. Иммуностимулирование ломтиков органоидов
    1. Поместите слайды микроскопа, содержащие органоидные секции, в коплинг банку с 50 мл предварительно 1x PBS, держа до 10 слайдов спина к спине.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Все органоидные секции должны быть погружены в жидкость.
    2. Инкубировать в течение 45 мин при 37 градусов по Цельсию, чтобы дегелатинизировать слайды.
    3. Вымойте 1x с 50 мл 1× PBS в течение 5 минут на RT: Передача слайдов в коплинг банку, содержащую свежие 1× PBS.
    4. Перенесите слайды в коплинг банку, содержащую 50 мл свежеприготовленногоглицина (таблица 2)и инкубировать в течение 10 минут на RT.
    5. Перенесите слайды в коплинговую банку, содержащую 50 мл 0,1% тритона(таблица 2)и пронизываете в течение 10 минут на RT.
    6. Вымойте с 1× PBS в течение 5 мин 2x.
    7. Приготовьте иммуностеинированную тарелку с 3-мм бумагой, пропитанной 1× PBS. Сухие слайды с тканью вокруг ломтиков и поместить их на 3 мм бумаги. С помощью пипетки Pasteur накройте всю поверхность слайдов блокирующимраствором (таблица 2)с 0,5 мл на слайд. Инкубация в течение 30 минут на RT.
    8. Удалите избыток блокирующего раствора и высушите слайды салфеткой по всему ломтикам. Поместите 50 МКЛ первичного антитела(таблица 3), разбавленного блокирующим раствором над секциями и накройте крышками. Поместите ломтики в ранее приготовленное иммуностеинирование блюдо. Инкубировать на ночь при 4 градусов по Цельсию.
    9. Перенесите слайды в банку коплинга с 50 мл TBST(таблица 2),пусть крышки падают, и мыть с TBST в течение 5 мин 3x.
    10. Поместите 50 МКЛ вторичного антитела, разбавленного в блокирующий раствор над секциями и накройте крышками. Поместите ломтики в ранее приготовленное иммуностеинирование блюдо. Инкубировать в течение 30 минут на RT, защищены от света.
    11. Передача слайдов в коплинг банку снова и мыть с 50 мл TBST в течение 5 мин 3x.
    12. Высушите горки с тканью вокруг ломтиков и поместите ломтики в ранее приготовленное блюдо иммуностеинирования. Добавьте 0,5 мл раствора DAPI по всей поверхности слайдов с пипеткой Pasteur. Инкубация в течение 5 минут на RT.
    13. Повторите шаг 4.4.9.
    14. Аккуратно высушите горки салфеткой. Добавьте 50 МКЛ монтажа среднего капля за каплей вдоль слайда, а затем осторожно опустите крышку на каждый слайд, слегка согнув его, чтобы избежать пузырьков.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Протокол был инициирован путем поощрения агрегации клеток с использованием биореакторов 0,1 л(рисунок 1A). Была проведена одноклеточная прививка iPSCs, при этом 250 000 клеток/мл посеяны в 60 мл среды со скоростью возбуждения 27 об/мин. Это было определено как день 0. После 24 ч, клетки эффективно формируется сфероидной формы агрегатов (день 1, рисунок 1B), и морфология была в состоянии хорошо поддерживается до 5-го дня, с постепенным увеличением размера, демонстрируя высокую степень однородности в совокупной морфологии и размера с течением времени. (Рисунок 1B). Количественный анализ с помощью микроскопии также выявил нормальное распределение совокупных размеров по дню 1(рисунок 1С). Совокупный размер является важным физическим параметром, способным побуждать клетки дифференцироваться к различным линиям29,,30. По этой причине, на основе совокупного размера сообщили в предыдущих исследованиях,чтобы вызвать эффективные нейронные 31,32 и мозжечковыеобязательства 21, генерируемые агрегаты были сохранены в mTeSR1 среды на 25 об / мин, пока они не достигли желаемого диаметра до начала дифференциации (200 мкм). На второй день средний диаметр составил 221,0 ± 54,4 мкм (средний ± SD) для линии ячейки F002.1A.13 и 212,1 ± 42,1 мкм для линии ячеек iPSC6.2. Таким образом, обе линии ячейки достигли оптимального совокупного размера в данный моментвремени (рисунок 1C).

Определение дня, когда посев iPSCs был выполнен как день 0, на второй день, после достижения желаемого совокупного диаметра, нейронная приверженность была вызвана одновременно с помощью SB431542, FGF2, и инсулин, содействие нейроэктодермальной дифференциации, а также умеренной каудализации, необходимой для среднего заднего мозга. После этого FGF19 и SDF1 были добавлены в культуру в дни 14 и 28, соответственно, для содействия поколению различных мозжечковых прародителей. В первые дни нейронной индукции использовалась скорость вращения 25 об/мин, которая была увеличена до 30 об/мин через 7 дней, чтобы избежать накопления и слипания больших агрегатов(рисунок 2A). Во время дифференциации органоиды показали более выраженную эпителиизацию, похожую на нервные трубоподобные структуры с светящимся пространством(рисунок 2B). Кроме того, оценка распределения органоидного диаметра продемонстрировала однородное распределение размеров во время первоначального мозжечкового обязательства до 14-годня (рисунок 2B).

Иммунофлюоресценция анализ подтверждает, что эффективная нейронная приверженность iPSC полученных органоидов уже достигается на 7 день дифференциации после добавления FGF2 и SB431542. Cryosections органоидов показали много структур, напоминающих нервной трубки окрашивания для PAX6 и NESTIN, с большинством клеток в органоидов, выражающих прародитель маркер NESTIN в дни 7 и 14 дифференциации (Рисунок 2C). После этого FGF19 и SDF1 способствовали генерации непрерывно размножающихся слоев прародителей(PAX6)и была достигнута эффективная нейронная дифференциация, о чем свидетельствует выражение TUJ1, нейрон-специфический класс III бета-тубулин, на дни 21 и 35 (Рисунок 2C). Кроме того, эффективная мозжечковая дифференциация также наблюдалась после 21 дней в биореакторах 0,1 л VW, продемонстрирована наличием двух различных популяций клеток: прародителей гранул-клеток (BARLH1 -клетки, рисунок 3A)и прогинаторов клеток Пуркинье (OLIG2+ - клетки, рисунок 3B). После 35 дней в культуре, различные популяции клеток в органоидах, как представляется, организованы в различные слои. Различные плоские овальные структуры внутри органоидов наблюдались с BARHL1и спинными мозжечковых прародителей в качестве непрерывного слоя на поверхностной стороне органоида(рисунок 3C,D) и SOX2в области люмиты этих овальных структур (Рисунок 3D). Кроме того, TUJ1и новорожденных нейронов, как представляется, мигрируют к поверхности, восстановление радиального выравнивания на внешней поверхности органоида (Рисунок 3E).

После генерации мозжечковых прародителей, дальнейшее созревание было повышено с помощью BrainPhysmedium 28, дополненной нейротрофическими факторами BDNF и GDNF. Иммунофлюоресценция окрашивания органоидных криозов использовалась для выявления различных подтипов мозжечковых нейронов. Клетки Пуркинье, ГАМК-нейроны, выражаюющие кальций-связывающий белок кальбиндин (CALB, рисунок 3F), были обнаружены в мозжечковых органоидах после протокола созревания. Кроме того, другой крупный мозжечковый нейрональный тип, гранулированные клетки, был идентифицирован как подмножество клеток, coexpressing PAX6 и MAP2(рисунок 3G). Интересно, что пул PAX6 ипрародителей, не выражаюх MAP2, сохранялся до 80 дней дифференциации. Были также обнаружены другие типы мозжечковых нейронов, в том числе однополярные клетки кисти, выражаюющие TBR2(рисунок 3H),и глубокие мозжечковые ядра проекционных нейронов, выражают TBR1 (Рисунок 3I). В дополнение к эффективной мозжечковой дифференциации и созревания, эта 3D динамическая система культуры с использованием БИОреакторов PBS 0.1 L VW позволила органоидам оставаться жизнеспособными в течение 90 дней, без значительной гибели клеток и некроза(рисунок 3J).

Figure 1
Рисунок 1: Поколение агрегатов с контролируемым размером с использованием масштабируемых биореакторов. (A)Особенности дизайна биореактора. (B)Брайтфилд фотомикрограф, показывающий агрегаты из двух различных линий iPSC в дни 1, 2 и 5. Шкала бар 100 мкм. (C)Распределение размеров плавающих агрегатов из различных линий iPSC в биореакторах. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 2
Рисунок 2: Поколение органов, полученных человеком iPSC, с использованием биореакторов 0,1 л. (A)Схематическое представление процедуры культуры, чтобы вызвать дифференциацию iPSCs мозжечковых органоидов. Клетки были посеяны при плотности 250 000 клеток/мл, а для содействия агрегации клеток использовалась агитационная скорость 27 об/мин. В первые дни дифференциации агрегаты поддерживались со скоростью агитации 25 об/мин. После этого, чтобы избежать накопления больших агрегатов, скорость агитации была увеличена до 30 об/мин. (B)Характеристика органоидной формы и размера. Brightfield фотомикрографы, показывающие iPSC полученных органоидов во время мозжечковой дифференциации в 0,1 л VW биореакторов. Шкала бар 100 мкм. Распределение органоидных диаметров показывает, что культура поддерживала однородные размеры органоидов вдоль протокола дифференциации. (C)Эффективная нейронная индукция в органоидах, полученных из iPSC. Иммунофлюоресценция для NESTIN, PAX6 и TUJ1 во время мозжечковой дифференциации. Шкала планки 50 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 3
Рисунок 3: Эффективная мозжечковая дифференциация и созревание органов, полученных человеком iPSC. (A-E) Эффективная мозжечковая приверженность. Иммуностентный анализ маркеров BARHL1, SOX2, OLIG2, NCAD и TUJ1 в указанные моменты протокола мозжечковой дифференциации. (F-I) Эффективное созревание мозжечковых органоидов, полученных человеком iPSC. Иммунофлюоресценция, показывающая различные типы мозжечковых нейронов, включая клетки Пуркинье (CALB, F), гранулированные клетки (PAX6 и MAP2, G), однополярные клетки кисти (TBR2) и глубокие мозжечковые ядра проекций нейронов (TBR1). (J)Высокая жизнеспособность клеток после мозжечкового созревания. Live/dead (кальцин-AM, зеленый и пропидий йодид, красный) окрашивание органоидов показало высокую жизнеспособность клеток и никаких признаков некротических областей после 80 дней в биореакторах. Шкала планки 50 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Подготовка средств массовой информации mTeSR1
Окончательный объем: 500 мл		 1. Оттепель mTeSR1 5× добавки при комнатной температуре (RT) или при температуре 4 градусов по Цельсию на ночь и смешать с базальной средой
2. Хранить полный mTeSR1 среды при 4 КК на срок до 2 недель или подготовить 40 мл aliquots и хранить при -20 градусов по Цельсию
3. Предварительно теплый полный mTeSR1 на RT перед использованием
gfCDM (фактор роста, свободный от химически определенной среды)
Окончательный объем: 60 мл		 30 мл ветчины F12
30 мл IMDM
600 йл химически определенного липидного концентрата (1% v/v)
2.4 монотиоглицелол (450 МКМ)
30 мкл апо-трансферрина (решение на уровне 30 мг/мл в воде, окончательная концентрация: 15 мкг/мл)
300 мг кристаллизации очищенной BSA (5 мг/мл)
42 Л инсулина (концентрация запасов на уровне 10 мг/мл, окончательная концентрация: 7 мкг/мл)
300 л P/S (0,5% v/v, 50 U/ml пенициллин/50 мкг/мл стрептомицина)
Нейробасал
Окончательный объем: 60 мл		 60 мл нейробазальной среды
600 йл N2 дополнения
600 ГЛ Глутамакс I
300 йл P/S (0,5% в/в).
Полная brainPhys
Окончательный объем: 60 мл		 60mL BrainPhys
1.2 мл нейрокалат SM1 Нейрональная добавка
600 йл N2 Дополнение
12 МЛ БДНФ (окончательная концентрация: 20 нг/мл)
12 ДЛ GDNF (окончательная концентрация: 20 нг/мл)
300 МКЛ Дибутирил-ПАМП (концентрация запасов: 100 мг/мл в воде, окончательная концентрация: 1 мМ)
42 МКЛ аскорбиновой кислоты (концентрация запасов: 50 мкг/мл в воде, окончательная концентрация: 200 нм)
Фондовые решения факторов роста и малых молекул Базовый фактор роста фибробластов (bFGF/FGF2)
Концентрация запасов: 100 мкг/мл		 1. Восстановить в 5 мМ Трис, рН 7,6, при концентрации 10 мг/мл
2. Разбавить 0,1% BSA в PBS (v/v) до окончательной концентрации запасов 100 мкг/мл
Стромальный клеточный фактор 1 (SDF1)
Концентрация запасов: 100 мкг/мл		 1. Восстановление в воде при концентрации 10 мг/мл
2. Разбавить 0,1% BSA (v/v) в PBS до окончательной концентрации запасов 100 мкг/мл.
Нейротрофический фактор мозга (BDNF)
Концентрация запасов: 100 мкг/мл
Глиальный клеточный нейротрофический фактор (GDNF)
Концентрация запасов: 100 мкг/мл
Коэффициент роста фибробластов 19 (FGF19)
Концентрация запасов: 100 мкг/мл		 1. Восстановить в 5 мМ фосфат натрия, рН 7,4, при концентрации 10 мг/мл
2. Разбавить 0,1% BSA в PBS (v/v) до окончательной концентрации запасов 100 мкг/мл
Ингибитор РОК Y-27632
Концентрация запасов: 10mM		 Восстановление в ДМСО при концентрации 10 мМ.
SB431542
Концентрация запасов: 10mM
Инсулина
Концентрация запасов: 10 мг/мл		 1. Восстановить 10 мг инсулина в 300 мкл 10 мМ НаОХ
2. Аккуратно добавьте 1 M NaOH, пока решение не станет прозрачным
3. Заполните до 1 мл стерильной водой.

Таблица 1: Фондовые решения и подготовка средств массовой информации. Перечислены все компоненты и тома, используемые для подготовки средств массовой информации для протокола обслуживания и дифференциации iPSCs, а также фондовые решения факторов роста и малых молекул. Для фондовых решений перечислены все концентрации запасов и протоколы для восстановления.

Желатин/сахароза
Окончательная концентрация: 7.5%/15% w/w		 1. Взвесьте 15 г сахарозы и 7,5 г желатина в стерильной стеклянной бутылке Schott и хорошо перемешайте
2. Предварительно разогреть PBS 1× при 65 градусов по Цельсию
3. Добавить предварительно разогретый PBS 1× до конечного веса 100 г и хорошо перемешать
4. Поместите стеклянную бутылку Schott в нагревательной пластине при 65 градусов по Цельсию и встряхните до тех пор, пока желатин не растает
5. Инкубировать при 37 градусов по Цельсию, пока раствор не стабилизируется
Глицин
Окончательная концентрация: 0,1 М		 Добавьте 0,37 г глицина в 50 мл свежеприготовленного PBS 1×.
Решение Triton
Окончательная концентрация: 0,1% ж/в		 1. Подготовка 10% Тритон X-100 акций: 5 г Triton X-100 в 50 мл PBS 1×
2. Добавить 0,5 мл акций Triton X-100 до 50 мл PBS 1×.
TBST
20 мМ Трис-HCl рН 8,0, 150 мм НаКл, 0,05% ж/в Tween-20		 20 мл Трис 1 М
30 мл NaCl 5 M
5 мл Tween-20 (10% бульона: 5 г Tween-20 в 50 мл воды)
Заполните до 1 л водой.
Блокирующее решение Добавьте 5 мл сыворотки крупного рогатого скота плода (FBS, окончательная концентрация: 10% v/v) до 50 мл TBST.
Решение DAPI Добавьте 15 л раствора бульона DAPI (1 мг/мл) в 10 мл дестилированной воды
Мовиол 1. Добавить 2,4 г mowiol до 6 г глицерола и встряхнуть в течение 1 ч в предварительно разогретой пластине при 50 градусов по Цельсию
2. Добавить 6 мл дистиллированной воды и встряхнуть в течение 2 ч
3. Добавить 12 мл Tris 200 мМ (рН 8,5) и встряхнуть в течение 10 мин
4. Центрифуга при 5000 × в течение 15 мин
5. Aliquot и хранить при -20 градусов по Цельсию.

Таблица 2: Растворы для подготовки органоидов для криозирования и иммуностения. Перечислены все компоненты и тома, используемые для подготовки растворов, используемых при подготовке органоидов для криозирования и иммуностения.

Антитела Виды-хозяины Разбавления
БАРХЛ1 Кролик 1/500
КАЛЬБИНДИН Кролик 1/500
MAP2 Мыши 1/1000
Н-КАДЕРИН Мыши 1/1000
НЕСТИН Мыши 1/400
OLIG2 Кролик 1/500
PAX6 Кролик 1/400
SOX2 Мыши 1/200
TBR1 Кролик 1/200
TBR2 Кролик 1/200
TUJ1 Мыши 1/1000

Таблица 3: Первичные антитела. Перечислены первичные антитела, клоны и оптимизированные разбавления, используемые для иммуностимления.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Потребность в больших количествах клеток, а также определенных культурных условиях для создания конкретных типов клеток для скрининга наркотиков и применения регенеративной медицины является движущей силой развития масштабируемых систем культуры. В последние годы несколько групп сообщили о масштабируемом поколении нейронных прародителейи функциональных нейронов 32,,33,34,обеспечивая значительные достижения в разработке новых моделей нейродегенеративных расстройств., Тем не менее, повторение некоторых критических событий эмбрионального развития по-прежнему отсутствует, и поддержание генерируемых функциональных нейронов в подвеске в течение длительных периодов времени еще небыло достигнуто 34. Представлена здесь динамическая система 3D культуры, способная генерировать нейрооружия, полученные iPSC, с мозжечковой идентичностью, а также способствовать дальнейшему созреванию в функциональные мозжечковые нейроны в условиях, свободных от химически определенных и кормушки в динамической культуре.

Перед началом мозжечковой дифференциации крайне важно поддерживать качество человеческих iPSCs. Таким образом, чтобы не скомпрометировать дифференциацию, необходимо выставить не более трех проходов iPSCs от оттаивания до прививки биореактора. Важным шагом в протоколе дифференциации является оценка совокупного размера. Совокупный размер играет решающую роль в индуцировании дифференциации к определенной клеточнойлинии 29. Кроме того, существует минимальный порог размера, который, как представляется, в пользудифференциации 35. Как уже сообщалось, оптимальный совокупный диаметр, полученный iPSC, длясодействия эффективной нейронной приверженности 31,,32 и мозжечковойдифференциации 21 является диаметром 200 мкм.

Кроме того, в этом динамическом протоколе, скорость агитации, используемая в первые дни культуры имеет решающее значение для контроля совокупного диаметра и нервной индукции. Культура началась с 27 об/мин, что достаточно для содействия агрегации iPSCs и избежать образования больших агрегатов (диаметры выше 350 мкм следует избегать). Агитация, используемая для содействия агрегации клеток после посева одной клетки, может быть увеличена до 30 об/мин, не влияя на жизнеспособность клеток; однако ожидается, что более высокие скорости агитации будут производить меньшие агрегаты. В зависимости от линии iPSC, 24 ч после посева клеток с использованием 27 об/мин, ожидаются два различных сценария: агрегаты, сформированные в настоящее время меньшего диаметра (Lt;200 мкм) или достигли диапазона размеров между 200-300 мкм. Если агрегаты больше 350 мкм при 24 ч после посева клеток, дифференциация не должна проводиться, и посев клеток должен быть повторен, потому что эффективность дифференциации будет очень низкой. Если агрегаты меньше 200 мкм, отсроченные среды должны быть заменены на iPSC обслуживания среды, и скорость агитации снижена до 25 об /мин. Ожидается, что при такой корректировке совокупный диаметр увеличится с первого дня до дня 2, вероятно, в результате слияния отдельных агрегатов, что будет вызвано снижением скорости агитации. В случае агрегатов с размерами от 200 до 300 мкм, оттраченная среда должна быть заменена дифференциацией среды, а нейронная индукция с FGF2 должна быть начата через 2 дня в культуре. На данный момент, скорость возбуждения также должна быть немного снижена, чтобы предотвратить чрезмерную гибель клеток, потому что клетки более чувствительны к стрессу стрижки в присутствии дифференциации среды. Кроме того, однородность популяции может быть проанализирована с использованием коэффициента вариации (CV), который измеряет изменчивость путем корреляции стандартного отклонения со средними совокупными диаметрами, согласно уравнению

Equation 2

в котором δ представляет собой стандартное отклонение совокупного диаметра и μ представляет собой средний диаметр. В этой динамической системе наблюдаемое среднее резюме составило 12,5 ± 3,3% (в среднем ± SD) для линии ячейки F002.1A.13 и 19,0 ± 0,37% для ячейки iPSC6.2 в день 2. Таким образом, в этой системе следует ожидать однородного размера популяции с резюме ниже 0,2 (lt; 20% вариаций). После 7 дней дифференциации средний совокупный диаметр колебался от 300 до 360 мкм, а скорость агитации была увеличена до 30 об/мин, чтобы агрегаты не оседались в нижней части биореактора VW объемом 0,1 л.

Дифференциация мозжечковых органоидов до 35-го дня и анализ совокупного размера в статических условиях были недавно зарегистрированы21. Авторы показали, что 3D агрегаты, сформированные и поддерживаемые в пластинах (например, Aggrewell) до 7-го дня дифференциации были однородными по размеру иформе 21. Однако, после переноса агрегатов в ультра-низкое вложение 6 пластин культуры хорошо, агрегаты начали меняться по размеру и морфологии21. На 35-й день в статических условиях, некоторые из 3D агрегатов достигли 1000 мкм для различных клеточных линий, которые ограничивали распространение питательных веществ и кислорода. В отличие от этого, используя наши динамические условия, агрегаты не достигли более 800 мкм в диаметре к 35-му дню, с улучшенной передачей массы за счет постоянного возбуждения среды, продвигаемой вертикальным колесом. Кроме того, совокупные размеры сохранялись до конца процесса созревания, показывая совокупный диаметр 646,6 ± 104,2 мкм к 90-му дню, что является самой длинной культурой, выполненной в биореакторах VW объемом 0,1 л.

Эффективная мозжечковая индукция была вызвана последовательным добавлением SB431542, FGF2, FGF19 и SDF1 в этой 3D динамической системе. Протокол начинается с комбинации SB431542, который является трансформирует бета-фактор роста (TGF-я) - блокатор рецепторов, который подавляет мезендодермальной дифференциации, и FGF2, который имеет большое влияние на каудализацию нейродепителиальнойткани 25. Таким образом, добавление этих двух молекул в первые дни культуры имеет важное значение для содействия дифференциации клеток в середине заднего мозга, территория, которая приводит к мозжечковой ткани. После первоначальной индукции в ткани среднего заднего мозга, необходимо добавить FGF19 для содействия спонтанному поколению структур среднего заднего мозга с спинно-вентральной полярностью, а также генерации различных мозжечковых прародителей36,,26. SDF1 облегчает организацию различных слоев мозжечковых прародителей, как видно на стадии развития, в которой мозжечковый нейрогенез происходит27. До 35-го дня, эти молекулы могут способствовать организации мозжечковых органоидов, которые могут повторить развитие мозжечка человека, что соответствует первому триместру мозжечка. После организации мозжечковых прародителей в различные слои, определенная нейрональная среда была использована для содействия их созреванию28. Другие средства массовой информации, используемые для поддержания нейронных клеток также могут быть протестированы, но более низкая эффективность, как ожидается. Таким образом, в этом протоколе, BrainPhys был использован для содействия дифференциации мозжечковых совершенных клеток в мозжечковых нейронов, потому что было сообщено, лучше имитировать здоровую нейронную среду и поддерживать нейрофизиологическую активность генерируемыхнейронов 28.

Используя эти динамические условия, может быть достигнуто более эффективное распространение питательных веществ, кислорода и факторов роста. Однако некоторые ограничения связаны с агитацией, используемой в протоколе дифференциации. Некоторый стресс стрижки может быть введен процессом возбуждения, который может повлиять на выживание, пролиферацию и дифференциацию клеток. Поэтому во время шага созревания, в котором клетки более чувствительны, культура должна быть тщательно проверена.

Дифференциация мозжечковых органоидов, напоминающих эмбриональное мозжечковое развитие человека, уже зарегистрирована7. Тем не менее, дальнейшее созревание этих эмбриональных мозжечковых органоидов в мозжечковые нейроны с использованием 3D культур остается проблемой. Поколение функциональных мозжечковых нейронов было достигнуто только путем совместного производства с грануламиклеток из различных источников 4,,7,15. Этот протокол успешно высококлассные мозжечковые обязательства человека iPSCs; кроме того, это первый протокол дифференциации различных мозжечковых нейронов в системе 3D-культуры без сотрудничества с клетками подачи. В частности, в нашей динамической системе культуры могут быть+произведены следующие типы клеток: клетки Пуркинье (Calbindin), гранулированные клетки (PAX6+/MAP2),однополярные щетки (TBR2) и глубокие мозжечковые ядра проекционных нейронов (TBR1), которые поддерживались в подвеске в течение 3 месяцев.++

Масштабируемое поколение мозжечковых органоидов представляет собой ценный инструмент для изучения эмбрионального развития мозжечка и патологических путей, участвующих в дегенерации этого органа. Кроме того, высокой пропускной скрининг на молекулы, которые восстанавливают мозжечковую функцию, может быть выполнен с использованием органоидов, полученных с помощью этой масштабируемой системы. В целом, этот метод удовлетворяет неудовлетворенную потребность в масштабируемом протоколе для генерации высококачественных мозжечковых органоидов, которые могут иметь важное значение для различных биомедицинских применений.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы YH и SJ являются сотрудниками PBS Biotech. Автор BL является генеральным директором и соучредителем PBS Biotech, Inc. Эти сотрудничающие авторы участвовали в разработке биореакторов, используемых в рукописи. Это не меняет приверженности авторов всем политикам журнала по обмену данными и материалами. Все остальные авторы не заявляют о конфликте интересов.

Acknowledgments

Эта работа была поддержана Funda'o para a Ci'ncia e a Tecnologia (FCT), Португалия (UIDB/04565/2020 через Programa Operacional Regional de Lisboa 2020, Проект N. 007317, PD/BD/105773/2014 до T.P.S и PD/BD/128376/2017 до D.E.S.N.), проекты, совместно финансируемые FEDER (POR Lisboa 2020-Programa Operacional Regional de Lisboa) PORTUGAL 2020) и FCT через грант PAC-PRECISE LISBOA-01-0145-FEDER-016394 и CEREBEX Поколение мозжечковых органоидов для Ataxia Research грант LISBOA-01-0145-FEDER-029298. Финансирование было также получено из Программы исследований и инноваций Европейского союза Horizon 2020 в соответствии с Грант-соглашением No 739572 -Центр регенеративной и точной медицины H2020-WIDESPREAD-01-2016-2017.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3MM paper WHA3030861 Merck
Accutase A6964 - 500mL Sigma cell detachment medium
Anti-BARHL1 Antibody HPA004809 Atlas Antibodies
Anti-Calbindin D-28k Antibody CB28 Millipore
Anti-MAP2 Antibody M4403 Sigma
Anti-N-Cadherin Antibody 610921 BD Transduction
Anti-NESTIN Antibody MAB1259-SP R&D
Anti-OLIG2 Antibody MABN50 Millipore
Anti-PAX6 Antibody PRB-278P Covance
Anti-SOX2 Antibody MAB2018 R&D
Anti-TBR1 Antibody AB2261 Millipore
Anti-TBR2 Antibody ab183991 Abcam
Anti-TUJ1 Antibody 801213 Biolegend
Apo-transferrin T1147 Sigma
BrainPhys Neuronal Medium N2-A & SM1 Kit 5793 - 500mL Stem cell tecnhnologies
Chemically defined lipid concentrate 11905031 ThermoFisher
Coverslips 24x60mm 631-1575 VWR
Crystallization-purified BSA 5470 Sigma
DAPI 10236276001 Sigma
Dibutyryl cAMP SC- 201567B -500mg Frilabo
DMEM-F12 32500-035 ThermoFisher
Fetal bovine serum A3840001 ThermoFisher
Gelatin from bovine skin G9391 Sigma
Glass Copling Jar E94 ThermoFisher
Glutamax I 10566-016 ThermoFisher
Glycine MB014001 NZYtech
Ham’s F12 21765029 ThermoFisher
Human Episomal iPSC Line A18945 ThermoFisher iPSC6.2
IMDM 12440046 ThermoFisher
Insulin 91077C Sigma
iPS DF6-9-9T.B WiCell
Iso-pentane PHR1661-2ML Sigma
L-Ascorbic acid A-92902 Sigma
Matrigel 354230 Corning basement membrane matrix
Monothioglycerol M6154 Sigma
Mowiol 475904 Millipore mounting medium
mTeSR1 85850 -500ml Stem cell technologies
N2 supplement 17502048 ThermoFisher
Neurobasal 12348017 ThermoFisher
Paraformaldehyde 158127 Sigma
PBS-0.1 Single-Use Vessel SKU: IA-0.1-D-001 PBS Biotech
PBS-MINI MagDrive Base Unit SKU: IA-UNI-B-501 PBS Biotech
Recombinant human BDNF 450-02 Peprotech
Recombinant human bFGF/FGF2 100-18B Peprotech
Recombinant human FGF19 100-32 Peprotech
Recombinant human GDNF 450-10 Peprotech
Recombinant human SDF1 300-28A Peprotech
ROCK inhibitor Y-27632 72302 Stem cell technologies
SB431542 S4317 Sigma
Sucrose S7903 Sigma
SuperFrost Microscope slides 12372098 ThermoFisher adhesion microscope slides
Tissue-Tek O.C.T. Compound 25608-930 VWR
Tris-HCL 1M T3038-1L Sigma
Triton X-100 9002-93-1 Sigma
Tween-20 P1379 Sigma
UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0 15575020 ThermoFisher

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Takahashi, K., et al. Induction of Pluripotent Stem Cells from Adult Human Fibroblasts by Defined Factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
  2. Thomson, J. A. Embryonic Stem Cell Lines Derived from Human Blastocysts. Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).
  3. Lancaster, M. A., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).
  4. Ishida, Y., et al. Vulnerability of Purkinje Cells Generated from Spinocerebellar Ataxia Type 6 Patient-Derived iPSCs. Cell Reports. 17 (6), 1482-1490 (2016).
  5. Liu, Y., Zhang, S. C. Human stem cells as a model of motoneuron development and diseases. Annals of the New York Academy of Sciences. 1198, 192-200 (2010).
  6. Mariani, J., Coppola, G., Pelphrey, K. A., Howe, J. R., Vaccarino, F. M. FOXG1-Dependent Dysregulation of GABA/ Glutamate Neuron Differentiation in Autism Spectrum Disorders. Cell. 162 (2), 375-390 (2015).
  7. Muguruma, K., Nishiyama, A., Kawakami, H., Hashimoto, K., Sasai, Y. Self-Organization of Polarized Cerebellar Tissue in 3D Culture of Human Pluripotent Stem Cells. Cell Reports. 10 (4), 537-550 (2015).
  8. Qian, X., et al. Generation of human brain region-specific organoids using a miniaturized spinning bioreactor. Nature Protocols. 13 (3), 565-580 (2018).
  9. Aubry, L., et al. Striatal progenitors derived from human ES cells mature into DARPP32 neurons in vitro and in quinolinic acid-lesioned rats. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (43), 16707-16712 (2008).
  10. Gunhanlar, N., et al. A simplified protocol for differentiation of electrophysiologically mature neuronal networks from human induced pluripotent stem cells. Molecular Psychiatry. 23 (5), 1336-1344 (2018).
  11. Hu, B. Y., Zhang, S. C. Differentiation of spinal motor neurons from pluripotent human stem cells. Nature Protocols. 4 (9), 1295-1304 (2009).
  12. Jo, J., et al. Midbrain-like Organoids from Human Pluripotent Stem Cells Contain Functional Dopaminergic and Neuromelanin-Producing Neurons. Cell Stem Cell. 19 (2), 248-257 (2016).
  13. Muguruma, K., et al. Ontogeny-recapitulating generation and tissue integration of ES cell-derived Purkinje cells. Nature Neurosciences. 13 (10), 1171-1180 (2010).
  14. Watson, L. M., Wong, M. M. K., Vowles, J., Cowley, S. A., Becker, E. B. E. A Simplified Method for Generating Purkinje Cells from Human-Induced Pluripotent Stem Cells. The Cerebellum. 17 (4), 419-427 (2018).
  15. Wang, S., et al. Differentiation of human induced pluripotent stem cells to mature functional Purkinje neurons. Science Reports. 5, 9232 (2015).
  16. Tao, O., et al. Efficient generation of mature cerebellar Purkinje cells from mouse embryonic stem cells. Journal of Neuroscience Research. 88 (2), 234-247 (2010).
  17. Croughan, M. S., Giroux, D., Fang, D., Lee, B. Novel Single-Use Bioreactors for Scale-Up of Anchorage-Dependent Cell Manufacturing for Cell Therapies. Stem Cell Manufacturing. , 105-139 (2016).
  18. Simunovic, M., Brivanlou, A. H. Embryoids, organoids and gastruloids: new approaches to understanding embryogenesis. Development. 144 (6), 976-985 (2017).
  19. Lou, Y. R., Leung, A. W. Next generation organoids for biomedical research and applications. Biotechnology Advances. 36 (1), 132-149 (2018).
  20. Silva, T. P., et al. Design Principles for Pluripotent Stem Cell-Derived Organoid Engineering. Stem Cells International. 2019, 1-17 (2019).
  21. Silva, T. P., et al. Maturation of human pluripotent stem cell-derived cerebellar neurons in the absence of co-culture. Frontiers of Bioengineering and Biotechnology. , (2020).
  22. Burridge, P. W., et al. A universal system for highly efficient cardiac differentiation of human induced pluripotent stem cells that eliminates interline variability. PLoS One. 6 (4), 18293 (2011).
  23. Watanabe, K., et al. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 25 (6), 681-686 (2007).
  24. Smith, J. R., et al. Inhibition of Activin/Nodal signaling promotes specification of human embryonic stem cells into neuroectoderm. Developmental Biology. 313 (1), 107-117 (2008).
  25. Yaguchi, Y., et al. Fibroblast growth factor (FGF) gene expression in the developing cerebellum suggests multiple roles for FGF signaling during cerebellar morphogenesis and development. Developmental Dynamics. 238 (8), 2058-2072 (2008).
  26. Fischer, T., et al. Fgf15-mediated control of neurogenic and proneural gene expression regulates dorsal midbrain neurogenesis. Developmental Biology. 350 (2), 496-510 (2011).
  27. Bagri, A., et al. The chemokine SDF1 regulates migration of dentate granule cells. Development. 129 (18), 4249-4260 (2002).
  28. Bardy, C., et al. Neuronal medium that supports basic synaptic functions and activity of human neurons in vitro. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (20), 2725-2734 (2015).
  29. Bauwens, C. L., et al. Control of Human Embryonic Stem Cell Colony and Aggregate Size Heterogeneity Influences Differentiation Trajectories. Stem Cells. 26 (9), 2300-2310 (2008).
  30. Bratt-Leal, A. M., Carpenedo, R. L., McDevitt, T. C. Engineering the embryoid body microenvironment to direct embryonic stem cell differentiation. Biotechnology Progress. 25 (1), 43-51 (2009).
  31. Miranda, C. C., et al. Spatial and temporal control of cell aggregation efficiently directs human pluripotent stem cells towards neural commitment. Biotechnology Journal. 10 (10), 1612-1624 (2015).
  32. Miranda, C. C., Fernandes, T. G., Diogo, M. M., Cabral, J. M. S. Scaling up a chemically-defined aggregate-based suspension culture system for neural commitment of human pluripotent stem cells. Biotechnology Journal. 11 (12), 1628-1638 (2016).
  33. Bardy, J., et al. Microcarrier Suspension Cultures for High-Density Expansion and Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells to Neural Progenitor Cells. Tissue Engineering Part C Methods. 19 (2), 166-180 (2013).
  34. Rigamonti, A., et al. Large-Scale Production of Mature Neurons from Human Pluripotent Stem Cells in a Three-Dimensional Suspension Culture System. Stem Cell Reports. 6 (6), 993-1008 (2016).
  35. Arora, N., et al. A process engineering approach to increase organoid yield. Development. 144 (6), 1128-1136 (2017).
  36. Gimeno, L., Martinez, S. Expression of chick Fgf19 and mouse Fgf15 orthologs is regulated in the developing brain by Fgf8 and Shh. Developmental Dynamics. 236 (8), 2285-2297 (2007).

Tags

Биоинженерия выпуск 160 индуцированные человеком плюрипотентные стволовые клетки мозжечковая дифференциация динамическая система определенные культурные условия криозирование иммуностеление
Масштабируемое поколение зрелых мозжечковых органоидов из плюрипотентных стволовых клеток человека и характеристика иммуностимулированием
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Silva, T. P., Fernandes, T. G.,… More

Silva, T. P., Fernandes, T. G., Nogueira, D. E. S., Rodrigues, C. A. V., Bekman, E. P., Hashimura, Y., Jung, S., Lee, B., Carmo-Fonseca, M., Cabral, J. M. S. Scalable Generation of Mature Cerebellar Organoids from Human Pluripotent Stem Cells and Characterization by Immunostaining. J. Vis. Exp. (160), e61143, doi:10.3791/61143 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter