Summary
Ein Protokoll zur Untersuchung von FcγRIIIa-gesteuerten Ereignissen durch therapeutische Antikörper in menschlichen natürlichen Killerzellen wird hier beschrieben. Diese künstliche Stimulationsplattform ermöglicht die Abfrage nachgeschalteter Effektorfunktionen wie Degranulation, Chemokin/Zytokin-Produktion und Signalwege, die durch die FcγRIIIa- und Fc-Anteile von Antikörpern, die an der Bindung beteiligt sind, vermittelt werden.
Abstract
Ein Wirkmechanismus für die klinische Wirksamkeit durch therapeutische Antikörper ist die Förderung immunbezogener Funktionen wie Zytokinsekretion und Zytotoxizität, angetrieben durch FcγRIIIa (CD16), das auf natürlichen Killerzellen (NK) exprimiert wird. Diese Beobachtungen haben zu Forschungen geführt, die sich auf Methoden zur Erhöhung von Fc-Rezeptor-vermittelten Ereignissen konzentrieren, einschließlich der Entfernung eines Fucose-Anteils, der auf dem Fc-Teil des Antikörpers gefunden wurde. Weitere Studien haben die mechanistischen Veränderungen der Signalgebung, der zellulären Prozesse und der zytotoxischen Eigenschaften aufgeklärt, die die ADCC-Aktivität mit afucosylierten Antikörpern erhöhen. Darüber hinaus haben andere Studien die potenziellen Vorteile dieser Antikörper in Kombination mit niedermolekularen Inhibitoren gezeigt. Diese Experimente demonstrierten die molekularen und zellulären Mechanismen, die den Vorteilen der Verwendung von afucosylierten Antikörpern in Kombinationseinstellungen zugrunde liegen. Viele dieser Beobachtungen basierten auf einem künstlichen In-vitro-Aktivierungstest, bei dem das FcγRIIIa auf menschlichen NK-Zellen durch therapeutische Antikörper aktiviert wurde. Dieser Assay bot die Flexibilität, nachgeschaltete Effektor-NK-Zellfunktionen wie Zytokinproduktion und -degranulation zu untersuchen. Darüber hinaus wurde dieser Assay verwendet, um Signalwege zu untersuchen und Moleküle zu identifizieren, die moduliert oder als Biomarker verwendet werden können. Schließlich wurden dem System weitere therapeutische Moleküle (d.h. niedermolekulare Inhibitoren) hinzugefügt, um Einblicke in die Kombination dieser Therapeutika mit therapeutischen Antikörpern zu geben, die im aktuellen klinischen Raum unerlässlich ist. Dieses Manuskript zielt darauf ab, eine technische Grundlage für die Durchführung dieses künstlichen menschlichen NK-Zellaktivierungsassays zu schaffen. Das Protokoll demonstriert wichtige Schritte für die Zellaktivierung sowie mögliche nachgelagerte Anwendungen, die von funktionellen Auslesungen bis hin zu mechanistischeren Beobachtungen reichen.
Introduction
In den letzten Jahrzehnten lag der Schwerpunkt auf der Entwicklung gezielter Krebstherapien mit Antikörpern. Therapeutische Antikörper wie Trastuzumab und Rituximab wirken durch mehrere Mechanismen, einschließlich der Verhinderung der Dimerisierung von Signalmolekülen und der Mobilisierung des Immunsystems1,2. Letzteres wird durch Antikörper-abhängige zelluläre Zytotoxizität (ADCC) erreicht, bei der Lymphozyten, die als natürliche Killerzellen (NK) bezeichnet werden, durch den Antikörper1,2zu einer Zielzelle gebracht werden. Indem die Zellen in der Nähe zueinander platziert werden, wird die NK-Zelle aktiviert und kann durch die Sekretion von Effektormolekülen eine Tumor-/Zielzelle lysieren3.
Auf molekularer Ebene bindet der Fab-Teil des Antikörpers sein verwandtes Antigen, das auf den Tumorzellen exprimiert wird, während sein Fc-Anteil das auf NK-Zellen exprimierte FcγRIIIa eingreift, um die beiden Zellen zusammenzubringen1,2. Nach dem Engagement des FcγRIIIa treiben Signalwege (d. h. MAPK- und PI3K-Signalwege) die Zytoskelettumlagerung, die Zytokinproduktion und die Zytotoxizität4,5,6,7, 8,9. Somit ist ADCC ein FcγRIIIa-gesteuertes Ereignis, das durch NK-Zellen und Antikörper vermittelt wird.
Da angenommen wurde, dass ADCC ein Wirkmechanismus für diese therapeutischen Antikörper ist, suchten die Forscher nach Methoden, um ADCC durch Modifikation des Antikörpers zu erhöhen. Eine Modifikation war die Entfernung von Fucose auf der an Asparagin 297 gebundenen Oligosaccharidkette, die die Bindungsaffinität des Fc-Anteils des Antikörpers zum FcγRIIIa10,11,12erhöht. In Tierversuchen zeigten Mäuse, die afucosylierte Antikörper erhielten, ein langsameres Tumorwachstum im Vergleich zu Mäusen, die mit ihrem fucosylierten Gegenstück13behandelt wurden. Noch wichtiger ist, dass Obinutuzumab (z. B. Gazyva, ein zugelassener afucosylierter Antikörper) eine bessere Wirksamkeit im Vergleich zu Rituximab (z. B. Rituxan, sein fucosyliertes Gegenstück) bei Patienten zeigte, bei denen chronische lymphatische Leukämie oder follikuläres Lymphom diagnostiziert wurde14,15.
Bis vor kurzem waren die Mechanismen, die einem erhöhten ADCC über afucosylierte Antikörper zugrunde liegen, unbekannt. In Kombination mit der Tatsache, dass es zahlreiche Forschungsprogramme gibt, die therapeutische Antikörper entwickeln, um FcγRIIIa-gesteuerte Mechanismen für Krebszellen zu nutzen, ist es unerlässlich, In-vitro-Assays zu entwickeln, die die molekularen und zellulären Aspekte untersuchen, die von diesen Antikörpern gefördert werden. Dies liefert ein grundlegendes Verständnis der Wirkmechanismen sowie des Potenzials, Biomarker zu entdecken. Daher wurde ein künstlicher Aktivierungstest entwickelt, um antikörperabhängige FcγRIIIa-vermittelte Funktionen zusätzlich zu Signal- und zellulären Eigenschaften zuuntersuchen 8. Durch diese Studien wurden die Mechanismen aufgeklärt, die einer erhöhten Wirksamkeit von afucosylierten Antikörpern zugrunde liegen, bei denen eine erhöhte Bindungsaffinität die Signalübertragung erhöht, um zelluläre Eigenschaften und zytotoxische Eigenschaften zu fördern8.
Der aktuelle Trend in klinischen Studien ist die Verwendung einer Kombination therapeutischer Moleküle16. Einer der am häufigsten mutierten Signalwege ist der PI3K-Signalweg, der enorme Anstrengungen bei der Entwicklung niedermolekularer Inhibitoren ausgelöst hat, die auf Komponenten dieses Signalwegsabzielen 17,18,19,20. Wie diese Moleküle jedoch in Kombination mit therapeutischen Antikörpern wirken, ist relativ unbekannt, insbesondere in Kombinationen, in denen der Inhibitor Moleküle beeinflussen kann, die den PI3K-Signalweg benötigen, um zu funktionieren, wie z.B. solche, die von therapeutischen Antikörpern angetrieben werden.
Zu diesem Zweck wurde der für die Studien mit afucosylierten Antikörpern verwendete In-vitro-Assay auch zur Untersuchung der Kombination von PI3K-Inhibitoren und therapeutischen Antikörpern verwendet. Diese Studien definierten die molekularen Eigenschaften der PI3K-Hemmung auf therapeutische Antikörper PI3K-gesteuerte Ereignisse und beschrieben, wie afucosylierte Antikörper diesen Verlust der Signalgebung ausgleichen können9. Diese Ergebnisse sind relevant, da sie potenzielle Orientierungshilfen für die Gestaltung klinischer Studien bieten. Darüber hinaus führte diese Versuchsreihe auch zu den ersten beschriebenen Beobachtungen zur kinetischen Regulation des PI3K-Signalwegs zur Modulation der Chemokin/Zytokin-Transkription und -Produktion, die als potenzielle Biomarker dienen können9.
Der künstliche In-vitro-Aktivierungstest, der zur Definition der oben beschriebenen Signal- und Zelleigenschaften verwendet wird, wurde entwickelt, um FcγRIIIa-gesteuerte Ereignisse in NK-Zellen zu untersuchen, die durch Antikörper in Abwesenheit von Zielzellen vermittelt werden. Ohne Zielzellen im System können alle beobachteten Signalereignisse und -funktionen direkt den NK-Zellen zugeordnet werden. In dem vorgestellten Assay wird Antikörper zu gereinigten NK-Zellen gegeben, an welchem Punkt der Fc-Anteil das FcγRIIIa bindet. Es folgt eine Vernetzung des Antikörpers mit einem antimenschlichen κ-Leichtketten-Antikörper zur künstlichen Stimulation der Zellen. Die Vernetzung des Antikörpers ahmt die Bindung des Zielantigens nach, um eine Signalplattform zu erzeugen, die nachgelagerte Ereignisse hervorruft. Abhängig von der Dauer der Stimulation können Forscher Signalwege, zelluläre Prozesse, zytotoxische Eigenschaften und Effektorfunktionen beurteilen8,9. In ähnlicher Weise bietet dieser Assay auch Flexibilität bei der Untersuchung dieser Ereignisse, wenn Antikörper mit anderen Molekülen kombiniert werden9.
Zusammen ist dies ein idealer In-vitro-Assay, um therapeutische Antikörper zu untersuchen, die NK-Zellantworten durch ihr FcγRIIIa als Teil des Wirkmechanismus hervorrufen. Dieses Protokoll beschreibt die Leistung dieses In-vitro-Aktivierungsassays und gibt Einblick in die verschiedenen Auslesungen, die durchgeführt werden können.
Protocol
Das folgende Protokoll entspricht den Richtlinien der Ethikkommission für Humanforschung von iQ Bioscience.
1. Isolierung von PBMCs und Anreicherung/Aufreinigung von NK-Zellen
HINWEIS: Andere Methoden zur Isolierung peripherer mononukleärer Blutzellen (PBMCs) und zur Anreicherung/Reinigung können ebenfalls durchgeführt werden.
- Ziehen Sie 200 ml Blut unter regulierten Bedingungen in ein Heparin enthaltendes Röhrchen.
- Geben Sie 15 ml des Dichtegradientenmediums in ein 50 ml Rohr mit einer porösen Barriere. Drehen Sie die Röhre bei 1000 x g für 30 s.
- 12,5 ml Blut in die Röhre geben, gefolgt von weiteren 12,5 ml PBS, und vorsichtig 3x invertieren. Drehen Sie die Röhre bei 800 x g für 15 min bei Raumtemperatur (RT) ohne Unterbrechungen.
- Bereiten Sie ein 50 ml konisches Rohr mit 40 ml PBS für jedes Rohr mit einer porösen Barriere vor, während sich die Zellen drehen.
- Entfernen Sie vorsichtig die Röhrchen und prüfen Sie nach der Zentrifugation. Suchen Sie nach einer dünnen, sichtbar weißen Schicht von PBMCs über der porösen Barriere, zwischen den 20 ml und 25 ml Abgrenzungen auf dem 50 ml Rohr.
- Entfernen Sie vorsichtig so viel Flüssigkeit wie möglich von der Oberseite mit einer Pipette, ohne die dünne, weiße PBMC-Schicht zu stören.
- Entfernen Sie mit einer sauberen 10 mL serologischen Pipette die PBMC-Schicht zusätzlich zur klaren, gelblichen Flüssigkeitsschicht vorsichtig bis zum Filter des Röhrchens.
- Die PBMCs und die Flüssigkeit werden in die in Schritt 1.4 hergestellte konische 50 ml PBS-haltige Flüssigkeit ausgetrieben. Schleuderröhren bei RT und 300 x g für 5 min.
- Saugen Sie die PBS-Wäsche an und fügen Sie zusätzliche 40 ml PBS hinzu. Schleuderröhren bei RT und 300 x g für 5 min.
- Zählen Sie nach dem Waschen die Zellen und resuspenieren Sie sie in 40 μL 2% BSA / PBS pro 1 x 107 Zellen.
- Fahren Sie mit der Isolierung von NK-Zellen nach der Methode Ihrer Wahl fort. Zur Auswahl stehen manuelle oder automatisierte magnetische Perlensortierung9,21. Eine fluoreszenzaktivierte Zellsortierung kann ebenfalls durchgeführt werden22.
- Entfernen Sie ein kleines Aliquot von Zellen, um die Reinheit der NK-Zellen durch Durchflusszytometrie zu bestimmen. Die Gating-Strategie umfasst Folgendes: Gate auf lebenden Zellen basierend auf dem Vorwärts- vs. Seitenstreuprofil, dann Bewertung der Reinheit basierend auf NK-Markern (z. B. CD3, CD56) in der spezifischen lebenden Population. Typische Reinheit ist >95%.
- Nachdem die Isolierung abgeschlossen ist, spinnen Sie die Zellen bei RT und 300 x g für 5 min, um sie zu pelletieren und abzusaugen.
- Resuspendieren Sie das Zellpellet auf 1 x10 7 Zellen/ml in RPMI 1640 mit Nährstoffen, 10% wärmeinaktiviertem FBS, 1 mM Natriumpyruvat, 55 mM 2-ME und 10 mM HEPES (pH = 7,2).
2. Antikörper-vermittelte Aktivierung von NK-Zellen über FcγRIIIa
- Stellen Sie eine gekühlte Mikrozentrifuge auf 4 °C.
- 1 x 106 (100 μL) resuspendierte NK-Zellen in 1,5 ml Röhrchen dosieren und auf Eis legen.
HINWEIS: Zellen können in eine 96-Well-U-Bodenplatte dosiert werden, wenn zahlreiche Proben vorhanden sind. - Bereiten Sie 1 μL Rituximab (oder Antikörper von Interesse) pro Probe vor und geben Sie 1 μL zu den Zellen für eine endgültige Konzentration von 1 μg/ml Antikörper.
HINWEIS: Andere Moleküle können den Zellen zu diesem Zeitpunkt oder früher zur Beurteilung von Kombinationseffekten hinzugefügt werden. Hier wurde Ritixumab zur Stimulation eingesetzt. In früheren Studien wurden niedermolekulare Inhibitoren zu den Stimulationen hinzugefügt9. - Die Probe 30 min auf Eis inkubieren. Während der Inkubation 50 μL 50 μg/ml antimenschlicher κ Leichtkettenantikörper pro Probe in Medien herstellen und auf 37 °C auf einem Wärmeblock oder in einem Wasserbad erwärmen.
- Nach der Inkubation der Zellen auf Eis 1 ml eiskaltes Medium zugeben und bei 135 x g für 5 min bei 4 °C drehen. Erneut mit 1 ml eiskaltem Medium waschen.
- Den Überstand nach der letzten Wäsche absaugen und 50 μL der in Schritt 2.5 hergestellten antimenschlichen κ Leichtkettenmischung zugeben.
- Proben für den Endnutzer bestimmte Zeitpunkte bei 37 °C sofort auf einem Wärmeblock oder in einem Wasserbad inkubieren.
- Stoppen Sie die Stimulation durch Zugabe von 1 ml eiskaltem Medium und drehen Sie die Proben sofort in einer gekühlten Zentrifuge bei 135 x g für 5 min. Noch einmal mit 1 ml eiskaltem Medium waschen.
3. Nachgelagerte Anwendungen und Auslesungen
- Abfrage von Signalmolekülen in FcγRIIIa-stimulierten NK-Zellen mittels Western-Blot-Analyse
HINWEIS: Es können verschiedene Proteintrenn- und Membrantransferapparate verwendet werden.- Nach dem letzten Waschen mit eiskalten Medien (Schritt 2.8) mischen sich Lysezellen mit 20 μL RIPA-Puffer, der Phosphatase und Proteaseinhibitoren enthält, 30 min auf Eis.
- Wickelrohre bei 2100 x g für 15 min bei 4 °C. Das Lysat in ein sauberes 1,5 ml Röhrchen geben und die für die Proteintrennung erforderlichen Reagenzien hinzufügen.
- Proteine auf SDS-PAGE-Gel trennen und nach Standardprotokollen auf eine Nitrocellulose- oder PVDF-Membran übertragen.
- Blockieren und untersuchen Sie die Membran gemäß dem Datenblatt des Herstellers für den primären Nachweisantikörper (hier wurden pAKT, pPRAS 40 und pERK1/2 verwendet).
- Fügen Sie HRP-konjugierten sekundären Antikörper und Chemilumineszenzreagenz gemäß den Empfehlungen des Herstellers auf der PVDF-Membran hinzu. Verwenden Sie Röntgenfilm oder Detektionsinstrument zur Visualisierung (hier wurde pAKT bei 60 kDa, pPRAS40 bei 40 kDa und pERK1/2 bei 42 kDa und 44 kDa nachgewiesen).
- Isolierung von mRNA und Vorbereitung zur Genexpressionsanalyse von FcγRIIIa-stimulierten NK-Zellen (Table of Materials)
- Nachdem der Zeitpunkt für die Stimulation erreicht ist (Schritt 2.7), legen Sie das Röhrchen auf Eis und drehen Sie es sofort in einer gekühlten Zentrifuge bei 135 x g für 5 min (ähnlich wie Schritt 2.8).
- Den Überstand entfernen und 2x mit 1 ml eiskaltem PBS waschen.
- Lysezellen mittels Guanidiumisothiocyanat-RNA-Extraktion (Materialtabelle). Verwenden Sie 1 μg mRNA, um eine umgekehrte Transkription unter Verwendung zufälliger Hexamere mit einem kommerziellen Kit durchzuführen (Table of Materials).
HINWEIS: Jede Methode der RNA-Extraktion oder cDNA-Synthese kann verwendet werden9,23,24. - cDNA bis zur Genexpressionsanalyse bei -20 °C einfrieren.
- Bewertung der Zytoskelettumlagerung in FcγRIIIa-stimulierten NK-Zellen
- Nach dem letzten Waschen mit eiskalten Medien (Schritt 2.8) wird das Zellpellet mit 50 μL 3,7% Paraformaldehyd für 10 min bei RT resuspendiert.
- Fügen Sie 1 ml PBS hinzu und drehen Sie es bei 135 x g für 5 min bei RT. Wiederholen Sie dieses Waschen noch einmal.
- Fügen Sie 100 μL 0,1% Triton X-100/ PBS für 5 min hinzu, um die Zellen zu permeabilisieren, und spinnen Sie Zellen bei 135 x g für 5 min bei RT zu Pellet.
- 100 μL 5 Einheiten/ml AF488-markiertes Phalloidin, verdünnt in 1% BSA/PBS, zugeben und 20 min bei RT inkubieren.
- Fügen Sie 1 ml PBS hinzu und drehen Sie bei 135 x g für 5 min bei RT zum Waschen. Resuspendieren Sie das Zellpellet im gewünschten Volumen für die durchflusszytometrische Analyse.
- Beurteilung der Degranulation von FcγRIIIa-stimulierten NK-Zellen mittels CD107a-Oberflächenfärbung
- Inkubieren Sie die Zellen mit dem interessierenden Antikörper auf Eis, wie in den Schritten 2.1–2.4 beschrieben. Bereiten Sie während der Inkubation 50 μL Antikörpermischung pro Probe vor. Die Mischung wird in Zellmedien mit einer Endkonzentration von 50 μg/ml Anti-Human-κ-Leichtkettenantikörper und 1 μg/ml Fluorochrom-markiertem CD107a hergestellt.
- Nach der Inkubation der Zellen auf Eis 1 ml eiskaltes Medium hinzufügen. Bei 135 x g für 5 min bei 4 °C rühren, dann erneut mit 1 ml eiskaltem Medium waschen.
- Den Überstand nach dem letzten Waschen absaugen, dann 50 μL der antimenschlichen κ Leichtkettenmischung zugeben und bei 37 °C für die gewünschten Zeitpunkte inkubieren.
- Zu den gewünschten Zeitpunkten 1 mL PBS hinzufügen und bei 135 x g für 5 min rt drehen. Überstand aspiratieren und 100 μL 4% Paraformaldehyd hinzufügen. Inkubieren Sie bei RT für 10 Min.
- Fügen Sie 1 ml PBS hinzu und drehen Sie bei 135 x g für 5 min bei RT zum Waschen. Resuspendieren Sie das Zellpellet im gewünschten Volumen für die durchflusszytometrische Analyse.
- Beurteilung der Chemokin/Zytokin-Produktion aus FcγRIIIa-stimulierten NK-Zellen
HINWEIS: Zur Beurteilung der Chemokin- und Zytokinproduktion können verschiedene Methoden und/oder Kits verwendet werden.- Nach Erreichen des Stimulationszeitpunkts (Schritt 2.7) wird das Röhrchen sofort auf Eis gelegt und in einer gekühlten Zentrifuge bei 135 x g für 5 min bei 4 °C gedreht.
- Den Überstand in ein sauberes Gefäß überführen. Gefrieren Sie den Überstand bis zur Chemokin- oder Zytokinbewertung mit dem gewünschten Assay.
HINWEIS: Zellpellets können jetzt mit eiskaltem PBS gewaschen und für Signal-, Genexpressions- und Zytoskelettumlagerungsstudien verarbeitet werden.
Representative Results
Es ist wichtig, dass die NK-Zellreinheit hoch ist, da der Fc-Anteil der Antikörper das fcγRIIIa binden kann, das auf anderen Zelltypen wie Monozyten exprimiert wird. Bei hoher Reinheit können die gemachten Beobachtungen direkt auf FcγRIIIa-gesteuerte Ereignisse in NK-Zellen zurückgeführt werden. Hier hatten NK-Zellen eine Reinheit von mehr als 90%, basierend auf CD56- und CD3-Färbungen (Abbildung 1). Darüber hinaus betrug die Rentabilität >95%. Vorsicht ist geboten, wenn Isolierungen mit geringerer Lebensfähigkeit verwendet werden. Um sicherzustellen, dass Ereignisse durch das FcγRIIIa angetrieben wurden, wurden Western Blots für Phospho-AKT (pAKT), Phospho-PRAS40 (pPRAS40) und Phospho-ERK1/2 (pERK1/2) durchgeführt, in denen NK-Zellen für 1–5 min aktiviert wurden. Wie gezeigt, wurde eine Akkumulation dieser Moleküle beobachtet (Abbildung 2). In ähnlicher Weise exprimierten aktivierte NK-Zellen MIP-1α, MIP-1β, IFN-γ und TNF-α, wie durch Genexpressionsanalyse gezeigt (Abbildung 3).
Zusätzlich wurde eine Umlagerung des Zytoskeletts in aktivierten Zellen beobachtet (Abbildung 4). Ein Prozentsatz der 4 h stimulierten NK-Zellen exprimierte CD107a auf der Zelloberfläche (Abbildung 5). Zusätzlich wurden IFN-γ, TNF-α, MIP-1α, MIP-1β und RANTES im Überstand nach 3 h Stimulation nachgewiesen (Abbildung 6). Diese Messwerte werden auf der Grundlage veröffentlichter Studien erwartet, da aktivierte NK-Zellen diese phosphorylierten Proteine sowie die Genexpression und Produktion der genannten Chemokine und Zytokineaufweisen 8,9. In allen Experimenten sollten die Stimulationsbedingungen eine Anti-Human-κ-Lichtkettenkontrolle und Antikörper ohne Anti-Human-κ-Lichtvernetzungskontrolle umfassen. Diese NK-Zellen sollten keine Phospho-Signalisierung, Degranulation, Chemokin/Zytokin-Produktion oder Chemokin/Zytokin-Genexpression aufweisen.
Abbildung 1: Repräsentative Strömungsprofile der NK-Zellreinheit nach Isolierung aus PBMCs. PBMCs wurden aus dem Blut eines gesunden Spenders isoliert, gefolgt von der Anreicherung von NK-Zellen unter Verwendung einer negativen Selektionsmethode für die Isolierung menschlicher NK-Zellen (Table of Materials). Die Zellen wurden vor und nach der Anreicherung mit CD56 und CD3 angefärbt, um die Reinheit zu bestimmen. Repräsentative Punktdiagramme von CD56 vs. CD3 vor und nach der Isolierung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: FcγRIIIa-aktivierte NK-Zellen weisen phosphorylierte Signalmoleküle auf. Die Zellen wurden mit Rituximab für 2 min stimuliert und Zelllysate wurden gemäß dem Protokoll hergestellt. Lysate wurden auf einem 4%–12% igen Gel getrennt, gefolgt von der Übertragung auf eine PVDF-Membran. Die Membran wurde mit Antikörpern gegen pAKT, pPRAS40, pERK1/2 und Aktin untersucht. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: FcγRIIIa-aktivierte NK-Zellen exprimieren Chemokin- und Zytokingene. NK-Zellen wurden mit Rituximab für 0 h, 0,5 h und 1 h stimuliert. mRNA wurde gesammelt, umgekehrt transkribiert und einer qPCR-Analyse für MIP-1α, MIP-1β, RANTES, IFN-γ und TNF-αunterzogen( Table of Materials ). (A) Relative Expression von MIP-1α, MIP-1β und RANTES zu jedem Zeitpunkt. (B) Relative Expression von IFN-γ und TNF-α zu jedem Zeitpunkt. Die Werte wurden auf das Aktin-Gen normalisiert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: FcγRIIIa-aktivierte NK-Zellen weisen eine zytoskelettale Umlagerung auf. NK-Zellen wurden mit Rituximab für 0 min, 5 min, 15 min und 30 min stimuliert, gefolgt von der Beurteilung der Zytoskelettumlagerung durch Phalloidinfärbung und Durchflusszytometrie. Das Verhältnis von MFI zum experimentellen Zeitpunkt zum MFI zum Zeitpunkt 0 von NK-Zellen, die mit Rituximab (Kreis, durchgezogene Linie) oder sekundären Antikörpern allein (quadratisch, gepunktete Linie) stimuliert werden. Balken stellen den SD von vier Replikaten dar. Sternchen stellen die statistische Signifikanz dar, die auf einem zweiseitigen ungepaarten Student's t-Test (*p < 0,05) basiert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 5: FcγRIIIa-aktivierte NK-Zellen exprimieren CD107a. NK-Zellen wurden mit Rituximab für 4 h stimuliert, gefolgt von der Beurteilung der Degranulation mittels CD107a und Durchflusszytometrie. (A) Prozentsatz der NK-Zellen, die CD107a nach Stimulation mit Rituximab (weiße Balken) oder antimenschlichem κ-Leichtketten-Antikörper (graue Balken) für 0 h und 4 h exprimieren. (B) CD107a MFI von NK-Zellen, stimuliert mit Rituximab (weiße Balken) oder antimenschliche κ-Leichtketten-Antikörper (graue Balken) nach 0 h und 4 h Behandlung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 6: FcγRIIIa-aktivierte NK-Zellen sezernieren Chemokine und Zytokine. NK-Zellen wurden für 0, 0,5, 1, 3 und 6 Stunden mit Rituximab stimuliert. Überstand wurde gesammelt, um die Freisetzung von MIP-1α, MIP-1β, RANTES, IFN-γ und TNF-α durch eine fluss- und perlenbasierte Zytokinbewertungsmethode zu messen (Tabelle der Materialien). (A) MIP-1α-, MIP-1β- und RANTES-Produktion zu jedem Zeitpunkt. (B) IFN-γ und TNF-α Produktion zu jedem Zeitpunkt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Discussion
Dieses Protokoll beschreibt Methoden zur Untersuchung von FcγRIIIa-gesteuerten Ereignissen in NK-Zellen, die durch Antikörper vermittelt werden. Diese Techniken ermöglichen die Bewertung potenzieller Wirkmechanismen therapeutischer Antikörper, die als ADCC1,2vorgeschlagen werden. Insbesondere bieten diese Methoden Flexibilität bei der Untersuchung der zugrunde liegenden molekularen Signalwege und zellulären Prozesse, die für ADCC verantwortlich sind. Sie ermöglichen auch die Beobachtung anderer Effektorfunktionen wie Chemokin- und Zytokinproduktion. Darüber hinaus ermöglichen diese Methoden die Identifizierung potenzieller Biomarker und Moleküle, die zur Modulation von ADCC eingesetzt werden können.
Grundlage für dieses Protokoll ist die künstliche Stimulation von NK-Zellen durch das FcγRIIIa mit Antikörpern in Abwesenheit von Zielzellen. Antikörpergebundene Zielzellen dienen typischerweise dazu, die Vernetzung von Fc-Rezeptoren zu fördern, um eine Plattform zu bilden, die die Signalübertragung und nachgelagerte Effekte steuert. Stattdessen wird die Vernetzung mit einem anti-humanen κ-Leichtketten-Antikörper in diesem Assay durchgeführt, wodurch die Notwendigkeit von Zielzellen zur Stimulation der NK-Zellen umgangen wird. Ohne Zielzellen können die Ergebnisse und Beobachtungen direkt den NK-Zellen zugeschrieben werden, vorausgesetzt, der Reinigungsprozess ist erfolgreich.
Wichtig ist, dass die Verwendung eines anti-humanen κ-Leichtkettenantikörpers zur Vernetzung des Antikörpers die Bindungsaffinität des Fc-Anteils für das FcγRIIIa nicht beeinträchtigt, eine Wechselwirkung, die die Stärke der Reaktionbestimmt 10,11,12,13. Tatsächlich haben Studien gezeigt, dass afucosylierte Antikörper ADCC aufgrund ihrer erhöhten Affinität zum FcγRIIIa10,11,12,13erhöhen. Nachfolgende Studien zeigten, dass diese erhöhte Affinität nicht durch den sekundären Antikörperersatz gegen die antimenschliche κ-Leichtkette beeinflusst wird und zur Untersuchung der Grundlage für ein erhöhtes ADCC8verwendet werden kann. Um sicherzustellen, dass die NK-Zelle durch Vernetzung des Antikörpers stimuliert wird, sollten zwei Negativkontrollen eingeschlossen werden: 1) therapeutischer Antikörper nur ohne den sekundären antihumanen κ-Leichtketten-Antikörper und 2) der sekundäre antimenschliche κ-Leichtketten-Antikörper. In beiden Fällen sollte keine Signal- oder Effektorfunktion erzeugt werden.
Diese Methode bietet auch Flexibilität für die Untersuchung der Auswirkungen therapeutischer Antikörper auf niedermolekulare Inhibitoren. Der Inhibitor kann vor der Vernetzung mit dem sekundären Antikörper hinzugefügt werden, so dass der Inhibitor Zeit hat, sein Ziel zu aktivieren. Es sollten jedoch Studien durchgeführt werden, um den optimalen Zeitpunkt der Inhibitorvorbehandlung zu bestimmen. Somit hat der Inhibitor eine maximale Wirkung auf die Stimulation. Vor diesem Hintergrund können Forscher auch die Auswirkungen eines Inhibitors nach der Stimulation untersuchen. In diesem Fall kann der Inhibitor nach der Vernetzung hinzugefügt werden, um zu untersuchen, wie er bereits erzeugte Signale und Prozesse beeinflusst. Zusammen bietet die hier beschriebene Methode maximale Flexibilität bei der Untersuchung kombinatorischer Effekte verschiedener niedermolekularer Inhibitoren mit therapeutischen Antikörpern.
Wie oben erwähnt, kann nach der Stimulation eine Vielzahl von Auslesungen durchgeführt werden. Western Blotting kann durchgeführt werden, um die Signalisierung mit SDS-PAGE und Membrantransfersystemen verschiedener Hersteller zu untersuchen. In ähnlicher Weise kann die Genexpression auch mit verschiedenen RNA-Extraktionsmethoden, Reverse-Transkriptionsreagenzien und Genexpressionsinstrumenten bewertet werden. Schließlich kann auch eine Färbung auf intrazelluläres oder extrazelluläres Protein durchgeführt werden, bei der Proben mit verschiedenen Durchflusszytometern analysiert werden können. Für die intrazelluläre Zytokin- und CD107a-Färbung (Schritt 3.4, die gleichzeitig beurteilt werden kann) sollte Monensin und/oder Brefeldin A hinzugefügt werden, um die Signale zu maximieren. Wir haben für jedes experimentelle Ziel unterschiedliche Plattformen verwendet und dennoch ähnliche Ergebnisse beobachtet. Daher kann die Methode je nach Studie mit verschiedenen Reagenzien, Plattformen und Instrumenten ergänzt werden.
Die Vernetzungszeit für die Stimulation hängt vom Ziel der Studie ab. Wenn Signalstudien gewünscht werden, liegt die typische Vernetzungsstimulationszeit zwischen 2 min und 10 min. pAKT, pPRAS40 und pERK1/2 Akkumulation erreicht ihren Höhepunkt bei 2 min und verschwindet nach 10 min8,9. Für funktionelle Studien (d.h. solche mit Chemokin/Zytokin-Produktion) müssen die Zellen je nach Analyt mindestens 30 min stimuliert werden9. Die Genexpressionsanalyse erfordert typischerweise auch 30 Minuten Stimulation9. Bei der Verwendung der RANTES-Genexpression als Auslesung ist Vorsicht geboten, da die RANTES-mRNA-Produktion unabhängig von der transkriptionellen Aktivierung ist, da sie bereits in Zellen gespeichert ist, um eine sofortige Translation und Freisetzung von Protein bei Stimulation zu ermöglichen25. Die Degranulation hingegen erfordert mindestens 3 h Stimulation. Trotz dieser allgemeinen Beobachtungen sollten Forscher kinetische Studien durchführen, um den optimalen Stimulationszeitpunkt für die jeweiligen Moleküle von Interesse zu bestimmen.
In ähnlicher Weise sollten Forscher den interessierenden Antikörper titrieren, um die optimale Konzentration zu bestimmen, da Antikörper mit unterschiedlichen Spezifitäten mit unterschiedlichen Affinitäten an FcγRIIIa binden, selbst wenn sie vom gleichen Isotyp sind. Zum Beispiel sind Rituximab und Trastuzumab beide ein IgG1-Isotyp, aber Trastuzumab bindet stärker an den Valinpolymorphismus von FcγRIIIa als Rituximab26,27. Dieser Unterschied in der Affinität kann zu funktionellen Unterschieden wie Degranulation führen, wie in veröffentlichten Studienbeobachtet 8.
Die Bestimmung der optimalen Konzentration ist auch wegen der geringen Affinität des FcγRIIIa wichtig, die der Fc-Anteil des Antikörpers hat. Dies kann zum Abwaschen des Antikörpers führen, da das Protokoll Waschschritte nach der Bindung des Antikörpers an den Fc-Rezeptor beinhaltet. Dies kann dann zu einer mangelnden Sensitivität der Assays führen, wie der geringe Prozentsatz an CD107a-positiven Zellen nach der Stimulation nahelegt (Abbildung 5). Die Bestimmung der optimalen Konzentration sollte jedoch die Gewissheit geben, dass die Ergebnisse nicht auf einen Mangel an Empfindlichkeit zurückzuführen sind. Darüber hinaus werden Zellen in den biochemischen und funktionellen Assays, die Massenzellen im Gegensatz zu Einzelzellauslesungen verwenden, eindeutig aktiviert (Abbildung 2, Abbildung 3, Abbildung 6).
Das Protokoll ist auch begrenzt, da es nicht vollständig nachahmt, was physiologisch geschieht. Der sekundäre antimenschliche K-Antikörper, der verwendet wird, imitiert die Vernetzung, die durch das auf Zellen exprimierte Zielantigen erzeugt wird. Hier wird eine sättigende Menge an sekundären Antikörpern hinzugefügt, um die maximale Reaktion zu erzeugen. Unterschiedliche Zielzellen exprimieren jedoch unterschiedliche Antigenspiegel, was die Vernetzung und Reaktion beeinflusst. Derzeit ist diese Plattform nicht optimiert, um die Auswirkungen verschiedener Antigenexpressionsniveaus nachzuahmen.
Ein weiterer Faktor, der bei der Durchführung dieser Experimente zu berücksichtigen ist, ist die Variabilität von Spender zu Spender aufgrund unterschiedlicher genetischer Hintergründe und immunologischer Geschichten zwischen Individuen. Daher ist beim Vergleich von NK-Zellantworten verschiedener Spender über dieselben Assays Vorsicht geboten. Ebenso sollten nur allgemeine Schlussfolgerungen gezogen werden, wenn verschiedene Spender verwendet werden.
Insgesamt ist die beschriebene Methode eine einfache und flexible Stimulationsplattform zur Untersuchung antikörpergetriebener FcγRIIIa-vermittelter Ereignisse in NK-Zellen. Es wurde verwendet, um die Grundlage für den erhöhten ADCC und die Wirksamkeit, die mit afucosylierten Antikörpern beobachtet wurden, besser zu verstehen8. Diese Methode wurde auch in einer Studie eingesetzt, in der therapeutische Antikörper und niedermolekulare PI3K-Inhibitoren kombiniert wurden9. Zusätzlich wurde ein bisher unbekannter Mechanismus für die Chemokin- und Zytokinproduktion identifiziert, der durch pS6 reguliert wurde9. Daher können zukünftige Studien, die diese künstliche Signalplattform verwenden, die Regulationsmechanismen für Effektorfunktionen, die durch das FcγRIIIa angetrieben werden, weiter aufklären. Es kann auch möglicherweise neue Moleküle identifizieren, die für diese Mechanismen wichtig sind, sowie neue Rollen für bekannte Moleküle.
Disclosures
Alle Autoren sind oder waren Mitarbeiter oder Berater für iQ Biosciences.
Acknowledgments
Die Autoren danken James Lee und Christopher Ng für die Kommentare und die Bearbeitung dieses Manuskripts.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 16% paraformaldehyde | Thermo Fisher Scientific | 50-980-487 | |
| Alexa Fluor 488 phalloidin | Thermo Fisher Scientific | A12379 | |
| anti-mouse HRP antibody | Cell Signaling Technologies | 7076 | |
| AutoMACS instrument | Miltenyi | NK cell isolation method; another isolation instrument may be used | |
| B-mercaptoethanol | Thermo Fisher Scientific | 21985023 | |
| Bovine Serum Albumin Fraction V, fatty acid free | Millipore Sigma | 10775835001 | |
| CD107a APC antibody | Biolegend | 328620 | |
| Cytokine 30-Plex Human Panel | Thermo Fisher Scientific | LHC6003M | chemokine/cytokine method; another chemokine/cytokine analysis method may be used |
| FBS | Hyclone | SH30071.01 | |
| Goat anti-human κ light chain antibody | Millipore Sigma | AP502 | |
| Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail | Thermo Fisher Scientific | 78440 | |
| HEPES | Thermo Fisher Scientific | 15630080 | |
| High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit | Thermo Fisher Scientific | 4368814 | cDNA transcription method; used according to manufacturer's protocol |
| IFN-? primers | Thermo Fisher Scientific | Hs00989291_m1 | |
| Leukosep tube (50 ml conical with porous barrier) | Greiner | 227290 | |
| Lymphoprep (density gradient medium) | Stemcell | 7851 | |
| MIP-1? primers | Thermo Fisher Scientific | Hs00234142_m1 | |
| MIP-1β primers | Thermo Fisher Scientific | Hs99999148_m1 | |
| NK cell isolation kit | Miltenyi | 130-092-657 | NK cell isolation kit; another isolation kit may be used |
| NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels | Thermo Fisher Scientific | another protein separation system may be used | |
| pAKT (S473) antibody | Cell Signaling Technologies | 4060 | |
| pERK1/2 antibody | Cell Signaling Technologies | 4370 | |
| pPRAS40 antibody | Cell Signaling Technologies | 13175 | |
| PVDF membrane | Thermo Fisher Scientific | nitrocellulose may be used | |
| RANTES primers | Thermo Fisher Scientific | Hs00982282_m1 | |
| RIPA buffer | Millipore Sigma | R0278 | |
| RPMI w/glutamax | Thermo Fisher Scientific | 61870 | |
| Sodium pyruvate | Thermo Fisher Scientific | 11360070 | |
| TNF-? primers | Thermo Fisher Scientific | Hs00174128_m1 | |
| Triton X-100 | Thermo Fisher Scientific | 85111 | |
| TRIzol | Thermo Fisher Scientific | 15596018 | RNA isolation method; used according to manufacturer's protocol |
| Xcell Blot II Transfer Module | Thermo Fisher Scientific | another protein separation system may be used | |
| Xcell SureLock Protein Gel Electrophoresis Chamber System | Thermo Fisher Scientific | another protein separation system may be used | |
| β-actin HRP antibody | Abcam | ab6721 | |
| β-actin primers | Thermo Fisher Scientific | Hs00982282_m1 |
References
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