En protokoll for å utføre avstamning sporing og funksjonell genetisk analyse av kandidat gener på en enkelt celle nivå ved hjelp av mosaikk analyse med doble markører (MADM) presenteres. MADM klonal analyse gir et kvantitativt rammeverk for å måle den proliferative atferd, cellulær utgang, og avstamning forholdet mellom individuelle forfedre og deres datter celler.
Fra et begrenset utvalg av forfedre danner den pattedyriske hjernebarken svært organiserte funksjonelle nevrale kretser. Imidlertid er de underliggende cellulære og molekylære mekanismene som regulerer avstamningsoverganger av nevrale stamceller (NSCer) og eventuell produksjon av nevroner og glia i det utviklende nevroepithelium fortsatt uklart. Metoder for å spore NSC divisjonsmønstre og kartlegge avstamningen av klonalt relaterte celler har avansert dramatisk. Imidlertid lider mange moderne avstamning sporingsteknikker av mangel på cellulær oppløsning av avkom celle skjebne, noe som er viktig for å tyde stamfar celle divisjon mønstre. Presentert er en protokoll ved hjelp av mosaikkanalyse med doble markører (MADM) for å utføre in vivo klonalanalyse. MADM manipulerer samtidig individuelle stamceller og visualiserer presise divisjonsmønstre og avstamningsprogresjon ved enestående enkeltcelleoppløsning. MADM-baserte interchromosomale rekombinasjonshendelser under G2-X-fasen av mitose, sammen med tidsmessig udugelig CreERT2,gir nøyaktig informasjon om fødselsdatoene til kloner og deres divisjonsmønstre. Dermed gir MADM-avstamning sporing enestående kvalitative og kvantitative optiske avlesninger av spredningsmodusen til stamcellestamitorer på enkeltcellenivå. MADM åpner også for undersøkelse av mekanismene og funksjonelle kravene til kandidatgener i NSC-avstamningprogresjon. Denne metoden er unik ved at komparativ analyse av kontroll og muterte subkloner kan utføres i samme vevsmiljø in vivo. Her er protokollen beskrevet i detalj, og eksperimentelle paradigmer for å ansette MADM for klonal analyse og avstamning sporing i den utviklende hjernebarken er demonstrert. Viktigere, denne protokollen kan tilpasses til å utføre MADM klonal analyse i noen murine stamcelle nisje, så lenge CreERT2 driveren er til stede.
Hjernebarken er en svært organisert struktur bestående av seks forskjellige lag. Cortex inneholder et variert utvalg av celletyper, inkludert nevroner og glia, som samhandler for å danne funksjonelle nevrale kretser. De fleste, om ikke alle, kortikale eksitatoriske projeksjon nevroner og glia er avledet fra et vanlig utvalg av nevrale stamceller (NSCs) kjent som radial glial stamfar (RGPs)1,2,3. RGPs selv er avledet fra nevroepitelstamceller (NESCs) som komponerer det tidlige embryonale nevroepithelium. Ved embryonal dag 9 (E9) hos mus begynner NESCs å gå over til RGPs4. RGP avstamning progresjon krever presis temporal og romlig regulering, og når denne prosessen er hindret, alvorlige nevrologiske lidelser som megalencephaly, microcephaly, lissencephaly, eller funksjonsnedsettelser som schizofreni og autisme kan resultere5,6. På E10 gjennomgår de fleste RGPs symmetriske proliferative divisjoner, noe som resulterer i en utvidelse av nevrale stamcellebasseng4,7. RGPs begynner til slutt å dele asymmetrisk, og produserer kortikale projeksjonsnevroner på en tidsmessig definert måte. Gjennom påfølgende bølger av nevrogenese migrerer nyfødte nevroner inn i den kortikale platen som danner kortikale laminale med tidlige fødte nevroner som opptar dype lag og sene fødte nevroner som bor i de overfladiske lagene8,9,10. Fordi klonalt relaterte pyramidale nevroner migrerer radialt inn i cortex med svært liten tangential dispersjon, datterceller har en tendens til å danne en kolonne eller kjegleformet struktur referert til som en nevronal radial enhet4,11,12,13. Ved E17 er embryonal nevrogen ekspansjon komplett hos mus14. RGPs kan også produsere ependymale celler og noen klasser av glia, inkludert astrocytter og oligodendrocytes1,15,16,17,18,19. Potensialet for RGPs å gi opphav til både nevroner og astrocytter synes å være konsistent på tvers av alle kortikale regioner18,med ca 1/6 av nevrogene RGPs også produsere glia11.
For tiden er de genetiske og epigenetiske faktorene som regulerer temporal progresjon av en stamcelle langs slektslinjen, for det meste ukjent. Temporale mønstre av genuttrykk kan ha betydelig innvirkning på avstamning beslutninger i RGPs20,21,22,23,24. Hvordan dette tett sammensveiset forholdet mellom temporal og romlig mønster fører til molekylært mangfold av voksne nevronale typer på tvers av kortikale områder er ikke kjent. På samme måte er hvordan det enkelte stamcellepotensialet og dens cellulære utgang modulert på celle- og molekylært nivå et viktig ubesvart spørsmål. Fremtidige studier vil forhåpentligvis ta opp noen av disse spørsmålene, og til slutt utvide vår forståelse av funksjonell kortikale kretsdannelse.
Utviklingsnevrobiologi søker å forstå avstamningsforholdet som celler i hjernen deler med hverandre. I utgangspunktet var svært få forskningsverktøy tilgjengelige for dette, og mange tidlige studier var avhengige av visuelle observasjoner av divisjonsmønstre i gjennomsiktige organismer som Caenorhabditis elegans25. De siste tiårene har sett en dramatisk økning i antall og raffinement av teknikker tilgjengelig13,26,27,28,29. Fremveksten av CRISPR-Cas9 genom redigeringssystemet gjør det mulig for syntetisk rekonstruksjon av celle avstamning relasjoner ved å innføre utviklende DNA strekkoder27,,30. To nylige eksempler på barcoding strategier inkluderer bruk av homing guide RNA som leder CRISPR-Cas9 til spesifikke DNA strekkode loci eller en cytidin deaminase smeltet sammen med nickase Cas9 å målrette endogene interspersed gjenta regioner31,32. Disse teknologiene gir svært multipleksede tilnærminger gjennom innføring av strekkoder som gradvis og stabilt akkumulerer unike mutasjoner over tid. Genomredigeringsmetoder er svært verdifulle fordi de tillater tilbakevirkende analyse av forholdet mellom to celler basert på den delte arven til disse strekkodene. Men for å lese strekkodene i individuelle celler, må vevet vanligvis forstyrres, og derfor går informasjon om posisjon, morfologi og absolutte celletall fra en individuell stamfar tapt.
Kombinatoriske merking paradigmer bevare romlig informasjon og i prinsippet også tillate skillet mellom nært lokalisert eller overlappende kloner33,34. For at en linjesporingsmetode skal være informativ, må den merke individuelle forfedre og deres stambånd på en sparsom og uutslettelig måte. Spesielt Brainbow35 og Confetti36,37 tilnærminger bruker stokastisk flerfarget Cre rekombininase-baserte journalister som uttrykker en kombinasjon av fluorescerende proteiner fra en enkelt locus. Det omfattende antallet samtidige fargekombinasjoner som kan oppnås in vivo gjør dette til et kraftig verktøy når du sporer kortikale RGP-kloner og astrocytter34. Transposon-baserte systemer som gir stabil genomisk integrasjon av transgenes koding fluorescerende reportere og tillater avstamning sporing av kortikale forfedre har også blitt utviklet33,,38,39,40,41. Transposonbaserte systemer har en ekstra fordel ved at reporteren konstruerer stabilt integrere seg i genomet, og dermed pålitelig etikett linealt relaterte datterceller. For å spore astrocytt linjer spesielt, en rekke metoder er utviklet som involverer elektroporering av piggyBac transposaser inkludert Star Track, som gjør bruk av en kombinasjon av konstruksjoner koding ulike fluorescerende proteiner40,42. En annen tilnærming, MAGIC markører, introduserer Brainbow vektorer som transposable transgenes. Dette har blitt brukt til å spore embryonale nevrale og astrocytt stamfar34,43. Nylig ble mosaikkanalyse ved dobbel rekombininasemeditert kassettutveksling (MADR) funnet å stikke mutantceller som uttrykker transgene elementer fra nøyaktig definerte kromosomale loci44. Disse kraftige in vivo kombinatoriske merking teknikker har gitt mange innsikt i avstamning dynamikken i stamceller. Disse analysene utføres imidlertid på fast vev, noe som gir et øyeblikksbilde av individuelle kloner på et definert utviklingsstadium. For å observere endringer i avstamningdynamikken til enkeltkloner over tid, må kroniske in vivo-bildemetoder som ligner på de som utføres i den voksne dentate gyrus, brukes45.
Mosaikkanalyse med doble markører (MADM) er en kraftig dual color labeling metode som gjør det mulig for in vivo avstamning sporing av individuelle stamceller i mus46,47. To komponenter er nødvendige for at MADM-merkingshendelser skal forekomme: For det første må MADM-kassetter målrettes mot identiske loci på homologkromosomer. Kassetter består av to kimeriske fluorescerende reporter gener, eGFP (grønn, [G]) og tandem dimer Tomato (rød, tdT [T]). GT-kassetten inneholder N-terminus av eGFP og C-terminus av tdT, atskilt med en intron som inneholder et loxP-område. GT TG-kassetten er konstruert omvendt, med N-terminus av tdT og C-terminus av eGFP. For det andre er uttrykket cre rekombinase i samme celle som inneholder de målrettede MADM-kassettene avgjørende. I fravær av Creuttrykker ikke de kimeriske kassettene funksjonelle eGFP eller tdT fordi deres kodesekvenser er forstyrret. LoxP-nettstedene fungerer som mål for Cre-mediert interchromosomal rekombinasjon, noe som resulterer i rekonstituering av begge uttrykkskassettene samtidig. Hvis rekombinasjon oppstår i G2-fasen av cellesyklusen etterfulgt av X-segregering (G2-X), vil de to dattercellene hver uttrykke ett av de to fluorescerende proteinene. Temporal regulering av CreERT2 aktivitet ved hjelp av tamoxifen (TM) gir nøyaktig informasjon om fødselsdato madm kloner og divisjon mønstre av deres avkom (Figur 1A)29,46,47.
MADM kan potensielt systematisk merke individuelle kloner med høy enkeltcelleoppløsning i musehjernen som ligner på tradisjonelle, men uspesifikke og arbeidskrevende metoder som Golgi farging48 eller fargestofffylling49. Fordi bare arrangøren kjører CreERT2 bestemmer celle type spesifisitet av klonal MADM merking, MADM kan i prinsippet brukes for klonal avstamning sporing i alle murine organ og vev47,,50,51,52. Faktisk har studier allerede brukt MADM til å avsløre avstamning relasjoner i kloner avledet fra ulike vev47,50,51,52,53,54,55,56,57,58,59. MADM eksperimentelle paradigmer har blitt brukt til å studere avstamning i kortikale projeksjon nevroner, glia, og postnatal stamceller i den utviklende neocortex7,11,12,46,60,61,62,63,64,65. MADM har også blitt brukt til å studere celleavledning i den voksne bulke gyrus, thalamus, cerebellar granulaceller, og interneuroner på klonalnivå (se tabell 1 for en komplett liste)47,53,54,56,57,66.
Et unikt trekk ved MADM er evnen til å genetisk knytte mutasjoner distal til en MADM kassett, og dermed skape en genetisk mosaikk (Figur 1B og figur 2). Dette resulterer i vill type datterceller merket med en fluorescerende markør (tdT i figur 1B)og homozygoterte mutant søsken med den andre (eGFP i figur 1B) i et umerket heterozygot miljø. MADM er unik ved at komparativ analyse av kontroll og muterte subkloner kan utføres i samme vevsmiljø in vivo. Opprinnelig ble MADM-kassetter rettet inn i Rosa26-locus 47,men MADM-analyse av genfunksjonen var begrenset til gener som var distale til locus. For å overvinne (i det minste delvis) denne begrensningen og utvide mulighetene for MADM-baserte genanalyser, ble MADM-kassetter banket inn nær centromeres av Chr. 751,Chr. 1146, og Chr. 1251. Målretting av alle 19 mus autosomer med MADM kassetter pågår og vil tillate nesten alle genet å bli studert i fremtiden, og gir en enestående plattform for studiet av utviklingsmessige avstamning relasjoner i kombinasjon med funksjonell genetisk analyse.
En metode for å bruke MADM til å spore celleavledning av individuelle RGPs in vivo i den utviklende neocortex er beskrevet. Når madm-hendelser kombineres med TM-inducible CreERT2,kan madm-hendelser bli nøyaktig tidsforstilt, noe som gir en svært kvalitativ og kvantitativ visuell avlesning av stamcelledelingsmønstre på enkeltcellenivå. Ved å titrere dosen av TM levert, i en ideell situasjon kan et gjennomsnitt på mindre enn en klone per kortikale halvkule oppnås, noe som gir tilstrekkelig romlig separasjon for å skille individuelle kloner. Ved å opprettholde vevintegritet fanger denne metoden også viktig informasjon om posisjon, morfologi og absolutte celletall. MADM kassetter på Chr. 117,11,12,46,56,57, på Chr. 751, og den opprinnelige MADM på Rosa2647,53,59 har blitt brukt i MADM klonal analyse studier. Den høye oppløsningen av individuelle celler gir enestående innsikt i både morfologi og klonal forholdet mellom datterceller og tillater levende avbildning av prolifererende stamceller og nye kloner46,52.
Keisersnitt og fostering av valper for analyse av kloner på postnatale tidspunkter er et nødvendig og kritisk skritt i protokollen. Avhengig av helsetilstanden til den TM-behandlede gravide demningen, kan det ikke være nødvendig å utføre en keisersnitt. Det er imidlertid fortsatt nødvendig å oppdra valpene med en fostermor, fordi den TM-behandlede moren kan ha problemer med å ammende. Det er ikke observert forskjeller i behovet for å fostre med forskjellige CreERT2-drivere. Både MADM linjer og fostermødre opprettholdes på en outbred CD-1 bakgrunn. Hvis keisersnitt ikke er nødvendig, kan den TM-behandlede gravide demningen som brukes til å generere eksperimentelle valper gjenbrukes for ytterligere eksperimentelle avl i samsvar med prinsipper i 3R (merk at dette bare kan gjøres hvis dyreeksperielle lisenser godkjenner denne praksisen). Fostermødre kan brukes til å fostre unger innen 2 dager etter at de føder, men høyere suksessrater har blitt observert når fostermødre føder samme dag som de eksperimentelle musene som må fostres. Derfor er det viktig å sette opp tidsdede parringer for fostermødre parallelt med eksperimentelle parring i trinn 1.1. Opprettholde et lignende kull nummer som den opprinnelige fostermors søppel kan forbedre overlevelsesraten av fostrede valper, og derfor fjerning av noen til alle de opprinnelige kull kan være nødvendig. Ytterligere tiltak som kan forbedre fosteringen inkluderer å gni eksperimentererens hansker med søppel og mat (for å fjerne duften av hanskene); gni valpene forsiktig etter keisersnittet med fragmenter av fostermorens skitne søppel og rede; og plassering av valpene i nær kontakt med fostermorens valper før de ble plassert i fostermuseburet.
Som i andre reporterbaserte linjesporingsmetoder, må det tas nøye hensyn når du velger den optimale CreERT2-driveren for MADM kloniske eksperimenter. For det første må arrangøren som brukes uttrykke recombinase både timelig og romlig i stamfarpopulasjonen av interesse. Å finne denne arrangøren kan være utfordrende, fordi noen arrangører kan endre uttrykksmønstre eller bli dempet på ulike utviklingsstadier. For å forbedre celletypespesifisitet flere stedsspesifikke rekombiner, hver drevet av separate arrangører, har blitt brukt. Når en eller begge rekombiner uttrykkes i samme celle, merker dette cellen og avkom med en fluorescerende reporter74,75,76,77. Oppsummert er det viktig å velge en CreERT2-sjåfør som er spesifikk for populasjonen av forfedre som analyseres.
Det mest kritiske trinnet i denne metoden er identifisering av en klone, fordi alle celler må avledes utvetydig fra en enkelt rekombinasjonshendelse (trinn 8.1). Titrering av TM-konsentrasjon sikrer mindre enn én klynge av røde/grønne celler per hjernehalvhalv og maksimerer sannsynligheten for å analysere en enkelt klone (trinn 2.2)7,11. Kloner bør kastes hvis nærliggende klynger av celler forekommer innen 500 μm av klone av interesse. Derfor er det viktig å undersøke flere seksjoner før og etter utseendet på en klone for å sikre at det ikke er noen flere rekombinasjonshendelser i nærheten. På grunn av svakere signal fra fluoroforeene er det nødvendig å utføre immunohistokjemi for eGFP og tdT i embryonale kloner (se avsnitt 6). Dette anbefales kun i voksne kloner hvis flere antigener vil bli colabeled. Når bilde kloner, er det viktig å fange hele bredden av cortex der klone ligger (dvs. fra pial overflate til corpus callosum; se trinn 8.4) for å ikke gå glipp av noen celler. Dette forenkler også bildejustering under bildebehandling (avsnitt 9). Del 8 i protokollen krever et invertert konfusisk mikroskop, men kan tilpasses avhengig av mikroskopoppsettet som er tilgjengelig. Epifluorescensmikroskopi kan brukes, men konfisk mikroskopi anbefales fordi dette fører til en reduksjon i lysforurensning fra utsiden av fokusplanet. Det er også viktig at laserintensiteten og gevinsten justeres slik at grønne, røde og gule celler kan identifiseres utvetydig. Uavhengig av oppsettet anbefales det å bruke et mål om minst 20x for å sikre full romlig separasjon av tett plasserte celler. I tillegg til å registrere den kortikale dybden av alle celler (trinn 8.6), kortikale regioner der klonene er plassert må identifiseres ved hjelp av en hjerneatlas som Allen Brain atlas eller andre stereotaxic koordinat kart. Et navneparadigme bør også vedtas for å sikre at klonebilder er lett identifiserbare. Følgende informasjon kan inkluderes i filnavnet: unik bilde-ID, datobilde ble tatt, genotype av dyr, induksjonsalder, analysealder, bildenummer i forhold til resten av bildene fra samme klone.
Innføring av en mutasjon distal til en MADM kassett gir karakteristisk generering av genetiske mosaikker71 og tillater disseksjon av molekylære regulatorer av avstamning og celletype mangfold på klonal nivå7,11,46,62. For å generere en genetisk mosaikk med MADM, må MADM-kassettene være meioly knyttet til samme kromosom som genet av interesse (se figur 2 for avlsordning). Dette begrenser dagens klonanalyse med MADM til gener som ligger på Chr. 751,Chr. 1146,Chr. 1251og Chr. 6 distal til Rosa26 locus47. Fremtidige studier vil bruke MADM kassetter rettet mot ethvert kromosom, slik at mosaikkanalysen av nesten alle gener av musegenomet på klonalnivå.
Til slutt er MADM ikke begrenset til analysen av stamceller i den utviklende neocortex. Studien av mange stamcellenisjatorer kan dra nytte av evnen til å løse spatiotemporale ordninger av klonalt relaterte celler. Ved å bruke MADM til andre områder av hjernen, sykdomsforhold (f.eks. kreft) eller i andre vev47,,50,51,52,53,54,55,56,57,58,59, studier viste slektsforhold i kloner avledet fra ulike klasser av stamceller og stamceller (se tabell 1 for gjeldende liste over MADM klonale studier). En annen interessant fremtidig anvendelse av MADM er å kombinere den med flere funksjonelle eller subcellulære reportere, noe som vil øke graden av informasjon som kan ervervet fra kloner.
The authors have nothing to disclose.
Vi takker alle medlemmer av Hippenmeyer-laboratoriet for diskusjon, Bioimaging Facility, Life Science Facility og Pre-Clinical Facility i IST Austria for teknisk støtte. Dette arbeidet ble støttet av IST Austria institusjonelle midler; R.B. fikk støtte fra Austrian Science Fund (FWF) Lise-Meitner program (M 2416); N.A fikk støtte fra Austrian Science Fund (FWF) Firnberg-Programm (T 1031); GC fikk støtte fra EUs forsknings- og innovasjonsprogram for Horizon 2020 under Marie Skłodowska-Curie-tilskuddsavtalen nr. A.H. fikk støtte fra en ÖAW DOC (Doktorgradsstipendiat ved det østerrikske vitenskapsakademiet). Denne studien ble også støttet av European Research Council (ERC) under EUs Forsknings- og innovasjonsprogram Horizon 2020 (tilskuddsavtale No 725780 LinPro) til S.H.
1 mL tuberculin syringe (Omnifix Luer Lock) | Braun | 9204512N | |
1,4-diazabicyclooctane (DABCO) | Roth | 0718.2 | |
10 mL Syringe (Omnifix Luer Lock) | Braun | 8508429N | |
15 mL conical centrifuge | Sarstedt | 65.554.502 | |
24 multi-well dishes | Roth/Greiner Bio-one | CE56.1 | |
27- gauge x 3/4 needle (Sterican) | Braun | 16010256E | |
Corn oil | Sigma | C8267-500ML | |
Coverslips (24 x 60 mm #1) | Thermo Fisher Scientific (Menzel) | 15747592 | |
Cryostat Cryostar NX70 | Thermo Fisher Scientific | 957000H | |
Dako Pen (Wax marker) | Agilent | S200230-2 | |
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Invitrogen | D1306 | |
Disposable microtome blade (MX35 Ultra) | Thermo Fisher Scientific | 705830 | |
Fine Forceps (Dumont #5) | Fine Science Tools (FST) | 11254-20 | |
Glass anti-roll plate | Histocom | M 449980 | |
Glycerol | Sigma | G5516 | |
LSM 800 Confocal | Zeiss | ||
Mounting medium | 25 mg/mL DAPCO, 6 g Glycerol, 2.4 g Mowiol 4-88, 6 mL dH2O, 12 mL 0.2 M Tris-HCl (pH 8.5) | ||
Mowiol 4-88 | Roth | 0713.2 | |
Normal donkey serum | Innovative Research | IGDNSER100ML | |
Paraformaldehyde | Sigma | 441244-1KG | |
Peristaltic pump 323E/D 400RPM | Watson-Marlow | 036.3124.00A | |
Sucrose | Sigma | S8501-5KG | |
Superfrost plus glass slides | Thermo Fisher Scientific | J1800AMNT | |
Tamoxifen | Sigma | T5648 | |
Tissue Embedding mold T-12 (22mm square) | Polysciences Inc. | 18986-1 | |
Tissue-Tek O.C.T | Sakura | 4583 | |
Triton X-100 | Sigma | T8787-250ML | |
Trizma hydrochloride | Sigma | 93363 | |
Tween-20 | Sigma | P9416-100ML | |
Software and Plugins: | |||
Fiji | 1.52p | Fiji | |
MultiStackReg | 1.45 | Download link | |
TurboReg | EPFL Bioimaging | ||
Zen Blue | 2.6 | Zeiss | |
Experimental Models: Organisms/Strains: | |||
Mouse: Emx1-CreER | The Jackson Laboratory | JAX:027784 | |
Mouse: MADM-11-GT | The Jackson Laboratory | JAX:013749 | |
Mouse: MADM-11-TG | The Jackson Laboratory | JAX:013751 | |
Primary antibodies: | |||
Chicken anti-GFP 1:500 | Aves Labs | GFP-1020 | |
Goat anti-tdTomato 1:500 | Sicgen Antibodies | AB8181-200 | |
Rabbit anti-RFP 1:500 | MBL | PM005 | |
Secondary antibodies: | |||
Donkey Anti-Chicken Alexa Fluor 488 1:500 | Jackson Immuno Research | 715-475-150 | |
Donkey Anti-Goat Cy3 1:500 | Jackson Immuno Research | 705-165-147 | |
Donkey Anti-Rabbit Cy3 1:500 | Jackson Immuno Research | 711-165-152 |